CN110951725A

CN110951725A - 一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺

Info

Publication number: CN110951725A
Application number: CN201911399484.0A
Authority: CN
Inventors: 董辉; 金维荣; 秦红友; 杨红
Original assignee: Shenyou Genomics Research Institute Nanjing Co Ltd
Current assignee: Shenyou Genomics Research Institute Nanjing Co Ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-04-03

Abstract

本发明涉及一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，步骤如下：1)将1个试剂盒内含有的6个深孔板分别进行预分装处理，将经过预分装处理后的深孔板颠倒混匀、离心后，撕开深孔板的封膜，并在预分装裂解结合液LB的深孔板孔中依次加入待测样本和蛋白酶K；2)通过核酸提取仪进行核酸的提取；3)核酸提取程序完毕后，取出6个深孔板，第6板深孔板中的溶液即为核酸溶液；本发明将裂解液和结合液真正意义上统一，裂解和结合同时进行，大大提高了工作效率，提高了核酸提取的浓度，且保证了核酸纯化的纯度。整个试剂盒中不含任何有毒物质，保证了操作人员的安全。

Description

一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺

技术领域

本发明涉及一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，属于核酸分离纯化技术领域。

背景技术

传统的核酸提取方法有酚-氯仿抽提法、碱抽提法、高盐沉淀、离子交换法、磁珠法等。然而存在一些不足，如使用苯酚和氯仿等毒性试剂，抽提时间过长，提取的DNA浓度和纯度低、半自动化、通量小等问题。高质量的人类遗传基因是各类研究的基础，核酸技术直接影响下游实验的实施。

针对目前磁珠类核酸提取试剂盒具有预处理繁琐、核酸浓度低、纯度低(多糖、无机盐残留等)、样本单一性、通量小等问题，本公司发明了一种基于磁珠法的一步法核酸提取纯化试剂盒。目前磁珠类核酸提取试剂盒预处理繁琐，样本需要先在裂解液的作用下充***解蛋白质、脂质等杂质，再向裂解好的样本中加入结合液去结合核酸，这样的操作方式大大降低工作效率和增加实验误差。CN 109504678 A专利中虽然将裂解液和结合液统一，但是使用步骤仍然是先裂解细胞再去结合核酸，而且结合液中的异丙醇在高温孵育过程中容易挥发，不能保证核酸浓度的稳定性，且长期使用对操作人员造成身体伤害。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供了基于磁珠法的一步法核酸提取试剂盒，本发明试剂盒的裂解液和结合液合并，裂解和结合同时进行，大大提高了工作效率；本试剂盒能满足的样本有唾液、全血、口拭子等的人类遗传基因检测样本DNA提取及纯化，且无需切换实验程序，简单操作。另外，本发明试剂盒预分装在深孔板内，一次性可以处理96个样本，实现高通量的核酸自动化提取。

为了实现上述目的，技术方案是：研发一种基于磁珠法的一步法核酸提取纯化试剂盒，其中包括预封装试剂裂解结合液LB、洗液W1、洗液W2、洗液W3、洗脱液lowTE、磁珠混液和单管蛋白酶K，裂解结合液LB的组分是异硫氰酸胍2～5mol/L、SDS 0.5～1％(w/v)、Tris-HCl 20～50mmol/L、EDTA 5～10mmol/L、Nacl 20～50mmol/L、Triton X-100 0.2～1.5％(v/v)、Tween 20 0.2-1.0％(v/v)和PEG 400 5～30％(v/v)，溶剂是无菌水。洗液W1的组分是盐酸胍2-4mol/L、Triton X-100 0.2～0.5％(v/v)、乙醇30～50％(v/v)，溶剂是无菌水。洗液W2是PEG 6000 5-10％(w/v)和Nacl 20～50mmol/L，溶剂是无菌水。洗液W3是75-80％(v/v)的乙醇。磁珠混液是磁珠0.25-2ng/ml和75-80％(v/v)的乙醇；洗脱液lowTE：Tris-HCl 10-30mmol/L、EDTA 1-5mmol/L。蛋白酶K浓度为20mg/mL。

异硫氰酸胍和SDS是变性剂，通过变性蛋白裂解细胞、蛋白质、多糖等。Tris-HCl溶液提供了保持核酸结构稳定的环境。EDTA作为核酸酶抑制剂，可以螯合溶液中Mg²⁺、Ca²⁺等二价金属离子。Triton X-100和Tween 20是一种非离子型表面活性剂，其能够溶解细胞内的脂质，增加细胞膜的通透性，有助于核酸的释放。PEG 400可以有效促进磁珠结合核酸，在加热条件下PEG 400不会挥发。本发明裂解结合液，既能裂解细胞，又能为核酸与磁珠的结合提供合适的环境，减少了操作步骤和提高核酸提取的质量。

为了本试剂盒可以同时满足唾液、全血、口拭子等样本，本试剂盒的洗液W1使用高浓度的盐酸胍，盐酸胍可以进一步裂解磁珠-核酸复合物中的蛋白质、多糖等，保证唾液样本的粘多糖等杂质的降解，减少唾液样本DNA对下游实验的抑制。洗液W2中可以进一步洗去上游的各种杂质包括盐酸胍等盐类，同样减少无机盐对下游实验的抑制。

本发明提供的核酸提取样本有唾液、全血、口拭子，其包括以下步骤：

1)将1个试剂盒内含有的6个深孔板分别进行预分装处理，将经过预分装处理后的深孔板颠倒混匀后瞬时离心10s，小心撕开深孔板封膜，并在第1板(预分装裂解结合液LB)孔中依次加入待测样本和蛋白酶K；

2)在核酸提取仪上设置提取程序，然后进行核酸的全自动提取；

3)提取程序运行完成后，取出6个深孔板，第6板深孔板中的溶液即为核酸溶液。

本发明还提供预分装孔板模式的试剂盒在核酸自动提取仪如天根TGuide S96程序。

磁棒转到第4板磁珠混液内，吸附磁珠；

带有磁珠的磁棒转到第1板裂解结合液LB，在裂解结合液LB作用下，细胞、蛋白等杂质裂解，释放核酸，在缓冲液的作用下核酸结合到磁珠上，磁棒下降吸附磁珠。

带有核酸的磁珠在磁棒的作用下转到第2板洗液W1内，在洗液W1的作用下洗去核酸上的蛋白质、多糖等杂质；

带有核酸的磁珠在磁棒的作用下转到第3板洗液W2内，在洗液W2的作用下洗去核酸上多余的糖类、盐类等杂质；

带有核酸的磁珠在磁棒的作用下转到第4块板内，在75-80％乙醇的作用下洗去核酸上面的杂质；

带有核酸的磁珠在磁棒的作用下转到第5板洗液W3内，继续在洗液W3的作用下洗去核酸上面的杂质；

带有核酸的磁珠在磁棒的作用下转到第6列洗脱液lowTE上方，干燥5min，挥发残留的乙醇，然后进入到第6板内，洗脱核酸；

洗脱结束后，磁珠在磁棒的吸附下转到第4板内，将磁珠丢弃，从而达到核酸分离。

本发明将裂解液和结合液真正意义上统一，裂解和结合同时进行，大大提高了工作效率，提高了核酸提取的浓度，且保证了核酸纯化的纯度。整个试剂盒中不含任何有毒物质，保证了操作人员的安全。

由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：

(1)不使用任何毒性试剂，保证了操作者的生命安全；

(2)提取效率高：无需任何预处理，样本直接裂解并结合上磁珠，一次性可以处理96个样本，整个过程在40min内完成，增强了工作效率，经济高效；

(3)自动化高：自动化程度高，减少了人为失误和误差；

(4)提取的DNA浓度和纯度高，提高了下游实验的工作效率。

附图说明

图1为全血样本提取后的DNA凝胶电泳图；

图2为唾液样本提取后的DNA凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。

实施例1：一种全血核酸DNA提取试剂盒的配制方法及应用

1.试剂：

裂解结合液：异硫氰酸胍2mol/L、SDS 0.5％(w/v)、Tris-HCl 20mmol/L、EDTA10mmol/L、Nacl 50mmol/L、Triton X-100 1％(v/v)、Tween 20 0.5％(v/v)和PEG 40020％(v/v)，溶剂是无菌水。

洗液W1的组分是盐酸胍3.5mol/L、Triton X-100 0.5％(v/v)、乙醇50％(v/v)，溶剂是无菌水。

洗液W2是PEG 6000 5％(w/v)和Nacl 20mmol/L，溶剂是无菌水。

洗液W3是75％乙醇(v/v)。

磁珠混液是磁珠1ng/ml和75％乙醇(v/v)。

洗脱液lowTE：Tris-HCl 20mmol/L、EDTA 1mmol/L。

蛋白酶K浓度为20mg/mL。

2.试剂预分装组成：

分装：按照表1所示，在第1板试剂盒96深孔板预分装裂解结合液LB，在第2板试剂盒96深孔板预分装洗液W1，在第3板试剂盒96深孔板预分装洗液W2，在第4板试剂盒96深孔板预分装磁珠混液，在第5板试剂盒96深孔板预分装洗液W3，在第6板试剂盒96深孔板预分装Low TE。

封膜：在热封仪上，利用热封仪将96孔板封住。

表1试剂盒中预分装试剂组成

组成	名称	板型/体积(ml)	每孔试剂量
				第1板	裂解结合液LB	深孔板/2.2	600ul
第2板	洗液W1	深孔板/2.2	600ul
				第3板	洗液W2	深孔板/2.2	600ul
第4板	磁珠混液	深孔板2.2	600ul
				第5板	洗液W3	深孔板2.2	600ul
第6板	Low TE	深孔板/1.0	100ul

3.实验步骤

1)取出6个预分装96深孔板，颠倒混匀数次使磁珠重悬，去掉包装，轻甩96深孔板使试剂及磁珠均集中到96深孔板底部(也可使用孔板离心机，500rpm离心1min)，使用前小心撕去铝箔封口膜，避免96深孔板振动，防止液体溅出。

2)在96深孔板的第1板中加入200μl抗凝全血样本和20μL蛋白酶K，将96深孔板(裂解结合液LB、洗液W1、洗液W2、洗液W3、磁珠混液、Low TE)放置于设备对应的位置；将磁棒套***96深孔板(磁珠混液)内；

3)运行对应的自动化提取程序；

表2自动化提取程序的反应条件

4)自动化提取程序结束后，第6板(Low TE)的溶液即为核酸溶液。

实施例2：一种口腔细胞核酸DNA提取试剂盒的配制方法及应用

1.试剂：按照实施例1进行配制。

2.试剂预分装组成：

分装：按照表3所示，在第1板试剂盒96深孔板预分装裂解结合液LB，在第2板试剂盒96深孔板预分装洗液W1，在第3板试剂盒96深孔板预分装洗液W2，在第4板试剂盒96深孔板预分装磁珠混液，在第5板试剂盒96深孔板预分装洗液W3，在第6板试剂盒96深孔板预分装Low TE。

封膜：在热封仪上，利用热封仪将96孔板封住。

表3试剂盒中预分装试剂组成

组成	名称	板型/体积(ml)	每孔试剂量
				第1板	裂解结合液LB	深孔板/2.2	450ul
第2板	洗液W1	深孔板/2.2	600ul
				第3板	洗液W2	深孔板/2.2	600ul
第4板	磁珠混液	深孔板/2.2	600ul
				第5板	洗液W3	深孔板/2.2	600ul
第6板	Low TE	深孔板/1.0	80ul

3.实验步骤

2)在96深孔板的第1板中加入450μl口腔细胞样本和20μL蛋白酶K，将96深孔板(裂解结合液LB、洗液W1、洗液W2、洗液W3、磁珠混液、Low TE)放置于设备对应的位置；将磁棒套***96深孔板(磁珠混液)内；

3)运行对应的自动化提取程序，按照实施例1中的表2；

自动化提取程序结束后，第6板(Low TE)的溶液即为核酸溶液。

实施例3：两种试剂盒对全血DNA抽提的比较

以8支EDTA抗凝全血为样本，分别用本发明试剂盒和对照试剂盒-GNT^TM血液基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)进行核酸提取。本发明试剂盒是按照实施例1的步骤以及反应条件进行提取核酸，GNT^TM血液基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)是按照试剂盒的使用说明书的步骤进行提取核酸。

1)将本发明试剂盒和对照试剂盒提取的核酸进行Qubit定量，得到DNA浓度，结果如表4所示。本发明试剂盒抽提产物浓度明显高于对照试剂盒。

表4本发明试剂盒和对照试剂盒提取的核酸进行Qubit定量检测表(ng/μl)

序号	本发明试剂盒提取后的核酸浓度	对照试剂提取后的核酸浓度
			T1	42.2	33.3
T2	62.6	60.1
			T3	53.1	51.7
T4	84.6	77.3
			T5	48.1	36.6
T6	62.3	53.7
			T7	74.9	54.2
T8	71.2	69.5

2)用超微量分光光度计检测OD₂₆₀/OD₂₈₀和D₂₆₀/OD₂₃₀值，其中1-8是本发明试剂盒抽提全血产物，9-16是对照试剂盒抽提产物，检测数据如表5。本发明试剂盒提取得到的DNA产物，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.7-2.0，OD₂₆₀/OD₂₃₀在1.7-2.0；对照试剂盒提取得到的DNA产物，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.5-2.0，OD₂₆₀/OD₂₃₀在1.0-2.0。本发明试剂盒抽提核酸产物纯度明显高于对照试剂盒。

表5用超微量分光光度计检测OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀值

序号	OD<sub>260</sub>/OD<sub>280</sub>	OD<sub>260</sub>/OD<sub>250</sub>	序号	OD<sub>260</sub>/OD<sub>280</sub>	OD<sub>260</sub>/OD<sub>250</sub>
						1	1.82	1.92	9	1.65	1.28
2	1.84	1.72	10	1.73	1.63
						3	1.79	1.72	11	1.50	1.16
4	1.85	1.96	12	1.69	1.10
						5	1.87	1.92	13	1.52	1.27
6	1.84	1.91	14	1.60	1.15
						7	1.82	1.87	15	1.58	1.28
8	1.78	1.92	16	1.51	1.21

3)凝胶电泳成像

图1为上述实验结果的电泳凝胶成像图，1-8是本发明试剂盒抽提产物，9-16是对照试剂盒抽提产物，条带清晰明亮，无明显降解。

实施例4：唾液样本进行核酸提取

取10支唾液样本(唾液收集管为南京申友生物科技公司的唾液保存管)，上下颠倒数次混合均匀。分别用本发明试剂盒和对照试剂盒-GNT^TM唾液DNA提取试剂盒(磁珠法)进行核酸提取。本发明试剂盒是按照实施例2的步骤以及反应条件进行提取核酸，GNT^TM唾液DNA提取试剂盒(磁珠法)是按照该试剂盒的使用说明书的步骤进行提取核酸。

1)本发明试剂盒以及对照试剂盒提取的核酸进行Qubit定量检测，得到核酸浓度，结果如表6表示。本发明试剂盒抽提产物浓度更高。

表6本发明试剂盒以及对照试剂盒提取的核酸进行Qubit定量检测表(ng/μl)

样本序号	本发明试剂盒抽提浓度	对照试剂盒抽提浓度
			T1	47.2	33.1
T2	50	33.5
			T3	37	22.6
T4	28.4	22.0
			T5	23.8	11.7
T6	30.28	24.1
			T7	16.21	11.1
T8	23.61	21.7
			T9	18.31	15.3
T10	45.2	30.2

2)用超微量分光光度计检测OD₂₆₀/0D₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀值，检测数据如表7表示，其中1-10是本发明试剂盒抽提产物，11-20是对照试剂盒抽提产物。本发明试剂盒抽提唾液样本得到的DNA产物，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.0，OD₂₆₀/OD₂₃₀在1.7-2.0。对照试剂盒抽提得到的DNA产物，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6-2.0，OD₂₆₀/OD₂₃₀在1.5-2.2。本发明试剂盒抽提产物纯度更高。

表7用超微量分光光度计检测OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀值

取基因组DNA溶液3μl用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测，其中1-10是本发明试剂盒抽提产物，11-20是对照试剂盒抽提产物,结果如图2表示，条带清晰明亮。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，其特征在于，步骤如下：

1)将1个试剂盒内含有的6个深孔板分别进行预分装处理，将经过预分装处理后的深孔板颠倒混匀、离心后，撕开深孔板的封膜，并在预分装裂解结合液LB的深孔板孔中依次加入待测样本和蛋白酶K；

2)通过核酸提取仪进行核酸的提取；

3)核酸提取程序完毕后，取出6个深孔板，第6板深孔板中的溶液即为核酸溶液。

2.根据权利要求1所述的一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，其特征在于，所述步骤(1)中6个试剂盒进行预分装处理的步骤如下：

(a)在第一个深孔板内装入裂解结合液LB；

(b)在第二个深孔板内装入洗液W1；

(c)在第三个深孔板内装入洗液W2；

(d)在第四个深孔板内装入磁珠混液；

(e)在第五个深孔板内装入洗液W3；

(f)在第六个深孔板内装入洗脱液lowTE。

3.根据权利要求2所述的一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，其特征在于，所述步骤(a)中裂解结合液LB包括以下组分：异硫氰酸胍2～5mol/L、SDS 0.5～1％(w/v)、Tris-HCl20～50mmol/L、EDTA 5～10mmol/L、Nacl 20～50mmol/L、Triton X-100 0.2～1.5％(v/v)、Tween 20 0.2～1.0％(v/v)和PEG 400 5～30％(v/v)，其余为溶剂。

4.根据权利要求2所述的一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，其特征在于，所述步骤(b)中洗液W1包括以下组分：盐酸胍2～4mol/L、Triton X-100 0.2～0.5％(v/v)、乙醇30～50％(v/v)，其余为溶剂。

5.根据权利要求2所述的一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，其特征在于，所述步骤(c)中洗液W2包括以下组分：PEG 6000 5～10％(w/v)和Nacl 20～50mmol/L，其余为溶剂。

6.根据权利要求3或4或5所述的一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，其特征在于：所述溶剂为无菌水。

7.根据权利要求2所述的一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，其特征在于：所述步骤(e)中洗液W3为75-80％(v/v)的乙醇。

8.根据权利要求2所述的一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，其特征在于：所述步骤(d)中磁珠混液包括以下组分：磁珠0.25-2ng/ml、75-80％(v/v)的乙醇。

9.根据权利要求2所述的一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，其特征在于：所述步骤(f)中洗脱液lowTE包括以下组分：Tris-HCl 10-30mmol/L、EDTA 1-5mmol/L。

10.根据权利要求1所述的一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺，其特征在于：所述每个深孔板均设有96个孔。