CN107223163A - 用于膀胱癌症的治疗，诊断和预后方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供为了癌症(例如膀胱癌)的治疗，诊断，及提供预后而检测一种或多种生物标志物(包括FGFR3，TP53，和/或EGFR)的表达的方法和组合物。本发明还提供供该方法中使用的试剂盒和制品。

Description

用于膀胱癌症的治疗，诊断和预后方法
发明领域
本发明涉及用于癌症(例如膀胱癌)的治疗，诊断和提供预后的方法。
发明背景
癌症仍然是人类健康的最致命威胁之一。在美国，癌症侵袭每年接近130万例新患者，而且是位于心脏病之后的第二位首要死亡原因，大约占4例死亡中的1例。实体瘤对大多数那些死亡负有责任。恶性肿瘤以不受控制的方式快速生长并转移，使得及时检测和治疗极其困难。
膀胱癌是全世界第五位最常见的恶性，每年报告接近400,000例新诊断病例和大约150,000例相关死亡。大约75-80％的膀胱癌患者在初始诊断时存在非肌肉侵入性膀胱癌(NMIBC)。虽然局限于固有层(lamina propria)且通常不是危及生命的，但是大约50-80％的NMIBC复发，常常需要昂贵的临床干预。NMIBC在约20-30％的情况中会进展至更加严重的肌肉侵入性膀胱癌(MIBC)。MIBC(T2和T3)仅仅构成约10-15％的新病例，但是它们赋予更高的风险发生转移性膀胱癌(pT4)。转移性膀胱癌与凄凉的5年存活可能性有关，而且代表一项至今只有少数有效疗法的未满足的重大医学需要。
因此，仍然需要用于癌症(例如膀胱癌)的治疗，诊断，和提供预后的有效手段。
发明概述
本发明涉及用于癌症(例如膀胱癌)的治疗，诊断，和提供预后的方法。
一方面，本发明特征在于一种治疗罹患膀胱癌的患者的方法，该方法包括对该患者施用治疗有效量的抗癌疗法，其中自该患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平已经测定为相对于该至少一种基因的参照水平升高：FGFR3，TP53，和EGFR。
另一方面，本发明特征在于一种用于诊断患者中的膀胱癌的方法，该方法包括下述步骤：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和EGFR；并(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平的升高鉴定具有膀胱癌的患者。在一些实施方案中，该方法进一步包括(c)告知该患者他们具有膀胱癌。在一些实施方案中，该方法进一步包括(d)当检测到该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平的升高时，为了所述患者的治疗选择抗癌疗法。在一些实施方案中，该方法进一步包括(e)对该患者施用治疗有效量的抗癌疗法。
另一方面，本发明特征在于一种用于罹患膀胱癌的患者的预后的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和EGFR；(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平；并(c)为该患者确定预后，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平升高指示较差的预后。在一些实施方案中，该预后是存活的预后。在一些实施方案中，在对该患者施用抗癌疗法之前进行该方法。在一些实施方案中，该方法进一步包括(d)当确定该患者具有较差的存活预后时，将该患者鉴定为很有可能受益于抗癌疗法的施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括(e)如果确定该患者具有较差的存活预后的话，对该患者施用治疗有效量的抗癌疗法。在一些实施方案中，该存活是无疾病存活或总体存活。
另一方面，本发明特征在于一种确定具有膀胱癌的患者是否很有可能响应抗癌疗法的治疗的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品至少一种下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和EGFR；并(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平的升高鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。在一些实施方案中，该方法进一步包括(c)对该患者施用治疗有效量的抗癌疗法。
另一方面，本发明特征在于一种为具有膀胱癌的患者优化抗癌疗法的治疗功效的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和EGFR；并(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平的升高鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。在一些实施方案中，该方法进一步包括(c)对该患者施用治疗有效量的抗癌疗法。
另一方面，本发明特征在于一种治疗罹患膀胱癌的患者的方法，该方法包括对该患者施用治疗有效量的除卡介苗(BCG)疫苗以外的抗癌疗法，其中自该患者获得的样品中TP53的表达水平已经测定为相对于TP53的参照水平升高。
在上述方面任一的一些实施方案中，该抗癌疗法包含FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，和/或EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，该抗癌疗法包含FGFR3拮抗剂和EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，该FGFR3拮抗剂，EGFR拮抗剂，或TP53拮抗剂是抗体或其功能性片段。在一些实施方案中，该FGFR3拮抗剂是抗FGFR3抗体，或其功能性片段。在一些实施方案中，该EGFR拮抗剂是抗EGFR抗体，或其功能性片段。在一些实施方案中，该TP53拮抗剂是抗TP53抗体，或其功能性片段。在一些实施方案中，该FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，或EGFR拮抗剂是小分子拮抗剂。在一些实施方案中，该FGFR3拮抗剂或EGFR拮抗剂是酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，该EGFR拮抗剂是厄洛替尼(erlotinib)(TARCEVATM)。在一些实施方案中，该抗癌疗法进一步包含(i)选自下组的药剂：抗肿瘤剂，化疗剂，生长抑制剂，和细胞毒剂，(ii)放疗，或(iii)其组合。
在上述方面任一的一些实施方案中，通过测量mRNA来测定自该患者获得的样品中该至少一种基因的表达水平。在一些实施方案中，通过聚合酶链式反应(PCR)测定法测定自该患者获得的样品中该至少一种基因的表达水平。在一些实施方案中，该PCR测定法是定量PCR测定法。
在上述方面任一的一些实施方案中，通过测量蛋白质来测定自该患者获得的样品中该至少一种基因的表达水平。在一些实施方案中，通过免疫组织化学(IHC)方法测定自该患者获得的样品中该至少一种基因的表达水平。
在上述方面任一的一些实施方案中，自该患者获得的样品是肿瘤样品。在一些实施方案中，该肿瘤样品是***固定-石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品。
在上述方面任一的一些实施方案中，该方法进一步包括测定至少两种该基因的表达水平。在一些实施方案中，该方法进一步包括测定所有三种该基因的表达水平。
在上述方面任一的一些实施方案中，FGFR3的表达水平已经测定为相对于参照水平升高至少2倍。在一些实施方案中，FGFR3的表达水平已经测定为相对于参照水平升高至少4倍。
在上述方面任一的一些实施方案中，EGFR的表达水平已经测定为相对于参照水平升高至少4倍。在一些实施方案中，EGFR的表达水平已经测定为相对于参照水平升高至少8倍。
在上述方面任一的一些实施方案中，该方法进一步包括测定自该患者获得的样品中至少一种选自下组的另外的基因的表达水平：DUSB3，FRS2，TSC1，ERBB3，CDKN1A，CCND1，TP63，MMP2，ZEB2，PIK3CB，PIK3R1，MDM2，SNAI2，AXL，ZEB1，BCL2B，TSC2，RB1，FGFR32，PIK3IP1，MTOR，PIK3CA，PTEN，AKT1，BCL2A，FRS3，ERBB2，FGFR31，FGF1，SNAI1，FGFR34，FGF9，和FGF2，其中该至少一种另外的基因的表达水平相对于该至少一种另外的基因的参照水平有变化。
在上述方面任一的一些实施方案中，该膀胱癌是非肌肉侵入性膀胱癌，肌肉侵入性膀胱癌，或转移性膀胱癌。在一些实施方案中，该非肌肉侵入性膀胱癌是复发性非肌肉侵入性膀胱癌。
附图简述
图1是显示关于实施例部分(例如实施例1-6)中分析的膀胱癌肿瘤标本的患者和临床病理学特征的信息的表。
图2A和2B是显示来自et al.Clin.Cancer Res.18(12):3377-3386,2012(图2A)的18,000种基因的表达的主成分分析(PCA)和仅使用与实施例部分中描述的定制膀胱癌Fluidigm基因表达小组重叠的82种基因(见例如表1)(图2B)的图。两项分析均显示属于等，见上文描述的膀胱癌亚型的样品的相似分布。
图2C和2D是显示用基于质心的分类器进行的交叉验证导致基于1,000种基因(图2C)和基于与定制膀胱癌Fluidigm基因表达小组重叠的82种基因(图2D)的等，见上文的膀胱癌亚型的相似分类精确性的图。图2A-2D中呈现的数据显示定制膀胱癌Fluidigm基因表达小组能将膀胱癌精确分类至分子限定亚型。线标记是为了清楚，办法指示数据点。
图3A和3B是显示Fluidigm测定法性能不受RNA输入量影响的图，如对于FGFR3(图3A)和对于PIK3CA(图3B)所显示的，具有递减输入量的通用RNA(uRNA)对照。
图3C和3D是显示定制膀胱癌Fluidigm基因表达小组的运行间数据再现性对于临床组织而言是高的图。图3C(HP-52719)和图3D(HP-50331)显示在不同天的运行之间均显示R2值＞0.98的两份代表性***固定石蜡包埋(FFPE)衍生RNA样品。
图3E是显示定制膀胱癌Fluidigm基因表达小组的高芯片间数据再现性的图。
图4A是来自Fluidigm分析(组织)和多组共调节基因(基因)的转录限定组织簇的热图。绿色，黄色，和红色组织组包含了大多数样品。
图4B是显示绿色，黄色，和红色组织簇(见例如图4A)与独特无疾病存活(DFS)可能性相关的图。红色组样品具有最好的DFS概况(红色对黄色：HR＝0.54，P＝0.03)，而绿色组样品与最差的DFS可能性相关(红色对绿色：HR＝0.29，P＝0.004)。
图4C是显示非侵入性和侵入性/转移组织学调用的图，指示绿色和红色组包括比黄色组显著更高频率的非侵入性样品，黄色组包括大部分侵入性组织和所有转移(绿色对红色：P＝0.1029，非显著的(NS)；绿色对黄色和红色对黄色：两项比较均为P<0.0001)。
图4D是显示三个主要组织簇中具有微***状组织学的肿瘤的频率的图。在黄色组中观察到更高频率的微***状组织学(绿色对红色：P＝0.2351，NS；绿色对黄色：P＝0.1167，NS；红色对黄色：P＝0.0063)。
图4E是显示绿色，红色，和黄色组之间就免疫浸润阳性样品的流行度而言无显著差异的图(绿色对红色：P＝0.3332，NS；绿色对黄色：P＝0.5197，NS；红色对黄色：P＝1，NS)。
图4F是显示三个组的治疗频率分布的图。绿色组比红色和黄色组得到更加猛烈的治疗(两项比较均为P<0.0001)，而红色和黄色组以相当的比率得到治疗(P＝0.8836，NS)。治疗包括卡介苗(BCG)疫苗，化疗，辐射，或其组合。
图5A是显示通过实施例2中描述的定制膀胱癌Fluidigm基因表达小组的表达分析鉴定出由绿色，黄色和红色组代表的3个主要组织子集以及由蓝色和紫色组代表的2个次要亚型的热图。
图5B是显示通过实施例2中描述的定制膀胱癌Fluidigm基因表达小组的表达分析鉴定出与不同生物学相关的4个主要基因表达簇的热图。箭指向每个簇的代表性基因，包括TP53和FGFR3(粉色簇I)；上皮-间充质转变(EMT)基因，像ZEB1/2和磷酸肌醇3激酶(PI3K)基因，诸如PIK3CA和PIK3R1(浅蓝色簇II)；其它PI3K基因，诸如PTEN和AKT1(洋红色簇III)；和成纤维细胞生长因子(FGF)配体和受体(浅褐色簇IV)。
图5C是显示图5A中描述的组织亚型与独特的无疾病存活(DFS)可能性相关的图。线条标记是为了清楚而非指示数据点。
图6A-6D是显示(图6A)非肌肉侵入性膀胱癌；(图6B)肌肉侵入性膀胱癌；(图6C)淋巴样浸润阳性组织；和(图6D)具有微***状组织学的***的组织学特征的代表性的苏木精&曙红(H&E)染色切片。比例尺指示100μm。
图7A是关于绿色，红色，和黄色组中的标本显示FGFR3突变状态，FGFR3免疫组织化学(IHC)，和组织病理学调用的彩图。
图7B是显示如通过Fluidigm基因表达分析测定的，突变体(MT)中FGFR3转录物水平与野生型(WT)样品相比更高(P<0.0001)的图。
图7C是显示如通过IHC测定的，FGFR3突变体样品表达比野生型组织更高的蛋白质水平(P<0.0001)的图。
图7D是显示绿色组中的FGFR3突变率与红色组和侵入性/转移性黄色组相比显著更高的图(两项比较均为P<0.0001)。
图7E是显示绿色组中的样品表达比红色组和黄色组中的样品显著更高的FGFR3转录物水平的图(两项比较均为P<0.0001)。
图7F是显示通过IHC测定的FGFR3蛋白质水平在绿色组中比红色组中更高，而且在黄色组中最低的图(绿色对红色：P＝0.0343；红色对黄色：P<0.0001)。
图7G是显示非侵入性，侵入性，和膀胱癌转移中FGFR3表达的一系列饼分图。分别在66％，32％，和33％的病例中观察到高蛋白质水平的FGFR3(IHC 2+/3+)。
图7H是显示具有高和低FGFR3侵入性肿瘤和膀胱癌转移的患者的3年或5年DFS比率的一系列图，证明在两种背景中高表达肿瘤中的更低DFS比率(表达截留＝第50百分位)。
图7I是显示FGFR3高表达病例的3年和5年总体存活(OS)的比率比FGFR3低表达病例更低的一系列图(表达截留＝第25百分位；高FGFR3，N＝15；低FGFR3，N＝24)。
图7J显示来自Kim et al.Mol.Cancer 9:3，2010的公众可得数据集的分析，通过Kaplan-Meier图(左小图)及通过3年和5年OS比率(右小图)二者指示具有表达高(“hi”)水平FGFR3的高级膀胱癌的患者具有比表达低(“lo”)水平FGFR3的高级膀胱癌的患者显著更差的OS概况(表达截留＝第75百分位；高FGFR3，N＝10；低FGFR3，N＝52)。
图8是显示软件(Qiagen，Redwood City，CA)分析将p53，PI3K-AKT，EMT，和ERBB及FGFR3途径鉴定为在非侵入性快速复发绿色组和较少攻击性红色组之间差异表达的图。将在绿色和红色组之间显著差异表达的45/96种基因(P<0.05，经多重检验校正)作为输入用于分析。
图9A是来自绿色，黄色，和红色组的样品中下一代测序(NGS)结果和通过Fluidigm分析(MutMap；参见Schleifman et al.PloS One 9:e90761,2014)测定的突变状态的彩图。经验证的突变是那些通过NGS和MutMap二者鉴定的。
图9B是TP53基因的示意图(棒棒糖图)，显示绿色，红色，和黄色组的样品中通过NGS鉴定的TP53突变。着色的框表示组织组指派。具有相似编号的框指向在相同样品中共检测到的突变。大多数突变在DNA结合域中聚簇且是非重叠的。
图9C是显示快速复发绿色组中存在与更加良性的红色组相比显著更高比率的TP53突变的图(P＝0.03)。TP53突变频率在红色和黄色或者绿色和黄色组之间没有显著差异(P＝0.1227，NS；和P＝0.3605，NS)。
图9D是显示与红色组和黄色组二者相比绿色组中TP53表达水平更高的图，如通过Fluidigm基因表达分析测定的(分别为P＝0.0187和P＝0.0020)。
图9E是显示与红色组和黄色组二者相比绿色组中TP53转录靶p21的表达水平显著更高的图(两项比较均为P<0.0001)，如通过Fluidigm基因表达分析测定的。
图9F是显示突变体TP53样品表达比野生型病例更高水平的TP53蛋白质的图(P＝0.0201)，如通过IHC测定的。
图9G是显示来自实施例1中描述的全部膀胱癌分组的TP53高和TP53低病例的相似DFS概况的Kaplan-Meier图(全部肿瘤阶段；P＝0.4218；TP53高N＝53；TP53低N＝73)。Hi，高；Lo，低。
图9H是显示非侵入性肿瘤中高TP53表达与朝向更差的DFS概率的趋势相关的Kaplan-Meier图(HR＝1.99；P＝0.1292)。
图9I是显示非侵入性肿瘤背景中高TP53表达与BCG治疗患者中显著更差的DFS可能性相联系的Kaplan-Meier图(HR＝4.2；P＝0.0405)。
图9J是显示非侵入性肿瘤中的高TP53表达与未接受治疗的患者的较差DFS可能性不相关的Kaplan-Meier图(HR＝0.57；P＝0.5749)。
图10是膀胱癌标本的一个子集中ERBB途径配体和受体表达的Fluidigm分析，以及相同样品中关键途径中的重叠突变和拷贝数改变的彩图。在定制Fluidigm小组上进行ERBB受体和配体的表达分析，突变分析，和拷贝数分析(Schleifman et al.PloS One 9:e90761,2014)。关于Fluidigm突变分析：深灰色条，突变体；中灰色条，由于技术原因无调用；白色条，不适用；浅灰色条，野生型。关于Fluidigm DNA拷贝数分析：深灰色条，DNA拷贝数增益；中灰色条，由于技术原因无调用；浅灰色条，无DNA拷贝数变化；白色条，不适用。
图11A是显示EGFR在绿色组中以与红色组和黄色组二者相比显著更高水平表达的图，如通过Fluidigm测定的(分别为P＝0.012和P＝0.0012)。
图11B是显示在非侵入性膀胱癌肿瘤中高EGFR表达水平与降低的3年和5年DFS比率相关的图(表达截留＝第25百分位；高EGFR，N＝22；低EGFR，N＝66)。
图11C是显示对于具有膀胱癌转移的患者，高EGFR表达水平与降低的DFS比率相关的图(表达截留＝第25百分位；高EGFR，N＝6；低EGFR，N＝4)。
图11D是显示在具有膀胱癌转移的患者中，高EGFR表达水平与更低的3年和5年OS比率相关的图(表达截留＝第50百分位；高EGFR，N＝3；低EGFR，N＝7)。
图11E是显示来自et al.Clin.Cancer Res.18(12):3377-3386,2012的独立数据集的分析的图。该图显示高EGFR表达与更差的3年和5年OS频率相关(表达截留＝第50百分位；高EGFR，N＝23；低EGFR，N＝28)。
图11F是显示来自Kim et al.Mol.Cancer 9:3,2010的独立数据集的分析的图。该图显示高EGFR表达与更低的3年和5年OS比率相关(表达截留＝第25百分位；高EGFR，N＝48；低EGFR，N＝14)。
图11G是显示用EGFR抑制剂厄洛替尼(TARCEVATM)处理膀胱癌细胞系鉴定了响应处理展现＞25％生长抑制(GI)的三种敏感性细胞系(UMUC5，UMUC10，和UMUC17)，和展示<25％GI的四种抗性细胞系(RT112，UMUC3，SW780，和BFTC905)的图。
图11H是显示EGFR在对厄洛替尼(TARCEVATM)敏感(＞25％GI)的膀胱癌细胞系中以比在响应治疗展现微小GI的细胞系中显著更高的水平表达的图(P＝0.0106)。
图12A是显示构成实施例1(例如表1)中描述的定制膀胱癌Fluidigm基因表达小组的基因的维恩图(Venn diagram)，该小组说明基于分析属于三个主要途径组的重叠和独特基因：(1)FGFR，RTK，MAPK，和PI3K途径；(2)发育和上皮-间充质转变(EMT)轴；和(3)TP53，基因组稳定性，和细胞周期调节网络。数目对应于每一部分中的独特基因的数目。
图12B是显示来自大项公共数据集的样品的无监督等级聚簇和相应的肿瘤等级，阶段，和分子类别的图，如等，见上文定义的。
图12C是显示基于与定制膀胱癌Fluidigm基因表达小组对应的探针相比递减数目的Illumina探针，关于来自等，见上文数据集的肿瘤的经交叉验证的误分类误差曲线的一系列图。每个图显示试图使用最近收缩质心分类器及全部基因的一个子集预测肿瘤等级，TNM阶段，或分子种类时造成的归类误差的量。沿着顶部x轴显示基因的数目，相应的“收缩因子”显示于底部x轴。
图12D是显示来自四个公共数据集的样品的无监督等级聚簇的一系列图，其基于来自与定制膀胱癌Fluidigm基因表达小组的基因对应的探针的信号及相应的已发表基底/管腔状态(Damrauer et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA111:3110-3115,2014)。
图13A是显示就递增通用RNA(uRNA)对照的输入量而言六个代表性测定法及它们的原始CT值的线性性能的一系列图。
图13B是显示对于存档FFPE组织的运行间数据再现性的一系列图，如对在不同天运行的两份代表性FFPE衍生RNA样品看到的。
图14A是显示来自公共数据集的基因和样品，以及来自实施例1和图1中描述的膀胱癌FFPE的组织分组的NMIBC，MIBC，和转移(MET)的无监督聚簇的结果的热图。白色块代表在各自数据集中未找到的基因。
图14B是显示从Damrauer等，见上文发现样品计算的膀胱癌小组基因的基底概况(红色条)和管腔概况(蓝色条)的图。对对数换算的表达值应用均值集中和单位方差标准化，并独立计算基底和管腔样品组的均值对数标准化表达水平以形成最终的概况。
图14C是显示用于计算来自公共数据的基底/管腔签名的方法学，然后将这些签名应用于膀胱小组数据以测量样品的基底/管腔相似性的示意图。
图15A显示基于膀胱癌小组基因表达及相应的B/L得分，组织学，和癌症相关基因的突变状态，204份FFPE样品(见实施例1和图1)的无监督等级聚簇(平均连锁，1-皮尔森相关距离度量)的结果。更多的细节见实施例6。
图15B-15E是显示来自图15A中的转录限定管腔和基底簇的样品中的B/L得分(图15B)，NMIBC，MIBC，和MET分布(图15C)，FGFR3突变的流行度(图15D)，和FGFR3IHC得分(图15E)的统计分析的图。
图15F显示基于图15A中在管腔和基底样品之间显著差异表达的基因的表达的途径活化得分。
图16A是显示原发性肿瘤中的B/L得分(X轴)和来自相同患者的匹配转移中的相应B/L得分(Y轴)之间的相关性图的图。点的颜色反映基于SNP基因分型与相同患者匹配的样品的显著性。Log10(p值)＝-4(P＝0.0001)，Log10(p值)＝-3(P＝0.001)，和Log10(p值)＝-2(P＝0.01)。虚线代表95％置信区间，超出其的转移和原发性样品B/L得分在0.05的p值是不同的。
图16B是显示原发性肿瘤(“pri”)，匹配转移(“met”)的B/L得分和关于匹配对中B/L状态中的分歧的相应p值的表。
图17A和17B是描绘分析结果的示意图，显示管腔样品中与基底样品中相比***受体的预测活化，其基于在FFPE组织中两个组之间显著差异表达的基因。
图18是使用下一代测序(NGS)AMPLISEQTM数据比较全部变异位点处的等位基因频率的皮尔森相关性矩阵，具有至少100x阅读覆盖率和＞10％的频率(平均而言，比较任两份样品之间的120个位点)。
发明详述
I.前言
本发明提供用于癌症(例如膀胱癌)的治疗，诊断，和预后方法和组合物。本发明基于如下的发现，即测定表1中所列至少一种基因(包括FGFR3，TP53，和/或EGFR)的表达水平(例如相对于参照样品有变化的表达水平)对于治疗罹患癌症的患者，诊断罹患癌症的患者，确定罹患癌症的患者的预后，确定具有癌症的患者是否很有可能响应抗癌疗法的治疗，和/或为具有癌症的患者优化抗癌疗法的治疗功效是有用的。在一些实施方案中，然后可以为该患者选择抗癌疗法，而且，进一步的，任选可以对该患者施用抗癌疗法。
II.定义
术语“表达水平”，“表达的水平”，或“水平”可互换使用，而且一般指生物学样品中多核苷酸(例如信使RNA(mRNA))或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因所编码的信息转换成细胞中存在的和运行的结构的过程。因此，依照本发明，基因的“表达”可以指转录成多核苷酸(例如mRNA)，翻译成多肽(例如蛋白质)，或甚至多肽的翻译后修饰。转录得到的多核苷酸的，翻译得到的多肽的，或翻译后修饰得到的多肽的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自蛋白质的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括那些转录成多核苷酸(像mRNA)，然后翻译成蛋白质的，还有那些转录成RNA但不翻译成蛋白质的(例如转运和核糖体RNA)。
术语“标志物”和“生物标志物”在本文中可互换使用，指基于DNA，RNA，蛋白质，碳水化合物，或糖脂的分子标志物，它们在受试者的或患者的样品中的表达或存在可通过标准方法(或本文中公开的方法)来检测，而且对于例如患者中的膀胱癌的诊断，罹患膀胱癌的患者的预后，具有膀胱癌的患者是否很有可能响应抗癌疗法治疗的确定，抗癌疗法在具有膀胱癌的患者中的治疗功效的优化，和/或涉及测定此类标志物的表达水平的治疗方法是有用的。此类生物标志物包括但不限于表1中所列基因。在一些实施方案中，该基因可以是FGFR3，TP53，和EGFR中的一项或多项。在一些实施方案中，该基因是FGFR3。在一些实施方案中，该基因是TP53。在一些实施方案中，该基因是EGFR。在其它实施方案中，该基因可以选自DUSB3，FRS2，TSC1，ERBB3，CDKN1A，CCND1，TP63，MMP2，ZEB2，PIK3CB，PIK3R1，MDM2，SNAI2，AXL，ZEB1，BCL2B，TSC2，RB1，FGFR32，PIK3IP1，MTOR，PIK3CA，PTEN，AKT1，BCL2A，FRS3，ERBB2，FGFR31，FGF1，SNAI1，FGFR34，FGF9，或FGF2。此类生物标志物的表达可以测定为自患者获得的样品中的比参照水平要高或低。具有大于或小于至少一种基因的参照表达水平的表达水平的个体可以鉴定为罹患膀胱癌的受试者/患者，具有特定预后(例如有利的或较差的预后)的患者，或很有可能响应抗癌疗法治疗的。
在某些实施方案中，术语“参照水平”在本文中指预定值。如技术人员会领会的，参照水平预先确定和设置为在例如特异性和/或灵敏度方面达到要求。这些要求可以变化，例如在不同管理机构之间。它可以是例如测定法灵敏度或特异性分别要设置成某些限制，例如80％，90％，95％或99％。这些要求也可以在阳性或阴性预测值方面限定。无论如何，基于本发明中给出的教导，总是会有可能到达达到那些要求的参照水平。在一个实施方案中，参照水平是在健康个体中确定的。在一个实施方案中，参照水平是在患者所属疾病实体中预先确定的(例如癌症类型，诸如膀胱癌，或膀胱癌的一个亚型)。在某些实施方案中，参照水平可以例如设置为调查的疾病实体中的值的总体分布的第20和第95百分位之间的任何百分位(例如第20，第25，第30，第35，第40，第45，第50，第55，第60，第65，第70，第75，第80，第85，第90，或第95百分位)。在特定实施方案中，参照水平设置为调查的疾病实体中的值的总体分布的第25百分位。在其它特定实施方案中，参照水平设置为调查的疾病实体中的值的总体分布的第50百分位。在其它实施方案中，参照水平可以例如设置为自给定群体中的或调查的疾病实体中的值的总体分布确定的中值，三分位，四分位或五分位。在其它实施方案中，参照水平可以例如设置为自给定群体中的或调查的疾病实体中的值的总体分布确定的中值。
在某些实施方案中，术语“升高”或“高于”指处于参照水平的水平或通过本文所述方法检测的，标志物(例如FGFR3，TP53，或EGFR)的水平与来自参照样品的水平相比5％，10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，100％，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，或更大的总体升高。
在某些实施方案中，术语“降低”或“低于”在本文中指低于参照水平的水平或通过本文所述方法检测的，标志物(例如FGFR3，TP53，或EGFR)的水平与来自参照样品的水平相比5％，10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更大的总体降低。
在某些实施方案中，术语“处于参照水平”指与参照样品中通过本文所述方法检测的标志物(例如FGFR3，TP53，和/或EGFR)水平相同的水平。
术语“诊断”在本文中用于指对分子或病理学状态，疾病或疾患(例如癌症，包括膀胱癌)的鉴定或分类。例如，“诊断”可以指特定癌症类型的鉴定。“诊断”还可以指特定癌症亚型的分类，例如通过组织病理学标准或分子特征(例如由一种或一组生物标志物(例如特定基因或由所述基因编码的蛋白质)的表达表征的亚型)。在一些实施方案中，癌症亚型可以是非肌肉侵入性膀胱癌(NMIBC；T0，T1)，肌肉侵入性膀胱癌(MIBC；T2，T3)或转移性膀胱癌。
患者对治疗或疗法(例如包含有效量的抗癌疗法(例如包含FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，和/或EGFR拮抗剂的抗癌疗法)的治疗)的“响应”或“响应性”指来自治疗或作为治疗的结果，给予处于癌症(例如膀胱癌)风险或具有癌症(例如膀胱癌)的患者的临床或治疗受益。此类受益可包括源自拮抗剂治疗或作为拮抗剂治疗的结果的细胞或生物学应答，完全响应，部分响应，稳定的病情(没有进展或复发)，或患者响应及稍后复发。技术人员会容易能够确定患者是否是响应性的。例如，就膀胱癌而言，响应可以通过膀胱癌受苦降低，诸如肿瘤生长降低和/或停止，肿瘤尺寸缩小，和/或膀胱癌的一种或多种症状(例如尿中的血(血尿)，排尿的变化，其它泌尿症状，背痛，或骨盆痛)减轻来反映。在一些实施方案中，响应可以通过癌症的转移性转变的指标或癌症的指标降低或减轻(例如阻止转移形成或转移数目或尺寸的减少/减小)来反映。例如，响应可以是诊断为表达相对于参照水平升高或降低水平的一种或多种表1中所列生物标志物(例如FGFR3，TP53，和EGFR)的患者中降低的肿瘤尺寸，无疾病存活，无进展存活，或总体存活。
术语“样品”和“生物学样品”可互换使用，指任何自个体获得的生物学样品，包括体液，身体组织(例如肿瘤组织)，细胞，或其它来源。体液是例如淋巴，血清，新鲜全血，外周血单个核细胞，冷冻的全血，血浆(包括新鲜的或冷冻的)，尿液，唾液，***，滑液和脊髓液。样品还包括***组织，肾组织，结肠组织，脑组织，肌肉组织，滑膜组织，皮肤，毛囊，骨髓，和肿瘤组织。用于自哺乳动物获得组织活检和体液的方法是本领域公知的。
“肿瘤样品”在本文中指自患者肿瘤衍生的或包含来自患者肿瘤的肿瘤细胞的样品。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检，循环中的肿瘤细胞，循环中的血浆蛋白质，腹水，衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如***固定的，石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
感兴趣多肽的“拮抗剂”(可互换称作“抑制剂”)是干扰感兴趣多肽的活化或功能，例如部分或完全阻断，抑制，或中和由感兴趣多肽介导的生物学活性的药剂。例如，多肽X的拮抗剂指部分或完全阻断，抑制，或中和由多肽X介导的生物学活性的任何分子。抑制剂的例子包括抗体；配体抗体；小分子拮抗剂；反义和抑制性RNA(例如shRNA)分子。优选地，抑制剂是结合感兴趣多肽的抗体或小分子。在一个特定实施方案中，抑制剂具有约1,000nM或更少的对感兴趣多肽的结合亲和力(解离常数)。在另一个实施方案中，抑制剂具有约100nM或更少的对感兴趣多肽的结合亲和力。在另一个实施方案中，抑制剂具有约50nM或更少的对感兴趣多肽的结合亲和力。在一个特定实施方案中，抑制剂共价结合至感兴趣多肽。在一个特定实施方案中，抑制剂以1,000nM或更少的半最大抑制浓度(IC50)抑制感兴趣多肽的信号传导。在另一个实施方案中，抑制剂以500nM或更少的IC50抑制感兴趣多肽的信号传导。在另一个实施方案中，抑制剂以50nM或更少的IC50抑制感兴趣多肽的信号传导。在某些实施方案中，拮抗剂将感兴趣多肽的表达水平或生物学活性降低或抑制至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％，或更多。在一些实施方案中，感兴趣多肽为FGFR3或FGFR3的配体。在一些实施方案中，感兴趣多肽为EGFR或FGFR3的配体。在一些实施方案中，感兴趣多肽为TP53。
除非另有说明，如本文中使用的，术语“多肽”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳类动物，诸如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然感兴趣多肽(例如蛋白质)。该术语涵盖“全长”，未加工多肽以及源自细胞中加工的任何形式的多肽。该术语还涵盖多肽的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。在一些实施方案中，该多肽为FGFR3。在其它实施方案中，该多肽为TP53。在其它实施方案中，该多肽为EGFR。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，经过修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶，或者通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。若存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物缀合。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如甲基膦酸酯，磷酸三酯，磷酰胺酯(phosphoamidate)，氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶，毒素，抗体，信号肽，聚L-赖氨酸等)的修饰，具有嵌入剂(例如吖啶，补骨脂素等)的修饰，含有螯合剂(例如金属，放射性金属，硼，氧化性金属等)的修饰，含有烷化剂的修饰，具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰，以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基基团可以用例如膦酸(phosphonate)基团，磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可缀合至固体或半固体支持物。可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代5’和3’末端OH。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸也可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2’-氧-甲基-，2’-氧-烯丙基-，2’-氟-或2’-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如***糖，木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))，P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))，(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))，P(O)R，P(O)OR’，CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R’各自独立为H或者取代或未取代的烃基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接，芳基，烯基，环烃基，环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“小分子”指具有约2000道尔顿或更小，优选约500道尔顿或更小的分子量的任何分子。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
术语“抗感兴趣多肽抗体”和“结合感兴趣多肽的抗体”指能够以足够亲和力结合感兴趣多肽，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向感兴趣多肽的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗感兴趣多肽抗体结合无关的，非感兴趣多肽的蛋白质的程度小于该抗体对感兴趣多肽的结合的约10％。在某些实施方案中，结合感兴趣多肽的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗感兴趣多肽抗体结合在来自不同物种的感兴趣多肽中保守的感兴趣多肽表位。在一些实施方案中，感兴趣多肽为FGFR3。在一些实施方案中，感兴趣多肽为EGFR。在一些实施方案中，感兴趣多肽为TP53。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体实质性或完全抑制抗原的生物学活性。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。“功能性片段”是维持全长抗体的功能的抗体片段。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有Fc区的重链的抗体。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体指包含来自非人高变区(HVR)的氨基酸残基和来自人框架区(FR)的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如互补决定区(CDR))对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。
如本文中使用的，除非另有说明，术语“成纤维细胞生长因子受体3”和“FGFR3”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然FGFR3。该术语涵盖“全长”，未加工的FGFR3以及FGFR3因细胞中的加工所致的任何形式。该术语还涵盖FGFR3的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。人FGFR3多肽的一种例示性野生型序列包含来自UniProt数据库的P22607-1或P22607-2的氨基酸序列。
如本文中使用的，术语“FGFR3拮抗剂”和“FGFR3抑制剂”指本领域当前已知的或将来会鉴定的任何FGFR3拮抗剂，而且包括在对患者施用时导致与患者中FGFR3活化有关的生物学活性(包括另外从FGFR3对其天然配体的结合得到的任何下游生物学效应)受抑制的任何化学实体。此类FGFR3拮抗剂包括能阻断FGFR3活化或FGFR3活化的任何下游生物学效应(与患者中的癌症治疗有关)的任何药剂。此类拮抗剂能通过直接结合受体的胞内域并抑制其激酶活性起作用。或者，此类拮抗剂能通过占据FGFR3受体的配体结合位点或其部分起作用，由此使得受体为其天然配体不可达的，从而阻止或降低其正常生物学活性。或者，此类拮抗剂能通过调控FGFR3多肽的二聚化，或FGFR3多肽与其它蛋白质的相互作用，或增强FGFR3的遍在蛋白化和胞吞降解起作用。FGFR3拮抗剂包括但不限于小分子抑制剂，抗体或抗体片段，反义构建体，小抑制RNA(即通过dsRNA的RNA干扰；RNAi)，和核酶。在一个优选的实施方案中，FGFR3拮抗剂是特异性结合人FGFR3的小分子或抗体。例示性FGFR3拮抗性抗体记载于例如美国专利No.8,410,250，通过援引将其完整收入本文。例如，美国专利No.8,410,250记载了FGFR3拮抗性抗体克隆184.6，184.6.1，和184.6.1N54S(这些克隆也称作“R3Mab”)。
术语“表皮生长因子受体(EGFR)”，“ErbB1”，“HER1”，和“EGFR激酶”在本文中可互换使用，而且指例如Carpenter et al.Ann.Rev.Biochem.56:881-914(1987)中披露的EGFR，包括其天然发生突变体形式(例如Humphrey et al.PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的删除突变体EGFR)。EGFR或ERBB1指编码EGFR蛋白质产物的基因。一种例示性人EGFR蛋白质的氨基酸序列可以见例如UniProt登录号P00533。
如本文中使用的，术语“EGFR拮抗剂”和“EGFR抑制剂”指本领域当前已知的或将来会鉴定的任何EGFR拮抗剂，而且包括在对患者施用时导致与患者中EGF受体活化有关的生物学活性(包括另外从EGF对其天然配体的结合得到的任何下游生物学效应)受抑制的任何化学实体。此类EGFR拮抗剂包括能阻断EGFR活化或EGFR活化的任何下游生物学效应(与患者中的癌症治疗有关)的任何药剂。此类拮抗剂能通过直接结合受体的胞内域并抑制其激酶活性起作用。或者，此类拮抗剂能通过占据EGF受体的配体结合位点或其部分起作用，由此使得受体为其天然配体不可达的，从而阻止或降低其正常生物学活性。或者，此类拮抗剂能通过调控EGFR多肽的二聚化，或EGFR多肽与其它蛋白质的相互作用，或增强EGFR的遍在蛋白化和胞吞降解起作用。EGFR拮抗剂包括但不限于小分子抑制剂，抗体或抗体片段，反义构建体，小抑制RNA(即通过dsRNA的RNA干扰；RNAi)，和核酶。在一个优选的实施方案中，EGFR拮抗剂是特异性结合人EGFR的小分子或抗体。
适合在本发明中使用的例示性EGFR拮抗剂包括例如小分子EGFR拮抗剂，包括喹唑啉EGFR激酶抑制剂，吡啶并嘧啶EGFR激酶抑制剂，嘧啶并嘧啶EGFR激酶抑制剂，吡咯并嘧啶EGFR激酶抑制剂，吡唑并嘧啶EGFR激酶抑制剂，苯基氨基-嘧啶EGFR激酶抑制剂，羟吲哚EGFR激酶抑制剂，吲哚并咔唑EGFR激酶抑制剂，酞嗪EGFR激酶抑制剂，异黄酮EGFR激酶抑制剂，quinalone EGFR激酶抑制剂，和tyrphostin EGFR激酶抑制剂，诸如下述专利公开文本中记载的那些，和EGFR激酶抑制剂的所有药学可接受的盐和溶剂合物：国际专利公开文本No.WO 96/33980，WO 96/30347，WO 97/30034，WO 97/30044，WO 97/38994，WO 97/49688，WO98/02434，WO 97/38983，WO 95/19774，WO 95/19970，WO 97/13771，WO 98/02437，WO 98/02438，WO 97/32881，WO 98/33798，WO 97/32880，WO 97/3288，WO 97/02266，WO 97/27199，WO 98/07726，WO 97/34895，WO 96/31510，WO 98/14449，WO 98/14450，WO 98/14451，WO95/09847，WO 97/19065，WO 98/17662，WO 99/35146，WO 99/35132，WO 99/07701，和WO 92/20642；欧洲专利申请No.EP 520722，EP 566226，EP 787772，EP 837063，和EP 682027；美国专利No.5,747,498，5,789,427，5,650,415，和5,656,643；和德国专利申请No.DE19629652。小分子EGFR拮抗剂的另外的非限制性例子包括Traxler,Exp.Opin.Ther.Patents 8(12):1599-1625(1998)中描述的任何EGFR激酶抑制剂。
能依照本发明使用的小分子EGFR拮抗剂的特定优选例子包括[6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(亦称为OSI-774，厄洛替尼，或TARCEVATM(厄洛替尼HCl)；OSI Pharmaceuticals/Genentech/Roche)(美国专利No.5,747,498；国际专利公开文本No.WO 01/34574，及Moyer et al.,Cancer Res.57:4838-4848(1997))；CI-1033(以前称作PD183805；Pfizer)(Sherwood et al.,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.40:723(1999))；PD-158780(Pfizer)；AG-1478(University of California)；CGP-59326(Novartis)；PKI-166(Novartis)；EKB-569(Wyeth)；GW-2016(也称作GW-572016或二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)；GSK)；和吉非替尼(也称作ZD1839或IRESSATM；Astrazeneca)(Woodburn et al.,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.38:633(1997))。能依照本发明使用的一种特定优选小分子EGFR激酶抑制剂是[6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(即厄洛替尼)，其盐酸盐(即盐酸厄洛替尼，TARCEVATM)，或其它盐形式(例如甲磺酸厄洛替尼)。
例示性EGFR拮抗性抗体包括Modjtahedi，et al.，Br.J.Cancer 67:247-253(1993)；Teramoto et al.，Cancer 77:639-645(1996)；Goldstein et al.，Clin.CancerRes.1:1311-1318(1995)；Huang，et al.，Cancer Res.15:59(8):1935-40(1999)；及Yanget al.，Cancer Res.59:1236-1243(1999)中描述的那些。如此，在一些实施方案中，EGFR拮抗性抗体可以是单克隆抗体Mab E7.6.3(Yang et al.Cancer Res.59:1236-43(1999))，或Mab C225(ATCC登录号HB-8508)，或具有其结合特异性的抗体或抗体片段。合适的单克隆EGFR拮抗性抗体包括但不限于IMC-C225(也称作西妥昔单抗或ERBITUXTM；ImcloneSystems)，ABX-EGF(Abgenix)，EMD 72000(Merck KgaA，Darmstadt)，RH3(York MedicalBioscience Inc.)，和MDX-447(Medarex/Merck KgaA)。
在本文中可互换使用的术语“TP53”，“细胞肿瘤抗原p53”，和“p53”指一种有力的肿瘤抑制蛋白，其编码一种393个氨基酸的磷蛋白。TP53在许多癌症中受到负调节或突变。TP53的缺失或失活可促成癌症。存在极其多种TP53突变。在一些情况中，癌症可过表达TP53，特别是突变型TP53。“野生型”TP53指在正常(即非癌性)细胞中找到的TP53或不具有与癌症有关的突变的TP53。样品的TP53状态(例如样品是否包括野生型或突变型TP53)可以如例如授予Vogelstein等人的美国专利No.6,090,566所述或使用标准技术(诸如本文中描述的或本领域已知的)来评估。TP53分子可包括但不限于含有与例如UniProt登录号P04637中所列序列实质性相同的序列的多肽和由那些序列编码的核酸分子。
“酪氨酸激酶抑制剂”指一定程度抑制酪氨酸激酶(诸如EGFR受体或FGFR3受体)的酪氨酸激酶活性的拮抗性分子。
“卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)疫苗”指用于在处于TB的高风险或TB常见的人中预防结核病(TB)的疫苗。它是自与引起TB的细菌相似的称作牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的细菌(卡介苗)的弱化形式制备的。疫苗可帮助身体的免疫***生成抗体来破坏TB细菌。它还可帮助免疫***来杀死癌细胞，而且用作例如膀胱癌的治疗。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症。“早期癌症”或“早期肿瘤”指非侵入性的或转移性的，或者归为0期，I期，或II期癌症的癌症。癌症的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤，母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和成视网膜细胞瘤)，肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)，神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤，胃泌素瘤，和岛细胞癌)，间皮瘤，施旺细胞瘤(包括听神经瘤)，脑脊膜瘤，腺癌，黑素瘤，和白血病或淋巴样恶性。此类癌症的更加特别的例子包括膀胱癌，鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌(SCLC)，非小细胞肺癌(NSCLC)，肺的腺癌和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃的癌或胃癌(包括胃肠癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，***，卵巢癌，肝癌，肝瘤，乳腺癌(包括转移性乳腺癌)，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌或肾的癌，***癌，外阴癌，甲状腺癌，肝的癌，***癌，***癌，睾丸癌，食管癌，胆道肿瘤，以及头和颈癌和各种骨髓瘤。
术语“癌前”指典型地在癌之前或发展成癌的疾患或生长。“癌前”生长会具有以异常细胞周期调节，增殖，或分化为特征的细胞，这些可通过细胞周期调节，细胞增殖，或分化的标志物来测定。
如本文中使用的，“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”，“癌性”，“细胞增殖性病症”，和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
“转移”指癌自其原发部位传播至身体中的其它位置。癌细胞能脱离原发性肿瘤，渗透入淋巴和血管，经由血流而循环，及在身体中其它地方的正常组织中的远端病灶(转移)中生长。转移可以是当地的或远端的。转移是一个连续过程，视肿瘤细胞自原发性肿瘤脱落，经由血流而传播，并在远端部位停止而定。在新的部位，该细胞建立血供且能生长至形成危及生命的团块。肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径二者调节这种行为，而且肿瘤细胞与远端部位中的宿主细胞之间的相互作用也是重要的。
“非转移的”指良性的或保留在原发部位且尚未渗透入淋巴或血管***或渗透至原发部位以外的组织的癌症。一般而言，非转移性癌症指作为0期，I期，或II期癌症和偶尔的III期癌症的任何癌症。
术语“抗癌疗法”指在治疗癌症中有用的疗法。抗癌治疗剂的例子包括但不限于拮抗剂，化疗剂，生长抑制剂，细胞毒剂，放射疗法中所使用的药剂，抗血管发生剂，凋亡剂，抗微管蛋白剂，和其它治疗癌症的药剂，抗CD20抗体，血小板衍生生长因子抑制剂(例如GLEEVECTM(Imatinib Mesylate))，COX-2抑制剂(例如celecoxib)，干扰素，细胞因子，结合一种或多种以下靶物的拮抗剂(例如中和性抗体)(ErbB2，ErbB3，ErbB4，PDGFR-β，BlyS，APRIL，BCMA或VEGF受体，TRAIL/Apo2)，和其它生物活性和有机化学剂，等。在特定实施方案中，拮抗剂是FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，或EGFR拮抗剂。本发明还包括它们的组合。
“放射疗法”或“放疗”指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足够损伤，以限制细胞正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。应当领会，本领域知道许多方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予，而典型的剂量范围为每天10-200个单位(戈瑞(Gray))。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗/处理个体或细胞的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用抗癌疗法(例如包括FGFR3拮抗剂，TP3拮抗剂，和/或EGFR拮抗剂的抗癌疗法)来延迟疾病或病症的形成。
“有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
本发明的物质/分子，激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态，年龄，性别和重量及该物质/分子，激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指物质/分子，激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害效果的量。术语“治疗有效量”指在哺乳动物(例如患者)中有效“治疗”疾病或病症的本发明抗体，多肽，或拮抗剂的量。在癌症的情况中，治疗有效量的药物能减少癌细胞数；缩小肿瘤体积或重量；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。就药物能预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。在一个实施方案中，治疗有效量是生长抑制量。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持续时间，距疾病进展的时间(TTP)，无疾病存活的持续时间(DFS)，无进展存活的持续时间(PFS)，响应率(RR)，响应持续时间，和/或生活质量来测量。
术语“存活”指患者保持活着，而且包括总体存活(overall survival)以及无疾病存活(disease free survival)。
术语“总体存活”指患者自诊断或治疗时起一个限定时间段保持活着，诸如1年，5年，等。
短语“无进展存活”在本发明的上下文中指治疗期间和治疗后，依照主治内科医生或调查人员的评估，患者的疾病不变坏，即不进展的时间长度。如技术人员会领会的，若与类似情况的患者的对照组的平均或均值无进展存活时间相比，患者经历更长的疾病不进展的时间长度，则患者的无进展存活得到改善或增强。
短语“无疾病存活(DFS)”指在针对癌症的首要治疗(primary treatment)结束之后患者在没有该癌症的任何体征或症状的情况下存活的时间长度。
“延长存活”指相对于未治疗患者(即相对于未用抗癌疗法(例如包含FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，和/或EGFR拮抗剂的抗癌疗法)治疗的患者)，或相对于不以指定参照水平表达FGFR3，TP53，和/或EGFR的患者，提高所治疗患者中的存活，例如总体或无疾病存活。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它***剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)，三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)(屈***酚(dronabinol),)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)，乙酰喜树碱，东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)，美法仑(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，泼尼莫司汀(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomysin)，放线菌素(actinomycin)，氨茴霉素(authramycin)，偶氮丝氨酸(azaserine)，博来霉素(bleomycin)，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素(carminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，放线菌素D(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星，氰基吗啉代多柔比星，2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C，霉酚酸(mycophenolic acid)，诺拉霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)，链佐星(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，蝶罗呤(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤(mercaptopurine)，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷(azauridine)，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素，疣孢菌素(verracurin)A，杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)，ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造纳米颗粒剂型帕利他塞(American PharmaceuticalPartners,Schaumberg,Illinois)和多西他塞(docetaxel)(Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovovin)；长春瑞滨(vinorelbine)能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)任何上述物质的药剂学可接受的盐，酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱和***龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。别的化疗剂包括可用作抗体药物缀合物的细胞毒剂，诸如美登木生物碱(例如DM1)和auristatin(例如MMAE和MMAF)。
“化疗剂”还包括起调节，降低，阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”，且常常是***或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。例子包括抗***类和选择性***受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，那洛昔芬(keoxifene)，LY117018，奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；***受体下调剂类(ERD)；起抑制或关闭卵巢作用的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)，醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)，醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(tripterelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节***生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑，氨鲁米特(aminoglutethimide)，醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)，依西美坦(exemestane)，福美坦(formestane)，法倔唑(fadrozole)，伏氯唑(vorozole)，来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)，依替膦酸盐(etidronate)，NE-58095，唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)，阿伦膦酸盐(alendronate)，帕米膦酸盐(pamidronate)，替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α，Raf，H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗，疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐，酸或衍生物。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞(例如膀胱癌细胞)生长和/或增殖的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长***类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))，紫杉烷类(taxanes)，和拓扑异构酶II抑制剂诸如蒽环类抗生素多柔比星(doxorubicin)((8S-顺式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮，即(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6，8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacenedione)，表柔比星(epirubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)，***(prednisone)，达卡巴嗪(dacarbazine)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，顺铂(cisplatin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohnand Israel编，Chapter 1，题为"Cell cycle regulation，oncogenes，and anti-neoplastic drugs"，Murakami et al.(WB Saunders:Philadelphia，1995)，尤其是第13页。紫杉烷类(帕利他赛(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他赛(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。帕利他赛和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝***的抑制。
如本文中所使用的，术语“患者”或“受试者”可互换使用，而且指想要治疗的任何单一动物，更优选哺乳动物(包括非人动物，诸如例如犬，猫，马，家兔，动物园动物，牛，猪，绵羊，和非人灵长类)。最优选的是，本文中的患者是人。
如本文中使用的，“施用”指将一定剂量的化合物(例如拮抗剂)或药物组合物(例如包含拮抗剂的药物组合物)给予受试者(例如患者)的方法。施用可以是通过任何合适的手段，包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用。胃肠外输注包括例如肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用，推注施用，和脉冲输注。
术语“有效量”指药物有效治疗病症(例如治疗癌症)的量。
术语“药物配制剂”指其形式容许药物的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的另外的成分的无菌制备物。
“无菌”配制剂是无菌的或不含所有活的微生物及其孢子。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品或药物的商品包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品或药物应用的适应征，用法，剂量，施用，禁忌症，要与包装产品组合的其它治疗产品，和/或警告的信息。
“试剂盒”指包含至少一种试剂(例如用于治疗癌症(例如膀胱癌)的药物，或用于特异性检测本发明的生物标志物基因或蛋白质的探针)的任何制品(例如包装或容器)。所述制品优选以用于实施本发明方法的单元来宣传，分发，或销售。
在本文中使用时，词语“标记物”指直接地或间接地缀合或融合至诸如核酸探针或抗体等试剂且便于检测与其缀合或融合的试剂的化合物或组合物。标记物可以是自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。该术语意图涵盖通过将可检测物质偶联(即物理连接)至探针或抗体进行的对探针或抗体的直接标记，以及通过与直接标记的另一试剂的反应性而进行的对探针或抗体的间接标记。间接标记的例子包括用荧光标记的二抗检测一抗，和用生物素末端标记DNA探针使得它能用荧光标记的链霉亲合素来检测。
III.治疗方法
本发明提供用于治疗罹患癌症的患者的方法。术语癌症涵盖增殖性病症的集合，包括但不限于癌前生长，良性肿瘤，和恶性肿瘤。良性肿瘤仍然局限于起源部位且没有能力渗透，侵入，或转移至远端部位。恶性肿瘤会侵入并损害它们周围的其它组织。它们还能获得脱离起源部位并传播至身体其它部分(转移)(通常经由血流或在***所处位置经由淋巴***)的能力。原发性肿瘤以发生它们的组织类型来分类；转移性肿瘤以衍生癌细胞的组织类型来分类。随着时间消逝，恶性肿瘤的细胞变得越来越异常，而且表现出更不像正常细胞。癌细胞外观的这种变化称作肿瘤等级(tumor grade)，而且将癌细胞描述为完全分化的(well-differentiated)(低级)，中度分化的(moderately-differentiated)，不良分化的(poorly-differentiated)，或未分化的(undifferentiated)(高级)。完全分化的细胞相当正常，表现为和类似它们起源的正常细胞。未分化的细胞指已经变得如此异常以致于不再可能确定其起源的细胞。在特定的实施方案中，本发明提供治疗膀胱癌的方法。
癌症分期***描述癌症在解剖学上已经传播了多远，而且试图将具有相似预后和处理的患者置于相同分期组中。可实施数项测试来帮助癌症分期，包括活检和某些影像检测诸如胸部x-射线，***x射线照片，骨扫描，CT扫描，和MRI扫描。验血和临床评估也用于评估患者的整体健康和检测癌症是否已经传播至某些器官。
为了对癌症分期，美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer)首先使用TNM分类***将癌症(特别是实体瘤)置于字母分类中。给癌症指派字母T(肿瘤大小)，N(可触知的结节)，和/或M(转移)。T1，T2，T3，和T4描述渐增的原发性病灶尺寸；N0，N1，N2，N3指示渐进发展中的结节累及；而M0和M1反映远端转移的存在与否。
在第二种分期方法中，也称作整体阶段分组(Overall Stage Grouping)或罗马数字分期(Roman Numeral Staging)，将癌症分成0期至IV期，掺入了原发性病症的尺寸以及结节传播和远端转移的存在。在这种***中，将癌症分组成四期，以罗马数字I至IV表示，或者归类为“复发”。对于有些癌症，0期称作“原位”或“Tis”，诸如乳腺癌的原位导管癌或原位小叶癌。高级腺瘤也可归类为0期。一般而言，I期癌症是小的局限性癌症，其通常是可治愈的，而IV期通常代表不能手术治疗的或转移性的癌症。II期和III期癌症通常是局部高级的和/或展现出涉及局部***。一般而言，较高期数指示更严重的(extensive)疾病，包括更大的肿瘤尺寸和/或癌症传播至邻近原发性肿瘤的附近***和/或器官。这些阶段有精确定义，但是定义对每一种癌症是不同的，而且是熟练技术人员已知的。
许多癌症登记诸如NCI的“监视流行病学和最终结果程序”(Surveillance，Epidemiology，and End Results Program)(SEER)使用概括分期(summary staging)。这种***用于所有类型的癌症。它将癌症病历分成五大类：
“原位”指只存在于它开始的细胞层中的早期癌症。
“局限性的”指癌症限于它开始的器官，没有传播的证据。
“区域性的”指癌症已经传播超出起源(原发性)部位至附近的***或器官和组织。
“远端的”指癌症自原发性部位传播至远端器官或远端***。
“未知的”用于描述没有足够信息来指明阶段的情况。
另外，癌症在原发性肿瘤被清除后几个月或几年复现是常见的。在所有可见的肿瘤都被根除后复现的癌症称作复发性疾病。在原发性肿瘤的区域中复现的疾病是局部复发的，而作为转移复现的疾病称作远端复发。
肿瘤可以是实体瘤或者是非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的例子包括白血病(例如慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)，急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)，成人急性成淋巴细胞性白血病(adult acutelymphoblastic leukemia)，急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)，成熟B细胞急性成淋巴细胞性白血病(mature B-cell acute lymphoblastic leukemia)，慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)，多形核细胞性白血病(polymphocyticleukemia)，或毛细胞性白血病(hairy cell leukemia))或淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，或何杰金氏病(Hodgkin’s disease))。实体瘤包括血液，骨髓，或淋巴***以外的身体组织的任何癌症。实体瘤可进一步分成上皮细胞起源的那些和非上皮细胞起源的那些。上皮细胞实体瘤的例子包括膀胱，胃肠道，结肠，乳腺，***，肺，肾，肝，胰腺，卵巢，头和颈，口腔，胃，十二指肠，小肠，大肠，***，胆囊，唇(labium)，鼻咽，皮肤，子宫，***官，泌尿器官，和皮肤的肿瘤。非上皮起源的实体瘤包括肉瘤，脑瘤，和骨瘤。定义部分中描述了肿瘤的其它例子
在一些实施方案中，本发明的方法包括对患者施用治疗有效量的抗癌疗法，其中自该患者获得的样品中至少一种本发明的生物标志物(例如表1中列出的生物标志物)的表达水平已经测定为相对于本发明的生物标志物的参照水平有变化。例如，在一些实施方案中，本发明提供治疗癌症(例如膀胱癌)的方法，其牵涉对患者施用治疗有效量的抗癌疗法，其中至少一种表1中列出的基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，或96种表1中列出的基因)的表达水平已经测定为相对于该至少一种基因的参照水平有变化。
在另一个例子中，在一些实施方案中，本发明提供治疗癌症(例如膀胱癌)的方法，其牵涉对该患者施用治疗有效量的抗癌疗法，其中至少一种表4中列出的基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，或48种表4中列出的基因)的表达水平已经测定为相对于该至少一种基因的参照水平有变化。在一些实施方案中，该变化是升高。在其它实施方案中，该变化是降低。
在特定实施方案中，本发明的方法包括对患者施用治疗有效量的抗癌疗法，其中自该患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平已经测定为相对于该至少一种基因的参照水平升高：FGFR3，TP53，和/或EGFR。本发明的生物标志物(例如表1中列出的基因，例如FGFR3，TP53，和/或EGFR)的表达水平可以使用本文中描述的任何方法或测定法(例如发明详述IV节或实施例中描述的方法或测定法)来测定。在一些实施方案中，该膀胱癌是NMIBC。在其它实施方案中，该膀胱癌是MIBC。在还有其它实施方案中，该膀胱癌是转移性膀胱癌。该患者可任选具有高级，顽固性，复发性，和/或化疗抗性形式的该癌症。例如，在一些实施方案中，患者可具有复发性膀胱癌，例如复发性NMIBC。
在本发明的任何前述方法中，自患者获得的样品中本发明的生物标志物(例如表1中列出的基因，例如FGFR3，TP53，和/或EGFR)的表达水平可以相对于该生物标志物的参照水平变化至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。例如，在一些实施方案中，自患者获得的样品中本发明的生物标志物的表达水平可以相对于该生物标志物的参照水平升高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。在其它实施方案中，自患者获得的样品中本发明的生物标志物的表达水平可以相对于该生物标志物的参照水平降低至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。
在特定实施方案中，自患者获得的样品中FGFR3，TP53，和/或EGFR中至少一种(例如1，2，或3种)的表达水平可以相对于该至少一种基因的参照水平升高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。例如，FGFR3的表达水平可以相对于FGFR3的参照水平升高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。在另一种情况中，TP53的表达水平可以相对于TP53的参照水平升高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。在还有另一种情况中，EGFR的表达水平可以相对于EGFR的参照水平升高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。
在一些实施方案中，参照水平可以设置为例如给定癌症类型(例如膀胱癌)中生物标志物(例如FGFR3，TP53，或EGFR)的表达水平的总体分布的第20百分位和第99百分位之间的任何百分位(例如第20，第25，第30，第35，第40，第45，第50，第55，第60，第65，第70，第75，第80，第85，第90，第95，或第99百分位)。在特定实施方案中，参照水平可以设置为膀胱癌中该值的总体分布的第25百分位。在其它特定实施方案中，参照水平可以设置为膀胱癌中该值的总体分布的第50百分位。在其它实施方案中，参照水平可以是膀胱癌中该值的总体分布的中值。
在一些实施方案中，本发明的方法包括对患者施用抗癌疗法，该抗癌疗法包括下述一项或多项(例如1，2，或3项)：FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，和/或EGFR拮抗剂。例如，在一些实施方案中，本发明的方法包括施用包含FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，或EGFR拮抗剂的抗癌疗法。在其它情况中，该方法可牵涉施用包含FGFR3拮抗剂和EGFR拮抗剂的抗癌疗法。在其它情况中，该方法可牵涉施用包含FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，和EGFR拮抗剂的抗癌疗法。
在任何前述方法中，该FGFR3拮抗剂可以是FGFR3拮抗性抗体或小分子FGFR3拮抗剂。例示性FGFR3拮抗性抗体(诸如184.6，184.6.1，和184.6.1N54S)记载于例如美国专利No.8,410,250，通过援引将其完整收入本文。在一些实施方案中，该小分子FGFR3拮抗剂是酪氨酸激酶抑制剂。
在任何前述方法中，该TP53拮抗剂可以是TP53拮抗性抗体或小分子TP53拮抗剂。
在任何前述方法中，该EGFR拮抗剂可以是EGFR拮抗性抗体或小分子EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，该小分子FGFR3拮抗剂是酪氨酸激酶抑制剂。在特定实施方案中，该小分子FGFR3拮抗剂是厄洛替尼(TARCEVATM)。
能在本发明的方法中使用的例示性EGFR拮抗剂包括例如小分子EGFR拮抗剂，包括喹唑啉EGFR激酶抑制剂，吡啶并嘧啶EGFR激酶抑制剂，嘧啶并嘧啶EGFR激酶抑制剂，吡咯并嘧啶EGFR激酶抑制剂，吡唑并嘧啶EGFR激酶抑制剂，苯基氨基-嘧啶EGFR激酶抑制剂，羟吲哚EGFR激酶抑制剂，吲哚并咔唑EGFR激酶抑制剂，酞嗪EGFR激酶抑制剂，异黄酮EGFR激酶抑制剂，quinalone EGFR激酶抑制剂，和tyrphostin EGFR激酶抑制剂，诸如下述专利公开文本中记载的那些，和EGFR激酶抑制剂的所有药学可接受的盐和溶剂合物：国际专利公开文本No.WO 96/33980，WO 96/30347，WO 97/30034，WO 97/30044，WO 97/38994，WO 97/49688，WO 98/02434，WO 97/38983，WO 95/19774，WO 95/19970，WO 97/13771，WO 98/02437，WO98/02438，WO 97/32881，WO 98/33798，WO 97/32880，WO 97/3288，WO 97/02266，WO 97/27199，WO 98/07726，WO 97/34895，WO 96/31510，WO 98/14449，WO 98/14450，WO 98/14451，WO 95/09847，WO 97/19065，WO 98/17662，WO 99/35146，WO 99/35132，WO 99/07701，和WO 92/20642；欧洲专利申请No.EP 520722，EP 566226，EP 787772，EP 837063，和EP 682027；美国专利No.5,747,498，5,789,427，5,650,415，和5,656,643；和德国专利申请No.DE 19629652。小分子EGFR拮抗剂的另外的非限制性例子包括Traxler,Exp.Opin.Ther.Patents8(12):1599-1625(1998)中描述的任何EGFR激酶抑制剂。
能在本发明的方法中使用的小分子EGFR拮抗剂的特定优选例子包括[6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(亦称为OSI-774，厄洛替尼，或TARCEVATM(厄洛替尼HCl)；OSI Pharmaceuticals/Genentech/Roche)(美国专利No.5,747,498；国际专利公开文本No.WO 01/34574，及Moyer et al.，Cancer Res.57:4838-4848(1997))；CI-1033(以前称作PD183805；Pfizer)(Sherwood et al.,1999,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.40:723)；PD-158780(Pfizer)；AG-1478(University ofCalifornia)；CGP-59326(Novartis)；PKI-166(Novartis)；EKB-569(Wyeth)；GW-2016(也称作GW-572016或二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)；GSK)；和吉非替尼(也称作ZD1839或IRESSATM；Astrazeneca)(Woodburn et al.，1997，Proc.Am.Assoc.CancerRes.38:633)。
能在本发明的方法中使用的例示性EGFR拮抗性抗体包括Modjtahedi，et al.，Br.J.Cancer 67:247-253(1993)；Teramoto et al.，Cancer 77:639-645(1996)；Goldstein et al.，Clin.Cancer Res.1:1311-1318(1995)；Huang，et al.，CancerRes.15:59(8):1935-40(1999)；及Yang et al.，Cancer Res.59:1236-1243(1999)中描述的那些。如此，在一些实施方案中，EGFR拮抗性抗体可以是单克隆抗体Mab E7.6.3(Yang etal.,Cancer Res.59:1236-43(1999))，或Mab C225(ATCC登录号HB-8508)，或具有其结合特异性的抗体或抗体片段。合适的单克隆EGFR拮抗性抗体包括但不限于IMC-C225(也称作西妥昔单抗或ERBITUXTM；Imclone Systems)，ABX-EGF(Abgenix)，EMD 72000(Merck KgaA，Darmstadt)，RH3(York Medical Bioscience Inc.)，和MDX-447(Medarex/Merck KgaA)。
在某些实施方案中，该癌表达FGFR3，扩增的FGFR3，易位的FGFR3，和/或突变的FGFR3。在某些实施方案中，该癌表达活化的FGFR3。在某些实施方案中，该癌表达易位的FGFR3(例如t(4；14)易位)。在某些实施方案中，该癌表达组成性FGFR3。在一些实施方案中，该组成性FGFR3包含酪氨酸激酶域和/或近膜域和/或配体结合域中的突变。在某些实施方案中，该癌表达配体不依赖性FGFR3。在一些实施方案中，该癌表达配体依赖性FGFR3。
在一些实施方案中，该癌表达包含与FGFR3-IIIbS248C对应的突变的FGFR3。在一些实施方案中，该癌表达FGFR3-IIIbS248C和/或FGFR3-IIIcS248C。
在一些实施方案中，该癌表达包含与FGFR3-IIIbK652E对应的突变的FGFR3。在一些实施方案中，该癌表达FGFR3-IIIbK652E和/或FGFR3-IIIcK650E。
FGFR3包含与FGFR3-IIIbS249C对应的突变。在一些实施方案中，该癌表达FGFR3-IIIbS249C和/或FGFR3-IIIcS249C。
在一个方面，该癌表达包含与FGFR3-IIIbG372C对应的突变的FGFR3。在一些实施方案中，该癌表达FGFR3-IIIbG372C和/或FGFR3-IIIcG370C。
在一个方面，该癌表达包含与FGFR3-IIIbY375C对应的突变的FGFR3。在一些实施方案中，该癌表达FGFR3-IIIbY375C和/或FGFR3-IIIcY373C。
在一些实施方案中，该癌表达(a)FGFR3-IIIbK652E和(b)FGFR3-IIIbR248C，FGFR3-IIIbY375C，FGFR3-IIIbS249C，和FGFR3IIIbG372C中的一种或多种。
在一些实施方案中，该癌表达(a)FGFR3-IIIbR248C和(b)FGFR3-IIIbK652E，FGFR3-IIIbY375C，FGFR3-IIIbS249C，和FGFR3-IIIbG372C中的一种或多种。
在一些实施方案中，该癌表达(a)FGFR3-IIIbG372C和(b)FGFR3-IIIbK652E，FGFR3-IIIbY375C，FGFR3-IIIbS249C，和FGFR3-IIIbR248C中的一种或多种。
在一些实施方案中，该癌表达FGFR3-IIIbR248C，FGFR3-IIIbK652E，FGFR3-IIIbY375C，FGFR3-IIIbS249C，和FGFR3-IIIbG372C。
在某些实施方案中，该癌表达相对于对照样品(例如正常组织的样品)或水平升高水平的磷酸-FGFR3，磷酸-FRS2和/或磷酸-MAPK。
会以与优良医学实践一致的方式进行构成抗癌疗法(例如包含拮抗剂(例如FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，和/或EGFR拮抗剂)的抗癌疗法)的组合物的配制，定剂量，和施用。在此内容中考虑的因素包括所治疗的癌症的具体类型，所治疗的具体哺乳动物，患者个体的临床状况，癌症的起因，投递药剂的部位，可能的副作用，拮抗剂的类型，施用的方法，施用的日程安排，和医学从业人员知道的其它因素。要施用的拮抗剂的有效量会由此类考量来决定。
依照已知方法给人类患者施用本发明的治疗剂，诸如静脉内施用(像推注或通过一段时间里的连续输注)，通过肌肉内，腹膜内，脑脊髓内，皮下，关节内，滑膜内，鞘内，口服，表面，或吸入路径。回体(ex vivo)策略也可用于治疗性应用。回体策略涉及用编码拮抗剂的多核苷酸转染或转导自受试者获得的细胞。然后将经过转染或转导的细胞返回受试者。细胞可以是极其多种类型之任一，包括但不限于造血细胞(例如，骨髓细胞，巨噬细胞，单核细胞，树突细胞，T细胞，或B细胞)，成纤维细胞，上皮细胞，内皮细胞，角质形成细胞，或肌肉细胞。
例如，如果抗癌疗法包括拮抗性抗体(例如FGFR3拮抗性抗体，TP53拮抗性抗体，或EGFR拮抗性抗体)，那么通过任何合适手段施用抗体，包括胃肠外，皮下，腹膜内，肺内，和鼻内，及(如果想要局部免疫抑制治疗的话)病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。另外，合适的是，通过脉冲输注来施用抗体，特别是使用递减剂量的抗体。优选的是，通过注射给予剂量给药，最优选的是，通过静脉内或皮下注射给予剂量给药，这部分取决于施药是短期的还是长期的。
在另一个例子中，在病症或肿瘤位置允许时，局部施用拮抗性化合物，例如通过直接注射，而且可以周期性重复注射。也可以在手术切除肿瘤后***地/全身地将拮抗剂投递至受试者或直接投递至肿瘤细胞，例如肿瘤或肿瘤床，用以预防或降低局部复发或转移。
可以将抗癌疗法与至少一种另外的具有抗癌特性的化合物在药物组合配制剂中组合或作为组合疗法以给药方案组合。所述药物组合配制剂或给药方案中的至少一种另外的化合物优选具有对拮抗剂组合物的补充活性，使得它们彼此不会产生不利影响。
所述抗癌疗法可以包括化疗剂，细胞毒剂，细胞因子，生长抑制剂，抗激素剂，及其组合。此类分子以对指定目的有效的量适当地组合存在。例如，含有拮抗剂(例如FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，和/或EGFR拮抗剂)的药物组合物还可以包含治疗有效量的抗肿瘤剂，化疗剂，生长抑制剂，细胞毒剂，或其组合。
组合中的治疗剂的施用通常在规定的时间段里进行(通常是数分钟，数小时，数天或数周，这取决于所选择的组合)。联合疗法旨在涵盖这些治疗剂以序贯方式的施用(也就是说，其中在不同时间施用每一种治疗剂)，以及这些治疗剂或治疗剂中至少两种以基本上同时的方式的施用。
可以通过相同路径或不同路径来施用治疗剂。例如，可以通过静脉内注射来施用组合中的拮抗性抗体，同时可以口服施用所述组合中的化疗剂。或者，例如，可以口服施用这两种治疗剂，或者可以通过静脉内注射来施用这两种治疗剂，这取决于具体的治疗剂。治疗剂的施用次序也随着具体药剂而变化。
根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量是约1μg/kg至100mg/kg每种治疗剂，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至约100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药，根据状况，持续治疗直至根据上文所述方法的测量，癌症得到治疗。然而，其它剂量方案也可能是有用的。可以依照制造商的说明书或由熟练从业人员凭经验确定来使用抗癌疗法(例如包含一种或多种拮抗剂(例如FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，和/或EGFR拮抗剂)，化疗剂，等的抗癌疗法)的各组分的制备和剂量给药日程表。此类化疗的制备和剂量给药日程表还记载于“Chemotherapy Service,”Ed.,M.C.Perry,Williams&Wilkins,Baltimore,Md(1992)。
组合疗法可以提供“协同作用”及证实是“协同性”的，即当一起使用活性组分时所实现的效果大于分开使用化合物时所产生的效果之和。当活性组分为如下情况时可以获得协同效应：(1)共配制和施用或在组合的单位剂量配制剂中同时投递；(2)作为分开的配制剂交替或平行投递；或(3)通过一些其它方案。当在交替疗法中投递时，在顺序施用或投递化合物时，例如通过不同注射器中的不同注射，可以获得协同效应。一般地，在交替疗法期间，顺序即连续施用有效剂量的每种活性组分，而在组合疗法中，一起施用有效剂量的两种或更多种活性组分。
除了通过上文所述传统路径将抗癌疗法施用于患者，本发明还包括通过基因疗法进行的施用。编码拮抗剂的核酸的此类施用涵盖在表述“施用治疗有效量的抗癌疗法”中。参见例如WO 1996/07321，其关注使用基因疗法来产生胞内抗体。此类方法对于例如靶向细胞内蛋白质诸如TP53可能是有用的。
主要有两种办法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞，即体内(in vivo)和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要拮抗剂的部位将核酸直接注射入患者。对于回体治疗，取出患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞直接施用于患者，或者例如封装入多孔膜再植入患者(参见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移入体外培养的细胞还是目的宿主的体内细胞而有所变化。适合于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体，电穿孔，显微注射，细胞融合，DEAE-右旋糖苷，磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的一种载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒，I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的***(例如，可用于脂质介导的基因转移的脂质有DOTMA，DOPE和DC-Chol)进行转染。在一些情况中，希望与对靶细胞特异性的药剂(诸如对靶细胞上的细胞表面膜蛋白特异性的抗体，针对靶细胞上受体的配体，等)一起提供核酸来源。在采用脂质体的情况中，可以使用与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白质靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段，针对在循环中经历内在化的蛋白质的抗体，和靶向胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的技术记载于例如Wu et al.，J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987)；及Wagner et al.，PNAS USA 87:3410-3414(1990)。基因标记和基因疗法方案记载于例如Anderson et al.,Science 256:808-813(1992)及WO 1993/25673。
IV.诊断和预后方法
本发明提供用于诊断罹患癌症的患者，用于确定罹患癌症的患者的预后，用于确定具有癌症的患者是否很有可能响应抗癌疗法治疗，及用于为具有癌症的患者优化抗癌疗法的治疗功效的方法。格外地，该方法对于诊断癌症的亚型，预测治疗结局，及提高对患者施用抗癌疗法会是有效的可能性是有用的。在数个实施方案中，该方法包括测定自患者获得的样品中至少一种本发明的生物标志物(例如表1中列出的生物标志物)的表达水平并比较该表达水平与本发明的生物标志物的参照水平。在特定实施方案中，该方法包括测定自患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和/或EGFR，并比较该表达水平与该至少一种基因的参照水平。本发明的生物标志物(例如FGFR3，TP53，和/或EGFR)的表达水平可以使用下文中描述的任何方法或测定法或通过本领域已知的任何方法或测定法来测定。在特定实施方案中，该癌症是膀胱癌。在一些实施方案中，该膀胱癌是NMIBC。在其它实施方案中，该膀胱癌是MIBC。在还有其它实施方案中，该膀胱癌是转移性膀胱癌。该患者可任选具有高级，顽固性，复发性，和/或化疗抗性形式的该癌症。例如，在一些实施方案中，患者可具有复发性膀胱癌，例如复发性NMIBC。
例如，在一些实施方案中，本发明提供用于在患者中诊断癌症的方法，该方法包括下述步骤：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种表1中列出的基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，或96种表1中列出的基因)的表达水平；并(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平的变化鉴定具有癌症的患者。在一些实施方案中，该变化可以是升高。在其它实施方案中，该变化可以是降低。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。例如，在特定实施方案中，本发明提供用于在患者中诊断癌症的方法，该方法包括下述步骤：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种(例如1，2，或3种)下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和EGFR；并(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平的升高鉴定具有癌症的患者。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在一些情况中，本发明提供用于在患者中诊断癌症的方法，该方法包括下述步骤：(a)测定自该患者获得的样品中FGFR3的表达水平；并(b)比较FGFR3的表达水平与FGFR3的参照水平，其中该患者样品中FGFR3的表达水平相对于该参照水平的升高鉴定具有癌症的患者。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在一些情况中，本发明提供用于在患者中诊断癌症的方法，该方法包括下述步骤：(a)测定自该患者获得的样品中TP53的表达水平；并(b)比较TP53的表达水平与TP53的参照水平，其中该患者样品中TP53的表达水平相对于该参照水平的升高鉴定具有癌症的患者。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在一些情况中，本发明提供用于在患者中诊断癌症的方法，该方法包括下述步骤：(a)测定自该患者获得的样品中EGFR的表达水平；并(b)比较EGFR的表达水平与EGFR的参照水平，其中该患者样品中EGFR的表达水平相对于该参照水平的升高鉴定具有癌症的患者。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在另一个例子中，在一些实施方案中，本发明提供用于在患者中诊断癌症的方法，该方法包括下述步骤：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种表4中列出的基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，或48种表4中列出的基因)的表达水平；并(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平的变化鉴定具有癌症的患者。在一些实施方案中，该变化可以是升高。在其它实施方案中，该变化可以是降低。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在任何前述方法中，该方法可进一步包括(c)告知该患者他们具有癌症。在任何前述方法中，该方法可进一步包括(d)当检测到该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该样品升高时，为了该患者的治疗选择抗癌疗法。在任何前述实施方案中，该方法可进一步包括对该患者施用治疗有效量的抗癌疗法，例如如发明详述III节中描述的。
在其它情况中，本发明提供用于罹患癌症的患者的预后的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种表1中列出的基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，或96种表1中列出的基因)的表达水平；(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平；并(c)为该患者确定预后，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平有变化指示较差的预后。在一些实施方案中，该变化可以是升高。在其它实施方案中，该变化可以是降低。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
例如，在一些情况中，本发明提供用于罹患癌症的患者的预后的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和EGFR；(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平；并(c)为该患者确定预后，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平升高指示较差的预后。
在一些情况中，本发明提供用于罹患癌症的患者的预后的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中FGFR3的表达水平；(b)比较FGFR3的表达水平与FGFR3的参照水平；并(c)为该患者确定预后，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平升高指示较差的预后。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在其它情况中，本发明提供用于罹患癌症的患者的预后的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中TP53的表达水平；(b)比较TP53的表达水平与TP53的参照水平；并(c)为该患者确定预后，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平升高指示较差的预后。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
例如，在一些情况中，本发明提供用于罹患癌症的患者的预后的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中EGFR的表达水平；(b)比较EGFR的表达水平与EGFR的参照水平；并(c)为该患者确定预后，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平升高指示较差的预后。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在其它情况中，本发明提供用于罹患癌症的患者的预后的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种表4中列出的基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，或48种表4中列出的基因)的表达水平；(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平；并(c)为该患者确定预后，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平有变化指示较差的预后。在一些实施方案中，该变化可以是升高。在其它实施方案中，该变化可以是降低。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在任何前述方法中，该预后可以是存活预后。在一些情况中，在对患者施用抗癌疗法之前进行该方法。在其它实施方案中，在对患者施用抗癌疗法期间进行该方法。在其它实施方案中，在对患者施用抗癌疗法之后进行该方法。
在任何前述方法中，该方法可进一步包括当确定患者具有较差的存活预后时，将患者鉴定为很有可能受益于抗癌疗法的施用。在其它情况中，该方法可进一步包括当确定患者具有较差的存活预后时，将患者鉴定为很有可能受益于抗癌疗法的施用。
在任何前述方法中，该方法可进一步包括如果如例如发明详述III节中所述确定患者具有较差的存活预后的话，对患者施用治疗有效量的抗癌疗法。
在任何前述方法中，存活可以是无疾病存活，无进展存活，或总体存活。
在其它情况中，本发明提供确定具有癌症的患者是否很有可能响应抗癌疗法治疗的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种表1中列出的基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，或96种表1中列出的基因)的表达水平；并(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平变化鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。在一些实施方案中，该变化可以是升高。在其它实施方案中，该变化可以是降低。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
例如，在一些情况中，本发明提供确定具有癌症的患者是否很有可能响应抗癌疗法治疗的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和EGFR；并(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平升高鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
例如，在一些情况中，本发明提供确定具有癌症的患者是否很有可能响应抗癌疗法治疗的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中FGFR3的表达水平；并(b)比较FGFR3的表达水平与FGFR3的参照水平，其中该患者样品中FGFR3的表达水平相对于该参照水平升高鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在其它情况中，本发明提供确定具有癌症的患者是否很有可能响应抗癌疗法治疗的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中TP53的表达水平；并(b)比较TP53的表达水平与TP53的参照水平，其中该患者样品中TP53的表达水平相对于该参照水平升高鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在还有其它情况中，本发明提供确定具有癌症的患者是否很有可能响应抗癌疗法治疗的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中EGFR的表达水平；并(b)比较EGFR的表达水平与EGFR的参照水平，其中该患者样品中EGFR的表达水平相对于该参照水平升高鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在其它情况中，本发明提供确定具有癌症的患者是否很有可能响应抗癌疗法治疗的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种表4中列出的基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，或48种表4中列出的基因)的表达水平；并(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平变化鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。在一些实施方案中，该变化可以是升高。在其它实施方案中，该变化可以是降低。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在一些情况中，本发明提供为具有癌症的患者优化抗癌疗法的治疗功效的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种表1中列出的基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，或96种表1中列出的基因)的表达水平；并(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平变化鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。在一些实施方案中，该变化可以是升高。在其它实施方案中，该变化可以是降低。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
例如，在一些情况中，本发明提供为具有癌症的患者优化抗癌疗法的治疗功效的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种(例如1，2，或3种)下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和EGFR；并(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平升高鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。在一些实施方案中，该变化可以是升高。在其它实施方案中，该变化可以是降低。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在一些情况中，本发明提供为具有癌症的患者优化抗癌疗法的治疗功效的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中FGFR3的表达水平；并(b)比较FGFR3的表达水平与FGFR3的参照水平，其中该患者样品中FGFR3的表达水平相对于该参照水平升高鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。在一些实施方案中，该变化可以是升高。在其它实施方案中，该变化可以是降低。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在一些情况中，本发明提供为具有癌症的患者优化抗癌疗法的治疗功效的方法，该方法包括：(a)测定自该患者获得的样品中至少一种表4中列出的基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，或48种表4中列出的基因)的表达水平；并(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平变化鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。在一些实施方案中，该变化可以是升高。在其它实施方案中，该变化可以是降低。在一些实施方案中，该癌症是膀胱癌。
在任何前述方法中，该方法可进一步包括测定自该患者获得的样品中至少一种选自下组的另外的基因的表达水平：DUSB3，FRS2，TSC1，ERBB3，CDKN1A，CCND1，TP63，MMP2，ZEB2，PIK3CB，PIK3R1，MDM2，SNAI2，AXL，ZEB1，BCL2B，TSC2，RB1，FGFR32，PIK3IP1，MTOR，PIK3CA，PTEN，AKT1，BCL2A，FRS3，ERBB2，FGFR31，FGF1，SNAI1，FGFR34，FGF9，和FGF2，其中该至少一种另外的基因的表达水平相对于该至少一种另外的基因的参照水平有变化。
在一些情况中，本发明提供治疗罹患膀胱癌的患者的方法，该方法包括对该患者施用治疗有效量的除卡介苗(BCG)疫苗以外的抗癌疗法，其中自该患者获得的样品中TP53的表达水平已经测定为相对于TP53的参照水平升高。
在任何前述方法中，该方法可进一步包括对该患者施用治疗有效量的抗癌疗法，如例如发明详述III节中描述的。
在任何前述方法中，可以通过测量信使RNA(mRNA)，如例如下文描述的或通过本领域已知的方法来测定本发明的生物标志物，例如表1中列出的基因，例如FGFR3，TP53，和/或EGFR的表达水平。在一些情况中，通过聚合酶链式反应(PCR)测定法来测定自该患者获得的样品中本发明的生物标志物的表达水平。在一些情况中，该PCR测定法是定量PCR测定法。在一些实施方案中，该定量PCR测定法是测定法。在一些实施方案中，该测定法是使用Fluidigm测定法实施的。
在任何前述方法中，可以通过测量蛋白质，如例如下文描述的或通过本领域已知的方法来测定本发明的生物标志物，例如表1中列出的基因，例如FGFR3，TP53，和/或EGFR的表达水平。在一些情况中，通过免疫组织化学方法来测定自该患者获得的样品中本发明的生物标志物的表达水平。
下文提供了一种通过免疫组织化学测定FGFR3的表达水平的例示性方法。类似测定法可用于本发明的其它生物标志物。
在一个实施方案中，可通过IHC来分析FGFR3过表达。可将来自肿瘤活检的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法并对照如下FGFR3蛋白质染色强度标准：
得分0：未观察到染色或者在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色。
得分1+：在超过10％的肿瘤细胞中检测到微弱的/刚刚可察觉的膜染色。所述细胞只在其部分膜中有染色。
得分2+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到微弱至中等的完全膜染色。
得分3+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。
在一些实施方案中，那些FGFR3过表达评估得分为0或1+的肿瘤可表征为FGFR3未过表达，而那些得分为2+或3+的肿瘤可表征为FGFR3过表达。
在一些实施方案中，FGFR3过表达的肿瘤可根据对应于每个细胞表达的FGFR3分子拷贝数的免疫组化得分进行定级，并且可通过生化方法测定：
0＝0-90个拷贝/细胞，
1+＝至少约100个拷贝/细胞，
2+＝至少约1000个拷贝/细胞，
3+＝至少约10,000个拷贝/细胞。
在一些情况中，自患者获得的样品是肿瘤样品。
在本发明的任何前述方法中，自患者获得的样品中本发明的生物标志物(例如表1中列出的基因)的表达水平可以相对于该生物标志物的参照水平变化至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。例如，在一些实施方案中，自患者获得的样品中本发明的生物标志物的表达水平可以相对于该生物标志物的参照水平升高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。在其它实施方案中，自患者获得的样品中本发明的生物标志物的表达水平可以相对于该生物标志物的参照水平降低至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。
在特定实施方案中，自患者获得的样品中FGFR3，TP53，和/或EGFR中至少一种(例如1，2，或3种)的表达水平可以相对于该至少一种基因的参照水平升高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。例如，FGFR3的表达水平可以相对于FGFR3的参照水平升高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。在另一种情况中，TP53的表达水平可以相对于TP53的参照水平升高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。在还有另一种情况中，EGFR的表达水平可以相对于EGFR的参照水平升高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，或更多。
在一些实施方案中，参照水平可以设置为例如给定癌症类型(例如膀胱癌)中生物标志物(例如FGFR3，TP53，或EGFR)的表达水平的总体分布的第20百分位和第99百分位之间的任何百分位(例如第20，第25，第30，第35，第40，第45，第50，第55，第60，第65，第70，第75，第80，第85，第90，第95，或第99百分位)。在特定实施方案中，参照水平可以设置为膀胱癌中该值的总体分布的第25百分位。在其它特定实施方案中，参照水平可以设置为膀胱癌中该值的总体分布的第50百分位。在其它实施方案中，参照水平可以是膀胱癌中该值的总体分布的中值。
所公开的方法和测定法提供方便，有效，且潜在划算的手段来获得可用于评估治疗患者的适宜或有效疗法的数据和信息。例如，患者可提供样品(例如肿瘤活检或血液样品)来诊断特定癌症，或癌症的亚型。在一些情况中，该诊断可以是对于膀胱癌。在其它情况中，该诊断可以是对于膀胱癌的亚型，例如NMIBC，MIBC，或转移性膀胱癌。在其它情况中，患者可在用抗癌疗法治疗之前提供样品(例如肿瘤活检或血液样品)，而且可通过多种体外测定法来检查样品以确定患者的细胞是否对抗癌疗法(例如包括FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，和/或EGFR拮抗剂的抗癌疗法)是敏感的。
医学领域(特别是关于诊断测试和治疗剂治疗的应用)技术人员会认识到，生物学***有些易变，而且并非总是全然可预测的，而且因此许多较好的诊断测试或治疗剂偶尔无效。如此，最终由主治内科医师的判断来为患者个体决定最适宜的治疗过程，这基于测试结果，患者状况和历史，及他或她自己的经验来做出。例如，甚至会有这样的情况，即使根据来自诊断测试的或来自其它标准的数据，没有预测出患者会对VEGF拮抗剂特别敏感，内科医师也会选择用抗癌疗法(例如包括拮抗剂(例如FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，和/或EGFR拮抗剂)的抗癌疗法)来治疗患者，特别是如果所有或大多数其它明显的治疗选项已经失败，或者如果与另一种治疗一起给予时预见有一些协同性。
样品可以取自怀疑具有或诊断具有癌症(例如膀胱癌)，因此很可能需要治疗的患者或没有怀疑具有任何病症的正常个体。为了评估标志物表达，可以在本发明的方法中使用患者样品(诸如那些含有细胞的，或由这些细胞生成的蛋白质或核酸)。在本发明的方法中，生物标志物的水平可通过评估样品(优选组织样品，例如肿瘤组织样品，诸如活检)中标志物的量(例如绝对量或浓度)来确定。另外，可以在含有可检测水平的生物标志物的体液或分泌物中评估生物标志物的水平。可用作本发明中样品的体液或分泌物包括例如血液，尿液，唾液，粪便，胸水，淋巴液，痰，腹水，***液，脑脊液(CSF)，或任何其它身体分泌物或其衍生物。词语“血液”意图包括全血，血浆，血清，或任何血液衍生物。此类体液或分泌物中生物标志物的评估在侵入性取样方法不适宜或不方便的情况中有时可以是优选的。然而，在样品是体液的情况中，本文中要测试的样品优选血液，滑膜组织，或滑液，最优选血液。
样品可以是冷冻的，新鲜的，固定的(例如***固定的)，离心的，和/或包埋的(例如石蜡包埋的)，等。当然，细胞样品可以在评估样品中标志物的量之前进行多种公知的收集后准备和保存技术(例如核酸和/或蛋白质提取，固定，保存，冷冻，超滤，浓缩，蒸发，离心，等)。同样，活检物也可进行收集后准备和保存技术，例如固定。
如上文记录的，任选地，前述方法可进一步包括任选选择抗癌疗法以施用于该患者并进一步包括任选对该患者施用抗癌疗法。
A.基因表达的检测
本文中描述的遗传生物标志物可以使用本领域已知的任何方法来检测。例如，可以使用Northern，点印迹，或聚合酶链式反应(PCR)分析，阵列杂交，RNA酶保护测定法，或使用商品化的DNA SNP芯片微阵列(包括DNA微阵列急射(snapshot))方便地对来自哺乳动物的组织或细胞样品测定例如来自感兴趣遗传生物标志物的mRNA或DNA。例如，实时PCR(RT-PCR)测定法(诸如定量PCR测定法)是本领域公知的。在本发明的一个例示性实施方案中，用于检测生物学样品中来自感兴趣遗传生物标志物的mRNA的方法包括使用至少一种引物通过逆转录自样品生成cDNA；扩增如此生成的cDNA；并检测扩增cDNA的存在。另外，此类方法可以包括一个或多个如下步骤，其容许测定生物学样品中mRNA的水平(例如通过同时检查“持家”基因(诸如肌动蛋白家族成员)的比较性对照mRNA序列的水平)。任选的是，可以测定扩增cDNA的序列。提供了用于检测FGFR3的表达水平的例示性方法，例如在美国专利申请公开文本No.2014/0030259中及在美国专利No.8,410,250中，通过援引将其二者完整收入本文。
1.核酸的检测
在一个具体的实施方案中，表1中所列基因的表达可通过RT-PCR技术来实施。用于PCR的探针可以用可检测标记物标记，诸如例如放射性同位素，发荧光化合物，生物发光化合物，化学发光化合物，金属螯合物，或酶。此类探针和引物可用于检测样品中所表达的表1中所列基因的存在。正如熟练技术人员会理解的，基于本文中提供的序列，可制备极其多种不同引物和探针，并有效用于扩增，克隆，和/或测定所表达的表1和/或表4中所列基因的存在和/或水平。在一些实施方案中，该RT-PCR可以是定量RT-PCR。在一些情况在，可以在微射流装置(例如Fluidigm BIOMARKTMBMK-M-96.96平台)中实施定量RT-PCR。
其它方法包括通过微阵列技术检验或检测组织或细胞样品中来自至少一种表1中所列基因(例如例如FGFR3，TP53，和EGFR mRNA)的mRNA的方案。使用核酸微阵列，逆转录并标记来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品以生成cDNA探针。然后使探针杂交至在固体支持物上固定化的核酸阵列。该阵列配置成该阵列的每个成员的序列和位置是已知的。例如，可以将在某些疾病状态中潜在表达的基因选集在固体支持物上排列成阵列。经过标记的探针与特定阵列成员的杂交指示衍生该探针的样品表达该基因。疾病组织的差异基因表达分析能提供有价值的信息。微阵列技术利用核酸杂交技术和计算技术在一个实验内评估数以千计的基因的mRNA表达概况(参见例如WO 2001/75166)。关于阵列制作的讨论，参见例如美国专利No.5,700,637；美国专利No.5,445,934；和美国专利No.5,807,522；Lockart,Nature Biotechnology,14:1675-1680(1996)；及Cheung et al.,NatureGenetics 21(Suppl):15-19(1999)。
另外，可采用利用EP 1753878中记载的微阵列进行的DNA概况分析和检测方法。此方法利用短串联重复(STR)分析和DNA微阵列快速鉴定和区分不同DNA序列。在一个实施方案中，使经过标记的STR靶序列杂交至携带互补探针的DNA微阵列。这些探针长度不同以覆盖可能STR的范围。利用杂交后酶促消化自微阵列表面选择性去除DNA杂合物的带标记物的单链区。根据仍然杂交至微阵列的靶DNA的样式来推导未知靶物中重复的数目。
微阵列处理器的一个例子是Affymetrix***，它是商品化的且包含通过在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而制作的阵列。可使用本领域技术人员知道的其它***。
在RT-PCR或其它基于PCR的方法以外，用于测定生物标志物水平的其它方法包括蛋白质组学技术，以及个性化遗传概况，这是在分子水平根据患者响应治疗癌症所必需的。本文中的专门化微阵列(例如寡核苷酸微阵列或cDNA微阵列)可包含一种或多种生物标志物，其具有与对一种或多种抗癌疗法的敏感性或耐药性有关的表达概况。供本发明中使用的可用于检测核酸的其它方法牵涉高通量RNA序列表达分析，包括基于RNA的基因组分析，诸如例如RNASeq。
许多参考文献是可获得的，它们提供了应用上述技术的指导(Kohler et al.,Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1980)；Tijssen,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985)；Campbell，Monoclonal Antibody Technology(Elsevier，Amsterdam，1984)；Hurrell，MonoclonalHybridoma Antibodies:Techniques and Applications(CRC Press，Boca Raton，FL，1982)；及Zola，Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques，pp.147-158(CRCPress，Inc.，1987))。Northern印迹分析是本领域公知的一种便利的技术，记载于例如Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第2版，1989，Sambrook，Fritch，Maniatis，Cold Spring Harbor Press，10Skyline Drive，Plainview，NY 11803-2500。用于评估基因和基因产物的状态的典型方案可见于例如Ausubel et al.编,1995,Current ProtocolsIn Molecular Biology,单元2(Northern印迹)，单元4(Southern印迹)，单元15(免疫印迹)和单元18(PCR分析)。
2.蛋白质的检测
关于检测蛋白质生物标志物，诸如表1中所列那些(例如FGFR3，TP53，和/或EGFR)，多种蛋白质测定法是可获得的，包括例如基于抗体的方法以及质谱术和本领域已知的其它类似手段。在基于抗体的方法的情况中，例如，可以在足以形成抗体-生物标志物复合物的条件下使样品接触对所述生物标志物特异性的抗体，然后检测所述复合物。蛋白质生物标志物的存在的检测可以以许多方式来实现，诸如通过用于测定多种组织和样品(包括血浆或血清)的Western印迹(含或不含免疫沉淀)，2维SDS-PAGE，免疫沉淀，荧光激活细胞分选(FACS)，流式细胞术，和ELISA规程。使用此类测定法形式的一系列免疫测定技术是可获得的，参见例如美国专利No.4,016,043，4,424,279及4,018,653。这些包括非竞争类型的单个位点和两个位点或“三明治式”测定法，以及传统的竞争性结合测定法二者。这些测定法也包括经标记抗体对靶生物标志物的直接结合。
三明治式测定法是最有用且最常用的测定法之一。三明治式测定技术存在许多变化形式，本发明意图涵盖所有的变化形式。简言之，在一种典型的正向测定法(forwardassay)中，将未标记的抗体固定化于固体基片上，并使待测试的样品与结合的分子接触。温育合适的一段时间后，即足以容许抗体-抗原复合体形成的一段时间，然后添加经能够产生可检测信号的报道分子标记的，对所述抗原特异性的第二抗体，并温育，容许足以形成抗体-抗原-经标记抗体的另一种复合体的时间。洗掉任何未反应的物质，并通过观察由所述报道分子产生的信号来测定所述抗原的存在。结果可以是定性的(通过对可视信号的简单观察来进行)，或者可以是定量的(通过与含有已知量的生物标志物的对照样品比较来进行)。
正向测定法上的变化包括同时测定法(simultaneous assay)，其中同时将样品和经标记的抗体两者添加至结合的抗体。这些技术对本领域技术人员是公知的，包括会容易明白的任何微小变化。在一种典型的正向三明治式测定法中，将具有对所述生物标志物特异性的第一抗体或是共价地或是被动地结合至固体表面。典型地，所述固体表面是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素，聚丙烯酰胺，尼龙，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以采用试管，珠，微量板盘的形式，或者适于进行免疫测定法的任何其它表面。结合过程是本领域公知的，并且一般包括交联，共价结合，或物理吸附，清洗聚合物-抗体复合体，为测试样品做好准备。然后将测试样品的等分试样添加至固相复合体，并在合适的条件(例如从室温至40℃，诸如25℃和32℃之间，包括端点在内)下温育足够的一段时间(例如2-40分钟或者过夜，如果更方便的话)，容许抗体中存在的任何亚基结合。温育期后，清洗抗体亚基固相，干燥，并与对生物标志物一部分特异性的第二抗体一起温育。所述第二抗体连接有用于指示第二抗体对分子标志物结合的报道分子。
一种备选的方法包括将样品中的靶生物标志物固定化，然后使固定化的靶物暴露于特异性抗体，该特异性抗体可以是或不是经报道分子标记的。根据靶物的量和报道分子信号的强度，可以通过用所述抗体直接标记，使结合的靶物变成可检测的。或者，使对第一抗体特异性的经标记第二抗体暴露于靶物-第一抗体复合体以形成靶物-第一抗体-第二抗体三元复合体。通过报道分子所发出的信号检测所述复合体。如本说明书中使用的，“报道分子”指通过其化学性质提供分析上可鉴定的信号的分子，所述信号容许结合至抗原的抗体的检测。这种类型的测定法中最常用的报道分子是酶，荧光团，或含发射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。
在酶免疫测定法的情况中，酶是缀合至第二抗体的，一般藉由戊二醛或高碘酸盐进行。然而，会容易认可的是，存在极其多种不同的缀合技术，它们对技术人员是轻易可获得的。常用的酶包括辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，和碱性磷酸酶等。一般选择与特定酶一起使用的底物以在相应酶的水解作用后产生可检测的颜色变化。合适酶的例子包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。还可能采用产生发荧光产物的荧光底物而不是上文所记录的显色底物。在所有情况中，将酶标记的抗体添加至第一抗体-分子标志物复合体，容许结合，然后洗掉过量的试剂。然后将含有合适底物的溶液添加至抗体-抗原-抗体复合体。底物会与连接至第二抗体的酶起反应，给出定性的视觉信号，其可以被进一步地定量(通常通过分光光度法)以给出存在于样品中的生物标志物的量的指标。或者，发荧光化合物(诸如荧光素和罗丹明)可以以化学方法偶联至抗体，而不改变所述抗体的结合能力。通过使用特定波长的光线照射来激发时，荧光染料标记的抗体吸收光能，在分子中诱导激发态，接着发出光线，其特征性颜色是用光学显微镜在视觉上可检测的。如在EIA中那样，容许荧光标记的抗体结合至第一抗体-分子标志物复合体。洗掉未结合的试剂后，然后使剩余的三元复合体暴露于适当波长的光线，观察到的荧光表明感兴趣的分子标志物的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域中都是非常完善建立的。然而，还可以采用其它报道分子，诸如放射性同位素，化学发光或生物发光分子。
B.试剂盒
为了用于检测生物标志物，本发明还提供了试剂盒或制品。此类试剂盒可用于例如诊断罹患或怀疑罹患癌症(例如膀胱癌)的患者，为罹患癌症(例如膀胱癌)的患者提供预后，和/或确定具有癌症(例如膀胱癌)的患者是否会有效响应抗癌疗法。这些试剂盒可包括装载装置，装载装置被分成小格以接纳紧密排列的一个或多个容器装置，诸如管形瓶，管，等，每个容器装置装有所述方法中要使用的不同成分之一。例如，所述容器装置之一可以装有可检测标记的或可以可检测标记的探针。此类探针可以是分别对蛋白质或信使(message)特异性的抗体或多核苷酸。若试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸，则试剂盒还可具有装有用于扩增靶核酸序列的核苷酸的容器和/或装有报告手段(诸如结合至报告分子(诸如酶，荧光，或放射性同位素标记物)的生物素结合蛋白，例如亲合素或链霉亲合素)的容器。
此类试剂盒通常会包括上文所述容器和一个或多个其它容器，其中装有从商业和使用者立场看想要的材料，包括缓冲剂，稀释剂，滤器，针头，注射器，和印有使用说明的包装插页。容器上可存在标签，指示该组合物用于具体的应用，而且还可指示体内或体外使用的说明，诸如上文所描述的那些。
本发明的试剂盒有许多实施方案。一个典型的实施方案是一种试剂盒，包括容器，所述容器上的标签，和装在所述容器内的组合物，其中所述组合物包括结合蛋白质或自身抗体生物标志物的一抗，而且所述容器上的标签指示该组合物可用于评估样品中此类蛋白质或抗体的存在情况，且其中所述试剂盒包括说明书，其关于使用该抗体来评估特定样品类型中生物标志物蛋白质的存在情况。所述试剂盒可进一步包括一套用于制备样品并将抗体应用于样品的说明书和材料。所述试剂盒可以包括一抗(primary antibody)和二抗(secondary antibody)二者，其中所述二抗缀合有标记物，例如酶标记物。
另一个实施方案是一种试剂盒，包括容器，所述容器上的标签，和装在所述容器内的组合物，其中所述组合物包括一种或多种在严格条件下与表1中所列生物标志物的互补物发生杂交的多核苷酸，而所述容器上的标签指示该组合物可用于评估样品中表1中所列生物标志物的存在情况，且其中所述试剂盒包括说明书，其关于使用该多核苷酸来评估特定样品类型中生物标志物RNA或DNA的存在情况。
试剂盒中的其它任选成分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液，清洗缓冲液，底物缓冲液等)，其它试剂(诸如可以被酶标记物化学改变的底物，例如色原)，表位修复液，对照样品(阳性和/或阴性对照)，对照载玻片等。试剂盒还可包括用于解读使用该试剂盒获得的结果的说明书。
在又一些具体的实施方案中，对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可包括例如：(1)第一抗体(例如附着至固体支持物的)，其结合生物标志物蛋白质；和任选的(2)不同的第二抗体，其结合所述蛋白质或所述第一抗体且缀合有可检测标记物。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒可包括例如：(1)寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸，其与编码生物标志物蛋白质的核酸序列发生杂交，或(2)一对引物，其可用于扩增生物标志物核酸分子。所述试剂盒还可包括例如缓冲剂，防腐剂，和蛋白质稳定剂。所述试剂盒可进一步包括检测可检测标记物所必需的成分(例如酶或底物)。所述试剂盒还可包括对照样品或一系列对照样品，其能被测定并与测试样品进行比较。所述试剂盒的每种成分可以封装在单独的容器内，而各个容器都可与说明书(用于解读使用该试剂盒实施的测定法的结果)一起在单个包装内。
在一些实施方案中，试剂盒包含任何本文所述核苷酸序列，例如SEQ ID NO:1-51中的一项或多项。
V.药物配制剂
依照本发明使用的本文中描述的抗癌疗法(例如包含拮抗剂诸如FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，和/或EGFR拮抗剂的抗癌疗法)的治疗剂的治疗用配制剂通过将具有期望纯度的治疗剂与任选的药学可接受载剂，赋形剂或稳定剂混合，以冻干配制剂或水溶液的形式制备供贮存。关于配制剂的一般信息参见例如Gilman et al.,(eds.)(1990)，ThePharmacological Bases of Therapeutics，8th Ed.，Pergamon Press；A.Gennaro(ed.),Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition,(1990),Mack Publishing Co.,Eastori,Pennsylvania；Avis et al.,(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker,New York；Lieberman et al.,(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets Dekker,New York；Lieberman et al.,(eds.)(1990),Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems Dekker,New York；及KennethA.Walters(ed.)(2002)Dermatological and Transdermal Formulations(Drugs and thePharmaceutical Sciences),Vol 119,Marcel Dekker。
可接受的载剂，赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
适于皮下施用的冻干配制剂记载于例如美国专利No.6,267,958(Andya等人)。此类冻干配制剂可以用合适的稀释剂重建至高蛋白质浓度，重建的配制剂可皮下施用于本文中要治疗的哺乳动物。
还涵盖治疗剂的结晶形式。参见例如US 2002/0136719A1。
本文中的配制剂还可含有超过一种活性化合物(上文提到的第二药物)，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。此类药物的类型和有效量取决于例如配制剂中存在的治疗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。优选的此类第二药物如上所述。
活性组分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递***中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.Ed.(1980)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有所述拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯，水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利No.3,773,919)，L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
实施例
提供下述实施例以例示但非限制当前要求保护的发明。
实施例1：材料和方法
肿瘤样品
从Cureline，Inc.(South San Francisco，CA)(在得到圣彼德堡市临床肿瘤医院的伦理委员会批准并得到知情同意书的适当确认后)或者从The MT Group(Van Nuys，CA)(得到机构审查委员会(Sterling Institutional Review Board)批准后)获得204份***固定石蜡包埋(FFPE)的膀胱癌肿瘤样品的集合。该临床样品忠实地重演在膀胱癌中通常观察到的预期的约80％/20％男性/女性比，且非肌层侵入性膀胱癌(NMIBC；T0，T1)，肌层侵入性膀胱癌(MIBC；T2,T3)和转移的比例分别为约75％和约25％(图1)，与膀胱癌群体中这些阶段的临床发病率一致(Jemal et al.CA Cancer J.Clin.61(2):69-90，2011；Heney，Urol.Clin.North Am.19(3):429-433,1992；Hall et al.Urology 52(4):594-601，1998)。一个病例子集具有伴随的治疗信息，无疾病存活(DFS)，和总体存活(OS)注释，与各自组的预期临床参数相似(图1，表3)。
由两名独立的病理学家评估苏木精和曙红(H&E)染色切片，并且由一名病理学家标出具有少于70％的赘生性细胞结构的病例的肿瘤区域进行宏观解剖。总的说来，肿瘤含量范围为70-90％。如先前所述(Schleifman et al.PLoS One 9(3):e90761；Schleifmanet al.PLoS One 9(2):e88401)自宏观解剖的样品提取RNA和DNA。
表达分析
如先前所述(Schleifman et al.PLoS One 9(2):e88401)，对在用ENVIRENETM脱石蜡后使用High Pure FFPE RNA Micro试剂盒(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)从宏观解剖的FFPE肿瘤样品提取的RNA进行基因表达分析。对患者标本实施膀胱癌相关基因(见表1)的96种独特mRNA转录物的基因表达分析，以100ng总RNA开始，使用 Taq和预扩增反应混合物(Invitrogen,Carlsbad,CA)在单一反应中将其逆转录成cDNA并预扩增。预扩增反应中包括最终稀释度为0.05x最初测定法浓缩液(Applied Biosystems,Foster City,CA)的全部96套引物/探针。热循环条件如下：1个循环的50℃，15分钟；1个循环的70℃，2分钟；14个循环的95℃，15秒和1个循环的60℃，4分钟。将预扩增的cDNA稀释2倍，然后使用通用PCRMasterMix(Applied Biosystems,Foster City,CA)在BIOMARKTMBMK-M-96.96平台(Fluidigm,South San Francisco,CA)上依照制造商的说明书扩增。一式三份测定全部样品。使用2-ΔCt方法(Livak et al.Methods 25(4):402-408,2001)将循环阈(Ct)值转换成相对表达，其中ΔCt是对各患者标本计算的靶基因的均值减去96个Ct值的均值。表2显示用于指示基因的定制探针和寡核苷酸的核苷酸序列。
表1：定制膀胱癌微射流小组和相应的测定法
HGNC＝HUGO基因命名委员会。
表2：定制探针和引物的寡核苷酸序列
突变分析和下一代测序
对在用ENVIRENETM去石蜡后使用FFPE试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)自宏观解剖的FFPE组织提取的基因组DNA进行突变分析(Schleifman et al.PLoS One 9(3):e90761)。如先前所述(Schleifman et al.PLoS One 9(3):e90761)使用突变特异性qPCR检测PIK3CA，EGFR，KRAS，NRAS，HRAS，FGFR3，MET，BRAF，KIT，AKT1，和FLT3中的突变。使用ION AMPLISEQTM癌症热点小组v2(Life Technologies,Carlsbad,CA)依照制造商的指导方针(参见例如Tsongalis et al.Clin.Chem.Lab.Med.52(5):707-714,2014)使用IONTORRENTTM下一代测序进行下一代测序(NGS)。表3显示膀胱癌样品(WT，野生型；MUT，突变型)的NGS突变分析的结果的汇总。
表3：膀胱癌样品的NGS突变分析
FGFR3免疫组织化学
使用VentanaXT自动染色平台(Ventana Medical Systems Inc,Tucson,AZ)对4-μm厚的FFPE组织切片实施免疫组织化学(IHC)。为了检测FGFR3，载玻片经历使用CC1延长抗原修复的预处理，接着用稀释至1μg/mL的抗FGFR3，克隆15C3(Genentech)一抗染色并于室温温育60分钟。为了扩增FGFR3信号，以1μg/mL施加未缀合的家兔抗小鼠接头抗体(Jackson Immunoresearch，West Grove,PA)并于室温温育32分钟。这以后是抗家兔OMNIMAPTM辣根过氧化物酶(HRP)试剂盒(Ventana Medical Systems Inc，Tucson,AZ)。
将切片用苏木精复染，脱水，清洗并盖上盖玻片供检查。
细胞系存活力研究
自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas，VA)或德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ,Braunschweig,Germany)获得膀胱癌细胞系。将早期世代的细胞系存档于Genentech细胞库并通过多重短串联重复测定法或如先前所述(O’Brien etal.Clin.Cancer Res.16(14):3670-3683,2010)进行鉴别。在补充有10％胎牛血清(Sigma,St.Louis，MO)，非必需氨基酸，和2mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM或RPMI 1640中维持全部细胞系。
厄洛替尼(TARCEVATM)是一种选择性的且有力的EGFR抑制剂。其结构，选择性，和生物学特性的详情先前已有描述(Stamos et al.J.Biol.Chem.277(48):46265-46272,2002)。如先前所述(O’Brien et al.Clin.Cancer Res.16(14):3670-3683,2010)进行细胞存活力研究。将细胞一式四份在正常生长培养基中以2,500个细胞每孔的密度分配于384孔板中并允许贴壁过夜。通过用基于5uM剂量起始的3倍稀释系列的10个浓度处理来测定厄洛替尼的剂量响应。72小时后使用发光细胞存活力测定法(Promega,Madison，WI)测量细胞存活力。与只用DMSO处理的对照相比计算每个浓度的百分比存活力。
统计分析
为了鉴定组织样品簇(亚组)，用欧氏距离(Euclidean distance)和完全连锁(complete linkage)进行无监督等级聚簇。应用非参数Mann-Whitney检验(参见例如Mannand Whitney,Annals of Mathematical Statistics 18(1):50-60,1947)和Bonferroni校正(参见例如Bonferroni,Pubblicazioni del R Instituto Superiore di ScienzeEconomiche e Commerciali di Firenze 8:3-62，1936和Miller，SimultaneousStatistical Inference，2nd Ed.，Springer Verlag,pages6-8，1981)来进一步鉴定膀胱癌样品簇间的差异表达基因。DFS定义为自手术之日至复发或死亡之日的时间。OS类似地定义为自手术之日至死亡之日的时间。在知道患者无复发(对于DFS)或活着(对于OS)的最晚观察时间点审查存活结局。使用Kaplan-Meier估值(参见例如Kaplan and Meier，Journal ofthe American Statistical Association 53(282):457-481，1958)来估算随时间变化的DFS概率和存活概率。还从Kaplan-Meier DFS/OS曲线估值计算3年和5年DFS比率和存活率。对于簇间差异突变频率的显著性，实施费舍尔精确检验。如关于统计学比较指出的那样使用费舍尔精确检验(参见例如Fisher，Journal of the Royal Statistical Society 85(1):87-94,1922)和双尾T检验(参见例如Student，Biometrika 6(1):1-25,1908)。
实施例2：定制的基于微射流的膀胱癌基因表达小组的开发及其在分层存档膀胱癌临床样品中的应用
虽然基因组分析已提供了对膀胱癌的分子基础的有价值的见解，但是大多数先前的研究依赖于使用冷冻组织，它们产生高质量核酸且通常不是很好地适合于表征来自临床试验的存档标本。然而，来自临床试验的存档标本常常与伴随的治疗信息，无疾病存活(DFS)和总体存活(OS)信息，以及使它们成为癌症基因组分析的卓越平台的其它信息相关。在此我们开发了基于微射流的膀胱癌基因表达小组，它是为了分析***固定，石蜡包埋组织而优化的。定制膀胱癌Fluidigm小组由选择用于捕捉膀胱癌生物学的关键属性的96种基因构成(见表1)。表1中描述的定制膀胱癌Fluidigm小组包括用于数据质量控制和标准化的两种持家基因连同91种独特的膀胱癌相关基因(见图12A)。
我们在一个大型公众可得数据集中评估定制膀胱癌Fluidigm小组成功鉴定膀胱癌亚型的能力( et al.Clin.Cancer Res.18(12):3377-3386,2012)。基于来自等(见上文)的18,000种基因的表达的主成分分析(PCA)图与使用来自定制膀胱癌Fluidigm小组的82种重叠基因的PCA图的比较显示相当的样品隔离样式(图2A-2B)。接着，我们进行对角线线性判别分析(DLDA)(Diaz-Uriarte et al.BMC Bioinformatics 7:3,2006)以评估我们的小组在将来自研究的膀胱癌正确分类中的精确性。我们发现来自等(见上文)的18000种基因中的大约200种是以＞80％的精确性将其研究中报告的大多数亚型正确分类所需要的(图2C)。比较而言，少至20种来自膀胱癌Fluidigm小组的基因以＞80％的精确性将数据集正确分类(图2D)。这指示小组上小心选择的基因以高度精确性捕捉疾病的关键转录类别。
为了确认定制膀胱癌Fluidigm小组在测量FFPE样品中的基因表达中的强健性和再现性，我们进行了一系列质量控制实验(图3A-3E)。首先，我们进行系列稀释以评估96项测定法中每一项的性能，在必要时重新设计测定法，以实现对于全部测试的线性标准稀释曲线(图3A和3B)。其次，我们运行多套FFPE衍生RNA样品并在不同天运行的重复样品的结果中观察到高一致性(图3C和3D；R2＞0.98)。第三，我们注意到关于我们在每7次独立运行中包括的对照RNA样品的高度芯片间数据再现性(图3E；R2＞0.92)。总之，来自我们定性和定量评估的结果指示定制膀胱癌Fluidigm小组为转录分层膀胱癌提供了稳健的且生物学相关的平台。
我们在一套204份FFPE膀胱癌组织的分析中采用定制膀胱癌Fluidigm小组(见实施例1和图1)。Fluidigm基因表达数据的无监督等级分析揭示了5个与独特DFS概率有关的转录限定的膀胱癌组织簇(图4A-4F，图5A和5C)。驱动组织聚簇的是5大组共调节基因，包括受体酪氨酸激酶(RTK)信号传导基因，诸如成纤维细胞生长因子(FGFR)和表皮生长因子(EGF)途径成员，凋亡基因，包括肿瘤遏制基因TP53，以及上皮-间充质转变(EMT)基因(图5B)。
我们将注意力聚焦于三个主要的组织簇，因为它们包括大部分患者样品并自这个点起将它们称作绿色，黄色，和红色组(图4A)。Kaplan-Meier分析揭示红色组与比黄色组更好的DFS概率相关(图4B；HR＝0.54，P＝0.03)，而且黄色组具有比绿色组显著更好的DFS概况(图4B；HR＝0.29，P＝0.004)。鉴于在膀胱癌组织学和患者结局之间较好建立的关联(Nargund et al.Semin.Oncol.39(5):559-572,2012；Resnick etal.Curr.Opin.Oncol.25(3):281-288,2013)，我们接下来检查绿色，红色，和黄色组织组的组织病理学属性。并非令人惊讶的，我们观察到与最好的DFS概况相关的红色组中的大多数样品是NMIBC组织学的(图4B和4C，图6A-D)。黄色组由比红色组显著更高比例MIBC病例构成，而且转移性病例唯独聚簇入此组，无需有监督分析(图4C)。
令人惊讶的，与最差的DFS可能性相关的绿色组几乎完全由典型的非攻击性NMIBC组织学的样品构成(图4B和4C，图6A-D)。这是一项令人惊讶的观察结果，提示定制Fluidigm小组可能鉴定出一组可能受益于紧密的临床监测和治疗干预的具有快速复发NMIBC的患者。为了排除绿色组可能代表一种攻击性组织学变体的可能性，我们进行了来自绿色，红色，和黄色组的组织的综合检查(见例如图4D和4E)。正如预期的，在MIBC和转移性黄色组中存在与NMIBC红色组相比显著更高的侵入性前微***状组织学发生率(图4D；P＝0.0063，图6A-6D)。然而，我们没有观察到攻击性NMIBC绿色组中与红色组相比微***状组织学发生率的统计学显著差异(图4D；P＝0.2351，图6A-6D)。我们还检查了三个组织组中已报告与膀胱癌患者临床结局相关的免疫浸润物(Otto et al.World J.Urol.30(6):875-877，2012)，而且没有观察到它们之间的显著差异(图4E)。在属于绿色和红色组的样品的肿瘤阶段和等级中没有显著差异。因此，转录限定绿色组没有表现为代表与有利结局的红色组在组织学上不同的疾病亚型。
接着，我们确定在绿色组中观察到的快速疾病复发是否可归于此患者群体的治疗不足。我们检查了三个转录限定组中用卡介苗(BCG)疫苗，化疗，或放疗，及其组合治疗的频率(图4F)。相当分数的来自的NMIBC红色和侵入性/转移性黄色组的患者(＞60％)接受了治疗(图4F；P＝0.8836)。快速复发NMIBC绿色组的患者以比红色和黄色组二者显著更高的比率进行治疗(图4F；对于两项比较均为P<0.0001)。这些结果指示来自绿色组的病例的快速复发不是由于辅助治疗不足，而且可能存在来自此NMIBC亚型的攻击性肿瘤的分子驱动器。
因此，定制膀胱癌Fluidigm小组为分层存档膀胱癌组织提供了强健的平台。此小组上一套临床注释膀胱癌样品的分析揭示了3种转录独特膀胱癌亚型，包括与较差DFS可能性相关的NMIBC绿色组。
实施例3：FGFR3在快速复发NMIBC中高突变和过表达，而且侵入性和转移性肿瘤子集中的高表达与较差的临床结局相关
NMIBC的特征性特征之一是它们在大约60-70％的病例中携带成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)中的体细胞活化突变(van Rhijn et al.J.Pathol.198(2):245-251；Tomlinson et al.J.Pathol.213(1):91-98,2007；Martinez-Torrecuadrada etal.Clin.Cancer Res.11(17):6280-6290,2005；Kompier et al.PLoS One 5(11):e13821,2010；Juanpere et al.Hum.Pathol.43(10):1573-1582,2012；Gust et al.Mol.CancerTher.12(7):1245-1254,2013；Cappellen et al.Nat.Genet.23(1):18-20,1999；Ah-Ahmadie et al.J.Pathol.224(2):270-279,2011)。大多数FGFR3突变是胞外或近膜域中的错义替代，它们导致配体不依赖性受体二聚化及随后的活化(Tomlinson等，见上文；Cappellen等，见上文)。在侵入性和转移性疾病中FGFR3中的突变频率下降至11-16％的事实导致关于FGFR3是否在高级疾病中继续驱动肿瘤发生，或者是否其致瘤作用主要局限于膀胱癌发生的早期阶段的不确定性(Tomlinson等，见上文；Al-Ahmadie等，见上文；Qing etal.J.Clin.Invest.119(5):1216-1229,2009；Liu et al.Genet.Mol.Res.13(1):1109-1120,2014)。
我们使用捕捉绝大多数已知FGFR3突变的定制多重PCR小组评估FGFR3的突变状态(Schleifman et al.PLoS One 9(3):e90761)。红色组的NMIBC样品的分析揭示了大约60％的预期FGFR3突变频率，而且正如预期的，MIBC和转移性黄色组的样品展现大约15％的显著更低的FGFR突变频率(图7A)。已报告FGFR3中的突变驱动FGFR3的更高表达水平(Tomlinson等，见上文)。与这些报告一致，我们检测到在转录和蛋白质水平二者上与野生型样品相比突变体中显著更高水平的FGFR3表达(图7B和7C；对于两项比较均为P<0.0001)。我们推理绿色组中高频率FGFR3突变的存在可能进一步确认它属于NMIBC亚型。确实，我们在快速复发NMIBC绿色组中观察到频繁的FGFR3突变(图7A)。然而，令人惊讶的，来自绿色组的绝大多数样品包含FGFR3中的突变，甚至以比在NMIBC红色组中观察到的显著更高的频率(图7A和7D；P<0.0001)。绿色组中的高FGFR3突变在转录(图7E；对于两项比较均为P<0.0001)和蛋白质(图7F；对于绿色对红色为P＝0.0343，而对于红色对黄色为P<0.0001)水平二者上与比NMIBC红色和侵入性/转移性黄色组中显著更高的FGFR表达相关。
上文描述的数据指示FGFR3表达的高突变和伴随过表达与快速复发NMIBC相关。如果FGFR3在疾病晚期阶段继续起癌症驱动器的作用，那么升高的FGFR3表达应在膀胱癌发生期间得到维持，至少在病例的一个子集中。为了确定情况是否如此，我们在RNA和蛋白质水平二者上检查FGFR3的表达水平，而且发现66％的NMIBC表达高水平的FGFR3，如通过免疫组织化学(IHC)测定的(图7G)。尽管高FGFR3表达病例的发生率在MIBC和膀胱癌转移中降低，但是来自这些更加高级阶段的肿瘤的＞30％维持高表达水平的FGFR3(图7G，IHC得分2+/3+)，与高级疾病中对FGFR3的持续需求一致。
在我们研究的全部膀胱癌分组中，我们观察到对于高FGFR3表达病例的有利DFS和OS生存概率，这与先前发表的报告一致(et al.Clin.Cancer Res.18(12):3377-3386,2012；Dyrskjot et al.Nat.Genet.33(1):90-96,2003；Kim et al.Mol.Cancer 9:3,2010)。然而，出乎意料的，MIBC和转移性背景二者中的高FGFR3表达与降低的3年和5年DFS概率有关(图7H)。此外，我们的样品中高级疾病(MIBC和转移性膀胱癌)中的高FGFR3表达与降低的3年和5年OS可能性有联系(图7I)。为了验证这些观察结果，我们检查了提供FGFR3表达和OS数据二者的数个公开数据集(et al.Clin.Cancer Res.18(12):3377-3386,2012；Kim et al.Mol.Cancer 9:3,2010)。尽管在那两项研究中的整个群体中高水平的FGFR3赋予较好的预后，与我们的数据集中的观察结果相似，但是我们注意到来自Kim等，见上文的研究的高FGFR3表达侵入性/转移性膀胱癌与低FGFR3表达相比显著更差的OS可能性，由此提供了关于我们的发现的独立确认(图7J)。我们还观察到来自等，见上文的研究的高级阶段的高FGFR3肿瘤较之低FGFR3肿瘤的更差OS的趋势。
综上所述，这些数据支持FGFR3作为快速复发NMIBC的驱动器，以及侵入性(MIBC)和转移性背景中攻击性疾病的推动器的作用。数项研究证明了在体外和在体内抑制FGFR3遏制高FGFR3表达膀胱癌的肿瘤生长(Martinez-Torrecuadrada et al.Clin.CancerRes.11(17):6280-6290,2005；Gust et al.Mol.Cancer Ther.12(7):1245-1254,2013；Qing et al.J.Clin.Invest.119(5):1216-1229,2009；Gomez-Roman et al.Clin.CancerRes.11(2Pt 1):459-465,2005；Lamont et al.Br.J.Cancer 104(1)75-82,2011；Tomlinson et al.Oncogene 26(40):5889-5899,2007)。因此，其癌症高表达FGFR3的高风险膀胱癌患者(例如具有快速复发NMIBC，MIBC，或转移性膀胱癌的患者)代表了用FGFR3拮抗剂治疗的较好候选者。
实施例4：肿瘤阻抑物TP53在快速复发NMIBC中突变且过表达
定制膀胱癌Fluidigm小组鉴定出NMIBC的转录限定攻击性子集。比较表达分析显示45/96种基因(47％)在快速复发NMIBC绿色组和更加良性的红色组之间显著差异表达(P<0.05，用多重检验校正)。差异表达基因属于FGFR3途径，如上文描述的，而且还有肿瘤阻抑物TP53，鸟类成红细胞增多病癌基因B(ERBB)，上皮-间充质转变(EMT)，磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白质激酶B(PI3K-AKT)途径(图8)。
为了进一步在突变水平表征我们的样品，我们进行了NGS分析(Tsongalis etal.Clin.Chem.Lab.Med.52(5):707-714,2014)。正如预期的，NGS数据确认了上文描述的且图7A中呈现的FGFR3突变的存在(图9A，表3)。此外，NGS分析揭示了数种其它基因中的突变，其中包括TP53，PIK3CA，KRAS，VHL，EGFR，PTEN，和IDH2(图9A，表3)。已报告了侵入性和转移性膀胱癌中的TP53突变，以及表面疾病中较低程度的TP53突变(George etal.J.Clin.Oncol.25(34):5352-5358,2007)。我们注意到侵入性/转移性黄色组中以及NMIBC红色组的少数病例中TP53突变的存在(图9A)。然而，令人惊讶的，我们在快速复发NMIBC绿色组中观察到高频率的TP53突变(图9A)。在除了3个以外的全部病例中，突变映射至TP53的DNA结合域，而且黄色组，红色组，和绿色组每一个中的TP53突变位点大多是非重叠的(图9B)。
我们假设TP53中的突变可能促成绿色组中观察到的较差的DFS可能性。与此一致，我们注意到与红色组相比快速复发绿色组的NMIBC中显著较高频率的TP53突变，但是与侵入性/转移性黄色组中观察到的在统计学上没有差异(图9C；分别为P＝0.03和P＝0.3605)。TP53的表达水平在绿色组中也比在红色组和黄色组中显著更高(图9D；分别为P＝0.0187和P＝0.002)。P53转录靶p21的表达水平在绿色组中也比在其它两个组中显著更高，进一步确认了升高的TP53表达水平(图9E；对于两项比较均为P<0.0001)。我们观察到突变体中与来自研究分组的野生型样品相比显著更高的TP53蛋白质水平(图9F；P＝0.0201)。这些发现指示TP53基因在绿色组的快速复发NMIBC中突变并优先过表达。
我们接着在我们的患者分组中确定TP53过表达的临床影响。我们发现在我们的整个膀胱癌群体中具有高TP53表达水平的肿瘤趋向于具有比低表达肿瘤更加有利的DFS概况(图9G；P＝0.4218)。有趣的是，当我们与其它组分开查看NMIBC组中的TP53表达时，高TP53表达和更好的DFS概率之间的这种相关性逆转了(图9H)。在NMIBC组中，我们发现升高水平的肿瘤阻抑物赋予与低表达病例相比更差的(虽然不是统计学显著的)DFS可能性(图9H；HR＝1.99，P＝0.1292)。TP53签名已显示与侵入性膀胱癌背景中对化疗的抗性相关(Choi etal.Cancer Cell 25(2):152-165,2014)。在我们的研究分组的NMIBC子集中，高TP53表达与BCG治疗患者中显著更差的DFS相关，BCG是通常施用于膀胱癌患者的治疗(图9I；HR＝4.2，P＝0.0405)。然而，NMIBC中高TP53表达与较差的DFS之间的这种联系在未治疗患者(即未接受治疗的患者)中没有看到(图9J；HR＝0.57，P＝0.5749)。我们的数据提示高频率的TP53突变可能促成NMIBC患者中的攻击性肿瘤行为，而且这可能部分由于此患者群体中BCG治疗的反生产性(counter-productive)效果。
实施例5：膀胱癌细胞系中高EGFR表达与较差的临床结局相关且赋予对厄洛替尼的敏感性
攻击性微***状组织学的肿瘤中ERBB2中的突变已有报告(Ross et al.ClinCancer Res.20(1):68-75,2014)。在我们的患者分组中，我们没有检测ERBB2突变；然而，我们鉴定了来自快速复发NMIBC绿色组的肿瘤中而非来自更加良性的表面红色组或来自侵入性/转移性黄色组的肿瘤中EGFR中的突变(图3A)。我们进行了ERBB家族配体和受体的更深度的基因组分析以调查此途径作为膀胱癌驱动器的潜在作用(图10)。我们观察到来自黄色组的2/39份样品(～5％)中的EGFR拷贝数增益和4/39份样品(～10％)中的ERBB2拷贝数增益，以及来自红色组的1/30份样品(～3％)中的ERBB2拷贝数增益(图10)。这些发现与先前的报告一致(Weinstein et al.Nature 507(7492):315-322,2014；Capellen etal.Nat.Genet.23(1):18-20,1999)，而且指示该途径可能在膀胱癌发生中发挥作用。
尽管我们没有在快速复发NMIBC中检测ERBB家族成员的DNA拷贝数变化，但是Fluidigm数据分析揭示了快速复发NMIBC绿色组中的EGFR表达水平与更加良性的NMIBC红色组以及来自侵入性/转移性黄色组的样品二者相比显著更高(图11A；分别为P＝0.012和P＝0.0012)。为了调查EGFR可能至少部分促成NMIBC中的攻击性膀胱癌行为的可能性，我们检查了其肿瘤表达高水平EGFR的患者较之表达低水平EGFR的患者的DFS概率。在非侵入性背景中，与具有低表达恶性的患者相比，表达高水平EGFR的NMIBC患者具有降低的3年及5年DFS可能性(图11B)。在高级转移性背景中，高EGFR表达水平也与降低的3年和5年DFS概率相关(图11C)。此外，与低表达病例相比，来自我们的分组的具有转移性疾病的患者中的高EGFR表达与不利的3年和5年OS可能性相关(图11D)。
为了验证这些发现，我们评估了两个独立数据集中的EGFR表达水平的预后值(et al.Clin.Cancer Res.18(12):3377-3386,2012；Kim et al.Mol.Cancer 9:3，2010)。在来自这两项研究的侵入性/转移性病例中，我们观察到高EGFR表达伴随着降低的OS概率，3年和5年二者随访时间表均如此(图11E和11F)。由此，来自我们的分组的数据以及来自两项独立研究的数据提示高EGFR表达可能至少部分促成膀胱癌的攻击性行为。
为了作为膀胱癌中针对抗EGFR疗法的响应的预测性生物标志物评估EGFR表达水平，我们就其对EGFR小分子抑制剂厄洛替尼的敏感性筛选了一组膀胱癌细胞系(Stamos etal.J.Biol.Chem.277(48):46265-46272,2002)。UMUC-5，UMUC-10和UMUC-17细胞系展现不同程度的对厄洛替尼的敏感性，范围从对于UMUC-5的＞75％生长抑制(GI)至对于UMUC-17的大约40％GI(图11G)。另一方面，4种细胞系(RT-112，UMUC-3，SW780，和BFTC905)响应厄洛替尼治疗展现最低限度的GI(图11G)。接着，我们检查了我们的细胞系中EGFR表达的水平。与不敏感的膀胱癌细胞系(<25％的最小GI)相比，敏感的细胞系(＞25％GI)表达显著更高水平的EGFR(图11H；P＝0.0106)。这些结果指示膀胱癌中EGFR的表达水平预示了它对EGFR途径抑制剂(例如厄洛替尼)的敏感性。
实施例6：定制膀胱癌Fluidigm小组将膀胱癌样品准确归类为基底亚型和管腔亚型
此实施例描述用于膀胱癌的转录分析的定制膀胱癌Fluidigm小组的另外的开发和计算机验证，包括存档的FFPE膀胱癌临床样品。如实施例1和2中描述的，该小组的基因包括受体酪氨酸激酶(RTK)途径的成分，诸如FGFR，ERBB，MET，PI3K/AKT，和MAPK轴；细胞周期和基因组稳定性基因，像TP53；以及细胞分化和发育的调节中涉及的基因，和上皮-间充质转变(EMT)(图12A)。
在计算机上，我们评估了定制膀胱癌Fluidigm小组(见表1)捕捉来自大型公开数据集( et al.Clin.Cancer Res.18(12):3377-3386,2012)的样品的关键分子和组织学属性的能力。基于与定制膀胱癌Fluidigm小组上的基因对应的125种探针的表达的样品的无监督等级聚簇揭示了两个主要分支(图12B)。左分支富集低级(G1/G2)肿瘤，T1期癌症，和MS1分子类别，如等，见上文限定的(图12B)。在右分支下，我们注意到G3/G4肿瘤的优势，及T3/T4恶性的富集，MS2a类别的膀胱癌的共聚簇，和来自限定的分子亚型的MS2b肿瘤的共隔离(图12B)。
接着，我们计算了肿瘤等级，TNM阶段，和转录类别的误分类错误率，如等，见上文定义的，使用全部24,394套Illumina探针或使用与定制膀胱癌Fluidigm小组的内容重叠的125套探针，并测定当在质心分类器中使用并通过交叉验证评估时逐渐缩小的基因子集的预测能力(Tibshirani et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:6567-6572，2002)(图12C)。我们发现了对肿瘤等级和TNM阶段的大约40％的相当的误分类错误率，以及对MS1，MS2a，和MS2b类别的大约20％的误分类差错频率(图12C)。在两种病例中均观察到误分类错误率随探针数目减少而相似增加(图12C)。这些结果提示定制膀胱癌Fluidigm小组的基因以高度的精确度捕捉分子类别，以及以与使用等，见上文中使用的Illumina微阵列的完整内容相似的有效性捕捉肿瘤等级和TNM阶段。
鉴于最近描述的膀胱癌的基底和管腔亚型的生物学和临床相关性(Damrauer etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111:3110-3115,2014；Choi et al.PLoS One 7:e30206,2012)，我们检查了定制膀胱癌Fluidigm小组在数个公开数据集中区分这两个分子亚群的能力。使用Damrauer等，见上文和Choi et al.Cancer Cell 25:152-165,2014在其发现和验证分组中确定的基底/管腔指派，我们基于与膀胱癌Fluidigm小组中的基因对应的探针的表达利用无监督办法对样品进行等级聚簇(图12D)。此办法将来自等，见上文数据集的39/44份(80％)管腔样品和42/47份(89％)基底样品，和来自Kim分组(Kim etal.Molecular Cancer 9:3,2010)的10/12份(83％)管腔肿瘤和17/18份(94％)基底肿瘤正确归类(图12D)。此外，此办法将来自Damrauer发现集(Damrauer等，见上文)的标本精确归类成管腔和基底亚型，分别为33/33例(100％)和23/28例(82％)病例(图12D)。最后，定制膀胱癌Fluidigm小组中的基因能够基于来自Choi发现数据集(Choi等，2012，见上文)的管腔和基底状态将样品正确归类，分别为23/24例(96％)和23/23例(100％)案例。综上所述，来自此计算机分析的发现证明定制膀胱癌Fluidigm小组中仔细选择的基因精确检测四个公开数据集中的基底/管腔状态。
为了评估定制膀胱癌Fluidigm小组的强健性和在测量FFPE样品中的基因表达的再现性，我们进行了一系列质量控制实验。首先，我们进行了系列稀释以评估每次测定的性能，必要时重新设计引物以实现对所有测试的线性标准稀释曲线(图13A)。我们还运行了多套FFPE衍生RNA样品并观察到来自不同天运行的重复样品的小组上每种基因的标准化表达的高一致性(图13B，R2范围＝0.98-0.99)。最后，我们注意到对于7次独立运行的每次中包括的通用人RNA对照的高度芯片间数据再现性(图3E，R2范围＝0.91-0.98)。
总而言之，来自我们的定性和定量评估的结果指示定制膀胱癌Fluidigm小组在技术上是强健的，而且可用于转录分层FFPE膀胱癌组织。为了进一步证明定制膀胱癌Fluidigm小组用于转录表征FFPE组织的效用，我们分析了一套204份样品，由原发性NIMBC，MIBC，以及***和远程MET构成，如上文实施例1和表1中描述的。我们检查了这些样品如何就基底/管腔转录特征而言与来自数个公开数据集的样品比较。正如预期的，使用来自与我们的小组上的基因对应的探针的中值集中表达的来自四个公开数据集(Damrauer等，2014，见上文；Kim等，2010，见上文；等，2012，见上文；和Choi等，2014，见上文)的样品的无监督等级聚簇揭示了基底和管腔样品的清楚隔离(图14A)。值得注意的是，Kim管腔样品与来自三个其它数据集的基底样品聚簇，并因此是此分析中的离群值(图14A)。我们观察到实施例1和图1中描述的膀胱癌分组中的NMIBC与管腔样品聚簇，而MIBC和MET表现为更加基底并与来自公开数据集的基底样品一起聚簇(图14A)。
为了进一步评估实施例1和图1中描述的204份FFPE样品的基底/管腔(B/L)转录签名，我们接着建立了用于计算这些肿瘤中每一个的B/L相似性得分的方法。首先，我们将公开数据集中与定制膀胱癌Fluidigm小组的基因对应的全部探针的表达进行中值集中，并计算基底和管腔小组中的平均基因表达值，如Damrauer等，见上文和Choi等，见上文指派的(图14B)。这容许我们获得来自公开数据集的管腔和基底小组中这些基因的每一个的表达的平均视图(图14B和14C)。例如，FGFR3在管腔样品中具有与我们的小组中的任何其它基因相比最高的平均表达值，而且平均FGFR3表达水平是来自公开数据集的基底样品中最低的之一(图14B)。然后我们通过计算与公开基底和管腔概况的相关性来导出每份FFPE样品的B/L相似性得分(图14C)。
实施例1和图1中描述的204份FFPE样品的无监督等级聚簇显示具有独特基因表达样式的两个主要分支：(1)右分支，其中具有较低B/L相似性得分的样品(管腔样的)共聚簇；和(2)左分支，它由具有较高B/L得分的样品(基底样的)构成(图15A)。统计分析确认了在指示管腔状态的左分支中显著更低的B/L得分，以及与分级树的右臂下的基底状态一致的显著更高的B/L得分(图15B，顶部左方)。我们观察到管腔组中与基底组相比显著更高分数的NMIBC(图15B，顶部右方)。MIBC在基底和管腔组二者中均呈现；然而，在基底组中观察到显著更高比例的MIBC(图15B)。有趣的是，几乎所有MET在分级树的基底臂下聚簇，提示实施例1和图1中描述的膀胱癌分组中的大多数MET展现基底转录概况(图15A和15C)。
如上文描述的，NMIBC的特征性特征之一是它们在大约60-80％的病例中携带FGFR3中的体细胞活化突变，而且在MIBC和MET中已报告低得多的大约15％的频率。我们使用定制等位基因特异性PCR小组评估了来自分组的样品中FGFR3和其它癌症相关基因的突变状态(Schleifman等，见上文；Tomlinson等，见上文；van Rhijn等，见上文；Martinez-Torrecuadrada等，见上文；Cappellen等，见上文，1999；和Al-Ahmadie等，见上文)。正如预期的，我们发现大约75％的肿瘤共聚簇在管腔标记下，是比来自基底组的样品中观察到的大约20％显著更高的分数(图15A和15D)。已报告FGFR3中的突变驱动更高表达水平的FGFR3蛋白质。与这些报告一致，我们注意到在来自管腔组的样品中与来自基底组的样品相比显著更高水平的FGFR3蛋白质，如通过IHC测量的(图15A和15D)。FGFR3突变和表达数据提供了我们的样品的管腔和基底状态的分子确认。
在B/L转录特征之外，我们评估了定制膀胱癌Fluidigm小组在测量属于已知涉及膀胱癌发生的途径的基因的表达中的效用，诸如TP53途径，PI3K/AKT途径，ERK/MAPK途径，和细胞周期信号传导轴的成分。我们使用经排列调整的p值来控制多重假设测试，将49/91种独一无二的基因鉴定为在基底和管腔组之间显著差异表达(表4)，并使用软件将这些基因定位至各途径(图15F)。
表4：在基底和管腔组之间差异表达的基因
在管腔肿瘤中呈现显著活化得分的途径包括NF-κB，TP53，ERK/MAP，G1/S细胞周期检查点，HGF，和VEGF信号传导途径(图15F)。另一方面，在基底组中显著活化的途径包括PTEN，PI3K/AKT，神经酰胺，和细胞周期调节信号传导途径(图15F)。使用软件的上游途径活化分析还揭示了属于管腔组的样品具有与***受体(ER)活化一致的表达概况，包括高水平的FGFR3，GATA3，CCND1，和ERBB3，低水平的AXL1，CXCL1，FGFR1，和BCL2，以及低表达水平的EMT基因，诸如SNAI1和ZEB1(图17A)。相反，属于基底组的样品展现这些基因的相反表达概况(图17B)。这些发现证明了我们的小组可提供关于测量FFPE组织中膀胱癌相关途径的转录状态的信息。
原发性膀胱癌的组织病理学特征在历史上驱动对膀胱癌患者的临床管理决策。随着对膀胱癌的遗传驱动器的了解增加，出现了新的途径用于基于疾病的分子属性的治疗性干预。然而，常常使用原发性肿瘤的分子特征来指导利用靶向剂的临床决策，甚至对于在转移性背景下正开发的药物。为了开始解决原发性肿瘤的关键分子特征是否在转录水平上代表膀胱癌转移中的那些，我们比较了来自相同患者的9对匹配的原发性肿瘤/MET的B/L得分。我们首先检查了下一代测序(NGS)数据并发现来自全部9对原发性/转移的变体是高度相关的，由此确立了匹配的肿瘤确实来自相同的患者(图16A和18)。原发性肿瘤和匹配的MET的B/L得分之间的关联分析指示5/9对具有几乎相同的B/L得分，而且2/9在其B/L状态中呈现非显著差异(图17A和17B)。有趣的是，我们观察到2/9个病例中B/L得分的显著变化，二者特征均为具有管腔原发性肿瘤和基底MET(图17A和17B)。这些发现提示原发性肿瘤的B/L状态并非总是反映在转移性病变中观察到的，而且指示膀胱癌转移的分子特征可能保证更加精确地指导临床的治疗决策。
用于实施例6的另外的材料和方法
公开数据集的分析
使用数个公开数据集来确定定制膀胱癌Fluidigm小组基因捕捉疾病的肿瘤阶段，等级，和关键转录特征诸如基底/管腔状态的预测能力。从Gene Expression Omnibus(GEO)网站(ncbi.nlm.nih.gov/geo/GSE32894)下载Illumina Human HT-12V3.0基因表达数据(et al.2012,见上文)。使用中位数平滑将表达数据标准化(Tukey etal.Exploratory Data Analysis,Addison-Wesley，publishers，1977)。使用平均连锁，1-皮尔森相关距离度量应用无监督等级聚簇分析以寻找样品分组，并使用已报告样品的肿瘤等级，TMN阶段，和分子类别(et al.2012,见上文)。评估定制膀胱癌Fluidigm小组的91种独特基因正确鉴定肿瘤等级，TNM阶段，和分子类别的能力，使用质心分类器办法进行测定。使用PAMR R文库(Tibshirani et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:6567-6572,2002)使用完整阵列或等，见上文表达数据集的对应的125个探针子集创建交叉验证的误分类错误曲线。在四个文献数据集(GSE32894，GSE5287，GSE13507，GSE48075)中评估定制膀胱癌Fluidigm小组的基因经由转录概况分析鉴定基底样和管腔样样品的能力。
对这些公开数据进行的基底或管腔归类如Damrauer等，见上文所述。简言之，从NCBI Gene Expression Omnibus(GSE5287)下载Damrauer等，见上文发现样品(N＝30，Affymetrix人基因组U133A阵列)。使用与定制膀胱癌Fluidigm小组上的基因对应的Affymetrix探针集。然后将对数换算的表达数据的剩余子集均值集中并标准化至单位方差。然后跨越归类为管腔样的12份样品和归类为基底样的18份样品(经由作者通讯接收的归类)计算91种独特基因的平均基因表达值以产生基底和管腔表达概况图。对三个其它公开数据集(GSE32894，GSE13507，GSE48075)重复此过程。
肿瘤
在此实施例中描述的实验中使用了实施例1中描述的204份***固定石蜡包埋的(FFPE)膀胱癌肿瘤样品的集合。如实施例1中所述从宏观解剖的样品提取RNA和DNA。
FFPE肿瘤的Fluidigm表达分析
如先前所述(O’Brien et al.Clin.Cancer Res.16:3670-3683，2010)，对在用脱石蜡后使用High Pure FFPE RNA Micro试剂盒(Roche Diagnostics,Indianapolis，IN)从宏观解剖的FFPE提取的RNA进行基因表达分析。对患者标本实施膀胱癌相关基因的96种独特mRNA转录物的基因表达分析，以100ng总RNA开始，使用SuperscriptIII/Platinum Taq和预扩增反应混合物(Invitrogen,Carlsbad,CA)在单一反应中将其逆转录成cDNA并预扩增。预扩增反应中包括最终稀释度为0.05x最初测定法浓缩液(Applied Biosystems,Foster City,CA)的全部96套Taqman引物/探针。热循环条件如下：1个循环的50℃，15分钟；1个循环的70℃，2分钟；14个循环的95℃，15秒和60℃，4分钟。将预扩增的cDNA稀释2倍，然后使用通用PCR MasterMix(AppliedBiosystems,Foster City,CA)在BIOMARKTMBMK-M-96.96平台(Fluidigm,South SanFrancisco,CA)上依照制造商的说明书扩增。一式三份测定全部样品。使用ΔCt方法(O’Brien等，见上文)将循环阈(Ct)值转换成相对表达，其中ΔCt是对各自患者标本计算的靶基因的均值减去参照基因的几何均值。对于定制膀胱癌Fluidigm小组上评估的基因，将循环阈(Ct)值使用中位数平滑进行标准化(Tukey等，见上文)。使用1-皮尔森相关性作为距离度量用平均连锁方法对标准化数据进行差异表达基因的等级聚簇，并随后使用R形象化。
突变分析
对在用脱石蜡后使用QIAamp FFPE试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)自宏观解剖的FFPE组织提取的基因组DNA进行突变分析(Lindgren et al.PLoS One 7:e38863,2012)。如先前所述(Schliefman et al.PLoS One 9:e88401,2014)使用突变特异性qPCR检测PIK3CA，EGFR，KRAS，NRAS，HRAS，FGFR3，MET，BRAF，KIT，AKT1，FLT3中的突变。
免疫组织化学
如实施例1中所述实施免疫组织化学。
基底/管腔相似性得分的计算，匹配的原发性肿瘤和转移的分析，及统计分析
如下测定实施例1中所述来自204份膀胱癌分组FFPE样品的样品的基底/管腔相似性得分，首先如先前所述(Damrauer等见上文)从公开的Damrauer等发现数据集派生基底/管腔表达概况。接着，测定每个概况和每个均值集中，单位方差标准化的FFPE样品之间的基底和管腔皮尔森相关性。组合这两个相关性得分以产生总的B/L相似性得分：B/L得分＝(基底概况相关性–管腔概况相关性)/2.0。B/L得分范围为+1.0至-1.0，得分高于0指示基底样样品，而得分低于0指示管腔样样品。相似地，以相似的方式计算9份匹配的原发性和转移性样品的B/L相似性得分。为了确认匹配样品是来自相同患者的，使用ION AMPLISEQTM癌症热点小组v2(Life Technologies,Carlsbad,CA)依照制造商的指导(Tsongalis et al.CCLM/FESCC 52:707-714,2014)进行下一代测序(NGS)，并通过比较所有变异位点处的等位基因频率来计算皮尔森相关性，其中两份样品都具有至少100x的阅读覆盖率且至少一份样品具有＞10％的等位基因频率(平均而言，在任两份样品之间比较120个位点)。通过将它们的相关性得分与随机样品配对的3,500个相关性进行比较找出原发性-转移性样品错配的可能性。将原发性和匹配的转移性之间的B/L得分的差异与由于典型***误差造成的预期差异进行比较。通过从定制膀胱癌Fluidigm小组进行基因采样及替换随机选择的样品并重新计算100,000种排列的B/L得分来实现***误差的估算。对于簇之间的差异突变频率的显著性，实施费舍尔精确检验。对全部其它统计学比较使用费舍尔精确检验和双尾t检验。

Claims (53)

1.一种治疗罹患膀胱癌的患者的方法，该方法包括对该患者施用治疗有效量的抗癌疗法，其中自该患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平已经测定为相对于该至少一种基因的参照水平升高：FGFR3，TP53，和EGFR。
2.一种用于诊断患者中的膀胱癌的方法，该方法包括下述步骤：
(a)测定自该患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和EGFR；并
(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平的升高鉴定具有膀胱癌的患者。
3.权利要求2的方法，进一步包括(c)告知该患者他们具有膀胱癌。
4.权利要求2或3的方法，进一步包括(d)当检测到该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平的升高时为了所述患者的治疗选择抗癌疗法。
5.权利要求2-4任一项的方法，进一步包括(e)对该患者施用治疗有效量的抗癌疗法。
6.一种用于罹患膀胱癌的患者的预后的方法，该方法包括：
(a)测定自该患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和EGFR；
(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平；并
(c)为该患者确定预后，其中该患者样品中相对于该参照水平升高的该至少一种基因的表达水平指示较差的预后。
7.权利要求6的方法，其中该预后是存活的预后。
8.权利要求6或7的方法，其中在对该患者施用抗癌疗法之前进行该方法。
9.权利要求6-8任一项方法，进一步包括(d)当确定该患者具有较差的存活预后时，将该患者鉴定为很有可能受益于抗癌疗法的施用。
10.权利要求6-9任一项的方法，进一步包括(e)如果确定该患者具有较差的存活预后的话，对该患者施用治疗有效量的抗癌疗法。
11.权利要求6-10任一项的方法，其中该存活是无疾病存活或总体存活。
12.一种确定具有膀胱癌的患者是否很有可能响应抗癌疗法的治疗的方法，该方法包括：
(a)测定自该患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和EGFR；并
(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平的升高鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。
13.一种为具有膀胱癌的患者优化抗癌疗法的治疗功效的方法，该方法包括：
(a)测定自该患者获得的样品中至少一种下述基因的表达水平：FGFR3，TP53，和EGFR；并
(b)比较该至少一种基因的表达水平与该至少一种基因的参照水平，其中该患者样品中该至少一种基因的表达水平相对于该参照水平的升高鉴定很有可能响应包含抗癌疗法的治疗的患者。
14.权利要求12或13的方法，进一步包括(c)对该患者施用治疗有效量的抗癌疗法。
15.权利要求1，4，5，或8-14任一项的方法，其中该抗癌疗法包含FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，和/或EGFR拮抗剂。
16.权利要求15的方法，其中该抗癌疗法包含FGFR3拮抗剂和EGFR拮抗剂。
17.权利要求15或16的方法，其中该FGFR3拮抗剂，EGFR拮抗剂，或TP53拮抗剂是抗体或其功能性片段。
18.权利要求17的方法，其中该FGFR3拮抗剂是抗FGFR3抗体，或其功能性片段。
19.权利要求17的方法，其中该EGFR拮抗剂是抗EGFR抗体，或其功能性片段。
20.权利要求17的方法，其中该TP53拮抗剂是抗TP53抗体，或其功能性片段。
21.权利要求15或16的方法，其中该FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，或EGFR拮抗剂是小分子拮抗剂。
22.权利要求21的方法，其中该FGFR3拮抗剂或EGFR拮抗剂是酪氨酸激酶抑制剂。
23.权利要求22的方法，其中该EGFR拮抗剂是厄洛替尼(erlotinib)(TARCEVATM)。
24.权利要求15-23任一项的方法，其中该抗癌疗法进一步包含(i)选自下组的药剂：抗肿瘤剂，化疗剂，生长抑制剂，和细胞毒剂，(ii)放疗，或(iii)其组合。
25.权利要求1-24任一项的方法，其中通过测量mRNA来测定自该患者获得的样品中该至少一种基因的表达水平。
26.权利要求25的方法，其中通过聚合酶链式反应(PCR)测定法测定自该患者获得的样品中该至少一种基因的表达水平。
27.权利要求26的方法，其中该PCR测定法是定量PCR测定法。
28.权利要求1-24任一项的方法，其中通过测量蛋白质来测定自该患者获得的样品中该至少一种基因的表达水平。
29.权利要求28的方法，其中通过免疫组织化学(IHC)方法测定自该患者获得的样品中该至少一种基因的表达水平。
30.权利要求1-29任一项的方法，其中自该患者获得的样品是肿瘤样品。
31.权利要求30的方法，其中该肿瘤样品是***固定-石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品。
32.权利要求1-31任一项的方法，进一步包括测定至少两种该基因的表达水平。
33.权利要求32的方法，进一步包括测定所有三种该基因的表达水平。
34.权利要求1-33任一项的方法，其中FGFR3的表达水平已经测定为相对于参照水平升高至少2倍。
35.权利要求34的方法，其中FGFR3的表达水平已经测定为相对于参照水平升高至少4倍。
36.权利要求1-35任一项的方法，其中EGFR的表达水平已经测定为相对于参照水平升高至少4倍。
37.权利要求36的方法，其中EGFR的表达水平已经测定为相对于参照水平升高至少8倍。
38.权利要求1-37任一项的方法，进一步包括测定自该患者获得的样品中至少一种选自下组的另外的基因的表达水平：DUSB3，FRS2，TSC1，ERBB3，CDKN1A，CCND1，TP63，MMP2，ZEB2，PIK3CB，PIK3R1，MDM2，SNAI2，AXL，ZEB1，BCL2B，TSC2，RB1，FGFR32，PIK3IP1，MTOR，PIK3CA，PTEN，AKT1，BCL2A，FRS3，ERBB2，FGFR31，FGF1，SNAI1，FGFR34，FGF9，和FGF2，其中该至少一种另外的基因的表达水平相对于该至少一种另外的基因的参照水平有变化。
39.权利要求1-38任一项的方法，其中该膀胱癌是非肌肉侵入性膀胱癌，肌肉侵入性膀胱癌，或转移性膀胱癌。
40.权利要求39的方法，其中该非肌肉侵入性膀胱癌是复发性非肌肉侵入性膀胱癌。
41.一种治疗罹患膀胱癌的患者的方法，该方法包括对该患者施用治疗有效量的除卡介苗(BCG)疫苗以外的抗癌疗法，其中自该患者获得的样品中TP53的表达水平已经测定为相对于TP53的参照水平升高。
42.权利要求41的方法，其中该抗癌疗法包含FGFR3拮抗剂，EGFR拮抗剂，和/或TP53拮抗剂。
43.权利要求42的方法，其中该抗癌疗法包含FGFR3拮抗剂和EGFR拮抗剂。
44.权利要求42或43的方法，其中该FGFR3拮抗剂，EGFR拮抗剂，或TP53拮抗剂是抗体，或其功能性片段。
45.权利要求44的方法，其中该FGFR3拮抗剂是抗FGFR3抗体，或其功能性片段。
46.权利要求44的方法，其中该EGFR拮抗剂是抗EGFR抗体，或其功能性片段。
47.权利要求44的方法，其中该TP53拮抗剂是抗TP53抗体，或其功能性片段。
48.权利要求42或43的方法，其中该FGFR3拮抗剂，TP53拮抗剂，或EGFR拮抗剂是小分子拮抗剂。
49.权利要求48的方法，其中该小分子拮抗剂是酪氨酸激酶抑制剂。
50.权利要求49的方法，其中该EGFR拮抗剂是厄洛替尼(TARCEVATM)。
51.权利要求41-50任一项的方法，其中该抗癌疗法进一步包含(i)选自下组的药剂：抗肿瘤剂，化疗剂，生长抑制剂，和细胞毒剂，(ii)放疗，或(iii)其组合。
52.权利要求41-51任一项的方法，其中通过测量mRNA来测定自该患者获得的样品中TP53的表达水平。
53.权利要求41-51任一项的方法，其中通过测量蛋白质来测定自该患者获得的样品中TP53的表达水平。
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