CN110055331A - 一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用。本申请的试剂盒包括用于高通量测序检测PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因突变情况的引物组合。本申请的试剂盒，灵敏度高、特异性强能有效提升血尿病人膀胱癌的检出率、提升早期发现率，提升病人5年生存率。采用本申请的试剂盒进行膀胱癌辅助筛查，以尿液为检测样本，取样方便，属于无创检测，能提升受检者的接受程度，有利于扩大膀胱癌筛查的覆盖人群，降低中国膀胱癌发生率，为全民健康提供保障。更为重要的是，采用本申请试剂盒进行筛查，可以有效避免阴性患者因行膀胱镜带来的***、尿路损伤等风险，提高患者的依从性，从而改善就医体验与医患关系。

Description

一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用
技术领域
本申请涉及膀胱癌基因检测领域，特别是涉及一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿液***最常见的恶性肿瘤，占我国泌尿液生殖系肿瘤发病率的第一位。2015年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病数约为8.03万，恶性肿瘤死亡数约为3.29万，发病率和死亡率随年龄增长而增加。血尿液是膀胱癌最常见的症状，研究发现12％的血尿病人经检查发现是膀胱癌。
目前临床应用的血尿检查一般有尿常规、B超、尿液脱落细胞学检查和膀胱内窥镜检查等。膀胱内窥镜检查被视为膀胱癌诊断的金标准，但膀胱镜检查可能导致如***、尿道损伤、膀胱损伤等负面影响。普通膀胱镜检通常令患者十分痛苦，患者依从性差；而无痛膀胱镜检查仍然会有麻醉风险，且收费较高，也无法避免***等负面影响的风险。超声检查虽然不会有膀胱内窥镜检查的负面作用，但是其灵敏度只有60-75％，特异度只有40-85％，无法准确筛查出癌症患者。
因此，无创的尿液标志物检测可作为膀胱癌辅助诊断或筛查非常好的参考方法。目前，无创的膀胱癌尿液标志物检测主要包括尿液脱落细胞学检查、荧光原位杂交技术和尿液蛋白检测。尿液脱落细胞学检查具有无创伤、特异性高、非侵入性的优点，但是其敏感性为13％-75％，特异性为85％-100％，且受多种因素影响。荧光原位杂交(FISH)技术也是一种尿液无创检测方法，检测3号、7号、17号染色体以及9号染色体的变异情况来辅助诊断***，有助于术后监测及评估复发危险性。目前膀胱癌诊断临床应用的FISH技术灵敏度达到90.78％，然而特异性较低，只有82.35％，其特异性与脱落细胞学检查没有统计学差异。无创的尿液蛋白检测，例如***抗原(Bladder tumor antigen,BTA)检测，采用化学发光法定量检测尿液中的BTA，灵敏度只有76.7％，特异度90.9％。另一种无创的尿液蛋白检测，尿核基质蛋白22(Nuclear matrix protein 22,NMP22)检测，北大吴阶平泌尿外科多中心临床试验证明胶体金法检测NMP22，其敏感性也只有69.6％，特异性84.9。美国FDA已经批准BTA Stat、BTA、Trak、NMP22、ImmunoCyt和FISH用于膀胱癌的诊断和术后随诊检查，其中ImmunoCyt是一种免疫细胞学检查。上述方法除FISH以外均已应用多年，总的来看，仍存在敏感性和特异性不足的问题。因此，有必要寻求一种新的灵敏度更高、特异性更强的无创的膀胱癌肿瘤检测方案。
高通量测序推动了基因测序行业发展，同时也极大地拓展了基因检测在精准医疗领域的应用。肿瘤液体活检由于其在检测肿瘤、辅助治疗方面的明显优势，被列为2015年十大突破技术之一，检测对象包括CTC、cfDNA、外泌体等。其中，cfDNA即游离DNA(Cell-freeDNA，cfDNA)，又称循环DNA，是存在于血液、尿液中游离于细胞外的DNA。cfDNA中来自肿瘤基因组的游离DNA片段，称为ctDNA；ctDNA与肿瘤细胞本身的DNA特点存在一致性，能够反映肿瘤的特征性改变。通过检测体液中的游离DNA的变异，例如突变、缺失、***、重排、拷贝数异常、甲基化等，可反映肿瘤组织的克隆特点，作为判断肿瘤良恶性，肿瘤疗效观测，复发监测的有效手段。cfDNA作为一种新型的诊断标志物，其应用价值在多种实体肿瘤中得以证实。cfDNA的无创性和易获得性，是液体活检的重要方式，被认为可以用于检测肿瘤早期诊断，进展过程，预后判断及个性化用药指导，是精准医疗的必备手段。
癌症早期患者的cfDNA便释放进体液，在影像学观察不到病灶的情况下，检测到cfDNA的肿瘤相关突变，可提示癌症早期风险。或者在患者没有出现晚期症状的情况下指导受检者进行进一步的临床检查，从而筛查出早期肿瘤患者，提高肿瘤的生存率以及治愈率。有统计数据表明膀胱癌的早期治愈率较高，关键在于早期病人的筛查。cfDNA突变检测相对于FISH检测以及蛋白标志物检测，其灵敏度、特异性更高，且受干扰因素较少，检测结果的准确性更高。
但是，目前尚未有关于膀胱癌的cfDNA突变检测方案或相关研究报道；因此，研发膀胱癌的cfDNA突变检测，对膀胱癌的早期筛查或预后具有重要意义。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒，包括用于高通量测序检测PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因突变情况的引物组合。
需要说明的是，本申请以膀胱镜检查正常为阴性，膀胱镜检查检出异常并通过病理检测验证为癌症患者为阳性，作为本申请检测的金标准对照；对55例样本的24个基因进行高通量测序分析，根据55例样本基因是否发生突变以及样本的真实阴阳性建立逻辑斯特回归模型；并利用该模型对样本进行随机抽取样本验证，分析多个基因叠加的AUC变化趋势，发现在4个基因的时候达到稳定，后面的基因突变对AUC提升影响不大。本申请的一种实现方式中，具体是PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因，可以达到灵敏度0.871，特异性为1。因此，本申请特别提出以PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因的突变情况作为膀胱癌辅助诊断或筛查的依据，并提出这四个基因突变情况检查的高通量测序引物组合，作为膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒。可以理解，采用本申请的试剂盒对膀胱癌进行诊断或筛查，其灵敏度可达87.1％，特异性可以达到100％，能够准确而特异性的对膀胱癌进行检测。
优选的，引物组合包括检测PTEN的第一引物对，检测BRAF的第二引物对，检测PIK3CA的第三引物对和检测FGFR2的第四引物对；第一引物对的上下游引物分别为Seq IDNo.1和Seq ID No.2所示序列，第二引物对的上下游引物分别为Seq ID No.3和Seq IDNo.4所示序列，第三引物对的上下游引物分别为Seq ID No.5和Seq ID No.6所示序列，第四引物对的上下游引物分别为Seq ID No.7和Seq ID No.8所示序列。
需要说明的是，Seq ID No.1至Seq ID No.8所示序列的四个引物对组合只是本申请的一种实现方式中具体的能够有效的对PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因进行扩增，并实现四个基因的高通量测序突变检测的引物序列，不排除还可以采用其它引物实现相同的功能。并且，在本申请的一种实现方式中，四个引物对，其上游引物或者下游引物可以组合在一起使用，实现四个靶标的多重扩增和检测，提高了检测效率。
优选的，本申请的试剂盒还包括用于高通量测序检测TP53、ERBB2、HRAS、AKT1、KRAS、TERT、CTNNB1、ACTB、APC、ARID1A、NRAS和mTOR中的至少一种基因的引物对。
需要说明的是，虽然本申请已经验证，在4个基因的时候达到稳定，后面的基因突变对AUC提升影响不大，也就是说，再增加检测基因的个数并不会提高检测的灵敏度和特异性；但是，为了更为全面而准确的了解膀胱癌基因突变情况，还可根据需求对其他的基因进行检测，例如TP53、ERBB2、HRAS、AKT1、KRAS、TERT、CTNNB1、ACTB、APC、ARID1A、NRAS和mTOR等。
优选的，检测TP53、ERBB2、HRAS、AKT1、KRAS、TERT、CTNNB1、ACTB、APC、ARID1A、NRAS和mTOR的引物对的上下游引物依序分别为Seq ID No.9至Seq ID No.32所示序列。
需要说明的是，Seq ID No.9至Seq ID No.32所示序列的引物同样只是本申请的一种实现方式中具体采用的引物序列，不排除还可以采用其它引物实现相同的功能。但是，在本申请的一种实现方式中，以上各基因的引物对的上游引物或者下游引物可以组合在一起使用，实现多个靶标的多重扩增和检测，大大提高了检测效率。
优选的，本申请的试剂盒还包括对样品DNA进行加接头处理的接头，以及与接头匹配的通用引物。
需要说明的是，接头以及相应的通用引物的具体序列可以参考现有的测序平台所使用的接头和通用引物，在此不作具体限定。例如，本申请的一种实现方式中，具体采用的接头为TruSeq接头，具体采用的通用引物为P5、P7和Universe F，并且，Universe F为SeqID No.49所示序列，P5为Seq ID No.50所示序列，P7为Seq ID No.51所示序列。
本申请的再一面公开了本申请的试剂盒在制备膀胱癌辅助诊断或筛查的装置中的应用。
可以理解，本申请的试剂盒能够用于膀胱癌辅助诊断或筛查，其中，试剂盒中还可以包括常规PCR或者高通量测序相关的引物或试剂，在此不作具体限定。至于膀胱癌辅助诊断或筛查的装置，可以是基因芯片或者其它类似的产品，基因芯片上可以根据本申请的试剂盒中的引物设计相应的检测探针或捕获探针，以实现不同的功能，在此不作具体限定。
本申请的再一面公开了一种非诊断治疗目的的膀胱癌无创基因检测方法，包括采用本申请的试剂盒对获取自尿液的游离DNA样品进行高通量测序，检测游离DNA中膀胱癌游离DNA的低频突变。
需要说明的是，本申请的“非诊断治疗目的的膀胱癌无创基因检测方法”，包括但不仅限于膀胱癌药物筛选、药效评价等。可以理解，本申请的试剂盒能够用于膀胱癌的诊断或筛查，同时也可以用于膀胱癌基因相关的研究，例如通过基因检测判断膀胱癌治疗药物的药效，又或者利用基因检测进行膀胱癌药物筛选等；因此，本申请的试剂盒并不仅限于膀胱癌的诊断或筛查。
本申请的再一面公开了一种用于膀胱癌无创基因检测高通量测序的文库构建方法，包括以下步骤：
预扩增步骤，包括对提取自尿液的游离DNA样品进行末端修复、加polyA尾和加接头，获得两端具有接头序列的DNA片段，然后采用接头通用引物对加接头的DNA片段进行PCR扩增，PCR扩增产物即预扩增产物；
文库构建步骤，从预扩增产物中取等体积的两份，分别进行TN(U)-PCR扩增和TN(D)-PCR扩增，其中，TN(U)-PCR扩增采用的上下游引物分别为接头通用引物中的一条引物和本申请的试剂盒中的上游引物，TN(D)-PCR扩增采用的上下游引物分别为接头通用引物中的一条引物和本申请的试剂盒中的下游引物；将TN(U)-PCR扩增和TN(D)-PCR扩增的扩增产物合并在一起，再采用通用引物，对扩增产物进行PCR扩增，PCR扩增产物即可以直接用于高通量测序的文库。
需要说明的是，本申请的文库构建中，分别进行TN(U)-PCR扩增和TN(D)-PCR扩增，其目的是为了更好的获得更完整的基因片段序列信息。可以理解，直接采用本申请试剂盒中的上下游引物进行扩增只能获得两条引物之间的片段；而分别进行TN(U)-PCR扩增和TN(D)-PCR扩增，一方面可以选择性的对靶标进行扩增；另一方面，两个扩增拼接在一起又可以获得一个完整的DNA片段，而不仅仅是本申请试剂盒中的上下游引物之间的片段。因为采用接头通用引物与本申请试剂盒中的上游引物进行的TN(U)-PCR扩增，可以实现上游引物到其中一个末端的扩增；而采用通用引物与本申请试剂盒中的下游引物进行的TN(D)-PCR扩增，可以实现下游引物到另一个末端的扩增；将TN(U)-PCR扩增和TN(D)-PCR扩增，两个的扩增产物组合在一起，即获得整个DNA片段的扩增。
优选的，TN(U)-PCR扩增采用的引物为P7和本申请的试剂盒中的上游引物；TN(D)-PCR扩增采用的引物为P7和本申请的试剂盒中的下游引物；第二轮PCR扩增采用的通用引物为P7和Universe F。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒，可以灵敏、特异的对膀胱癌进行筛查，灵敏度高、特异性强能够有效提升血尿病人膀胱癌的检出率、提升膀胱癌的早期发现率，进而提升病人的5年生存率。并且，采用本申请的试剂盒进行膀胱癌辅助诊断或筛查，是以尿液样本作为检测样本，取样方便，属于无创检测，能够提升受检者的接受程度，有利于扩大膀胱癌筛查的覆盖人群，降低中国膀胱癌的发生率，为全民健康提供保障。更为重要的是，采用本申请试剂盒的膀胱癌辅助诊断或筛查，可以有效避免阴性患者因行膀胱镜带来的***、尿路损伤等风险，提高患者的依从性，从而改善就医体验与医患关系。
附图说明
图1是本申请实施例中文库构建的流程示意图；
图2是本申请实施例中预测模型的AUC曲线图。
具体实施方式
基于现有的膀胱癌无创检测灵敏度和特异性不足的问题，本申请创造性的以高通量测序为基础，提出了一种基于尿液游离DNA多基因panel高通量检测的膀胱癌辅助诊断或筛查试剂盒和方法，其主要用于血尿病人的辅助诊断，在预期做膀胱镜检查之前进行初步筛查，从而降低膀胱镜检查带来的伤害，提高患者的检查依从性。本申请的检测试剂盒和方法，取样安全无创，直接采用血尿病人的晨尿，从尿液中抽提游离DNA进行检测。具体的，本申请筛选了与膀胱癌高度相关的24个肿瘤基因，对其热点突变区域设计相应的引物。采用单分子标记高通量测序技术进行检测cfDNA的低频突变检测。在测试了55个样本之后，发现0.5％及以上的突变率其检测重复性较好，0.5％以下的突变其重复性较差，因此，分析认为0.5％的突变为患者尿液中真实含有的突变，且突变的reads数大于等于2条的突变为可信突变。
本申请检测了55例病人的样本，并进行模型构建，统计学分析，得到标志物诊断模型的灵敏度、特异性、AUC，以用于辅助诊断以及血尿病人的癌症早期筛查。最终通过对24个基因的测序分析，根据测序分析的结果，结合真实样本的临床信息进行建模分析；然后根据测序分析的结果，采用随机森林方法对基因的重要性进行排序，再选取重要性top n(n＝1,2,..16)基因，进行建模分析，发现PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2这四个基因的时候AUC已经在0.9以上，灵敏度和特异性达到最佳，往后再无提升，最终的灵敏度为0.871，特异性为1。因此，本申请用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒，包括用于高通量测序检测至少PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因突变情况的引物组合。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例的检测试验样本来源于中南大学湘雅医院泌尿外科，所有试验样本的临床病理诊断结果都是确定的；本例将本例的检测试剂盒和方法的检测结果与临床病理诊断结果进行对照，用以评判本例检测试剂盒和方法的检测灵敏度、特异性、一致性。详细如下：
一、样本采集
采集55个未进行膀胱镜检查以及未进行手术的血尿患者的尿液样本各80mL，用于游离DNA提取；其中尿液样本的采集和保存方式参考专利申请201711107815.X，该专利申请中关于尿液样本采集的全部信息引用到本例中。本例采集尿液样本的患者临床信息如表1所示。
表1采集样本的患者临床信息
二、DNA提取
1.在15mL的BD管中依次加入2mL的Lysis Buffer、120μL的蛋白酶K、15μL的助沉剂、30μL的磁珠、1.8mL尿液，拧紧管盖，轻轻颠倒混匀混匀；
2.将15mL的BD管放入垂直混合仪上，15r/min、30min；
3.将2mL的DNA低吸附管放在磁力架上，将上步骤的约4mL样本吸打混匀，转移2mL至低吸附管中，静置1min，弃上清；每次吸完2mL后用擦手纸擦干净枪管；
4.再将剩余2mL样本转移至低吸附管中，静置1min，弃上清；
5.加500μL的WashBufferA，将离心管取下，轻轻颠倒混，放回磁力架上，静置1min，弃上清，离心，除尽残余；
6.加500μL的WashBuffer B，将离心管取下，轻轻颠倒混，放回磁力架上，静置1min，弃上清，离心，除尽残余；
7.持离心管在磁力架上，轻轻加入550μL的Wash Buffer C，尽量不要冲起磁珠，静置1min，去上清；
8.从磁力架上取下离心管，瞬时离心，用黄枪头吸尽残余，开盖，室温放置2min；
9.加55μL的洗脱液，重悬磁珠，55℃水浴10min，不时轻轻混匀；
10.取出，待冷凝后，稍离心，放回磁力架，静置1min，将洗脱液转入新的1.5mL离心管中，即获得所需待测DNA。
对每个样本提取的DNA，各取2μL进行Qubit浓度测定。结果显示，本例提取的55个样本的DNA都符合使用需求，能够用于后续检测。提取的DNA保存于-20℃备用。
三、文库构建和上机测序
1.预文库构建
(1)末端修复和加polyA
由于提取自尿液的游离DNA其本身片段较小，无需再对DNA进行片段化处理，直接对其进行末端修复和加polyA处理，每个反应的反应体系为60μL，包括：7μL的End Repair&A-Tailing Buffer、3μL的End Repair&A-TailingEnzyme Mix，以及50μL的样本DNA。
反应条件为：PCR仪上20℃30min，65℃30min，然后4℃待机。
(2)加接头
本例采用的接头为TruSeq接头，即Illumina的TruSeqDNA建库试剂盒中的接头。
将5μL浓度为5μM的接头加入60μL的末端修复和加polyA的产物中，并加入30μL的Ligation buffer和10的DNALigase，以及5μL超纯水，即获得总体积为110μL的加接头反应体系。
反应条件为：PCR仪上20℃15min，然后4℃待机。
加接头反应结束后，采用0.8×XP Beads回收加接头产物，最后用20μL水洗脱。
(3)预文库PCR扩增
本例采用所添加的接头上的通用引物对加接头的纯化回收产物进行预扩增，本例采用的通用引物为P5和P7引物，同样是Illumina的TruSeqDNA建库试剂盒中的通用引物。
PCR扩增的反应体系为：Primer Mix 5μL、2×KAPAHiFi HotStart Ready Mix25μL、回收的加接头产物20μL。
PCR反应条件为：98℃45s，然后进入10个循环：98℃15s、60℃30s、72℃30s，循环结束后72℃1min，然后4℃待机。
PCR反应结束后，采用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示，所有样本都有扩增成功。
并采用1.0×XP Beads回收预扩增产物，最后30μL水洗脱。
2.终文库构建
本例针对与膀胱癌高度相关的24个肿瘤基因，对其热点突变区域进行引物设计，用于高通量测序检测。24个基因的引物如表2所示。
表2膀胱癌24个肿瘤基因的检测引物和通用引物
表2的“引物名称”有三段字符组成，例如“PTEN-233-D”，其中“PTEN”是指检测靶标基因，“233”是指引物序列在基因中的位置，“D”是指下游引物，上游引物用“U”表示。本例在所有上游引物和下游引物中都添加了相同的一段通用序列“ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT”，用于配合本例的文库构建方法。
本例从预扩增产物的回收产物中取等体积的两份，分别进行TN(U)-PCR扩增和TN(D)-PCR扩增，其中，TN(U)-PCR扩增采用的上下游引物分别为接头通用引物P7和表2中的上游引物，TN(D)-PCR扩增采用的上下游引物分别为接头通用引物P7和表2中的下游引物；然后，将TN(U)-PCR扩增和TN(D)-PCR扩增的扩增产物合并在一起，再采用通用引物UniverseF和P7，对混合的扩增产物再进行PCR扩增，PCR扩增产物即可以直接用于高通量测序的文库。本例的建库流程如图1所示。建库详细试验如下：
TN(U)-PCR扩增的反应体系为50μL，包括：5×KAPA2G BufferA 5μL、5U/μL的KAPA2G Fast HotStart DNA Polymerase 0.1μL、10mM的KAPA dNTPMix 0.5μL、TN(U)+P7的混合引物2μL、“(3)预文库PCR扩增”的回收纯化产物10μL，补充超纯水至50μL。
TN(D)-PCR扩增的反应体系为50μL，包括：5×KAPA2G BufferA 5μL、5U/μL的KAPA2G Fast HotStart DNA Polymerase 0.1μL、10mM的KAPA dNTPMix 0.5μL、TN(D)+P7的混合引物2μL、“(3)预文库PCR扩增”的回收纯化产物10μL，补充超纯水至50μL。
其中，TN(U)+P7的混合引物和TN(D)+P7的混合引物中，各引物的浓度分别为10mM。
两个PCR反应的条件相同，均为：95℃3min，然后进入20个循环：95℃15s、60℃30s、72℃30s，循环结束后，72℃1min，然后4℃待机。
两个PCR扩增的产物混合后采用1.2×XP Beads回收，即加入120μL的磁珠，最后用24μL的DB洗脱，获得TN(U)-PCR扩增和TN(D)-PCR扩增的回收产物，-20℃保存备用。
然后再采用Universe F+P7通用混合引物，对TN(U)-PCR扩增和TN(D)-PCR扩增的回收产物进行扩增，反应体系为50μL，包括：2×KAPAHiFi HotStartReady Mix 25μL、Primer Mix 1μL，以及TN(U)-PCR扩增和TN(D)-PCR扩增的回收产物24μL。
反应条件为：98℃45s，然后进入10个循环：98℃15s、60℃30s、72℃30s，循环结束后，72℃1min，然后4℃待机。
PCR扩增产物采用1.2×XP Beads回收，最后用30μL的DB洗脱，即获得本例的测序文库。取5μL的PCR回收产物，用2％琼脂糖凝胶电泳质控检测，结果显示，本例所有样品的测序文库都具有明显的靶标条带。
3.上机检测
对本例构建的高通量测序文库，用ABI StepOneTMSystem进行定量质检，然后用illuminaNext-Seq 500测序。定量质检的结果显示，所有样品的测序文库都能够满足高通量测序要求，可以用于后续的高通量测序分析。
四、结果分析
本例采集了55例样本进行试验，其中临床病理诊断阳性31例，阴性24例。临床病理诊断以膀胱镜检查正常为阴性，膀胱镜检查检出异常并通过病理检测验证为癌症患者为阳性，作为检测的金标准对照。根据55例样本重基因是否发生突变以及样本的真实阴阳性建立逻辑斯特回归模型：
x＝a0+a1*gene1+...+an*genen
求出每个模型的x值，将得到的拟合值x代入sigmoid函数求出其方程。本例通过R直接建模实现。
f(x)＝1/(1+e-x)
得到拟合结果f(x)，即膀胱癌风险指数：
f(x)>0.5为阳性
f(x)<＝0.5为阴性
本例采用sigmoid函数关于(0,0.5)中心对称，所以直接取0.5为阈值。其中，a0、a1…an为常数；是通过55个样本的实际数据建模得出的参数，e为自然常数，gene1…genen为有突变的基因，这里是指代自变量名称，对一个样本，有突变的基因代入1，无突变的基因代入0，可以直接计算出每个样本的x，进而代入sigmoid函数，求出f(x)，进而判断样本阴阳性。
结果显示，虽然本例筛选研究的24个肿瘤基因都是与膀胱癌高度相关的基因，但是，其中仅仅16个基因有检测出阳性突变，即PTEN、BRAF、PIK3CA、FGFR2、TP53、ERBB2、HRAS、AKT1、KRAS、TERT、CTNNB1、ACTB、APC、ARID1A、NRAS和mTOR，其余8个基因没有发现突变。并且，PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2这四个基因的突变频率较高，是最佳的标志物诊断模型；其余12个基因在样本中检测到的突变频率不高对辅助诊断提升性能意义不大，但是也能从侧面提示受检者可能有尿路***的器质性或病理性改变。
利用本例构建的模型对样本进行随机抽取样本验证，分析多个基因叠加的AUC变化趋势，发现在PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2这四个基因的时候达到稳定，后面的基因突变对AUC提升影响不大。4个基因的组合模型的灵敏度和特异性达到稳定，如表3所示。
表3不同的基因突变组合对模型的影响
基因数目 AUC 灵敏度 特异度 power
1 0.8226 0.6452 1.0000 0.997
2 0.9194 0.8387 1.0000 1
3 0.9227 0.8387 1.0000 1
4 0.9382 0.8710 1.0000 1
5 0.9509 0.8710 1.0000 1
6 0.9509 0.8710 1.0000 1
7 0.953 0.8710 1.0000 1
8 0.953 0.8710 1.0000 1
9 0.955 0.8710 1.0000 1
10 0.955 0.8710 1.0000 1
11 0.955 0.8710 1.0000 1
12 0.955 0.8710 1.0000 1
13 0.955 0.8710 1.0000 1
14 0.955 0.8710 1.0000 1
15 0.955 0.8710 1.0000 1
16 0.955 0.8710 1.0000 1
表3中基因数为1、2、3时，分别为PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2这四个基因中重要性排序top1个、top2个、top3个基因的统计结果；基因数为4即PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因。从表3可以看出，采用PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2这四个基因组合作为标志物诊断膀胱癌，其灵敏度为0.8710，特异性为1.0；统计最终的AUC，如图2所示，AUC＝0.9382。
综上所述，本例涉及的尿液多基因检测panel，辅助诊断膀胱癌或者早期筛查血尿病人，可非常好地对病人进行筛选，阳性患者进一步做金标准膀胱镜检查，阴性患者可避免膀胱镜带来的风险。本例检测试剂盒和检测方法的灵敏度为0.87，特异性为100％，优于其它的无创检测方法例如超声、FISH、脱落细胞学检查、尿液蛋白检测等。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 人和未来生物科技（长沙）有限公司
<120> 一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用
<130> 19I28015
<160> 51
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaggtgaa gatatattcc tccaattcag 60
gac 63
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttactttg atatcaccac acacaggtaa 60
cgg 63
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaactgat gggacccact ccatcgagat 60
ttc 63
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctatttctt catgaagacc tcacagtaaa 60
aat 63
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtggaag atccaatcca tttttgttgt 60
cca 63
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<213> 人工序列
<400> 6
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gaa 63
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acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctcctac tcaccatcct gtgtgcaggc 60
tcc 63
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<213> 人工序列
<400> 8
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgaagat gattgggaaa cacaagaata 60
tca 63
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<213> 人工序列
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gcg 63
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ctt 63
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atc 63
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ctt 63
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acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggatcag ctggatggtc agcgcactct 60
tgc 63
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<212> DNA
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ggt 63
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<211> 63
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<213> 人工序列
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gtt 63
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<211> 63
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<213> 人工序列
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acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttggcta caaggagcgg ccgcaggatg 60
tgg 63
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<213> 人工序列
<400> 17
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgattctg aattagctgt atcgtcaagg 60
cac 63
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acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaaatgac tgaatataaa cttgtggtag 60
ttg 63
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<400> 19
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgaaagga aggggagggg ctgggagggc 60
ccg 63
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<213> 人工序列
<400> 20
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcgcctcc tccgcgcgga ccccgccccg 60
tcc 63
<210> 21
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<400> 21
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcctcttc ctcaggattg cctttaccac 60
tca 63
<210> 22
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttagtcac tggcagcaac agtcttacct 60
gga 63
<210> 23
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggcatac ccctcgtaga tgggcacagt 60
gtg 63
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctccgtacc actggcatcg tgatggactc 60
cgg 63
<210> 25
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcacttag agatgtagct gtggaaaagt 60
tta 63
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcggggga tgatatgcca cgggtgtatt 60
gtg 63
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<211> 63
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<213> 人工序列
<400> 27
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagtaagg gagggcaaga agatatgaac 60
ctg 63
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgcagaa atactcacag gcaagctgga 60
ggg 63
<210> 29
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctggatt agctggattg tcagtgcgct 60
ttt 63
<210> 30
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtgaaat gactgagtac aaactggtgg 60
tgg 63
<210> 31
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttcttga tgcttctctc cttcttctct 60
tgg 63
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttctcatg ccagaggatg gccactcgga 60
tca 63
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcagaatc ctgtctatca caatcagcct 60
ctg 63
<210> 34
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtgctgt gggggtcctg gtagtgtggg 60
tct 63
<210> 35
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttccatc tacatctacc aagaatggtg 60
gag 63
<210> 36
<211> 63
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<213> 人工序列
<400> 36
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tcc 63
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acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgcgcta atggcgggct gcatccagga 60
ggc 63
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgccccgc acacgctccc aggcgaagtc 60
acc 63
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaggagga caggccctga cacaggatgt 60
ttg 63
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act 63
<210> 41
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gtc 63
<210> 42
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<400> 42
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aac 63
<210> 43
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<212> DNA
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<400> 43
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagtaaag aattctgtaa tttgtagact 60
tct 63
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<400> 44
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ttt 63
<210> 45
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ctg 63
<210> 46
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<213> 人工序列
<400> 46
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tgc 63
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gga 63
<210> 48
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<213> 人工序列
<400> 48
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ttt 63
<210> 49
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat 60
ct 62
<210> 50
<211> 29
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<213> 人工序列
<400> 50
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
caagcagaag acggcatacg agat 24

Claims (10)

1.一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒，其特征在于：包括用于高通量测序检测PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因突变情况的引物组合。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物组合包括检测PTEN的第一引物对，检测BRAF的第二引物对，检测PIK3CA的第三引物对和检测FGFR2的第四引物对；
所述第一引物对的上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列，所述第二引物对的上下游引物分别为Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列，所述第三引物对的上下游引物分别为Seq ID No.5和Seq ID No.6所示序列，所述第四引物对的上下游引物分别为Seq ID No.7和Seq ID No.8所示序列。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：还包括用于高通量测序检测TP53、ERBB2、HRAS、AKT1、KRAS、TERT、CTNNB1、ACTB、APC、ARID1A、NRAS和mTOR中的至少一种基因的引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：检测TP53、ERBB2、HRAS、AKT1、KRAS、TERT、CTNNB1、ACTB、APC、ARID1A、NRAS和mTOR的引物对的上下游引物依序分别为Seq IDNo.9至Seq ID No.32所示序列。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：还包括对样品DNA进行加接头处理的接头，以及与接头匹配的通用引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述接头为TruSeq接头。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述通用引物为P5、P7和Universe F，Universe F为Seq ID No.49所示序列，P5为Seq ID No.50所示序列，P7为Seq ID No.51所示序列。
8.根据权利要求1-7任一项所述的试剂盒在制备膀胱癌辅助诊断或筛查装置中的应用。
9.一种非诊断治疗目的的膀胱癌无创基因检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1-7任一项所述的试剂盒对获取自尿液的游离DNA样品进行高通量测序，检测游离DNA中膀胱癌游离DNA的低频突变。
10.一种用于膀胱癌无创基因检测高通量测序的文库构建方法，其特征在于：包括以下步骤，
预扩增步骤，包括对提取自尿液的游离DNA样品进行末端修复、加polyA尾和加接头，获得两端具有接头序列的DNA片段，然后采用接头通用引物对加接头的DNA片段进行PCR扩增，PCR扩增产物即预扩增产物；
文库构建步骤，从预扩增产物中取两份，分别进行TN(U)-PCR扩增和TN(D)-PCR扩增，其中，TN(U)-PCR扩增采用的引物为接头通用引物中的一条引物和权利要求1-7任一项所述的试剂盒中的上游引物，TN(D)-PCR扩增采用的引物为接头通用引物中的一条引物和权利要求1-7任一项所述的试剂盒中的下游引物；将TN(U)-PCR扩增和TN(D)-PCR扩增的扩增产物合并在一起，再采用通用引物对扩增产物进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增产物即可以直接用于高通量测序的文库；
优选的，所述TN(U)-PCR扩增采用的引物为P7和权利要求1-7任一项所述的试剂盒中的上游引物；
所述TN(D)-PCR扩增采用的引物为P7和权利要求1-7任一项所述的试剂盒中的下游引物；
所述第二轮PCR扩增采用的通用引物为P7和Universe F。
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