JP2022528938A - Fgfrの決定に基づいて試料を分類する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、尿路上皮がんまたは膀胱がんを発症しているか、または発症する危険性がある患者の試料を分類する方法に関するものであり、前記方法は、a)前記患者からの試料において、FGFR遺伝子の変化の有無、および/またはFGFR1、FGFR2、FGFR3またはFGFR4からなる群から選択される受容体をコードする少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを決定する工程、およびb)工程の結果から前記患者の試料を少なくとも2つの分類の1つに分類する工程を含む方法に関する。(図6)
Description
本出願は、分子診断の分野に関する。
尿路上皮がん(UC)は、世界中で最も一般的な10種類の悪性腫瘍の1つであり、新規症例数はほぼ386000例、死亡数はほぼ150200例であり、高い再発率と進行率を特徴とする。数十年間、転移性UCに対する唯一の治療レジメンはプラチナ製剤ベースの化学療法であり、標準化学療法レジメンに失敗した患者の5年全生存率が15%以下と不良であり、予後もきわめて不良である。
免疫療法は、抗がん治療の新たな概念を表している。特に、CTLA4、PD-1またはPD-L1を標的とする抗体は、例えば、免疫原性が高い腫瘍と考えられる転移性黒色腫患者において、驚くべき治療成功をもたらした。さらに、ニボルマブのような抗体は、全身進行性非小細胞肺がんおよび腎細胞がんの治療に使用され、成功を収めている。非小細胞肺がんや黒色腫のように、変異負荷の高い腫瘍型では、これらの治療法の奏功はとくに説得力がある。
UCは体変異率が最も高いがん腫であり、そのためネオアンチゲンが増加していることから免疫原性の高い腫瘍と考えられている。この2年間に、治療応答性に関する有望な結果を示したいくつかの研究が発表された。一方、いくつかの研究では、免疫組織化学的染色によって判定したPD-L1発現とは無関係であるという有益性が示された。その後の研究で、PD-L1発現状態依存性応答(アテゾリズマブ、ペムブロリズマブ)が示された。
現在、腫瘍浸潤性免疫細胞(IC)のPD‐L1染色は、潜在的な治療応答者のサブセットのみを検出するようであるが、そのすべてではない。遺伝子発現研究から、管腔I腫瘍を有する患者ではアテゾリズマブの方が有益性が低いことが示唆されており、FGFR3変異が濃縮されている可能性がある。異常なFGFRシグナル伝達は、血管新生をサポートすることだけでなく、がん細胞の増殖と生存を直接的に促すことによって腫瘍の発生を促進することができる。
進行期の筋層浸潤性膀胱がん(病期≧T2)では、患者の5%~20%がFGFR3がん遺伝子に点変異を有し、40%がFGFR3タンパク質の発現をアップレギュレートしている。FGFR3は上部尿路UCでも一般的に変化し、膀胱のUCよりも高悪性度上部尿路UCでより一般的に変化する(35.6%対21.6%, P = 0.065)。FGFR変異状態、免疫浸潤、PDL1などの免疫療法標的の発現と免疫療法アプローチに対する応答性との相互作用はほとんど知られていないが、エルダフィチニブなどのFGFR阻害剤に関して相乗的または補完的治療選択肢の可能性を秘めている。
研究範囲
進行性尿路上皮がん患者における抗PD-1および抗PD-L1治療結果に対するFGFR3変異およびFGFR2・FGFR3遺伝子融合の予測値を評価するための調査を実施した。予後の関連性は、FGFR発現、分子サブタイプおよびPD1/PDL1状態との関連でさらに評価した。
進行性尿路上皮がん患者における抗PD-1および抗PD-L1治療結果に対するFGFR3変異およびFGFR2・FGFR3遺伝子融合の予測値を評価するための調査を実施した。予後の関連性は、FGFR発現、分子サブタイプおよびPD1/PDL1状態との関連でさらに評価した。
したがって、化学療法および/または免疫腫瘍学的治療において予後不良であるUC患者を同定することは、本発明の1つの目的である。
FGFR阻害剤から恩恵を受ける可能性のあるそれらのUC患者を同定することは、本発明のさらなる目的の1つである。
これらおよび他の目的は、独立した請求項に記載の方法および手段によって達成される。従属請求項は、具体的な実施形態に関連する。
本発明は、尿路上皮がんまたは膀胱がんに罹患しているか、または発症するリスクがある患者の試料を分類する方法を提供する。a)前記患者からの試料において、FGFR遺伝子における変化の有無を決定する工程、および/またはFGFR1、FGFR2、FGFR3またはFGFR4からなる群より選択される受容体をコードする少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを決定する工程、およびb)工程の結果から前記患者の試料を少なくとも2つの分類の1つに分類する工程を含む方法。
[図8] FGFR3-TACC3再構成の構造。FGFR3およびTACC3遺伝子座のゲノム構成(上)報告されたFGFR3-TACC3バリアントでは、ゲノム再編成により、FGFR3遺伝子のエクソン17およびイントロン17のごく一部とTACC3遺伝子のイントロン10の近接が引き起こされ、接合mRNAのサンガー配列が示すように、FGFR3のエクソン17とTACC3のエクソン11のインフレーム融合が引き起こされる。この融合構造は、同定された最も頻度の高いmRNA融合バリアントの1つである。箱は、FGFR3-TACC3のRT-PCRスクリーニングアッセイに用いられる診断用プライマーの位置を示す。FGFR3‐TACC3の構造は必ずFGFR3のTKドメインとTACC3のコイルドコイルドメインを含む。FGFR3のキナーゼドメインはエクソン12~18にある。図8は、以下で議論するプライマー組合せをさらに示している。検出に用いるプローブは図8には示していない。列Aは、FGFR3-TACC3融合構築物の存在を検出し、定量することができるプライマー組合せを示す。列Bは、FGFR3のC末端の存在または不在(破線)、およびFGFR3のN末端の存在を検出することによって、野生型FGFR3対FGFR3-TACC3融合構築物を検出および定量するために用いることができるプライマー組合せを示す。FGFR3のC末端はFGFR3野生型にのみ存在し、融合構築物には欠けている。列Cは、TACC3のC末端の存在およびTACC3のN末端の有無(破線)を検出することにより、野生型TACC3対FGFR3-TACC3融合構築物を検出および定量するために使用できるプライマー組合せを示す。TACC3のN末端はTACC3野生型にのみ存在し、融合構築物では欠損している。列Dは、FGFR3のエクソン16(FGFR3野生型並びに融合構築物中に存在する)の存在、及びFGFR3のエクソン18(FGFR3野生型に存在するが融合構築物中には欠損している)の有無(破線)を検出することにより、野生型FGFR3-TACC3融合構築物の検出及び定量に使用可能なプライマー組合せを示す。
次の表は、再度プライマー組合せを示している。
次の表は、再度プライマー組合せを示している。
[図9] 図8の列Cに記載のプライマーを用いた発現試験の結果。使用したプライマー組合せは、既知の融合遺伝子に保持または欠失され、したがって過剰発現され得るFGFR2およびFGFR3の3’-配列を標的とするRT-qPCRアッセイを検出することにより、野生型FGFR3-TACC3融合構築物を検出および定量することが可能である。FGFR2及びFGFR3の定量的PCR (qPCR)は、StepOnePlus(登録商標) real-time PCRシステム(米国アプライドバイオシステムズ(登録商標))のTaqMan(登録商標) fast advanced master mix (米国アプライドバイオシステムズ(登録商標))を用いて実施された。FFPE組織試料からのRNAのcDNA合成は、調査した各遺伝子に特異的なリバースプライマーを有するSuperscript III (登録商標) reverse transcriptase kit (Invitrogen社、米国)を用いて実施した。確認されたFGFR融合を有する細胞株および試料(例えば、RT4.RT112およびPt1~Pt 4)は、区切点から標的配列5’のmRNA発現が上昇すること、融合区切点の標的配列3’のmRNA発現が減少することは、区切点前後の個々のFGFR mRNA発現の相対的な不均衡である。FGFR3-TACC3融合の特異的PCRを用いて差異(1CT以上)および高いFGFR3および-2発現を示す試料を分析し、次世代シークエンシングおよび増幅プライマーを用いた双方向サンガーシークエンシングによりさらに検証した。
a) FGFR3のエクソン16の存在(FGFR3野生型および融合産物に存在する)
b) FGFR3のエクソン18の有無(FGFR3野生型に存在するが融合産物には存在しない)。
両エクソンの発現が類似している試料は、FGFR3-TACCC3の遺伝子再編成、または融合を示さず、一方、エクソン16とエクソン18の発現の不均衡(例えば、エクソン16の発現が18よりも高い)を有する試料は、FGFR3-TACCC3のそのような遺伝子再編成、または融合を示す。
a) FGFR3のエクソン16の存在(FGFR3野生型および融合産物に存在する)
b) FGFR3のエクソン18の有無(FGFR3野生型に存在するが融合産物には存在しない)。
両エクソンの発現が類似している試料は、FGFR3-TACCC3の遺伝子再編成、または融合を示さず、一方、エクソン16とエクソン18の発現の不均衡(例えば、エクソン16の発現が18よりも高い)を有する試料は、FGFR3-TACCC3のそのような遺伝子再編成、または融合を示す。
[図10] 図8の列Cに従ったプライマーを用いて行った発現試験結果のさらなる分析。
A) 全コホートのFGFR3エクソン16およびエクソン18レベルの相対mRNA発現レベル赤い四角で示された患者は、FGFR3の遺伝子融合を有する尿路上皮がん患者に由来し、一方、FGF受容体遺伝子融合を有さない患者は、三角形の黒い丸で囲まれたもの(filled black circles of triangles)で示されている。FGFR遺伝子融合を有する患者は比較的高いエクソン16を示すが、エクソン18のmRNA発現は中間であった。
B) エクソン16発現からエクソン18の相対的mRNA発現を差し引いて(すなわち、((40-DCT FGFR3エクソン16)-(40-DCT FGFR3エクソン18))、遺伝子比を構築すると、特にFGFR3遺伝子融合を含む腫瘍で有意に高い遺伝子比(>DDCT2)が明らかになった。対照的に、FGFR3遺伝子融合のない患者は、FGFR3エクソン16とFGFR3エクソン18の両方のバランスのとれた発現を示す、より低い遺伝子比率(~DDCT 0)を示した。
A) 全コホートのFGFR3エクソン16およびエクソン18レベルの相対mRNA発現レベル赤い四角で示された患者は、FGFR3の遺伝子融合を有する尿路上皮がん患者に由来し、一方、FGF受容体遺伝子融合を有さない患者は、三角形の黒い丸で囲まれたもの(filled black circles of triangles)で示されている。FGFR遺伝子融合を有する患者は比較的高いエクソン16を示すが、エクソン18のmRNA発現は中間であった。
B) エクソン16発現からエクソン18の相対的mRNA発現を差し引いて(すなわち、((40-DCT FGFR3エクソン16)-(40-DCT FGFR3エクソン18))、遺伝子比を構築すると、特にFGFR3遺伝子融合を含む腫瘍で有意に高い遺伝子比(>DDCT2)が明らかになった。対照的に、FGFR3遺伝子融合のない患者は、FGFR3エクソン16とFGFR3エクソン18の両方のバランスのとれた発現を示す、より低い遺伝子比率(~DDCT 0)を示した。
[図11] 研究における患者コホートと試料の選択を記述したフローチャート。
[図12] 本願が言及するエクソンを有するTACC3の遺伝子構造を示す。
[図13] 本願が言及するエクソンを有するFGFR3の遺伝子構造を示す。
[図14] (A)FGFR3-TACC3融合タンパク質の様々なバリアント、FGFR3-TACC3融合特異的RT-PCRアンプリコンのアガロースゲル分離を示す。(B)FGFR3-TACC3融合特異的RT-PCR産物のサンガー配列決定クロマトグラム。矢印は2つの遺伝子の分解点を示す。Kurobeら(2016)より引用、その内容は参照により本明細書に援用される。
本発明を詳細に説明する前に、本発明は説明されたデバイスの特定の構成要素部分に限定されず、あるいはそのようなデバイスおよび方法は変化する可能性があるので、説明された方法のプロセス工程に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを意図したものではないことも理解されたい。明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「a」、「an」および「the」は文脈が明確に別途指示しない限り、単数形および/または複数形の参照を含むことに留意されたい。さらに、数値によって区切られるパラメータ範囲が与えられる場合、その範囲は、これらの限界値を含むものとみなされることを理解されたい。
さらに、本明細書に開示される実施形態は、互いに関連しない個々の実施形態として理解されることを意味しないことを理解されたい。一実施形態で議論される特徴は、本明細書に示される他の実施形態に関連しても開示されることを意味する。1つの場合において、特定の特徴が1つの実施形態で開示されず、別の実施形態で開示される場合、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されることを意味しないことを必ずしも意味しないことを理解するのであろう。当業者であれば、他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の主旨であるが、単に明瞭にするため、及び本明細書を管理可能な量に維持するために、これが行われていないことを理解されよう。
さらに、本明細書で参照される先行技術文献の内容は、参照により援用される。これは、特に、標準的または通常方法を開示する先行技術文献を指す。その場合、参照による援用は、十分に実施可能な開示を可能にし、長い反復を避ける目的がある。
本発明の第1の態様によれば、尿路上皮がんまたは膀胱がんに罹患しているか、または発症するリスクがある患者の試料を分類する方法が提供され、その方法は以下の工程を含む:
a) 前記患者由来の前記試料において、以下を決定する工程
・FGFR遺伝子の変化の有無、および/または
・FGFR1、FGFR2、FGFR3またはFGFR4からなる群より選択される受容体をコードする少なくとも1つの遺伝子の発現レベル、および
b) 工程a)の結果から前記患者の試料を少なくとも2つの分類の1つに分類する工程。
a) 前記患者由来の前記試料において、以下を決定する工程
・FGFR遺伝子の変化の有無、および/または
・FGFR1、FGFR2、FGFR3またはFGFR4からなる群より選択される受容体をコードする少なくとも1つの遺伝子の発現レベル、および
b) 工程a)の結果から前記患者の試料を少なくとも2つの分類の1つに分類する工程。
線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)は、その名称が示すように、タンパク質の線維芽細胞増殖因子ファミリーの一員に結合する受容体である。線維芽細胞の増殖因子受容体は、3つの免疫グロブリン様ドメイン、1つの膜貫通へリックスドメイン、チロシンキナーゼ活性をもつ細胞内ドメインからなる細胞外リガンドドメインからなる。これらの受容体は、22の構成員からなる最大の増殖因子リガンドファミリーの一員である線維芽細胞増殖因子と結合する。
FGFRは、3つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン(D1‐D3)、膜貫通ドメイン(TM)、および2つの細胞内チロシンキナーゼドメイン(TK1およびTK2)を含むいくつかのドメインを有する~800アミノ酸の受容体チロシンキナーゼである。
4つの線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)遺伝子の天然交互スプライシングにより、FGFRの48以上の異なったアイソフォームが産生される。これらのアイソフォームはリガンド結合特性やキナーゼドメインが異なる。
3種類の免疫グロビン(Ig)様ドメインは、D1とD2の間にある一連の酸性アミノ酸(「アシッドボックス」)を提示する。この「アシッドボックス」は、FGFRへのFGF結合の調節に関与することができる。FGF結合には免疫グロブリン様ドメインD2とD3で充分である。それぞれの受容体はいくつかのFGFによって活性化される。多くの場合、FGF自身も複数の受容体(すなわち、7つの主要なFGFRすべてに結合するFGF1)を活性化することができる。しかしながら、FGF7は、FGFR2のみを活性化することができ、FGF18はFGFR3を活性化することが最近示された。
これまでのところ、脊椎動物では、それぞれのmRNA配列とともに表1に示した以下のFGFRが同定されており、そのすべてがチロシンキナーゼスーパーファミリー(FGFR1からFGFR4)に属している。当業者は、従来の知見と併せて、本明細書に記載された開示に基づいて、これらの遺伝子のいずれかの発現を同定し、定量するのに適したプライマー組合せ(任意にプローブを用いる)を選択することができることに注意すべきである。
一般的に、「尿路上皮がん」と「膀胱がん」という用語は、範囲が重複しており、互換的に使われることもある。一般的には、「尿路上皮がん」という用語が一般的な定義として用いられ、「膀胱がん」は一定の種類の尿路上皮がんを決定するために用いられることがある。「尿路上皮がん」という用語を尿管内のがんを指すために用い、「膀胱がん」を膀胱内のがんをために用いる場合がある。
一実施形態では、その発現レベルが決定される2つの遺伝子はFGFR2とFGFR3である。
本明細書中で使用される用語「FGFR遺伝子における変化」は、特に、FGFR3遺伝子が、例えば変異または融合によって変化した試料に関する。一実施形態において、その変化が決定される遺伝子はFGFR3である。
FGFR3遺伝子の典型的な変化は、TACC3との融合である。
本発明の1以上の実施形態によれば、工程a)の結果から患者の試料を少なくとも2つの分類の1つに分類する工程b)が、以下のいずれかに分類することを含む:
(i) 抗がん剤による治療について良好な予後、または
(ii) 抗がん剤による治療について不良な予後。
(i) 抗がん剤による治療について良好な予後、または
(ii) 抗がん剤による治療について不良な予後。
本発明の1つ以上の実施形態によれば、工程b)の分類に基づいて治療の方法が選択され、治療の方法が以下のいずれかから選択される:
(i) 抗がん剤による治療について良好な予後の場合には、抗がん剤の投与、または
(ii) 抗がん剤による治療について不良な予後の場合には、FGFR阻害剤の投与。
(i) 抗がん剤による治療について良好な予後の場合には、抗がん剤の投与、または
(ii) 抗がん剤による治療について不良な予後の場合には、FGFR阻害剤の投与。
本発明の1以上の実施形態によると、前記発現レベルは、以下の少なくとも1つにより決定される:
(i) 標識された一本鎖プローブを用いるハイブリダイゼーションに基づく方法、
(ii) ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含むPCRに基づく方法、
(iii) 検出可能なシグナルを生成するために分子が結合する電極システムを包含する、特定の分子の電気化学的検出に基づく方法。
(iv) マイクロアレイおよび/またはバイオチップの使用を含むアレイに基づく方法
(v) 1つ以上の標的特異的タンパク質バインダーを用いる免疫学的方法。
(i) 標識された一本鎖プローブを用いるハイブリダイゼーションに基づく方法、
(ii) ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含むPCRに基づく方法、
(iii) 検出可能なシグナルを生成するために分子が結合する電極システムを包含する、特定の分子の電気化学的検出に基づく方法。
(iv) マイクロアレイおよび/またはバイオチップの使用を含むアレイに基づく方法
(v) 1つ以上の標的特異的タンパク質バインダーを用いる免疫学的方法。
本明細書中で使用される用語「PCRに基づく方法」は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む方法を指す。これは、生きている生物を用いずに、酵素的複製を経て、DNAやRNAのように核酸分子を指数関数的に増幅するためのアプローチである。PCRはin vitroな技術であるため、DNAの形成に制約を加えずに行うことができ、広範囲に遺伝子操作を行うように広範囲に改変することができる。発現レベルの決定に際しては、例えば、(1)逆転写酵素の助けを借りて完全なmRNAプール(いわゆるトランスクリプトーム)をcDNAに逆転写し、(2)それぞれのプライマーの助けを借りて所定のcDNAの存在を検出することによって、所定のmRNAの存在を検出するために、PCRに基づく方法を用いることができる。このアプローチは一般に逆転写酵素PCR (rtPCR)として知られている。さらに、PCRに基づく方法は、例えばリアルタイムPCRを含み、特に発現レベル、動力学的または定量的PCR(qPCR)の分析に適している。
用語「定量的リアルタイムPCR」(qPCR)は、試料中の鋳型の定量を可能にするあらゆる種類のPCR法をいう。定量的リアルタイムPCRは、例えばTaqMan技術またはLightCycler技術のような性能または生成物検出の異なる技術を含む。例えば、TaqMan技術は、二重標識蛍光発生プローブを使用する。TaqManリアルタイムPCRは、従来のPCRエンドポイントではなく、PCRの指数関数的段階の間のフルオロフォアを介した生成物の蓄積を測定する。生成物の指数関数的増加は、閾値サイクルCT、すなわち、蛍光の有意な指数関数的増加が検出され、かつ反応中に存在するDNA鋳型のコピー数と直接相関するPCRサイクルの数を決定するために使用される。反応の設定は従来のPCRと非常に似ているが、PCRチューブ内の蛍光分子の測定が可能なリアルタイム熱サイクル装置で行われる。通常のPCRとは異なり、TaqManリアルタイムPCRでは、プローブを反応に加える。すなわち、DNA鋳型内の20~60ヌクレオチドの断片に相補的で、2つのプライマーの間に位置する一本鎖オリゴヌクレオチドである。蛍光レポーターまたはフルオロフォア(例えば、6-カルボキシフルオレセイン、頭文字:FAM、またはテトラクロロフルオレシン、頭文字:TET)およびクエンチャー(例えば、テトラメチルローダミン、頭文字:TAMRA、ジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド「副溝バインダー」、頭文字:MGB)は、それぞれプローブの5’末端および3’末端に共有結合している[2]。プローブに付着したフルオロフォアとクエンチャーが近接すると、フルオロフォアからの蛍光が阻害される。PCRの過程で、DNA合成が始まると、Taqポリメラーゼの5’から3’のエキソヌクレアーゼ活性が、鋳型にアニールしたプローブの割合(したがって、その名前はTaqポリメラーゼ+PacMan)を分解する。プローブが分解されるとフルオロフォアがそこから離れ、クエンチャーに近接して壊れるので、消光作用が解消されてフルオロフォアの蛍光が出る。したがって、リアルタイムPCRサーマルサイクラーで検出される蛍光は、放出されるフルオロフォアおよびPCRに存在するDNA鋳型の量に正比例する。
本明細書の「マイクロアレイ」はまた、「バイオチップ」または「生物学的チップ」を意味する。少なくとも約100/cm2の、好ましくは少なくとも約1000/cm2の不連続な領域の密度を有する領域のアレイ。マイクロアレイ中の領域は、約10~250μmの範囲で直径などの典型的な寸法を有し、アレイ中の他の領域とほぼ同じ距離だけ隔てられている。
本明細書中で使用される用語「ハイブリダイゼーションに基づく方法」とは、相補的な一本鎖核酸またはヌクレオチドアナログを一本の二本鎖分子に結合させるプロセスを付与する方法を指す。ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、正常条件下ではその相補体に結合することになるので、2本の完全に相補的な鎖が互いに容易に結合することになる。バイオアナリシスでは、非常に多くの場合、相補的な標的配列を見つけるために、標識された一本鎖プローブが用いられる。このような配列が試料中に存在する場合、プローブは前記配列とハイブリダイズし、その配列はその標識のために検出することができる。他のハイブリダイゼーションに基づく方法は、マイクロアレイおよび/またはバイオチップ法を含む。そこで、プローブを固相上に固定化し、それを次に試料に曝露する。試料中に相補的な核酸が存在する場合、これらはプローブにハイブリダイズし、したがって検出され得る。これらのアプローチは「アレイに基づく方法」としても知られている。さらにもう一つのハイブリダイゼーションに基づく方法は、PCRであり、これは上で説明した。発現レベルの決定に関しては、ハイブリダイゼーションに基づく方法を用いて、所定の遺伝子のmRNAの量を決定することができる。
「分子の電気化学的検出に基づく方法」という用語は、検出可能なシグナルの生成のもとに、分子、特にタンパク質、核酸、抗原、抗体などの生体分子が結合する電極系を利用する方法に関する。このような方法は、例えば、本発明の出願人によって提出されたWO0242759、WO0241992およびWO02097413に開示されており、その内容は参照により本明細書に援用される。これらのディテクターは、例えばシリコンチップの結晶学的表面によって形成される平坦な表面を有する基板、及び例えばデジタル間電極又は2次元電極アレイの形をとることができる電気ディテクターを含む。これらの電極は、標的分子、例えば標的核酸分子に特異的に結合することができるプローブ分子、例えば核酸プローブを有する。プローブ分子はたとえばチオール-金結合によって固定化されている。この目的のために、プローブを、金表面を含む電極に結合するチオール基でその5’-または3’-末端で修飾する。これらの標的核酸分子は、例えば、西洋ワサビペルオキシディーゼ(HRP)またはアルカリホスファターゼのような酵素標識を有することができる。標的分子がプローブに結合した後、基質が付加される(例えば、α-ナフチルリン酸または3,3’5,5’-テトラメチルベンジジン、これは、特に酸化還元反応において、前記酵素によって変換される)。次に、前記反応の生成物、または電子の交換により前記反応で生成される電流を、部位特異的様式で電気ディテクターの助けを借りて検出することができる。
用語「免疫学的方法」とは、1つ以上の標的特異的タンパク質バインダーが使用される方法を意味する。このような方法には、ウエスタンブロット法(WB)、免疫組織化学法(IHC)、免疫蛍光法(IF)、免疫細胞化学法(ICC)およびELISAがあり、いずれもルーチンの方法である。とりわけ上記の方法で使用されるのに適しているこのようなタンパク質バインダーは、例えば、FGFR1、FGFR2、FGFR3またはFGFR4のいずれか、またはそれらの変化したバリアントに結合するポリ-またはモノクローナル抗体である。このような抗体は、通常の方法(免疫化/ハイブリドーマ)を用いた当業者によって生成することができ、通常の供給者からも得ることができる。次の表は、非限定的な例の一覧のみを示している:
本発明の1以上の実施形態によれば、FGFR遺伝子中の前記変化は、以下によって決定される
(i) 変化したFGFRバリアントの発現レベルの決定
(ii) 少なくともその発現レベルの決定
・変化したFGFRバリアントに組み込まれるFGFRエクソン、および
・変化したFGFRバリアントに組み込まれないFGFRエクソン、
両者を比較し、
(iii) 各々の変化を同定するための各々のFGFR遺伝子の配列決定、および/または
(iv) SNaPshot突然変異解析。
(i) 変化したFGFRバリアントの発現レベルの決定
(ii) 少なくともその発現レベルの決定
・変化したFGFRバリアントに組み込まれるFGFRエクソン、および
・変化したFGFRバリアントに組み込まれないFGFRエクソン、
両者を比較し、
(iii) 各々の変化を同定するための各々のFGFR遺伝子の配列決定、および/または
(iv) SNaPshot突然変異解析。
それぞれの方法は、当業者によく知られており、本明細書の他の箇所で議論する。
このような変化したFGFRバリアントは、FGFR3-TACC3融合であることが好ましく、とりわけ、その内容が参照により本明細書に援用されるコスタら(2016)、またはその内容が参照により本明細書に援用されるLasorellaら(2017)、またはその内容が参照により本明細書に援用されるKurobeら(2016)において開示される。
本発明の1以上の実施形態によれば、前記発現レベルは、以下の少なくとも1つのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCRまたはqPCR)によって決定される:
・FGFR野生型mRNA、および/または、
・変化したFGFRバリアントのmRNA。
・FGFR野生型mRNA、および/または、
・変化したFGFRバリアントのmRNA。
この目的のためには、適当なプライマー、および任意にプローブが必要であり、本明細書の他の箇所に開示する。このような手法では、mRNA転写産物をcDNAに逆転写し、次にそのcDNAをqPCR反応における鋳型として用いて、遺伝子発現産物を検出し、定量する。
RT-PCRまたはqPCRでは、標的DNA分子の増幅は、PCRの間、すなわち、リアルタイムでモニターされ、通常のPCRのように、その最終段階ではモニターされない。リアルタイムPCRは、定量的(定量的リアルタイムPCR)、および半定量的、すなわち、DNA分子の一定量の上/下(半定量的リアルタイムPCR)に用いることができる。
リアルタイムPCRにおけるPCR産物の検出のための2つの一般的な方法は:(1)任意の二本鎖DNAとインターカレートする非特異的蛍光色素、および(2)プローブとその相補的配列とのハイブリダイゼーション後にのみ検出を可能にする蛍光レポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的DNAプローブである。
ある遺伝子の発現レベルの1つの測定はCt(「サイクル閾値」)である。Ctは、蛍光シグナルが閾値を越える(すなわち、バックグラウンドレベルを越える)のに必要なサイクル数と定義される。Ctレベルは試料中の標的mRNAの量に逆比例する。すなわち、Ctレベルが低いほど、試料中の標的mRNAの量が多くなる。すなわち、それぞれの遺伝子発現レベルが高くなる。
本発明の1つ以上の実施形態によれば、この方法は、1つ以上の正規化発現レベルを得るために、工程a)で決定された1つ以上の発現レベルが、工程b)以前に1つ以上の基準遺伝子の1つ以上の発現レベルで正規化されることを特徴とするという特徴を有する。
PCRにおける基準遺伝子は、KozeraおよびRapacz(2013)で考察されており、その内容は参照により本明細書に援用される。
PCRにおける基準遺伝子は、KozeraおよびRapacz(2013)で考察されており、その内容は参照により本明細書に援用される。
所定の遺伝子の発現レベルを正常化するためには、基準遺伝子との比較を行うことが望ましい。1つの実施形態では、FGFR(以下では標的遺伝子と呼ぶ)、好ましくはFGFR2およびFGFR3の正規化遺伝子発現を以下の公式により算出する:
40-((Ct標的遺伝子)-(Ctハウスキーパー))
本明細書中では「ΔCT」とも呼ばれる。
40-((Ct標的遺伝子)-(Ctハウスキーパー))
本明細書中では「ΔCT」とも呼ばれる。
本発明の1以上の実施形態によれば、本方法は、前記1以上の基準遺伝子が少なくとも1つのハウスキーピング遺伝子であることを特徴とする。
本明細書で使用する「ハウスキーピング遺伝子」という用語は、基準遺伝子のより特殊な形態を指す。細胞機能の維持に必須な活性をもつタンパク質をコードする一群の遺伝子を指す。これらの遺伝子は、典型的にはすべての細胞種で同様に発現している。ハウスキーピング遺伝子には、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、Cypl、アルブミン、アクチン、例えばβ-アクチン、チューブリン、シクロフィリン、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HRPT)、L32、28S、および18Sが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の1以上の実施形態によれば、少なくとも1つのハウスキーピング遺伝子は、次の表2に示すCALM2、B2Mおよび/またはRPL37Aからなる群より選択される。当業者は、従来の知見と併せて、本明細書に記載された開示に基づいて、これらの遺伝子のいずれかの発現を同定し、定量するのに適したプライマー組合せ(任意にプローブを用いる)を選択することができることに注意すべきである。
本発明の1以上の実施形態によると、KRT5、ERBB2、KRT20、PD1、PD-L1、および/またはTACC3からなる群から選択される少なくとも1つ以上の遺伝子の発現レベルが決定され、任意に正規化される。これらの遺伝子を次の表3に示す。
当業者は、従来の知見と併せて、本明細書に記載された開示に基づいて、これらの遺伝子のいずれかの発現を同定し、定量するのに適したプライマー組合せ(任意にプローブを用いる)を選択することができることに注意すべきである。
表に記載されているNCBI参照は単なるサンプルであることに注意する。それぞれのmRNAの他のアイソフォームやバリアントが存在することもあり、それぞれのデータベースの当業者で簡単に見つけることができる。
当業者は、従来の知見と併せて、本明細書に記載された開示に基づいて、これらの遺伝子のいずれかの発現を同定し、定量するのに適したプライマー組合せ(任意にプローブを用いる)を選択することができることに注意すべきである。
本発明の1つ以上の実施形態によれば、本方法は、尿路上皮がんまたは膀胱がんがT2、T3またはT4期がんであることを特徴とする。
尿路上皮がんまたは膀胱がんは以下のように4つの病期に分類される:
尿路上皮がんまたは膀胱がんは以下のように4つの病期に分類される:
T1:腫瘍は、膀胱の内壁とその下の筋肉を隔てている結合組織(粘膜固有層と呼ばれる)に拡がっているが、膀胱壁の筋層は侵されていない。
T2:腫瘍が膀胱壁の筋層まで拡がっている。
T3:腫瘍は膀胱周囲組織(膀胱を取り囲む脂肪組織)内に増殖している。
T4:腫瘍が以下のいずれかに拡がっている:腹壁、骨盤壁、男性の前立腺または精のう(***を運ぶ管)、女性の子宮または腟。
T2:腫瘍が膀胱壁の筋層まで拡がっている。
T3:腫瘍は膀胱周囲組織(膀胱を取り囲む脂肪組織)内に増殖している。
T4:腫瘍が以下のいずれかに拡がっている:腹壁、骨盤壁、男性の前立腺または精のう(***を運ぶ管)、女性の子宮または腟。
本発明の1以上の実施形態によると、工程b)における分類は、FGFR2および/またはFGFR3の発現レベルに依存する。
好ましくは、工程b)における分類は、それぞれFGFR2およびFGFR3の発現レベル間の比率、またはそれらの正規化された発現レベルに依存する。したがって、このようなアプローチは遺伝子間不均衡の存在を明らかにするために用いられる。
14.工程b)の分類が、FGFR遺伝子、好ましくはFGFR3遺伝子における変化の有無に依存する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
FGFR遺伝子、好ましくはFGFR3遺伝子におけるそのような変化は、本明細書中で議論されるように、例えば、FGFR3とTACC3との間の融合である。このような変化は遺伝子内不均衡をもたらす。このような変異は、FGFR3のキナーゼドメインの過剰活性につながる可能性があり、したがって、FGFR3の相対的過剰発現と同様の作用を有する可能性がある。
本明細書中で使用される場合、用語「アップレギュレートされた」は、所与の試料中の遺伝子の発現、すなわち、転写されたmRNAまたは翻訳されたタンパク質の量が多い状態に関する。1つの実施形態では、健康な患者または正常患者についての比較試料におけるその発現の少なくとも1.3倍である。
本明細書中で使用される場合、用語「過剰発現」は、所与の試料中の遺伝子の発現、すなわち、転写されたmRNAまたは翻訳されたタンパク質の量が多い状態に関する。1つの実施形態では、健康な患者または正常患者についての比較試料におけるその発現の少なくとも1.3倍である。
一実施形態では、FGFR2のΔCTが35以上であれば、FGFR2はアップレギュレートまたは過剰発現しているとみなされる。
一実施形態では、FGFR3のΔCTが33,97以上であれば、FGFR3はアップレギュレートまたは過剰発現していると考えられる。
本明細書中で使用される場合、用語「ダウンレギュレートされた」は、所与の試料中の遺伝子の発現、すなわち、転写されたmRNAまたは翻訳されたタンパク質の量が低くなる条件に関する。1つの実施形態において、健康な患者または正常患者についての比較試料におけるそれの発現より少なくとも1.3倍低い。
本明細書中で使用される場合、用語「過少発現」は、所与の試料中の遺伝子の発現、すなわち、転写されたmRNAまたは翻訳されたタンパク質の量が低くなる条件に関する。1つの実施形態において、健康な患者または正常患者についての比較試料におけるそれの発現より少なくとも1.3倍低い。
一実施形態では、ΔCTが35未満であれば、FGFR2はダウンレギュレートされているか、過少発現しているとみなされる。一実施形態では、ΔCTが33,97未満であれば、FGFR3はダウンレギュレートされているか、過少発現しているとみなされる。
本明細書中で使用される用語「FGFR遺伝子における変化」は、特に、FGFR3遺伝子が、例えば変異または融合によって変化した試料に関する。このような変異体は、例えば、FGFR3遺伝子のエクソン7、10および15に存在し得る。最も頻繁に観測される変異体の1つはエクソン7におけるS249Cである(Tomlinson et al., 2007)。他の頻繁に観察されるFGFR3の変化は、FGFR3-TACC3融合であり、例えば、その内容が参照により本明細書に援用されるCostaら(2016)またはその内容が参照により本明細書に援用されるLasorellaら(2017)に記載されている通りである。
一般的に、図に示されるように、以下のFGFR状態は、(i)免疫腫瘍薬のような抗がん剤、または(ii)FGFR阻害剤による治療に関して適切な予後予測能を提供するものとして決定されている。表4にいくつかの例を示す。
したがって、もしFGFR2がアップレギュレートされるか、または過剰発現されるならば、それぞれの患者は、抗がん剤による治療について良好な予後を有する。したがって、選択されるべき治療様式は、免疫腫瘍薬のような抗がん剤である。
FGFR3がアップレギュレートまたは過剰発現している場合、選択すべき治療様式はFGFR阻害剤である。同様に、FGFR2がダウンレギュレートまたは低発現であり、FGFR3が変化している場合、選択すべき治療様式はFGFR阻害剤である。
もしFGFR2とFGFR3がダウンレギュレートされているか、低発現であるならば、それぞれの患者は抗がん剤による治療の予後が良好である。したがって、選択されるべき治療様式は、免疫腫瘍薬のような抗がん剤である。
特に、もしFGFR3がダウンレギュレートされているか、あるいは低発現であるならば、これは免疫浸潤の増加につながる可能性があり、その結果、免疫チェックポイント阻害剤(後述参照)のような免疫腫瘍薬による治療が成功する可能性があることが示唆される。
本発明の1つ以上の実施形態によれば、試料は、工程a)における決定前の試料に含まれる核酸の精製のために、シリカコーティングされた磁気粒子およびカオトロピック塩で処理される。
本発明の1以上の実施形態によると、抗がん剤は少なくとも1つの化学療法剤を含む。
本発明の1以上の実施形態によると、抗がん剤は免疫チェックポイント阻害剤を含む。
チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント、すなわちその作用を刺激または阻害する免疫系の重要な調節因子を標的とするがん免疫療法薬の一種である。腫瘍はこれらのチェックポイントを使って、免疫系による攻撃から身を守ることができる。チェックポイント治療は阻害チェックポイントを遮断し、免疫系の機能を回復させることができる。
本発明の1以上の実施形態によると、免疫チェックポイント阻害剤は、少なくとも以下からなる群より選択される1つである
・PD-1阻害剤、
・PD-L1阻害剤、
・CTLA-4阻害剤、
・LAG3阻害剤、
・TIM3阻害剤、および/または
・OX40阻害剤。
・PD-1阻害剤、
・PD-L1阻害剤、
・CTLA-4阻害剤、
・LAG3阻害剤、
・TIM3阻害剤、および/または
・OX40阻害剤。
本発明の1つ以上の実施形態によると、免疫チェックポイント阻害剤は、以下からなる群より選択される少なくとも1つである
・抗体、
・修飾された抗体フォーマット、
・標的結合特性を保持する抗体誘導体または断片、
・抗体ベースの結合タンパク質、
・オリゴペプチドバインダー、および/または
・抗体ミメティック。
・抗体、
・修飾された抗体フォーマット、
・標的結合特性を保持する抗体誘導体または断片、
・抗体ベースの結合タンパク質、
・オリゴペプチドバインダー、および/または
・抗体ミメティック。
「抗体」は、「免疫グロブリン」(Ig)とも呼ばれ、一般的に2本の重鎖(H)と2本の軽鎖(L)の4本のポリペプチド鎖から構成されており、そのため多量体であるタンパク質またはその同等のIgホモログ(例えば、重鎖のみで構成されているラクダ科のナノボディ、重鎖または軽鎖のいずれかに由来し得る単一ドメインの抗体(dAb));その全長機能性変異体、バリアント、または誘導体とアロタイプを含む(マウス、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗体を含み、Ig分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持し、二重特異性(dual specific)、二重特異性、多特異性、および二重可変ドメイン免疫グロブリンを含むが、これらに限定されない;免疫グロブリン分子は、任意のクラス(例:IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、またはサブクラス(例:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)のいずれかである。)
本明細書で使用される「抗体ベースの結合タンパク質」は、他の非免疫グロブリン、または非抗体由来の成分の状況において、少なくとも1つの抗体由来のVH、VL、またはCH免疫グロブリンドメインを含む任意のタンパク質を表すことができる。そのような抗体ベースのタンパク質には、(i)免疫グロブリンCHドメインの全部または一部を持つ受容体または受容体成分を含む結合タンパク質のFc融合タンパク質、(ii)VHおよびまたはVLドメインが代替の分子足場に結合した結合タンパク質、または(iii)免疫グロブリンVH、および/またはVL、および/またはCHドメインが、天然に存在する抗体または抗体断片には通常見られない方法で結合および/または組み立てられた分子が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「抗体誘導体または断片」は、全長ではない抗体由来の少なくとも1つのポリペプチド鎖を含む分子に関するもので、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
(i)可変軽鎖(VL)、可変重鎖(VH)、定常軽鎖(CL)、定常重鎖1(CH1)ドメインからなる一価の断片であるFab断片;
(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む2価の断片である、F(ab’)2断片;
(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFab(Fd)断片の重鎖の一部;
(iv)抗体のシングルアームのVLおよびVHドメインからなる可変断片(Fv)断片、
(v)単一の可変ドメインを含むドメイン抗体(dAb)断片;
(vi)単離された相補性決定領域(CDR);
(vii)単鎖Fv断片(scFv);
(viii)VHとVLのドメインが単一のポリペプチドの鎖で発現されるが、短すぎてその2つのドメインを同一鎖上でペアリングできないリンカーを使用し、それにより、ドメインは別の鎖の相補性ドメインとペアになり、2つの抗原結合部位が作成される、二価の二重特異性抗体であるダイアボディ;および
(ix)相補性軽鎖ポリペプチドと一緒になって1対の抗原結合領域を形成する1対のタンデムFvセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む線状抗体;および
(x)免疫グロブリン重鎖および/または軽鎖の他の非全長部分、またはそれらの変異体、バリアント、もしくは誘導体の単独または任意の組み合わせ。
いずれの場合でも、前記誘導体または断片は、標的結合特性を保持している。
(i)可変軽鎖(VL)、可変重鎖(VH)、定常軽鎖(CL)、定常重鎖1(CH1)ドメインからなる一価の断片であるFab断片;
(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む2価の断片である、F(ab’)2断片;
(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFab(Fd)断片の重鎖の一部;
(iv)抗体のシングルアームのVLおよびVHドメインからなる可変断片(Fv)断片、
(v)単一の可変ドメインを含むドメイン抗体(dAb)断片;
(vi)単離された相補性決定領域(CDR);
(vii)単鎖Fv断片(scFv);
(viii)VHとVLのドメインが単一のポリペプチドの鎖で発現されるが、短すぎてその2つのドメインを同一鎖上でペアリングできないリンカーを使用し、それにより、ドメインは別の鎖の相補性ドメインとペアになり、2つの抗原結合部位が作成される、二価の二重特異性抗体であるダイアボディ;および
(ix)相補性軽鎖ポリペプチドと一緒になって1対の抗原結合領域を形成する1対のタンデムFvセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む線状抗体;および
(x)免疫グロブリン重鎖および/または軽鎖の他の非全長部分、またはそれらの変異体、バリアント、もしくは誘導体の単独または任意の組み合わせ。
いずれの場合でも、前記誘導体または断片は、標的結合特性を保持している。
本明細書で使用される用語「修飾された抗体フォーマット」は、抗体-薬物-コンジュゲート、ポリアルキレンオキシド修飾scFv、モノボディ、ディアボディ、ラクダ抗体、ドメイン抗体、二重または三重特異性抗体、IgA、またはj鎖で結合された2つのIgG構造と分泌成分、サメ抗体、新世界霊長類フレームワーク+非新世界霊長類CDR、ヒンジ領域を除去したIgG4抗体、CH3ドメインに2つの追加結合部位をエンジニアリングしたIgG、Fcガンマ受容体への親和性を高めるためにFc領域を変更した抗体、CH3+VL+VHを含む二量体化コンストラクトなどを包含する。
本明細書中で使用される用語「抗体ミメティック」は、免疫グロブリンファミリーに属さないタンパク質を指し、およびアプタマー、または合成ポリマーのような非タンパク質でさえも指す。いくつかの種類は、抗体様ベータシート構造を有する。抗体に対する「抗体ミメティック」または「代替スカフォールド」の潜在的な利点は、より良好な溶解性、より高い組織移行、加熱および酵素に対するより高い安定性、および比較的低い生産コストである。
いくつかの抗体ミメティックは大きなライブラリーで提供することができ、考えられるすべての標的に対して特異的な結合候補を提供する。抗体と同様に、標的特異的抗体ミメティックは、ハイスループットスクリーニング(HTS)技術のほか、ファージディスプレイ、バクテリアディスプレイ、イーストまたは哺乳動物ディスプレイのように、確立されたディスプレイ技術を用いることによって開発することができる。現在開発されている抗体ミメティックには、例えば、アンキリン反復タンパク質(DARPinと呼ばれる)、C型レクチン、黄色ブドウ球菌のA型ドメインタンパク質、トランスフェリン、リポカリン、フィブロネクチンの第10のIII型ドメイン、クニツドメインプロテアーゼ阻害剤、ユビキチン由来バインダー(アフィリンと呼ばれる)、ガンマクリスタリン由来バインダー、システインノットまたはノッチン、チオレドキシンAスカフォールドベースのバインダー、SH-3ドメイン、ストラドボディ、ジスルフィド結合およびCa2+によって安定化された膜受容体の「Aドメイン」、CTLA4ベースの化合物、Fyn SH3、およびアプタマー(特定標的分子に結合するペプチド分子)が包含される。
FGFR阻害剤はFGFRシグナル伝達を阻害するため、腫瘍の生存に影響を及ぼす様式が異なっている。これらは、ヒトがん細胞におけるパクリタキセル、およびエトポシドのような通常の抗がん剤に対する腫瘍感受性の増大を可能にし、それにより抗アポトーシス能力を増加する。さらに、FGFシグナル伝達抑制は、血管再生を劇的に減少させ、がん、血管新生の特徴的所見の1つに打撃を与え、乳がんに対する一般的なVEGFR-2治療後のFGF2アップレギュレーションに基づく自己分泌FGFシグナル伝達に依存するヒト腫瘍の腫瘍負荷を減少させる。このような方法で、FGFR阻害剤は治療法と相乗的に作用し、将来の再発の潜在的経路を排除することにより、がんクローン再燃を遮断することができる。
さらに、EGFRまたはVEGFRを標的とした治療後にFGFR活性化マイナーサブポピュレーションがクローン性に進化するため、FGFR阻害剤は再発腫瘍に効果的である可能性がある。FGFR阻害剤にはヒトがんの薬剤耐性を克服する作用機序が多岐にわたるため、FGFRを標的とした治療は難治がん治療の有望なストラテジーである。
本発明の1以上の実施形態によると、FGFR阻害剤はFGFRチロシンキナーゼ阻害剤である。チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)は、チロシンキナーゼを阻害する薬剤である。チロシンキナーゼは、シグナル伝達カスケードによる多くのタンパク質の活性化を担う酵素である。通常、これらは膜貫通型受容体の細胞内部分を形成し、細胞外リガンドが結合すると活性化される。チロシンキナーゼは、TKIが阻害する工程であるタンパク質にリン酸基を付加する(リン酸化)ことによってタンパク質を活性化する。TKIは抗がん剤として用いられるのが一般的である。例えば、これらは慢性骨髄性白血病の治療結果を大幅に改善している。
本発明の別の態様によると、以下にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される:
a) FGFR1、FGFR2、FGFR3またはFGFR4のいずれか1つ、または変化したFGFR遺伝子をコードする核酸分子、または、
b) FGFR1、FGFR2、FGFR3またはFGFR4のいずれか1つ、またはそのアイソフォーム、または変化したFGFRをコードするmRNA。
前記オリゴヌクレオチドが、以下からなる群より選択される:
- 増幅プライマー(フォワードおよび/またはリバース)、
- 標識されたプローブ、および/または
- 基質結合プローブ。
a) FGFR1、FGFR2、FGFR3またはFGFR4のいずれか1つ、または変化したFGFR遺伝子をコードする核酸分子、または、
b) FGFR1、FGFR2、FGFR3またはFGFR4のいずれか1つ、またはそのアイソフォーム、または変化したFGFRをコードするmRNA。
前記オリゴヌクレオチドが、以下からなる群より選択される:
- 増幅プライマー(フォワードおよび/またはリバース)、
- 標識されたプローブ、および/または
- 基質結合プローブ。
本発明の一以上の実施形態によれば、前記オリゴヌクレオチドは、上記記載の方法を実施するためのキットの製造用に提供される。
好ましくは、(i)フォワード増幅プライマー、(ii)リバース増幅プライマーおよび(iii)プローブ(標識および/または基質結合)のセットを提供する。
任意に、上記に加えて、以下にハイブリダイズし得る少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される:
a) 基準遺伝子、またはハウスキーピング遺伝子をコードする核酸分子、または
b) 基準タンパク質、またはハウスキーピングタンパク質をコードするmRNA。
上記オリゴヌクレオチドは、以下からなる群より選択される:
- 増幅プライマー(フォワードおよび/またはリバース)、、
- 標識されたプローブ、および/または
- 基質結合プローブ。
任意に、上記に加えて、以下にハイブリダイズし得る少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される:
a) 基準遺伝子、またはハウスキーピング遺伝子をコードする核酸分子、または
b) 基準タンパク質、またはハウスキーピングタンパク質をコードするmRNA。
上記オリゴヌクレオチドは、以下からなる群より選択される:
- 増幅プライマー(フォワードおよび/またはリバース)、、
- 標識されたプローブ、および/または
- 基質結合プローブ。
好ましくは、(i)フォワード増幅プライマー、(ii)リバース増幅プライマー、および(iii)プローブ(標識および/または基質結合)のセットをその目的のために提供する。好ましくは、基準遺伝子またはハウスキーピング遺伝子は、CALM2、B2Mおよび/またはRPL37Aからなる群から選択される。
いくつかの適当なプライマー(フォワードおよび/またはリバース)およびプローブが本明細書の配列表に示されていることに注意すること。
本発明の1つ以上の実施形態によると、上記記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含むキット。
本発明の1つ以上の実施形態によると、上記記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含むキット。
本発明の1つ以上の実施形態によれば、キットは、上記のように、リバースプライマー、フォワードプライマーの少なくとも1つのセット、および任意にプローブを含む。
本発明の1以上の実施形態によれば、本キットは、以下を含む:
a) FGFR2をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワード/リバースプライマーのセット、および任意に適当なプローブ、およびb)FGFR3をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワード/リバースプライマーのセット、および任意に適当なプローブ。
a) FGFR2をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワード/リバースプライマーのセット、および任意に適当なプローブ、およびb)FGFR3をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワード/リバースプライマーのセット、および任意に適当なプローブ。
このようなプライマーおよび任意にプローブの例を、配列表、配列番号25~57(FGFR2)および配列番号58~75(FGFR3)に示す。
本発明の教示、およびここに開示された配列情報、ならびにFGFR2および3のゲノムおよびmRNA配列を示す公開データベースに基づいて、当業者は、いかなる発明の活動なしに、同様に適切な改変プライマー及びプローブを見出すことができる。したがって、このような代替品は、本出願の範囲にも含まれるものとする。
本発明の1つ以上の実施形態によれば、このキットはさらに、FGFR3-TACC3融合タンパク質の存在を検出することができるプライマーのセットを含む。
本発明の1以上の実施形態によれば、本キットは、以下を含む:
a) FGFR2をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワードプライマー/リバースプライマーのセット、およびb)FGFR3-TACC3融合タンパク質の存在を検出することができるプライマーのセット。
本発明の1以上の実施形態によれば、本キットは、以下を含む:
a) FGFR2をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワードプライマー/リバースプライマーのセット、およびb)FGFR3-TACC3融合タンパク質の存在を検出することができるプライマーのセット。
本発明の1以上の実施形態によれば、FGFR3-TACC3融合タンパク質セットの存在を検出することができるプライマーのセットは、以下を含む:
a) FGFR3とTACC3との融合部位からN末端に位置するFGFR3エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマー、及びFGFR3とTACC3との融合部位からC末端に位置するTACC3エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマー、
b) FGFR3のN末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマーと、FGFR3のN末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマーに加えて、FGFR3のC末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマーと、FGFR3のC末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるリバースプライマー、
c) TACC3のC末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるフォワードプライマー、およびTACC3のN末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるリバースプライマー、ならびにTACC3のN末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるフォワードプライマー、および/またはTACC3のN末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるリバースプライマー、
d) FGFR3とTACC3との融合部位からN末端に位置するFGFR3エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマー、及びFGFR3とTACC3との融合部位からC末端に位置するFGFR3エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマー。
a) FGFR3とTACC3との融合部位からN末端に位置するFGFR3エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマー、及びFGFR3とTACC3との融合部位からC末端に位置するTACC3エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマー、
b) FGFR3のN末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマーと、FGFR3のN末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマーに加えて、FGFR3のC末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマーと、FGFR3のC末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるリバースプライマー、
c) TACC3のC末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるフォワードプライマー、およびTACC3のN末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるリバースプライマー、ならびにTACC3のN末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるフォワードプライマー、および/またはTACC3のN末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるリバースプライマー、
d) FGFR3とTACC3との融合部位からN末端に位置するFGFR3エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマー、及びFGFR3とTACC3との融合部位からC末端に位置するFGFR3エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマー。
選択肢a)は、定義されたFGFR3-TACC3融合タンパク質の発現を測定するのに役立つ。
選択肢b)は、FGFR3 N末端とC末端の発現間のデルタを測定するのに役立つ。FGFR3-TACC3融合体が存在する場合、FGFR3のC末端の発現はFGFR3のN末端の発現よりも小さいはずである。この実施形態により、様々なFGFR3-TACC3融合タンパク質バリアントを測定することができる。
選択肢c)は、TACC3のN末端とC末端の発現間のデルタを測定するのに役立つ。FGFR3-TACC3融合体が存在する場合、TACC3 C末端の発現はTACC3 N末端の発現よりも高く、この実施形態を用いて、異なったFGFR3-TACC3融合タンパク質バリアントを測定することができる。
選択肢d)は、FGFR3とTACC3の融合部位からN末端に位置するFGFR3エクソンと、FGFR3とTACC3の融合部位からC末端に位置するFGFR3エクソンとの間の発現のデルタを測定するのに役立つ。FGFR3-TACC3融合体が存在する場合、N末端に位置するFGFR3エクソンの発現は、C末端に位置するFGFR3の発現よりも高くなければならない。
選択肢a)~d)は、図8A~Dの実施形態に相当する。
TACC3およびFGFR3のエクソン構造を図12および13に開示する。TACC3遺伝子は、23.6kbに及ぶ16個の確認されたエクソンから構成されている。FGFR3遺伝子は16.5Kbに及ぶ19個のエクソンから構成されており、そのうちヒトではエクソン1が知られていない。この情報に基づいて、当業者は、本発明の教示を読む場合に、プライマーおよび任意にプローブを設計することができる。
選択肢a)の1つの実施形態において、フォワードプライマーは、FGFR3のエクソン1-18中の核酸分子にハイブリダイズすることが可能であり、リバースプライマーは、TACC3のエクソン11-16中の核酸分子にハイブリダイズすることが可能である。
選択肢a)のこのようなプライマーおよび任意にのプローブの例を配列表、配列番号149および150に示す。
選択肢b)のこのようなプライマーおよび任意にプローブの例を、配列表、配列番号153、154、157および158に示す。
選択肢c)のこのようなプライマーおよび任意にプローブの例を、配列表、配列番号155、156、159および160に示す。
選択肢d)の1つの実施形態において、FGFR3のエクソン1~17の核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワードプライマー、およびFGFR3のエクソン18またはそれ以上の核酸分子にハイブリダイズすることができるリバースプライマー。
選択肢d)のこのようなプライマーおよび任意にプローブの例を配列表、配列番号161-166に示す。
他で考察されているように、FGFR3-TACC3融合タンパク質は文献に記載されている。図8に示した1つの例では、融合はN->C配向で、FGFR3のエクソン1~17とTACC3のエクソン11~16からなる。選択肢a)およびd)の好ましい実施形態として上記に示すプライマーキットは、このような融合構造の基礎の一つとして設計されている。しかしながら、融合構造が異なっている場合には、プライマーおよび任意にプローブを改変することができるか、または改変しなければならない。
本発明の教示、ならびにFGFR3およびTACC3のゲノムおよびmRNA配列を示す本明細書および公開データベース、ならびに代替FGFR3-TACC3融合タンパク質の構造の公的利用可能性(図8および14、ならびにクローベら(2016)を参照のこと。これらの内容は、参考により本明細書に援用される)に基づいて、当業者は、いずれの発明の活動無しに、同様に適切な情報プライマーおよびプローブを見出すことができる。したがって、このような代替品は、本出願の範囲にも含まれるものとする。
本発明の1以上の実施形態によると、本発明のキットは、以下を含むプライマー/プローブセットを含む:
a) 表1に記載のフォワードプライマーとリバースプライマー、および任意にプローブ、ならびに表2に記載のフォワードプライマーとリバースプライマー、および任意にプローブ、
b) a)のプライマーおよび任意にプローブ、および少なくとも表3に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに任意にプローブ、
c) 表1に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および任意にプローブ、ならびに表3に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および任意にプローブ。
a) 表1に記載のフォワードプライマーとリバースプライマー、および任意にプローブ、ならびに表2に記載のフォワードプライマーとリバースプライマー、および任意にプローブ、
b) a)のプライマーおよび任意にプローブ、および少なくとも表3に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに任意にプローブ、
c) 表1に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および任意にプローブ、ならびに表3に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および任意にプローブ。
任意に、前記キットは、基準遺伝子、またはハウスキーピング遺伝子を検出するためのリバースプライマー、フォワードプライマーのセット、および任意にプローブを含む。好ましくは、該遺伝子は、CALM2、B2Mおよび/またはRPL37Aからなる群より選択される。
本明細書中で使用される用語「変化したFGFR遺伝子」は、例えば、変異または融合によって変化したFGFR3遺伝子に関する。このような変異体は、例えば、FGFR3遺伝子のエクソン7、10および15に存在し得る。最も頻繁に観測される変異体の1つはエクソン7におけるS249Cである(Tomlinson et al., 2007)。他の頻繁に観察されるFGFR3の変化は、例えばCosta R et al. (2016)に記載されているように、FGFR3-TACC3融合であり、その内容は、本明細書に参照により援用される。
本明細書中で使用される場合、用語「変化したFGFR」は、そのような変化したFGFR遺伝子に依存する遺伝子産物、すなわちタンパク質またはmRNAに関する。
本発明の1以上の実施形態によれば、該キットは、1以上の蛍光分子、発光分子、放射性分子、酵素分子および/または消光分子で標識される標識プローブを含む。
本発明の文脈で使用できるプローブの典型的なタイプの1つは、いわゆるTaqManプローブである。TaqManプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの5’末端に共有結合された蛍光体と、3’末端のクエンチャーから構成されている。いくつかの異なるフルオロフォア(例えば、6-カルボキシフルオレセイン、略語:FAM、またはテトラクロロフルオレセイン、略語:TET)およびクエンチャー(例えば、テトラメチルローダミン、略語:TAMRA)が利用可能である。クエンチャー分子は、Forster共鳴エネルギー移動(FRET)を介してサイクラーの光源によって励起されたときにフルオロフォアによって放出される蛍光を消光する。フルオロフォアとクエンチャーが近接している限り、蛍光信号は消光により抑制される。TaqManプローブは、特定のプライマーのセットによって増幅されたDNAの領域内にアニールするように設計されている。(図とは異なり、プローブは一本鎖のDNAに結合する)TaqManプローブは、標的配列との結合親和性を高めるために、マイナーグルーブバインダー(MGB)部位であるジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド(DPI3)とコンジュゲートさせることができる。MGBコンジュゲートプローブは、ファンダルワールス力の安定化が進むため、より高い融解温度(Tm)を持つ。Taqポリメラーゼがプライマーを伸長して新生鎖を合成すると(ここでも一本鎖の鋳型上であるが、図に示した方向とは逆の方向、すなわち相補鎖の3’から5’への方向である)、Taqポリメラーゼの5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にアニーリングしたプローブが分解される。プローブが分解されると、フルオロフォアがプローブから離れ、クエンチャーとの密着状態が解除されるため、クエンチング効果が解除され、フルオロフォアの蛍光が得られる。したがって、定量的PCRサーマルサイクラーで検出される蛍光は、PCRで放出されたフルオロフォアと存在するDNAテンプレートの量に正比例する。
本発明の1以上の実施形態によれば、上記記載によるオリゴヌクレオチドまたはキットの使用は、尿路上皮がんまたは膀胱がんに罹患しているか、または発症するリスクがある患者の試料を少なくとも2つの分類の1つに分類する方法において提供される。
本発明は図面および前記の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む(comprising)」という語は、他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞「a(1つの)」又は「an(1つの)」は複数形を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。
本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、N末端からC末端まで示される;本明細書に開示される全ての核酸配列は、5’->3’で示される。
材料及び方法
解析した患者の病態と生存データ
本研究のために、72のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)進行性尿路上皮がん試料を5つの病理学研究所から得た(2016年~2018年に収集)。すべての検体は、2010年のTNM分類に従って病理学的病期について再評価し、共通の悪性度分類システム(WHO 1974、AH、ME)に従って悪性度分類した。患者72名(男52名[72%]、女20名[28%])に免疫療法を施行し、患者49名(69%)にPD1阻害剤(ニボルマブ、ペムブロリズマブ)、22名(31%)にPDL1阻害剤(アテゾリズマブ)を投与した。免疫療法開始後の追跡期間中央値は7.1か月(範囲:1~25か月)であった。患者50名(69%)は膀胱に由来する腫瘍を有し、患者22名(31%)は上部尿路(尿管および/または腎盂)に腫瘍を有していた。組織病理学におけるTNM病期分類(膀胱摘除術、腎尿管摘除術、初診時)では、52人の患者(73%)がT3またはT4腫瘍を有していた。全身化学療法に関しては、患者4名(6%)が術前化学療法を受け、67名(94%)は術前化学療法を受けていない。補助療法の設定では、20名(28%)が補助化学療法を受け、52名(72%)の患者が補助化学療法を受けていない。病理組織学的データおよび外科手術を以下の表6に要約する。
解析した患者の病態と生存データ
本研究のために、72のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)進行性尿路上皮がん試料を5つの病理学研究所から得た(2016年~2018年に収集)。すべての検体は、2010年のTNM分類に従って病理学的病期について再評価し、共通の悪性度分類システム(WHO 1974、AH、ME)に従って悪性度分類した。患者72名(男52名[72%]、女20名[28%])に免疫療法を施行し、患者49名(69%)にPD1阻害剤(ニボルマブ、ペムブロリズマブ)、22名(31%)にPDL1阻害剤(アテゾリズマブ)を投与した。免疫療法開始後の追跡期間中央値は7.1か月(範囲:1~25か月)であった。患者50名(69%)は膀胱に由来する腫瘍を有し、患者22名(31%)は上部尿路(尿管および/または腎盂)に腫瘍を有していた。組織病理学におけるTNM病期分類(膀胱摘除術、腎尿管摘除術、初診時)では、52人の患者(73%)がT3またはT4腫瘍を有していた。全身化学療法に関しては、患者4名(6%)が術前化学療法を受け、67名(94%)は術前化学療法を受けていない。補助療法の設定では、20名(28%)が補助化学療法を受け、52名(72%)の患者が補助化学療法を受けていない。病理組織学的データおよび外科手術を以下の表6に要約する。
カプランマイヤー分析では、男女患者の全生存期間は同等であった(図2A)。PD1阻害剤(ニボルマブ/ペムブロリズマブ)で治療した患者とPDL1阻害剤(アテゾリズマブ)で治療した患者を比較した場合も同じであった。再度、IO治療を受けた生存患者群で有意差は認められなかった。進行膀胱腫瘍および進行上部尿管腫瘍の患者を対象としたカプランマイヤー法による解析では、全生存率は同等であった(データーは示していない)。遠隔転移のある患者(n=19)は、遠隔転移のない患者(n=40;12カ月後の生存確率59.2%、p=0.0048、(データは示していない))と比べて、全生存期間が有意に短かった(12カ月後の生存確率25.3%)。
SNaPShot配列決定のためのDNA分離
自動化手順(Promega Maxwell, Promega, Wisconsin, USA)を用いてホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPE)からDNAを単離した。通常、腫瘍含有量が50%以上の10μm FFPE切片5枚を1患者腫瘍当たり使用した。簡単に述べると、切片をキシロールで脱パラフィンし、RNAseを含まないエタノール(100%、96%、70%)を用いて再水和した。分画した腫瘍組織を300μlインキュベーション緩衝液(PROMEGA社)に懸濁し、80℃でサーモシェーカー(350rpm)上で10分間プレインキュベートし、一晩56℃(550rpm)でプロテイナーゼK(PROMEGA社)で処理した。次に、Promega DNA精製キット(Promega社、ウィスコンシン州、米国)を用いて溶解物からDNAを単離した。
自動化手順(Promega Maxwell, Promega, Wisconsin, USA)を用いてホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPE)からDNAを単離した。通常、腫瘍含有量が50%以上の10μm FFPE切片5枚を1患者腫瘍当たり使用した。簡単に述べると、切片をキシロールで脱パラフィンし、RNAseを含まないエタノール(100%、96%、70%)を用いて再水和した。分画した腫瘍組織を300μlインキュベーション緩衝液(PROMEGA社)に懸濁し、80℃でサーモシェーカー(350rpm)上で10分間プレインキュベートし、一晩56℃(550rpm)でプロテイナーゼK(PROMEGA社)で処理した。次に、Promega DNA精製キット(Promega社、ウィスコンシン州、米国)を用いて溶解物からDNAを単離した。
FGFR3-SNaPshot突然変異解析
FGFR3変異解析は、前述のようにSNaPshot PCRにより実施した(van Oers 2007を参照のこと、その内容は参照により本明細書に援用される)。要するに、膀胱がんに見出されるすべてのFGFR3変異を含むFGFR3遺伝子の3領域(その内容が参照により本明細書に援用されるvan Rhijn 2002を参照のこと)を、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において同時に増幅した。過剰なプライマーおよびdNTPを除去した後、9つのFGFR3変異を検出する8つのSNaPshotプライマーをPCR産物にアニーリングし、標識ジデオキシヌクレオチドで伸長した。これらの伸長プライマーを自動シークエンサー上で分析し、取り込まれたヌクレオチド上に標識を付け、変異の有無を示した。すべての変異は、2回目の独立したSNaPshot分析によって検証した。
FGFR3変異解析は、前述のようにSNaPshot PCRにより実施した(van Oers 2007を参照のこと、その内容は参照により本明細書に援用される)。要するに、膀胱がんに見出されるすべてのFGFR3変異を含むFGFR3遺伝子の3領域(その内容が参照により本明細書に援用されるvan Rhijn 2002を参照のこと)を、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において同時に増幅した。過剰なプライマーおよびdNTPを除去した後、9つのFGFR3変異を検出する8つのSNaPshotプライマーをPCR産物にアニーリングし、標識ジデオキシヌクレオチドで伸長した。これらの伸長プライマーを自動シークエンサー上で分析し、取り込まれたヌクレオチド上に標識を付け、変異の有無を示した。すべての変異は、2回目の独立したSNaPshot分析によって検証した。
FGFR融合遺伝子スクリーニングと検証
一般的なRQ-PCRアッセイは、既知の融合遺伝子において保持または欠失され、したがって過剰発現され得るFGFR2およびFGFR3の3’-配列を標的とし、前記のようにして確立された。(Erben 2010)StepOnePlus(登録商標) real-time PCR system (米国アプライドバイオシステムズ(登録商標))のTaqMan(登録商標) fast advanced master mix (米国アプライドバイオシステムズ(登録商標))を用いて、FGFR2およびFGFR3の定量的PCR (qPCR)を実施した。FFPE組織試料からのRNAのcDNA合成は、調査した各遺伝子に特異的なリバースプライマーを有するSuperscript III (登録商標) reverse transcriptase kit (Invitrogen社、米国)を用いて実施した。qPCRには以下のプロトコルを用いた:95℃で20秒、その後95℃で3秒あたり40サイクル、60℃で30秒。Al測定は複製で行った。差異(1CTより大)およびまたは高いFGFR3および-2発現を示す試料を、FGFR3-TACC3融合のための特異的PCRで分析し、次世代シークエンシングでさらに検証した。単一またはネステッドPCRにおけるFGFR3‐TACC3融合遺伝子陽性試料のPCR産物を、増幅プライマーを用いた双方向サンガーシークエンシングにより確認した。
一般的なRQ-PCRアッセイは、既知の融合遺伝子において保持または欠失され、したがって過剰発現され得るFGFR2およびFGFR3の3’-配列を標的とし、前記のようにして確立された。(Erben 2010)StepOnePlus(登録商標) real-time PCR system (米国アプライドバイオシステムズ(登録商標))のTaqMan(登録商標) fast advanced master mix (米国アプライドバイオシステムズ(登録商標))を用いて、FGFR2およびFGFR3の定量的PCR (qPCR)を実施した。FFPE組織試料からのRNAのcDNA合成は、調査した各遺伝子に特異的なリバースプライマーを有するSuperscript III (登録商標) reverse transcriptase kit (Invitrogen社、米国)を用いて実施した。qPCRには以下のプロトコルを用いた:95℃で20秒、その後95℃で3秒あたり40サイクル、60℃で30秒。Al測定は複製で行った。差異(1CTより大)およびまたは高いFGFR3および-2発現を示す試料を、FGFR3-TACC3融合のための特異的PCRで分析し、次世代シークエンシングでさらに検証した。単一またはネステッドPCRにおけるFGFR3‐TACC3融合遺伝子陽性試料のPCR産物を、増幅プライマーを用いた双方向サンガーシークエンシングにより確認した。
次世代シークエンシング
GATC Biotech社のFFPE試料から、Agilent Sure選択技術を用いたハイブリダイゼーションに基づく標的捕獲次世代シークエンシングアプローチであるINVIEW Oncopanel All-in-one (Konstanz、ドイツ)を用いて、関連する可能性のある遺伝的変化を分析した。パネルは、次世代イルミナプラットフォーム上の597のがん関連遺伝子(https://www.eurofinsgenomics.eu/en/next-generation-sequencing/ngs-built-for-you/inview-panel/inview-oncopanel-all-in-one/)のエクソンとプロモーター領域を網羅している。肉眼的に健康な尿路上皮組織をマクロ解剖し、コピー数分析の対照とした。核酸分子は、製造元の規格に従い、ビーズに基づくシステム(XTRACTキット、STRATIFYER Molecular Pathology GmbH社、ドイツ)を用いて抽出し、塩基配列決定および遺伝子発現解析に用いた。
GATC Biotech社のFFPE試料から、Agilent Sure選択技術を用いたハイブリダイゼーションに基づく標的捕獲次世代シークエンシングアプローチであるINVIEW Oncopanel All-in-one (Konstanz、ドイツ)を用いて、関連する可能性のある遺伝的変化を分析した。パネルは、次世代イルミナプラットフォーム上の597のがん関連遺伝子(https://www.eurofinsgenomics.eu/en/next-generation-sequencing/ngs-built-for-you/inview-panel/inview-oncopanel-all-in-one/)のエクソンとプロモーター領域を網羅している。肉眼的に健康な尿路上皮組織をマクロ解剖し、コピー数分析の対照とした。核酸分子は、製造元の規格に従い、ビーズに基づくシステム(XTRACTキット、STRATIFYER Molecular Pathology GmbH社、ドイツ)を用いて抽出し、塩基配列決定および遺伝子発現解析に用いた。
mRNA評価およびRT-qPCRによる定量のためのFFPE組織からのRNA単離
RNAは10μm切片を用いてFFPE組織から抽出し、市販のビーズ抽出法(XTRACTキット; STRATIFYER Molecular Pathology GmbH, Cologne, Germany)により全自動処理した。RNAを100μlの溶出緩衝液で溶出し、RNA溶出物を分析した。RT-qPCRを、以前に記載したように遺伝子特異的TaqMan(登録商標)に基づくアッセイを用いることにより(Eckstein 2018、Eckstein 2018、Worst 2018)、FGFR1~4 mRNAの相対的定量化およびハウスキーピング遺伝子発現に適用した。それぞれの患者試料または対照を3回分析した。実験は、以下のプロトコールに従ってRoche Light Cycler LC480(Roche, Germany)で行った:50℃で5分間、95℃で20秒間、続いて95℃で15秒間、および60℃で60秒間の40サイクル。40回の増幅サイクルを適用し、3つのマーカーのサイクル定量化閾値(Ct)値および各試料についての1つの参照遺伝子を、3回の測定の平均として推定した。ハウスキーピング遺伝子のCT値(ΔCt)から標的遺伝子のCT値を差し引いてΔCT値を正規化し、これを行っているサイクル(例:40サイクル)の内容に設定した。
RNAは10μm切片を用いてFFPE組織から抽出し、市販のビーズ抽出法(XTRACTキット; STRATIFYER Molecular Pathology GmbH, Cologne, Germany)により全自動処理した。RNAを100μlの溶出緩衝液で溶出し、RNA溶出物を分析した。RT-qPCRを、以前に記載したように遺伝子特異的TaqMan(登録商標)に基づくアッセイを用いることにより(Eckstein 2018、Eckstein 2018、Worst 2018)、FGFR1~4 mRNAの相対的定量化およびハウスキーピング遺伝子発現に適用した。それぞれの患者試料または対照を3回分析した。実験は、以下のプロトコールに従ってRoche Light Cycler LC480(Roche, Germany)で行った:50℃で5分間、95℃で20秒間、続いて95℃で15秒間、および60℃で60秒間の40サイクル。40回の増幅サイクルを適用し、3つのマーカーのサイクル定量化閾値(Ct)値および各試料についての1つの参照遺伝子を、3回の測定の平均として推定した。ハウスキーピング遺伝子のCT値(ΔCt)から標的遺伝子のCT値を差し引いてΔCT値を正規化し、これを行っているサイクル(例:40サイクル)の内容に設定した。
統計解析
すべてのp値を両側で算出し、<0.05の値を有意であるとみなした。生存分析は単変量カプランマイヤー回帰により行い、Log-Rankで有意性を検定した。試験の結果、有意レベルが0.05未満であることが明らかになった場合、結果は有意であるとした。数値連続変数の統計解析はノンパラメトリック検定(Wilcoxon順位和検定、Kruskal-Wallis検定)を行った。連続変数の相関解析はスピアマン順位相関を用いて行った。統計解析はすべてGraphPad Prism 7.2(GraphPad Software Inc.、米国カリフォルニア州ラ・ジョラ)およびJMP SAS 13.2(SAS、米国ノースカロライナ州カロライナ州)により実施した。
すべてのp値を両側で算出し、<0.05の値を有意であるとみなした。生存分析は単変量カプランマイヤー回帰により行い、Log-Rankで有意性を検定した。試験の結果、有意レベルが0.05未満であることが明らかになった場合、結果は有意であるとした。数値連続変数の統計解析はノンパラメトリック検定(Wilcoxon順位和検定、Kruskal-Wallis検定)を行った。連続変数の相関解析はスピアマン順位相関を用いて行った。統計解析はすべてGraphPad Prism 7.2(GraphPad Software Inc.、米国カリフォルニア州ラ・ジョラ)およびJMP SAS 13.2(SAS、米国ノースカロライナ州カロライナ州)により実施した。
患者コホート
多施設(n=5)で日常的に抗PD‐1/抗PD‐L1免疫腫瘍薬で治療された患者を1次、2次および3次治療の一部として同定し、原発性および転移性腫瘍組織選択のそれぞれの試料選択をもたらした。
多施設(n=5)で日常的に抗PD‐1/抗PD‐L1免疫腫瘍薬で治療された患者を1次、2次および3次治療の一部として同定し、原発性および転移性腫瘍組織選択のそれぞれの試料選択をもたらした。
プライマー・プローブセット
以下に、本発明を実施するための任意のプローブを有するPCRプライマーセットを示す。当業者は、規定されていない場合、適当なプローブを選択することができることに留意すべきである。
以下に、本発明を実施するための任意のプローブを有するPCRプライマーセットを示す。当業者は、規定されていない場合、適当なプローブを選択することができることに留意すべきである。
Claims (31)
- 尿路上皮がんまたは膀胱がんに罹患しているか、または発症するリスクがある患者の試料を分類する方法であって、以下の工程を含む方法:
a) 前記患者由来の前記試料において、以下を決定する工程、
・FGFR遺伝子の変化の有無、および/または
・FGFR1、FGFR2、FGFR3またはFGFR4からなる群より選択される受容体をコードする少なくとも1つの遺伝子の発現レベル、および
b) 工程a)の結果から前記患者の試料を少なくとも2つの分類の1つに分類する工程。 - 工程a)の結果から患者の試料を少なくとも2つの分類の1つに分類する工程b)が、以下のいずれかに分類することを含む、請求項1に記載の方法。
(i) 抗がん剤による治療について良好な予後、または
(ii) 抗がん剤による治療について不良な予後。 - 工程b)の分類に基づいて治療の方法が選択され、治療の方法が以下のいずれかから選択される、請求項1または2に記載の方法。
(i) 抗がん剤による治療について良好な予後の場合には、抗がん剤の投与、または
(ii) 抗がん剤による治療について不良な予後の場合には、FGFR阻害剤の投与。 - 前記発現レベルが、以下の少なくとも1つにより決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
(i) 標識された一本鎖プローブを用いるハイブリダイゼーションに基づく方法、
(ii) ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含むPCRに基づく方法、
(iii) 検出可能なシグナルを生成するために分子が結合する電極システムを包含する、特定の分子の電気化学的検出に基づく方法、
(iv) マイクロアレイおよび/またはバイオチップの使用を含むアレイに基づく方法、
(v) 1つ以上の標的特異的タンパク質バインダーを用いる免疫学的方法。 - FGFR遺伝子における前記変化が以下により決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
(i) 変化したFGFRバリアントの発現レベルの決定、
(ii) 少なくとも
・変化したFGFRバリアントに組み込まれるFGFRエクソン、および
・変化したFGFRバリアントに組み込まれないFGFRエクソン
発現レベルの決定および両者の比較、および/または
(v) それぞれの変化を同定するために、それぞれのFGFR遺伝子の配列を決定する。 - 前記発現レベルが、以下の少なくとも1つのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCRまたはqPCR)によって決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
・FGFR野生型mRNA、および/または、
・変化したFGFRバリアントのmRNA。 - 1つ以上の正規化発現レベルを得るために、工程a)で決定された1つ以上の発現レベルが、工程b)以前に1つ以上の基準遺伝子の1つ以上の発現レベルで正規化されることを特徴とする、前記請求項のいずれか1つに記載の手法。
- 前記1以上の基準遺伝子が少なくとも1つのハウスキーピング遺伝子であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのハウスキーピング遺伝子が、CALM2、B2Mおよび/またはRPL37Aからなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- KRT5、KRT20、PD1及び/又はPD-L1からなる群より選択される少なくとも1つ以上の遺伝子の発現レベルが決定され、任意に正規化されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 尿路上皮がんまたは膀胱がんがT2、T3またはT4期がんであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)の分類がFGFR2および/またはFGFR3の発現レベルに依存する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)の分類が、それぞれFGFR2とFGFR3の発現レベル間の比率、またはそれらの正規化発現レベルに依存する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)の分類が、FGFR遺伝子、好ましくはFGFR3遺伝子における変化の有無に依存する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)の決定前に試料中に含まれる核酸分子を精製するために、試料をシリカ被覆磁気粒子およびカオトロピック塩で処理する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 抗がん剤が少なくとも1つの化学療法剤を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 抗がん剤が免疫チェックポイント阻害剤を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫チェックポイント阻害剤が、以下からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項17記載の方法。
・PD-1阻害剤、
・PD-L1阻害剤、
・CTLA-4阻害剤、
・LAG3阻害剤、
・TIM3阻害剤、および/または
・OX40阻害剤。 - 免疫チェックポイント阻害剤が、以下からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項17または18記載の方法
・抗体、
・修飾された抗体フォーマット、
・標的結合特性を保持する抗体誘導体または断片、
・抗体ベースの結合タンパク質、
・オリゴペプチドバインダーおよび/または
・抗体ミメティック。 - 免疫チェックポイント阻害剤が、表5に記載の群から選択される少なくとも1つである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- FGFR阻害剤がFGFRチロシンキナーゼ阻害剤である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- FGFR阻害剤が、表6に記載の群から選択される少なくとも1つである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- a) FGFR1、FGFR2、FGFR3またはFGFR4のいずれか1つ、または変化したFGFR遺伝子をコードする核酸分子、または、
b) FGFR1、FGFR2、FGFR3またはFGFR4のいずれか1つ、またはそのアイソフォーム、または変化したFGFRをコードするmRNA
にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、
オリゴヌクレオチドが、
- 増幅プライマー(フォワードおよび/またはリバース)、
- 標識されたプローブ、および/または、
- 基質結合プローブ
からなる群より選択され、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットの製造用である、オリゴヌクレオチド。 - 請求項21に記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含むキット。
- 以下を含む、請求項24に記載のキット:
a) FGFR2をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワード/リバースプライマーのセット、および任意に適当なプローブ、および
b) FGFR3をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワード/リバースプライマーのセット、および任意に適当なプローブ。 - さらに、FGFR3-TACC3融合タンパク質の存在を検出することができるプライマーのセットを含む、請求項25に記載のキット。
- 以下を含む、請求項24に記載のキット:
a) FGFR2をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるフォワードプライマー/リバースプライマーのセット、および
b) FGFR3-TACC3融合タンパク質の存在を検出することができるプライマーのセット。 - FGFR3-TACC3融合タンパク質の存在を検出することができるプライマーのセットが以下を含む、請求項26~27のいずれか一項に記載のキット:
a) FGFR3とTACC3との融合部位からN末端に位置するFGFR3エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマー、及びFGFR3とTACC3との融合部位からC末端に位置するTACC3エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマー、
b) FGFR3のN末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマーと、FGFR3のN末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマーに加えて、FGFR3のC末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマーと、FGFR3のC末端領域をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるリバースプライマー、
c) TACC3のC末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるフォワードプライマー、およびTACC3のN末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるリバースプライマー、ならびにTACC3のN末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるフォワードプライマー、および/またはTACC3のN末端領域をコードする核酸分子とハイブリダイズすることができるリバースプライマー、
d) FGFR3とTACC3との融合部位からN末端に位置するFGFR3エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるフォワードプライマー、及びFGFR3とTACC3との融合部位からC末端に位置するFGFR3エクソンの核酸分子にハイブリダイズできるリバースプライマー。 - 以下を含むプライマー/プローブセットを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のキット。
a) 表1に記載のフォワードプライマーとリバースプライマー、および任意にプローブ、ならびに表2に記載のフォワードプライマーとリバースプライマー、ならびに任意にプローブ、
b) a)のプライマーおよび任意にプローブ、および少なくとも表3に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに任意にプローブ、
c) 表1に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および任意にプローブ、ならびに表3に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに任意にプローブ。 - 1つ以上の蛍光分子、発光分子、放射性分子、酵素分子および/または消光分子で標識される標識プローブを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のキット。
- 尿路上皮がんまたは膀胱がんに罹患しているか、または発症するリスクがある患者の試料を少なくとも2つの分類の1つに分類する方法における、前記請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはキットの使用。
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