CN108676884A - 一种用于预测膀胱癌的肿瘤标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于预测膀胱癌的肿瘤标志物，该肿瘤标志物为DDX46，DDX46基因扩增引物的基因靶点序列为5’‑GATTGTGATTGAAGAAGAA‑3’，DDX46基因上游引物序列为5’‑AAAATGGCGAGAAGAGCAACG‑3’，DDX46基因下游引物序列为5’‑CATCATCGTCCTCTAAACTCCAC‑3’。本发明应用高通量测序技术对8例早期初诊膀胱癌患者的膀胱癌组织和正常组织进行检测，结果发现DDX46基因在膀胱癌组织中高表达，进一步通过RT‑PCR的方法验证了9例患者的膀胱癌组织和正常组织中DDX46mRNA表达，IHC的方法验证了56例膀胱癌及10例正常组织石蜡切片中DDX46蛋白的表达。

Description

一种用于预测膀胱癌的肿瘤标志物

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基因及其扩增引物，尤其涉及一种DDX46基因扩增引物及其作为膀胱癌分子标志物中的应用。

背景技术

膀胱癌作为泌尿***最常见的恶性肿瘤之一，居中国泌尿系肿瘤的首位，在西方仅次于***癌，且膀胱癌的发病呈现逐年上升和年轻化的趋势。据2015年中国癌症调查数据显示，在男性最常见的十种肿瘤中，膀胱癌的发病率2000～2011年期间有上升的趋势，但死亡率保持相对稳定。膀胱癌在初次诊断时，约70％～75％为非肌肉浸润性膀胱癌，然而局部复发率高达70％，其中约20％的初诊非肌层浸润性膀胱癌会进展为肌层浸润性膀胱癌，具有易复发的特点。由于膀胱癌病因复杂，其发生发展是一个多因素，多层面，多通路的复杂过程，发病机制并不明确，临床上亟待找到能早期诊断、复发检测的分子标志物及靶向治疗的作用靶点。

DDX46基因，属于DEAD-box家族成员，位于染色体5q31.1上。有研究表明DDX46可通过调节mRNA前体的可变剪切影响消化器官和脑部的发育，还与造血细胞的分化发育密切相关。最近有学者指出，DDX46基因高表达与食管鳞状细胞癌、结肠癌及骨肉瘤的发生发展密切相关。但是，DDX46基因在膀胱癌中的作用尚不清楚，且未见有文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供了一种用于预测膀胱癌的肿瘤标志物，通过寻找DDX46基因的靶点序列，设计DDX46基因的引物序列，构建了干扰DDX46基因表达的慢病毒载体，通过敲低膀胱癌细胞系(5637、T24)中DDX46基因表达发现抑制了膀胱癌细胞的增殖、侵袭和迁移，诱导细胞凋亡；动物实验阐明DDX46基因抑制膀胱癌T24细胞成瘤的能力。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种用于预测膀胱癌的肿瘤标志物，该肿瘤标志物为DDX46，DDX46基因扩增引物的基因靶点序列为5’-GATTGTGATTGAAGAAGAA-3’，DDX46基因上游引物序列为5’-AAAATGGCGAGAAGAGCAACG-3’，DDX46基因下游引物序列为5’-CATCATCGTCCTCTAAACTCCAC-3’。

所述DDX46基因扩增引物在鉴定膀胱癌中的应用。

本发明应用高通量测序技术对8例早期初诊膀胱癌患者的膀胱癌组织和正常组织进行检测，结果发现DDX46基因在膀胱癌组织中高表达，进一步通过RT-PCR的方法验证了9例患者的膀胱癌组织和正常组织中DDX46mRNA表达，IHC的方法验证了56例膀胱癌及10例正常组织石蜡切片中DDX46蛋白的表达。

附图说明

图1为慢病毒敲低膀胱癌T24和5637细胞DDX46基因表达；

图2为Celigo细胞计数检测细胞增殖图；

图3为MTT实验检测细胞活力图；

图4为克隆形成实验检测细胞增殖图；

图5为Transwell侵袭实验及划痕实验图；

图6为流式细胞术检测细胞凋亡图。

图7为裸鼠成瘤实验动物及瘤体图。

具体实施方式

本发明用于预测膀胱癌的肿瘤标志物DDX46基因影响膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移，诱导凋亡的具体步骤如下：

1、构建干扰DDX46基因表达的慢病毒载体，敲低膀胱癌T24和5637细胞DDX46基因表达。

1.1DDX46基因RNAi慢病毒制备

1)DDX46基因编号为NM_014829，用DDX46基因作为模板，按照RNAi的设计原则，通过软件评估选择出了DDX46基因的靶点序列为：5’-GATTGTGATTGAAGAAGAA-3’。其对照序列为公认的阴性序列：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’；

2)在DDX46基因shRNA干扰序列两段添加合适的限制性酶切位点(如：AgeI酶的酶切位点CCGG，EcoRI酶的酶切位点AATTC及该位点互补序列G)，并在反义链的5’端添加TTTTT互补序列，而正义链3’端添加终止信号TTTTT，制备成单链的DNA oligo片段，然后进行双链DNA Oligo的合成。

3)应用AgeI酶和EcoRI酶对pGC-LV载体进行双酶切，使其线性化；

4)用T4DNA连接酶将线性的pGC-LV载体和上述制备的DDX46基因shRNA双链在同一反应体系中进行连接，置于16℃反应过夜；

5)将上述连接产物和制备好的大肠杆菌感受态细胞，同时转入到一个500μL的LB液体培养基中且不添加抗生素，37℃条件下以200rpm的速度震荡培养1h；取含有氨苄青霉素的LB固体培养基均匀涂抹上述菌液150μL，将培养基放在37℃，含5％CO₂的培养箱中培养过夜。筛选阳性菌落进行PCR扩增分析，最后提取质检合格的质粒进行后续实验。

1.2慢病毒的包装

1)将包含20μg的DDX46基因重组质粒、15μg的pHelper1.0质粒及10μg的pHelper2.0质粒的混合溶液共转染293T细胞，6h后弃去培养皿中所有液体，用PBS洗涤3次，保证残余的转染混和物均被洗去；

2)收集293T细胞，并加入含10％胎牛血清的培养液继续培养48h，收取细胞上清液获得慢病毒，通过离心纯化浓缩获得高纯度慢病毒；

3)慢病毒滴度检测。

1.3DDX46基因干扰慢病毒转染膀胱癌细胞T24和5637

1)用完全培养基重悬经0.25％胰酶消化的对数生长期的T24和5637细胞，使细胞悬液浓度为3-5×104个/mL，接种于6孔板继续培养；

2)培养至细胞铺板量达15-30％左右，根据实际情况加入适量病毒，感染膀胱癌细胞系，感染时病毒与细胞的的数目比用感染复数(multiplicity of infection,MOI)表示：膀胱癌T24细胞与5637细胞病毒感染的MOI均为10，实验组LV-DDX46-RNAi(3640-1)加入病毒的量均为6.67μL，病毒滴度为3×108TU/mL。阴性对照组CON053加入病毒的量均为4μL，病毒滴度为5×108TU/mL。

3)加入病毒后16h后，弃去培养瓶内液体，加入常规培养基继续培养；

4)培养期间注意监测细胞状态，保证实验组和对照组细胞状态良好，没有出现细胞大量死亡现象。在更换常规培养基56h后，将培养基置于荧光显微镜下，观察绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的表达情况，计算荧光表达为阳性的细胞比率即感染荧光率；若感染荧光率达到70％以上则继续后续实验。

1.4qRT-PCR验证T24和5637细胞中DDX46基因的表达

1)按照上海普飞生物技术有限公司TRIzol RNA提取试剂盒操作说明书提取总的RNA；

①细胞刮刮取对数生长期的膀胱癌T24和5637细胞置于离心管中，放入离心机以2000rpm的转速离心5min，吸弃上清；

②室温，向离心管内加入1mL TRIzol，轻轻吹打细胞团，使其充分混匀，然后静置5min；

③将离心管内液体转移至1.5mL新EP管，加入200μL氯仿并混匀，放置10min；

④用低温高速离心机在4℃条件下，12800rpm高速离心15min；

⑤缓缓的吸取上层清液，加入新的1.5mL EP管中，然后量取等体积4℃预冷的异丙醇并加入到EP管中，上下颠倒混匀，放在4℃冰水混合物中静置10min；

⑥同步骤④的条件离心12min，吸弃上清液；

⑦向EP管内加入浓度为75％的乙醇1mL，清洗2次(乙醇为DEPC水现配现用)；

⑧4℃条件下11800rpm高速离心5min，吸弃上清；

⑨将EP管放置在室温条件下自然干燥，向管内加入RNase-free水溶解RNA；

⑩用Nanodrop2000/2000C分光光度计检测RNA的浓度及质量。

2)通过软件分析，获得DDX46基因和内参GAPDH引物序列分别为：

DDX46基因(110bp)上游引物序列：5-AAAATGGCGAGAAGAGCAACG-3’，下游引物序列：5’-CATCATCGTCCTCTAAACTCCAC-3’，GAPDH内参

(121bp)上游引物序列：5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3，下游引物序列：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’

3)按照逆转录M-MLV试剂盒的操作说明书进行RNA逆转录获得cDNA；

按照下表配置混合物，振荡混匀后离心30s，使混合物在70℃水浴中变性10min，然后将混合物放置在4℃冰水浴中，使Oligo dT和模板退火；

获得上述的混合物后，在冰上配制逆转录反应体系，并将混合物加入逆转录反应体系中，振荡混匀后，离心30s；取出后放置在42℃水浴箱内孵育1h，然后再70℃孵育10min，使逆转录酶失活。最后将获得的cDNA产物保存于-20℃冰箱。

注：dNTPs是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物，浓度为10mM

4)根据TAKARA SYBR Master Mixture试剂盒操作说明书进行PCR基因扩增；按下表配置扩增体系，反应条件为：95℃15s、95℃5s、60℃30s，三个过程共循环45次，在每次60℃30s的退火延伸结束时测量OD值。制作熔解曲线：95℃1min，95℃→55℃→95℃，且每升高0.5℃，维持4s,并同时读取吸光值；采用2-ΔΔCt法进行数据分析来反应样本中DDX46基因的相对表达水平。其中，ΔCt代表DDX46基因Ct值与GAPDH内参基因Ct值得差值。

2、Celigo细胞计数

1)用胰酶消化对数生长期的各组目的细胞，用完全培养基重悬细胞并进行细胞计数，最后将重悬细胞液的细胞浓度调整到4x10⁶个/ml；

2)本实验选择96孔板，每孔添加100μl重悬细胞液，为每组设置3个复孔，将各组孔板放入一定条件下的培养箱中(37℃、5％CO2、湿度适宜)培养过夜；

3)第2天开始，用Celigo细胞计数仪进行读板，每天1次，连续5天，尽可能地在同一个时间进行读板；

4)根据具体情况适当调整分析软件的参数，计算并收集不同组别每个孔板中的携带绿色荧光目的细胞的个数，最后汇总后进行制图(不同组别连续5天的生长曲线图)和差异对比分析；

5)分析：绘制基于细胞计数值和细胞增殖倍数的细胞生长曲线图，两者均时间为横坐标，但纵坐标有所不同，前者的纵坐标是细胞计数值，后者的纵坐标是细胞增殖倍数(各时间点细胞计数值与第一天细胞细胞计数值之比)。

3、MTT细胞活力实验

1)收集对数生长期的T24和5637细胞，将其重悬为单细胞悬液，并进行细胞计数；

2)按照1500cells/well，每组3个复孔，铺96孔板5张。铺板完成后，静置5min，然后将板置于显微镜下观察各实验组和对照组细胞是否分布均匀。若分布不均，则需重新铺板。最后将培养瓶放置在37℃、CO2浓度5％的培养箱中培养过夜；

3)铺板后的1到5天，每天同一时间点向每个孔内均加入MTT 20μL浓度为5mg/mL，期间无需更换培养基，然后置培养箱中继续孵育；

4)孵育4h后，轻轻吸弃上层的培养液，但不能接触孔板底部的甲瓒颗粒，加入PBS轻柔的冲洗2次后，加入二甲基亚枫(DMSO)100μL，并放在振荡器振荡，使甲瓒颗粒充分溶解，用酶标仪检测每孔在490nm处OD值；

5)数据整理分析。

4、克隆形成实验

1)胰酶消化对数生长期的各组目的细胞，用完全培养基重悬细胞并进行细胞计数，最后将重悬细胞液的细胞浓度调整到5x10⁶个/ml；

2)本实验选择6孔板，每孔添加100μl重悬细胞液，每组设置3个复孔，将各组孔板放入一定条件下的培养箱中(37℃、5％CO₂、湿度适宜)培养，第1次换液后，每隔2-3天换液一次，同时于倒置显微镜下观察细胞的生长状况；

3)14-16天后，确认形成细胞团块中细胞的计数基本均大于50，同时在倒置荧光显微镜下对其进行拍照；

4)向每孔中添加适量PBS液，充分混匀，后将废液倒掉；

5)将1mL 4％多聚甲醛添加到每个孔板中已到达固定细胞的目的，0.5h-1h后再次向每孔中添加适量PBS液，充分混匀，后将废液倒掉；

6)后将500μl GIEMSA染液添加到每个孔板中，使细胞均染上颜色，维持15-25min；

7)最后再向每孔中添加适量双蒸水，充分混匀，后将废液倒掉，共3次，待其自然干燥后用相机拍照，并收集数据进行统计学分析。

5、Transwell侵袭实验

1)根据实验设计取出所需数目的小室，放置在新的24孔板中，向上室内加入100μL无血清的培养基，置37℃培养箱1h；

2)用无血清培养基配制细胞悬液，计数并调整细胞数为105个/孔(24孔板)；

3)吸去上室中培养基，加入细胞悬液100μL，下室内加入FBS浓度为30％的培养基600μL；与此同时，用上述细胞悬液铺MTS 96孔板一块作为转移参照，接种5000cell/孔，即刻测定OD570；

4)将接种好的板置37℃培养箱24h，吸弃小室内培养基，用镊子夹取无菌棉球轻轻擦去非转移细胞，然后用Giemsa染色液浸染膜下表面的转移细胞3-5min，清洗小室，晾干并拍照；

5)将提前配置好的10％的醋酸200μL加入96孔板，用剪刀和镊子取下底膜置于醋酸中至细胞完全溶解，取100μL置新的孔中检测OD570；

6)数据分析：转移率：转移率＝A转移/AMTS；计算各组转移均值，并计算标准差，通过T-Test分析得到相应的p值，判断各组间是否存在显著性差异(p<0.05，有显著性差异，否则无显著性差异)。

6、划痕实验

1)将所有需要的器材灭菌处理，划痕仪在操作前紫外照射30min；

2)实验组(LV-DDX46-RNAi)和对照组(Control-LV)分别在96孔板中加入约3×104个/孔感染后的细胞，以次日细胞达到90％以上汇合度为准；

3)第二天更换低浓度血清培养基，以96孔板底部下端中央为参照标准，用划痕仪向上轻轻推动形成划痕；然后用无血清培养基洗去漂浮的细胞，加入含低浓度血清的培养基，并拍照；

4)将划好的培养基置于37℃、5％CO₂培养箱，按照预实验选择的时间点用荧光显微镜以96孔中心阴影区域为参照，划痕置于图片的正中拍照(0h、3h、6h或0h、4h、8h)；

5)比较培养不同时间的划痕图片，测量每个孔不同时间点的图片中划痕区域的宽度，计算各组细胞迁移率，最终比较肿瘤细胞迁移能力的差异。

7、流式细胞术检测细胞凋亡

1)用胰酶消化对数生长期的各组目的细胞，完全培养基重悬细胞并进行细胞计数，最后将重悬细胞液的细胞浓度调整到1x10⁶个/ml；

2)本实验选择6孔板，每孔添加100μl重悬细胞液，每组设置3个复孔，将各组孔板放入一定条件下的培养箱中(37℃、5％CO2、湿度适宜)培养过夜5天；

3)收集以上细胞于15ml的离心管中；

4)在常温下，以1300rmp/min的转速离心10min，倒掉上清废液，向离心管中添加2mlD-Hanks液(于4℃下预冷)，震荡1min，使其充分摇匀洗涤细胞；

5)弃上层废液，再向离心管中添加200μl1×binding buffer，在常温下，以1300rmp/min的转速离心3min，倒掉上清废液，共2次；

6)向该离心管中添加10μl Annexin V-APC染色，避光，在常温下反应15-20min；

7)再向离心管中添加400-800μl 1×binding buffer(具体视细胞数量而定)，1h内用流式细胞仪进行检测，并收集数据进行统计学分析。

8、裸鼠成瘤实验

1)收集对数生长期的膀胱癌T24细胞，使细胞悬液的浓度为2×10⁷个细胞/mL，用一次性注射器，按照每只0.5mL，皮下注射至动物右前肢腋下。

2)各组小鼠在相同条件下进行饲养，连续监测裸鼠的成瘤情况，于接种第16天开始，用游标卡尺精确测量瘤体长径和短径(单位：mm)，瘤体体积＝π/6×L×W×W，即＝3.14/6×L×W×W。其中L代表长径,W代表短径。每周2次，连续3周；

3)皮下注射35天后，给实验组及对照组所有裸鼠注射过量戊巴比妥钠，实行安乐死，并通过颈椎脱臼的方法确认其死亡。用预先准备好的医用剪刀和镊子切取肿瘤。以标尺作为参照，在白板左边及上方放置好标尺，在中间空白处排列好动物和瘤体，记录并观察标尺刻度，用数码照相机拍摄动物及瘤体照片；

4)用天平称量各个瘤体的重量，然后将各组瘤体分别放于多聚甲醛固定常温保存及-80℃冷冻保存，整理并分析数据。

图1所示构建DDX46基因干扰慢病毒后，敲低膀胱癌T24和5637细胞DDX46基因表达，进行PCR验证，结果DDX46基因均表达下调。

图2所示敲低表达DDX46基因细胞增殖受到抑制。

图3所示敲低表达DDX46基因细胞活力降低。

图4所示敲低表达DDX46基因细胞的克隆形成能力减弱。

图5所示敲低表达DDX46基因细胞的侵袭和迁移能力均受到抑制。

图6所示敲低表达DDX46基因细胞的凋亡增加。

图7所示敲低表达DDX46基因细胞在裸鼠体内的成瘤能力减弱。

因此，采用本发明的DDX46基因的引物能成功构建DDX46基因干扰慢病毒，抑制膀胱癌的增殖、侵袭和迁移，诱导凋亡，并减弱其在裸鼠体内的成瘤能力。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (2)

1.一种用于预测膀胱癌的肿瘤标志物，其特征在于：该肿瘤标志物为DDX46，DDX46基因靶点序列为5’-GATTGTGATTGAAGAAGAA-3’，DDX46基因扩增引物中的上游引物序列为5’-AAAATGGCGAGAAGAGCAACG-3’，DDX46基因扩增引物中的下游引物序列为5’-CATCATCGTCCTCTAAACTCCAC-3’。

2.如权利要求1所述的用于预测膀胱癌的肿瘤标志物，其特征在于：所述DDX46基因扩增引物在鉴定膀胱癌中的应用。