CN111289748A - ErbB3蛋白在制备膀胱癌无创诊断产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了ErbB3蛋白在制备膀胱尿路上皮癌无创诊断产品中的应用，包括以下步骤：查询病史、诊断前准备、诊断材料准备、正式检测、检测结果分析和得出最终结论，本发明结构合理，使用安全方便，通过对患者尿液中的ErbB3蛋白进行检测的含量可以对患者是否患有膀胱尿路上皮癌进行诊断；利用ErbB3蛋白对于区分膀胱高级别与低级别尿路上皮癌的诊断界值，通过检测患者尿液中ErbB3含量，可提供肿瘤恶性级别信息，对于术前评估和术后随访能具有一定的参考价值；第三，肌层浸润型膀胱尿路上皮癌容易远处转移，利用本无创诊断产品对患者尿中ErbB3蛋白对肌层浸润型肿瘤的诊断界值；对更准确的临床诊断和制定治疗策略有着十分重大的意义。

Description

ErbB3蛋白在制备膀胱癌无创诊断产品中的应用
技术领域
本发明涉及膀胱癌诊断技术领域，具体为ErbB3蛋白在制备膀胱尿路上皮癌无创诊断产品中的应用。
背景技术
膀胱癌是指发生在膀胱的一类恶性肿瘤，其组织类型多属于尿路上皮癌，根据肿瘤细胞形态和生物学行为不同，可以分为高级别尿路上皮癌和低级别尿路上皮癌，根据浸润程度不同，分为浸润性尿路上皮癌和非浸润性尿路上皮癌，目前膀胱尿路上皮癌的发病率处于上升趋势，是泌尿生殖***肿瘤发病率第一位的肿瘤，因此，提高对***诊断和治疗的效果，对于国民健康有着十分重大的意义；
膀胱癌患者的临床表现大多为无痛性、间歇性和全程性肉眼血尿，也可表现为镜下血尿，少数患者可首先出现尿频、尿急和尿痛等膀胱刺激症状，也有部分患者是健康体检时影像学偶然发现的膀胱内肿物，膀胱癌治疗的效果与是否能早期发现肿瘤密切相关，早期诊断的患者通常预后较为良好，术后5年的生存率可达到90%以上，经尿道膀胱镜检查取标本进行病理活检是目前诊断***的金标准，但是该方法具有侵袭性，而且不易推广进行人群筛查，尿脱落细胞学检查也是一种常用的方法，但是该方法敏感度很低，且容易受到***和结石等影响，因此非常有必要从尿液中发现高效地诊断标记物对***进行诊断和治疗随访，我们研究发现通过检测尿液中ErbB3蛋白的含量可望帮助膀胱尿路上皮癌人群诊断和疾病随访。
发明内容
本发明提供ErbB3蛋白在制备膀胱癌无创诊断产品中的应用，可以有效解决上述背景技术中提出的经尿道膀胱镜检查取标本进行病理活检是目前诊断***的金标准，但是该方法具有侵袭性，而且不易推广进行人群筛查，尿脱落细胞学检查也是一种常用的方法，但是该方法敏感度低，且容易受到***和结石等影响的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：ErbB3蛋白在制备膀胱癌无创诊断产品中的应用，包括以下步骤：
S1、对怀疑罹患膀胱尿路上皮癌患者进行病史采集和体格检查；
S2、对符合诊断条件的患者进行诊断前准备；
S3、对诊断时所需要的材料进行准备；
S4、对已经包被抗体的ELISA板平衡至室温后，向对应的孔加入 100µL配制好的尿液样品；
S5、向已经包被抗体的ELISA板中加入生物素标记抗ErbB3抗体；
S6、向已经包被抗体的ELISA板中加入稀释后的HRP-链霉亲和素；
S7、向已经包被抗体的ELISA板中依次加入TMB显色液和终止液，利用酶标仪450nm读数；
S8、采用sigmaplot 12.0软件计算浓度值；
S9、根据计算的ErbB3蛋白浓度值与健康人群的ErbB3蛋白浓度值进行对比，诊断患者是否患有膀胱尿路上皮癌。
所述步骤S1中，进行膀胱尿路上皮癌诊断的患者需要满足任何初诊疑似膀胱尿路上皮癌，且既往未行化疗、放疗或手术等抗肿瘤治疗；患者既往无罹患可能对尿蛋白产生影响的相关疾病；
所述步骤S2中，确认患者满足S1中所有条件后，取患者入院后第二天的晨尿，立即于4℃条件下，通过4500r/min离心机离心10分钟，取至少2ml上清液保存于-80℃冰箱，备用。
所述步骤S3中，诊断前所需要的材料包括：包被anti-HumanErbB3抗体的ELISA板、浓缩20×洗液、去离子水、洗板机、生物素标记抗ErbB3抗体、浓缩200×HRP-链霉亲和素、TMB显色液、终止液和450nm酶标仪；利用去离子水将浓缩洗液稀释至20倍以备用；对浓缩HRP-链霉亲和素进行离心，然后利用去离子水稀释至200倍以备用；。
所述步骤S4中，当已经包被抗体的ELISA板平衡至室温后，向对应的孔加入100µL配制好的标准品和患者尿液样品，用封板膜封住整块板条，4℃孵育过夜。
所述步骤S5中，将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条5次，每孔加入300µLlx洗液，洗板清洗干净后，向已经包被抗体的ELISA板每孔加入100µL配制好的生物素标记抗ErbB3抗体，室温孵育1h。
所述步骤S6中，将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条5次，每孔加入300 µLlx洗液，洗板清洗干净后，向已经包被抗体的ELISA板每孔加入100µL配制好的HRP-链霉亲和素，室温孵育45min。
所述步骤S7中，将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条5次，每孔加入300 µLlx洗液，洗板清洗干净后，向已经包被抗体的ELISA板每孔加入100µLTMB显色液，室温避光孵育30min，并向已经包被抗体的ELISA板每孔加入50µL终止液，立即在酶标仪450nm读数。
所述步骤S8中，采用sigmaplot 12.0软件计算尿标本的ErbB3蛋白浓度值。
所述步骤S9中，将最终得到的患者晨尿中的ErbB3蛋白浓度的值与健康人群尿液中ErbB3蛋白浓度值进行对比和分析，对患者是否患有膀胱癌进行诊断。
与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明结构科学合理，使用安全方便，通过对患者尿液中的ErbB3蛋白进行检测的含量可以对患者是否患有膀胱尿路上皮癌进行诊断；利用ErbB3蛋白对于膀胱高级别与低级别尿路上皮癌、肌层浸润与非浸润性尿路上皮癌进一步区分的诊断值，通过分析对应标本的检测结果，有助于临床判断肿瘤级别，了解是否存在膀胱壁肌层侵犯的风险，从而对进一步制定临床诊断和治疗策略有着十分重大的意义。另外，通过对肿瘤直径和尿液中ErbB3蛋白的浓度进行Spearman相关性分析，ErbB3在膀胱癌病人尿液中的含量与肿瘤最大径大小呈现中等强度正相关，而与患者年龄和BMI不相关， 因此利用ErbB3尿中浓度，还可对肿瘤直径有初步的判断。最后，通过对ErbB3进行免疫组织化学染色，发现80%膀胱尿路上皮病人ErbB3阳性表达，佐证其在该肿瘤发展过程中可能发挥重要作用，为日后进一步深入机制研究奠定了基础。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1是本发明诊断流程示意图。
图2是本发明尿液中ErbB3浓度与肿瘤最大径的相关性散点图。
图3是本发明膀胱癌诊断示意图。
图4是本发明膀胱高级别尿路上皮癌与低级别尿路上皮癌区分的诊断值示意图。
图5是实验结果1号板标准曲线。
图6是实验结果2号板标准曲线。
图7是实验结果3号板标准曲线。
图8是实验结果膀胱癌诊断数据值。
图9是实验结果肿瘤级别判断图。
图10是实验结果膀胱壁肌层侵犯数据图。
图11是实验结果膀胱壁肌层侵犯数据图。
图12是实验结果膀胱癌患者与正常对照组尿液中ErbB3蛋白浓度的对比表。
图13是实验结果不同病理级别膀胱癌患者尿液中ErbB3浓度对比表。
图14是是实验结果否肌层浸润膀胱癌患者尿液中ErbB3浓度对比表。
图15是实验结果不同性别膀胱癌患者尿液中ErbB3浓度对比表。图16是实验结果糖尿病与血糖正常的膀胱癌患者尿液中ErbB3浓度对比表。
图17是实验结果高血压与血压正常的膀胱癌患者尿液中ErbB3浓度对比表。
图18是实验结果尿液中ErbB3浓度与肿瘤最大径、BMI及年龄的相关性表。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例：如图所示，本发明提供一种技术方案，ErbB3蛋白在制备膀胱癌无创诊断产品中的应用，包括以下步骤：
S1、对怀疑罹患膀胱尿路上皮癌患者进行病史采集和体格检查；
S2、对符合诊断条件的患者进行诊断前准备；
S3、对诊断时所需要的材料进行准备；
S4、对已经包被抗体的ELISA板平衡至室温后，向对应的孔加入 100µL配制好的尿液样品；
S5、向已经包被抗体的ELISA板中加入生物素标记抗ErbB3抗体；
S6、向已经包被抗体的ELISA板中加入稀释后的HRP-链霉亲和素；
S7、向已经包被抗体的ELISA板中依次加入TMB显色液和终止液，利用酶标仪450nm读数；
S8、采用sigmaplot 12.0软件计算浓度值；
S9、根据计算的ErbB3蛋白浓度值与健康人群的ErbB3蛋白浓度值进行对比，诊断患者是否患有膀胱尿路上皮癌。
所述步骤S1中，进行膀胱尿路上皮癌诊断的患者需要满足任何初诊疑似膀胱尿路上皮癌，且既往未行化疗、放疗或手术等抗肿瘤治疗；患者既往无罹患可能对尿蛋白产生影响的相关疾病；
所述步骤S2中，确认患者满足S1中所有条件后，取患者入院后第二天的晨尿，立即于4℃条件下，通过4500r/min离心机离心10分钟，取至少2ml上清液保存于-80℃冰箱，备用。
所述步骤S3中，诊断前所需要的材料包括：包被anti-HumanErbB3抗体的ELISA板、浓缩20×洗液、去离子水、洗板机、生物素标记抗ErbB3抗体、浓缩200×HRP-链霉亲和素、TMB显色液、终止液和450nm酶标仪；利用去离子水将浓缩洗液稀释至20倍以备用；对浓缩HRP-链霉亲和素进行离心，然后利用去离子水稀释至200倍以备用；。
所述步骤S4中，当已经包被抗体的ELISA板平衡至室温后，向对应的孔加入100µL配制好的标准品和患者尿液样品，用封板膜封住整块板条，4℃孵育过夜。
所述步骤S5中，将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条5次，每孔加入300µLlx洗液，洗板清洗干净后，向已经包被抗体的ELISA板每孔加入100µL配制好的生物素标记抗ErbB3抗体，室温孵育1h。
所述步骤S6中，将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条5次，每孔加入300 µLlx洗液，洗板清洗干净后，向已经包被抗体的ELISA板每孔加入100µL配制好的HRP-链霉亲和素，室温孵育45min。
所述步骤S7中，将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条5次，每孔加入300 µLlx洗液，洗板清洗干净后，向已经包被抗体的ELISA板每孔加入100µLTMB显色液，室温避光孵育30min，并向已经包被抗体的ELISA板每孔加入50µL终止液，立即在酶标仪450nm读数。
所述步骤S8中，采用sigmaplot 12.0软件计算尿标本的ErbB3蛋白浓度值。
所述步骤S9中，将最终得到的患者晨尿中的ErbB3蛋白浓度的值与健康人群尿液中ErbB3蛋白浓度值进行对比和分析，对患者是否患有膀胱癌进行诊断。
以下为膀胱癌患者与正常对照组尿液中ErbB3浓度对比实验结果。
（1）实验人群
尿液标本患者的研究标准包括尿液标本患者入组标准和排除标准，尿液标本患者入组标准为：
a.进行过尿道膀胱肿物电切术、膀胱部分切除术或膀胱全切术等手术治疗，且术后病理诊断明确为膀胱癌的患者；
b.患者为初次就诊且未行化疗、放疗或手术等抗肿瘤治疗；
c.患者无其他泌尿***相关疾病；
d.正常对照组为经体检证实为无泌尿及其他***相关疾病的健康人。
排除标准为：
a.凡不符合上述纳入标准的患者；
b.患者为尿路上皮癌术后复发再次就诊；
c.入院诊断考虑为膀胱占位，但由于经济、担心手术风险和身体情况不适宜手术等各种原因未行手术治疗，未取得病理活检结果的患者；
d.留取尿液放置时间过久未及时离心冰冻保存；
e.患者本人或家属不同意加入本次实验者。
（2）样本预处理
提取符合标准的患者和健康人的晨尿，并立即于4℃条件下4500r/min离心机离心处理10分钟，取上清液7ml保存于-80℃冰箱。
（3）实验材料
实验所需试剂、材料和器材包括：ErBb3 ELISA试剂盒、Biotek Elx800酶标仪、移液器、枪头、试管、离心机、普通冰箱、-80℃超低温冰箱、滤纸、500µL和2ml离心管、100 ml和1L量筒、去离子水、Sigmalplot分析软件；
ErBb3 ELISA试剂盒成分为：
a.ErbB3 Microplate (Item A)：96孔板已包被anti-Human VEGF-A抗体；
b.Wash Buffer Concentrate (20x) (Item B)：25ml 20x浓缩洗液；
c.Standards (Item C)：重组人Human ErbB3标准品；
d.Assay Diluent A (Item D)：30 ml，用于标准品及样品的稀释；
e.Assay Diluent B (Item E)：15ml 5x浓缩液，用于标准品及样品的稀释；
f.Detection Antibody ErbB3(Item F)：生物素标记抗ErbB3抗体；
g.HRP-Streptavidin concentrate (Item G)：200µL 200x浓缩HRP-链霉亲和素；
h.TMB One-Step Substrate Reagent (Item H)：12ml3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)；
i.Stop Solution (Item I)：8ml0.2M硫酸。
（4）实验准备
a.将试剂盒以及样品平衡至室温；
b.样品根据预处理结果原液上样；
c.Assay Diluent B (Item E) 使用去离子水稀释5倍备用；
d.标准品准备；离心Item C小管，然后加入400µL 1x Assay Diluent B (Item E)到标准品小管中，混合均匀后即为 50ng/ml的标准品贮存液，吸取30µL标准品贮存液加入含570µL 1x Assay Diluent B (Item E)离心管内，混匀，标记为STD1，准备7个1.5 ml离心管，往7个离心管中分别加入400 µL 1x Assay Diluent B(Item E)缓冲液，之后依次标记为STD2、STD3、STD4、STD5、STD6、STD7、Zero Standard，然后用2500pg/ml的STD1梯度稀释标准品，抽取200µL 2500pg/ml标准溶液加入STD2 小管中，混匀后取其中的200ul加入到STD3管中混匀，一直按照此方法继续直至配好STD7，Zero Standard只是400 µL 1x AssayDiluent A即标准品0 pg/ml；
e.洗液稀释：浓缩洗液用去离子水稀释至20倍之后留作备用；
f.离心检测抗体小管 (Item F) ，加入100µL稀释液 1x Assay Diluent B(Item E)充分溶解，轻微上下锤打，使用1x Assay Diluent B(Item E)稀释液将其稀释至80倍；
g.离心HRP-链霉亲和素(Item G)，然后用稀释液1x Assay Diluent B(Item E)稀释200倍后使用。
（5）实验步骤
a.将试剂盒以及样品平衡至室温；
b.已经包被抗体的ELISA板平衡至室温后，在对应的孔加入 100µL配制好的标准品及样品，用封板膜封住整块板条，4℃孵育过夜；
c.将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条5次，每孔加入300µL洗液；
d.洗板干净后，每孔加入100µL配制好的检测抗体，室温孵育1h；
e.将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条5次，每孔加入300µL洗液；
f.每孔加入100µL配制好的HRP-链霉亲和素室温孵育45 min；
g.将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条5次，每孔加入300µL洗液；
h.加入100µLTMB显色液至每孔中，室温避光孵育30min；
i.加入50µL终止液至每孔中，立即在酶标仪450nm读数；
j.采用sigmaplot12.0软件计算浓度值。
实验结果见附图
综上可知：通过检测患者尿液中的ErbB3蛋白的浓度可以直接对患者是否患有膀胱癌进行诊断，减轻了患者在诊断膀胱癌过程中所承受的心理压力和生理压力，使得膀胱癌的诊断更加的便捷。
本发明的工作原理及使用流程：本发明结构科学合理，使用安全方便，通过对患者尿液中的ErbB3蛋白进行检测的含量可以对患者是否患有膀胱癌进行诊断，利用ErbB3蛋白对于膀胱高级别尿路上皮癌与低级别尿路上皮癌进一步区分的诊断值，通过分析高级别尿路上皮癌和低级别尿路上皮癌的患者，发现前者尿液中ErbB3显著高于后者，有助于临床判断肿瘤级别，对于术前评估和术后随访能具有一定的参考价值，肌层浸润型膀胱尿路上皮癌容易远处转移和进展，如能较早的了解是否存在膀胱壁肌层侵犯的风险，对于进一步制定临床诊断和治疗策略有着十分重大的意义，通过对肿瘤直径和尿液中ErbB3蛋白的浓度进行研究发现，ErbB3在膀胱癌病人尿液中的含量与肿瘤最大径大小呈现中等强度正相关，通过Spearman相关性分析，尿ErbB3浓度与患者年龄不相关，因此，我们通过对ErbB3尿中浓度，可对肿瘤直径有初步的判断。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.ErbB3蛋白在制备膀胱癌无创诊断产品中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
S1、对怀疑罹患膀胱尿路上皮癌患者进行病史采集和体格检查；
S2、对符合诊断条件的患者进行诊断前准备；
S3、对诊断时所需要的材料进行准备；
S4、对已经包被抗体的ELISA板平衡至室温后，向对应的孔加入 100µL配制好的尿液样品；
S5、向已经包被抗体的ELISA板中加入生物素标记抗ErbB3抗体；
S6、向已经包被抗体的ELISA板中加入稀释后的HRP-链霉亲和素；
S7、向已经包被抗体的ELISA板中依次加入TMB显色液和终止液，利用酶标仪450nm读数；
S8、采用sigmaplot 12.0软件计算浓度值；
S9、根据计算的ErbB3蛋白浓度值与健康人群的ErbB3蛋白浓度值进行对比，诊断患者是否患有膀胱尿路上皮癌。
2.根据权利要求1所述的ErbB3蛋白在制备膀胱尿路上皮癌无创诊断产品中的应用，其特征在于：所述步骤S1中，进行膀胱尿路上皮癌诊断的患者需要满足任何初诊疑似膀胱尿路上皮癌，且既往未行化疗、放疗或手术等抗肿瘤治疗；患者既往无罹患可能对尿蛋白产生影响的相关疾病。
3.根据权利要求1所述的ErbB3蛋白在制备膀胱尿路上皮癌无创诊断产品中的应用，其特征在于：所述步骤S2中，确认患者满足S1中所有条件后，取患者入院后第二天的晨尿，立即于4℃条件下，通过4500r/min离心机离心10分钟，取至少2ml上清液保存于-80℃冰箱，备用。
4.根据权利要求1所述的ErbB3蛋白在制备膀胱尿路上皮癌无创诊断产品中的应用，其特征在于：所述步骤S3中，诊断前所需要的材料包括：包被anti-HumanErbB3抗体的ELISA板、浓缩20×洗液、去离子水、洗板机、生物素标记抗ErbB3抗体、浓缩200×HRP-链霉亲和素、TMB显色液、终止液和450nm酶标仪；利用去离子水将浓缩洗液稀释至20倍以备用；对浓缩HRP-链霉亲和素进行离心，然后利用去离子水稀释至200倍以备用。
5.根据权利要求1所述的ErbB3蛋白在制备膀胱尿路上皮癌无创诊断产品中的应用，其特征在于：所述步骤S4中，当已经包被抗体的ELISA板平衡至室温后，向对应的孔加入100µL配制好的标准品和患者尿液样品，用封板膜封住整块板条，4℃孵育过夜。
6.根据权利要求1所述的ErbB3蛋白在制备膀胱尿路上皮癌无创诊断产品中的应用，其特征在于：所述步骤S5中，将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条5次，每孔加入300µLlx洗液，洗板清洗干净后，向已经包被抗体的ELISA板每孔加入100µL配制好的生物素标记抗ErbB3抗体，室温孵育1h。
7.根据权利要求1所述的ErbB3蛋白在制备膀胱尿路上皮癌无创诊断产品中的应用，其特征在于：所述步骤S6中，将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条5次，每孔加入300 µLlx洗液，洗板清洗干净后，向已经包被抗体的ELISA板每孔加入100µL配制好的HRP-链霉亲和素，室温孵育45min。
8.根据权利要求1所述的ErbB3蛋白在制备膀胱尿路上皮癌无创诊断产品中的应用，其特征在于：所述步骤S7中，将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条5次，每孔加入300 µLlx洗液，洗板清洗干净后，向已经包被抗体的ELISA板每孔加入100µLTMB显色液，室温避光孵育30min，并向已经包被抗体的ELISA板每孔加入50µL终止液，立即在酶标仪450nm读数。
9.根据权利要求1所述的ErbB3蛋白在制备膀胱尿路上皮癌无创诊断产品中的应用，其特征在于：所述步骤S8中，采用sigmaplot 12.0软件计算尿标本的ErbB3蛋白浓度值。
10.根据权利要求1所述的ErbB3蛋白在制备膀胱尿路上皮癌无创诊断产品中的应用，其特征在于：所述步骤S9中，将最终得到的患者晨尿中的ErbB3蛋白浓度的值与健康人群尿液中ErbB3蛋白浓度值进行对比和分析，对患者是否患有膀胱癌进行诊断。
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