CN105452440A - 细胞的培养方法、细胞培养装置及试剂盒 - Google Patents

细胞的培养方法、细胞培养装置及试剂盒 Download PDF

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CN105452440A CN201480042131.4A CN201480042131A CN105452440A CN 105452440 A CN105452440 A CN 105452440A CN 201480042131 A CN201480042131 A CN 201480042131A CN 105452440 A CN105452440 A CN 105452440A
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萩原昌彦
川口哲夫
马场浩祐
清水基久
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Abstract

本发明涉及细胞的培养方法、以及，用于在所述培养方法中使用的细胞培养装置及试剂盒。本发明的细胞的培养方法包括将细胞适用于聚酰亚胺多孔质膜，进行培养。本发明的方法在一实施方式中，包括将细胞接种到上述聚酰亚胺多孔质膜的表面的工序。或者，在一实施方式中，其包括下列工序：在上述聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面载乘细胞悬浮液，放置上述聚酰亚胺多孔质膜，或者移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出，或者刺激表面的一部分，使细胞悬浮液被吸入上述膜，进而使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。或者，在一实施方式中，其包括下列工序：将上述聚酰亚胺多孔质膜之一面或两面用细胞培养液或灭菌的液体润湿，向上述润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液，进而使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。

Description

细胞的培养方法、细胞培养装置及试剂盒
【技术领域】
本申请主张基于2013年7月26日中提出的日本国申请特愿2013-155550的优先权，其全部内容并入本说明书中。
本发明涉及细胞的培养方法、细胞培养装置及试剂盒。
【背景技术】
【细胞培养】
细胞在活体内一般作为三维的集团存在，但在经典的平面培养中，以细胞平铺在容器的形状单层状培养。多有报告，由培养环境的差异，细胞的性质也大不同。另外，对于在液体培养基中培养细胞的悬浮培养，有适宜于悬浮培养的细胞，也有不适宜的细胞。
SCIVAXCorporation开发的NanoCulture(注册商标)Plate(NCP)是由纳米印迹技术，在底面实施模仿细胞外基质的图案化(微矩形和微蜂巢)的粘接型的3维培养多联盘。微矩形是四角形状，微蜂巢是取六角形状的规则的的重复结构。通过细胞将此微图案作为支架利用，能动地形成球形(细胞多数凝集而成三维状态)。
另外，报告有使用将均一的极细胞突起(纳米柱)规则地多数列的细胞培养片(“纳米柱细胞培养片”)，进行结构与活体肝脏组织接近的3维之间细胞组织体(球形)的培养的事例(Takahashietal.，TissueEngineeringPartA.June2012，Vol.16，No.6，p.1983-1995)。
特开2009-213421记载使用蜂巢状多孔质膜(蜂巢膜)的球形的制造方法及球形制造装置。
这些细胞培养方法在是利用有正规则的重复图案的片(膜)，细胞粘接于片的表面状而增殖，由细胞培养形成的是同样的形状的细胞多数凝集而成三维状态的球形方面共通，在其含义中限定。需求用于将细胞更简便地、有效、并且稳定培养的方法的开发。
【聚酰亚胺多孔质膜】
聚酰亚胺是指重复单位中含酰亚胺键的高分子的总称，通常，芳香族化合物直接由酰亚胺键连接的芳香族聚酰亚胺。芳香族聚酰亚胺由于芳香族和芳香族经酰亚胺键而具有共价结构，具有刚直且强固的分子结构，并且，由于酰亚胺键具有强的分子间力，有非常高的水平的热、机械、化学性质。
聚酰亚胺多孔质膜，自本发明前，以滤器、低介电常数膜、燃料电池用电解质膜等，特别是以电池关系作为中心的用途利用。国际公开WO2010/038873、特开2011-219585、及特开2011-219586记载了，特别是，气体等的物质透过性优良，空孔率高，两表面的平滑性优良，相对强度高，也不涉及高空孔率，有多数对向膜厚度方向的压缩应力的耐力优良的大空隙的聚酰亚胺多孔质膜。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:特开2009-213421
专利文献2:WO2010/038873
专利文献3:特开2011-219585
专利文献4:特开2011-219586
【非专利文献】
非专利文献1:Takahashietal.，TissueEngineeringPartA.June2012，Vol.16，No.6，p.1983-1995
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
本发明涉及细胞的培养方法、以及用于所述培养方法的细胞培养装置及试剂盒。
【解决课题的技术方案】
不以限定为囝的，但本发明优选含以下的实施方式。
【实施方式1】
细胞的培养方法，其包括将细胞适用于聚酰亚胺多孔质膜，进行培养。
【实施方式2】
实施方式1所述的方法，其包括将细胞接种于上述聚酰亚胺多孔质膜的表面的工序。
【实施方式3】
实施方式1所述的方法，其包括下列工序：
在上述聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面载乘细胞悬浮液，
放置上述聚酰亚胺多孔质膜，或者移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出，或者刺激表面的一部分，使细胞悬浮液被吸入上述膜，进而
使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。
【实施方式4】
实施方式1所述的方法，其包括下列工序：
将上述聚酰亚胺多孔质膜之一面或两面用细胞培养基或灭菌的液体润湿，
向上述润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液，进而
使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。
【实施方式5】
实施方式4所述的方法，其中活细胞停留在上述聚酰亚胺多孔质膜内，死细胞与水分一同流出。
【实施方式6】
实施方式4或5所述的方法，其中上述灭菌的液体是灭菌水或灭菌的缓冲液。
【实施方式7】
实施方式1～6之任一项所述的方法，其包括向细胞培养容器中放入细胞培养基、细胞及1个或其以上的上述聚酰亚胺多孔质膜，其中，聚酰亚胺多孔质膜处于悬浮于细胞培养基中的状态下。
【实施方式8】
实施方式7所述的方法，其特征在于使用2个以上的上述聚酰亚胺多孔质膜的小片。
【实施方式9】
实施方式7或8所述的方法，其中细胞自发粘接到上述聚酰亚胺多孔质膜。
【实施方式10】
实施方式1～6之任一项所述的方法，其中将上述聚酰亚胺多孔质膜
(i)折叠，
(ii)卷成卷状，
(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者
(iv)结成绳状
而在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定。
【实施方式11】
实施方式10所述的方法，其中细胞自发粘接到上述聚酰亚胺多孔质膜。
【实施方式12】
实施方式1所述的方法，其包括将2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右积层到细胞培养基中使用。
【实施方式13】
实施方式1所述的方法，其中将实施方式2-12之任一项所述的方法的2种或更多种方法组合使用。
【实施方式14】
实施方式1～13之任一项所述的方法，其中细胞在聚酰亚胺多孔质膜的表面及内部生长增殖。
【实施方式15】
实施方式1～14之任一项所述的方法，其中细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌及细菌。
【实施方式16】
实施方式15所述的方法，其中动物细胞是属于脊椎动物门的动物来源的细胞。
【实施方式17】
实施方式15所述的方法，其中细菌选自乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及蓝细菌。
【实施方式18】
实施方式1～14之任一项所述的方法，其中细胞选自多能性干细胞、组织干细胞、体细胞及生殖细胞。
【实施方式19】
实施方式1～13之任一项所述的方法，其中细胞选自肉瘤细胞、株化细胞及转化细胞。
【实施方式20】
实施方式1～19之任一项所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是含自四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。
【实施方式21】
用于在实施方式1～20之任一项所述的细胞的培养方法中使用的细胞培养装置，其含聚酰亚胺多孔质膜。
【实施方式22】
实施方式21所述的细胞培养装置，其中2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右积层。
【实施方式23】
用于实施方式1～20之任一项所述的细胞的培养方法中使用的试剂盒，其含聚酰亚胺多孔质膜。
【发明效果】
本发明基于向聚酰亚胺多孔质膜适用细胞，则细胞生长的发现。细胞优选自发粘接到聚酰亚胺多孔质膜，可在膜的表面及内部增殖。由本发明的方法，将细胞简便，有效，并且稳定培养变得可能。
【附图说明】
【图1】图1显示作为向聚酰亚胺多孔质膜的细胞悬浮液的接种形态的1实施方式自然接种。
【图2】图2显示向作为聚酰亚胺多孔质膜的细胞悬浮液的接种形态的1实施方式吸入接种。
【图3】图3显示人间质系干细胞的自然接种时的各接种面经时的变化。
【图4】图4显示人皮肤成纤维细胞的自然接种的各接种面经时的变化。
【图5】图5显示人皮肤成纤维细胞B面接种时的观测结果(24小时后)(湿膜法)，显示荧光显微镜照片及实体显微镜照片。
【图6】图6显示人间质系干细胞的A面吸入接种时的经时的变化(一点湿法)。
【图7】图7显示人间质系干细胞的B面吸入接种时的经时的变化(一点湿法)。
【图8】图8显示人间质系干细胞含浸接种时的各观测面经时的变化。
【图9】图9是人间质系干细胞含浸接种时的低倍率照片及关于实验的概观的照片。
【图10】图10显示PC12细胞吸入接种时的经时的变化。
【图11】图11显示将人皮肤成纤维细胞使用膜厚25μm的聚酰亚胺多孔质膜培养时的细胞数。横轴显示培养后的天数，纵轴显示膜每1平方厘米的细胞数。
【图12】图12显示将人皮肤角化细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
【图13】图13显示将人脐带静脉内皮细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
【图14-1】图14-1显示将Vero细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(25μm片)的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
【图14-2】图14-2显示将Vero细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(40μm片)的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
【图14-3】图14-3显示将Vero细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(75μm片)的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
【图15-1】图15-1显示将HeLa细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(25μm片)的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
【图15-2】图15-2显示将HeLa细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(40μm片)的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
【图15-3】图15-3显示将HeLa细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(75μm片)的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
【图16-1】图16-1显示将CHO细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(25μm片)的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
【图16-2】图16-2显示将CHO细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(40μm片)的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
【图16-3】图16-3显示将CHO细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(75μm片)的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察的结果。
【实施方式】
【I.细胞的培养方法】
本发明涉及细胞的培养方法。
本发明的细胞的培养方法包括将细胞适用于聚酰亚胺多孔质膜，进行培养。本发明人发现聚酰亚胺多孔质膜适宜于细胞的粘接、培养，由此想到本发明。本发明的方法特征在于包括，向聚酰亚胺多孔质膜适用细胞，在聚酰亚胺膜的表面或内部培养细胞。
【细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的适用】
细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的适用的具体性的工序不特别限定。可采用本说明书中记载的工序、或者可对于将细胞适用于膜状的载体适宜的任意的方法。不旨在限定，但本发明的方法，例如，含如以下一样的实施方式。
(A)实施方式，其包括将细胞接种于上述聚酰亚胺多孔质膜的表面的工序；
(B)实施方式，其包括下列工序：
在上述聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面载乘细胞悬浮液，放置，或者移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出，或者刺激表面的一部分，使细胞悬浮液被吸入上述膜，进而
使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出；以及，
(C)实施方式，其包括下列工序：
将上述聚酰亚胺多孔质膜之一面或两面用细胞培养液或灭菌的液体润湿，
向上述润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液，进而
使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。
(A)的实施方式包括在聚酰亚胺多孔质膜的表面直接接种细胞、细胞块。或者，将聚酰亚胺多孔质膜放入细胞悬浮液中，也含从膜的表面使细胞培养液浸润的实施方式。
接种到聚酰亚胺多孔质膜的表面的细胞粘接到聚酰亚胺多孔质膜，进入多孔之内部。优选为，即使不特别从外部加物理或化学力，细胞自发粘接到聚酰亚胺多孔质膜。接种到聚酰亚胺多孔质膜的表面的细胞可在膜的表面及/或内部稳定生长－增殖。细胞根据生长－增殖的膜的位置，可取各种不同的形态。
在(B)的实施方式中，在聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面载乘细胞悬浮液。放置聚酰亚胺多孔质膜，或者移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出，或者刺激表面的一部分，通过使细胞悬浮液被吸入上述膜，细胞悬浮液渗透到膜中。不被理论束缚，这被认为是由聚酰亚胺多孔质膜的各表面形状等来源的性质。由本实施方式，细胞被吸入接种到装填膜的细胞悬浮液的位置。
或者，如(C)的实施方式一样，将上述聚酰亚胺多孔质膜之一面或两面的部分或全体用细胞培养液或灭菌的液体润湿后，也可向润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液。此时，细胞悬浮液的通过速度大大升高。
例如，本说明书的实施例4中记载的一点湿法是以膜的飞散防止作为主目的而使膜极一部分润湿的方法，实质上几乎接近于不使膜润湿的干法((B)的实施方式)。但是，对于润湿的小部分被认为细胞液的膜透过变得迅速。另外，本说明书的实施例3中记载的湿膜法是向使聚酰亚胺多孔质膜之一面或两面的全体充分地润湿的(之后将其记作“湿膜”)装填细胞悬浮液的方法。此时，在聚酰亚胺多孔质膜的全体中，细胞悬浮液的通过速度大大升高。
在(B)及(C)的实施方式中，使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。由此浓缩细胞悬浮液中的细胞的浓度，使细胞以外的不要的成分与水分一同流出等的处理也变得可能。
(A)的实施方式有时称为“自然接种”(B)及(C)的实施方式有时称为“吸入接种”。
不旨在限定，但优选为，在聚酰亚胺多孔质膜活细胞选择性地停留。从而，在本发明的优选的实施方式中，活细胞停留在上述聚酰亚胺多孔质膜内，死细胞优先与水分一同流出。在本发明的实施例3中，适用于本发明的上述聚酰亚胺多孔质膜的前的细胞培养基(细胞悬浮液)中活细胞率是90％，但适用于聚酰亚胺多孔质膜，流出的液体中活细胞率是65％。比较细胞生死，则活细胞的向膜的吸附率是88％、渗出率是12％，死细胞的向膜的吸附率是40％、渗出率是60％。在本发明的上述聚酰亚胺多孔质膜中活细胞被认为选择性地吸附。
在实施方式(C)中使用的灭菌的液体不特别限定，可为灭菌的缓冲液或灭菌水。缓冲液，例如，是(+)及(-)Dulbecco氏PBS、(+)及(-)Hank氏平衡盐溶液等。将缓冲液的例示于以下的表1。
【表1】
成分 浓度(mmol/L) 浓度(g/L)
NaCl 137 8.00
KCl 2.7 0.20
Na2HPO4 10 1.44
KH2PO4 1.76 0.24
pH(-) 7.4 7.4
本发明还含通过使处于悬浮状态的粘接性细胞与聚酰亚胺多孔质膜悬浮共存而使细胞附着于膜的实施方式(含浸)。例如，在本发明的细胞的培养方法中，为了将细胞适用于聚酰亚胺多孔质膜，也可向细胞培养容器中放入细胞培养基、细胞及1个或其以上的上述聚酰亚胺多孔质膜。细胞培养基是液体的情况中，聚酰亚胺多孔质膜处于悬浮于细胞培养基中的状态下。从聚酰亚胺多孔质膜的性质，细胞可粘接到聚酰亚胺多孔质膜。从而，即使是先天不适宜于悬浮培养的细胞，聚酰亚胺多孔质膜可在悬浮于细胞培养基中的状态下培养。优选为，细胞自发粘接到聚酰亚胺多孔质膜。“自发粘接”是指，即使不特别从外部加物理或化学力，细胞停留在聚酰亚胺多孔质膜的表面或内部。
细胞培养由细胞培养中的存在形态而培养细胞可分类为粘接培养系细胞和悬浮培养系细胞。粘接培养系细胞是附着于培养容器而增殖的培养细胞，在继代中进行培养基更换。悬浮培养系细胞是在培养基中悬浮状态下增殖的培养细胞，在一般而言继代时不进行培养基更换，进行稀释培养。悬浮培养由于可在悬浮状态、即液体中培养，可大量培养，与仅在培养容器表面生长的附着细胞比较，由于是立体的培养，有每单位空间的可培养细胞数多的益处。
由本发明，在概念上，通过不限于细胞的种类而以与悬浮培养类似的形态培育细胞变得可能，提供简便地培养大量的细胞的方法。在本发明的细胞培养方法中，在将聚酰亚胺多孔质膜悬浮于细胞培养基中的状态下使用时，也可使用2个以上的上述聚酰亚胺多孔质膜的小片。由于聚酰亚胺多孔质膜是柔性的薄膜，例如，通过将该小片悬浮于培养液中而使用，一定容量的细胞培养基中含持有多表面积的聚酰亚胺多孔质膜变得可能。通常培养的情况中，容器底面积成为细胞可培养的面积的上限，但在使用本发明的聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养中，先前含持的聚酰亚胺多孔质膜的大表面积的全部成为可细胞培养的面积。由于聚酰亚胺多孔质膜使细胞培养液通过，例如在折皱的膜内也供给营养或氧等变得可能。
聚酰亚胺多孔质膜的小片的大小，形状不特别限定。形状可取圆、椭圆形、四角、三角、多角形、绳状等任意的形。例如，含一边的长度是约0.1mm-约20mm、优选为约0.2mm-约10mm，更优选为，约1mm-约5mm的四角形(正方形、长方形等)、三角形等。或者，例如，优选为，直径可为约0.1mm-约20mm、更优选为约0.5mm-约10mm的圆形。通过使这些小片分散到液中，形成与悬浮培养近似的形态。
由于本发明的聚酰亚胺多孔质膜有柔软性，可使形状变化使用。也可将聚酰亚胺多孔质膜加工形状为不是平面状而是立体状而使用。例如，也可将聚酰亚胺多孔质膜(i)折叠，(ii)卷成卷状，(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者，(iv)结成绳状而在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定。通过如(i)-(iv)一样加工形状，与使用小片时同样地，可向一定容量的细胞培养基中放入多种聚酰亚胺多孔质膜。再者，因为可以各小片作为集合体处理，将细胞体集合化而移动变得可能，综合的应用性高。
作为与小片集合体同样的想法，也可将2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右积层到细胞培养基中使用。积层是指，也含聚酰亚胺多孔质膜一部分重合的实施方式。由积层培养，以窄的空间高密度培养细胞变得可能。也可在已经细胞培育的膜上再使膜积层而设置形成与别种细胞的多层***。再者，在立体环境下的细胞间相互作用验证或，无应激的细胞培养方法等，向药物开发的利用也可能。积层的聚酰亚胺多孔质膜的数不特别限定。
也可将上述的本发明的细胞的培养方法以2种或更多种方法组合使用。例如，使用实施方式(A)-(C)之任何的方法首先向聚酰亚胺多孔质膜适用细胞，接下来，也可将细胞粘接的聚酰亚胺多孔质膜悬浮培养。或者，作为向聚酰亚胺多孔质膜适用的工序，也可将上述实施方式(A)-(C)之任何的方法的2种或更多组合使用。
在本发明的方法中，优选为，细胞在聚酰亚胺多孔质膜的表面及内部生长增殖。无显示细胞在立体结构体之内部生长增殖的报告例。由在本发明中聚酰亚胺多孔质膜的利用，细胞的继续的的三维培养变得可能。不旨在限定，但由本发明的方法，细胞持续增殖2天以上、更优选为4天以上、再优选为6天以上。在本说明书的记载的实施例1及4中观察到细胞增加21天。
【2.细胞】
可在本发明的方法中利用的细胞的种类不特别限定，可在任意的细胞的增殖中利用。
例如，细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌及细菌。动物细胞大的分为属于脊椎动物门的动物来源的细胞和无脊椎动物(属于脊椎动物门的动物以外的动物)来源的细胞。本说明书中，动物细胞的来源不特别限定。优选是指，属于脊椎动物门的动物来源的细胞。脊椎动物门含无颌类和有颌类，有颌类含哺乳纲、鸟纲、两栖纲、爬行纲等。优选为，一般而言，是称为哺乳动物的属于哺乳纲的动物来源的细胞。哺乳动物不特别限定，但优选为，含小鼠、大鼠、人、猴、猪、狗、绵羊、山羊等。
本说明书中的植物细胞的来源不特别限定。含苔藓植物、蕨类植物、种子植物的植物的细胞成为对象。
种子植物细胞来源的植物含单子叶植物、双子叶植物之任何。不旨在限定，但在单子叶植物中，含兰科植物、稻科植物(稻、玉米、大麦、小麦、高粱等)、莎草科植物等。在双子叶植物中，含属于菊亚纲、木兰亚纲、蔷薇亚纲等多的的亚纲的植物。
藻类也可看作细胞来源生物。含从作为真正细菌的蓝细菌(蓝藻)，真核生物、且作为单细胞生物的(硅藻、黄绿藻、涡鞭毛藻等)及作为多细胞生物的海藻类(红藻、褐藻、绿藻)等不同的组。
本说明书中的古细菌及细菌的种类也不特别限定。古细菌由甲烷菌－高度好盐菌－嗜热好酸菌－超嗜热菌等组成。细菌，例如，选自乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及蓝细菌等。
可在本发明的方法中利用的动物细胞或植物细胞的种类不旨在限定，但优选为，选自多能性干细胞、组织干细胞、体细胞、及生殖细胞。
在本发明中“多能性干细胞”是指有向所有的组织的细胞分化的能力(分化多能性)的干细胞的总称。不旨在限定，但多能性干细胞含胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚性生殖干细胞(EG细胞)、生殖干细胞(GS细胞)等。优选为，是ES细胞或iPS细胞。iPS细胞由无伦理问题等的理由而特别优选。作为多能性干细胞可使用公知之任意，但例如，可使用国际公开WO2009/123349(PCT/JP2009/057041)中记载的多能性干细胞。
“组织干细胞”是指，可分化的细胞系列被限定于特定的组织，但有可分化为多样的细胞种的能力(分化多能性)的干细胞。有例如骨髓中的造血干细胞成为血细胞的原来，神经干细胞分化为神经细胞。此外，有制造肝脏的肝干细胞、成为皮肤组织的皮肤干细胞等各种各样的种类。优选为，组织干细胞选自间质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、或者造血干细胞。
“体细胞”是指构成多细胞生物的细胞之中生殖细胞以外的细胞。在有性生殖中不继承到第二代。优选为，体细胞选自肝细胞、胰腺细胞、肌细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、成纤维细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、或者淋巴细胞、红细胞、白细胞、单核细胞、巨噬细胞或巨核细胞的血细胞。
“生殖细胞”是指具有在生殖中将遗传信息向第二代传递的作用的细胞。例如，含用于有性生殖的配偶子、即卵子、***、***、***、用于无性生殖的孢子等。
细胞也可选自肉瘤细胞、株化细胞及转化细胞。“肉瘤”是指骨、软骨、脂肪、肌肉、血液等的非上皮性细胞来源的***细胞中发生的癌，含软部肉瘤、恶性骨肿瘤等。肉瘤细胞是肉瘤来源的细胞。“株化细胞”是指，经长期间在体外维持，至具有一定的稳定的性质，半永久地继代培养变得可能的培养细胞。存在含PC12细胞(大鼠肾上腺髓质来源)、CHO细胞(中国仓鼠卵巢来源)、HEK293细胞(人胎儿肾脏来源)、HL-60细胞(人白血细胞来源)、HeLa细胞(人子***来源)等人的各种各样的生物种的各种各样的组织来源的细胞株。“转化细胞”是指从细胞外部导入核酸(DNA等)，使遗传的性质变化的细胞。对于动物细胞、植物细胞、细菌的转化，各适宜的方法是公知的。
【3.聚酰亚胺多孔质膜】
聚酰亚胺是指，重复单位中含酰亚胺键的高分子的总称，通常是指，芳香族化合物直接经酰亚胺键连接的芳香族聚酰亚胺。由于芳香族聚酰亚胺是芳香族和芳香族经酰亚胺键而具有共价结构，具有刚直且强固的分子结构，并且，由于酰亚胺键具有强的分子间力，有非常地高的水平的热、机械、化学性质。
本发明的聚酰亚胺多孔质膜，优选为，是含自四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺(作为主要的成分)的聚酰亚胺多孔质膜，更优选为是自四羧酸二酐和二胺得到的含聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。“作为主要的成分含”是指，作为聚酰亚胺多孔质膜的构成成分，自四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺以外的成分基本上不含，或者也可含，但不给自四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质带来影响的附加成分。
也含成形含自四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物后，由在250℃以上热处理得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。
【聚酰胺酸】
聚酰胺酸是聚合四羧酸成分和二胺成分而得到。聚酰胺酸是可通过热亚胺化或化学亚胺化闭环而作为聚酰亚胺的聚酰亚胺前体。
聚酰胺酸是，即使酰胺酸之一部分被亚胺化，只要是不给本发明带来影响的范围，就可使用。即，聚酰胺酸也可部分热亚胺化或化学亚胺化。
将聚酰胺酸热亚胺化时，根据需要，可将亚胺化催化剂、含有有机磷的化合物、无机微粒子、有机微粒子等的微粒子等添加到聚酰胺酸溶液。另外，将聚酰胺酸化学亚胺化时，根据需要，可将化学亚胺化剂、脱水剂、无机微粒子、有机微粒子等的微粒子等添加到聚酰胺酸溶液。即使向聚酰胺酸溶液配合上述成分，优选为在着色前体不析出的条件下进行。
【着色前体】
在本发明中，着色前体是指，由250℃以上的热处理而一部分或全部碳化而生成着色化物的前体。
作为本发明中使用的着色前体，均一地溶解或分散于聚酰胺酸溶液或聚酰亚胺溶液，由250℃以上、优选为260℃以上、再优选为280℃以上、更优选为300℃以上的热处理、优选为在空气等的氧存在下的250℃以上、优选为260℃以上、再优选为280℃以上、更优选为300℃以上的热处理而热分解，优选为碳化生成着色化物，更优选为生成黑色系的着色化物，更优选为碳***着色前体。
着色前体加热则成看似碳化物的物质，但在组织上含碳以外的异元素，含层结构、芳香族交联结构、含四面体碳的无秩序结构的物质。
碳***着色前体不特别限制，例如，可举出自石油焦油、石油沥青、煤焦油、煤沥青等的焦油或沥青、焦炭、含丙烯腈的单体得到的聚合物、二茂铁化合物(二茂铁及二茂铁衍生物)等。在这些之中，优选为自含丙烯腈的单体得到的聚合物及/或二茂铁化合物，优选为作为自含丙烯腈的单体得到的聚合物聚丙烯酸类树脂腈。
四羧酸二酐可使用任意的四羧酸二酐，可根据期望的特性等适宜选择。作为四羧酸二酐的具体例，可举出苯均四酸二酐、3,3’,4,4’-联苯基四羧酸二酐(s-BPDA)、2,3,3’,4’-联苯基四羧酸二酐(a-BPDA)等的联苯基四羧酸二酐、氧基二酞酸二酐、二苯基砜-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、双(3,4-二羧苯基)硫化物二无水物、2,2-双(3,4-二羧苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷二无水物、2,3,3’,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、3,3’,4,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、双(3,4-二羧苯基)甲烷二无水物、2,2-双(3,4-二羧苯基)丙烷二无水物、p-亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、p-双亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、m-三联苯基-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、p-三联苯基-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、1,3-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二无水物、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二无水物、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)联苯基二无水物、2,2-双〔(3,4-二羧基苯氧基)苯基〕丙烷二无水物、2,3,6,7-萘四羧酸二酐、1,4,5,8-萘四羧酸二酐、4,4’-(2,2-六氟异亚丙基)二酞酸二酐等。另外，也优选使用2,3,3’,4’-二苯基砜四羧酸等的芳香族四羧酸。这些可单独，也可将2种以上组合使用。
在这些之中，特别是，优选为选自联苯基四羧酸二酐及苯均四酸二酐的至少一种芳香族四羧酸二酐。作为联苯基四羧酸二酐，可适宜地使用3,3’,4,4’-联苯基四羧酸二酐。
二胺可使用任意的二胺。作为二胺的具体例，可举出以下的二胺。
(1)1,4-二氨基苯(对苯二胺)、1,3-二氨基苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯等的苯核1个的苯二胺；
(2)4,4’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚等的二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基联苯基、2,2’-二甲基-4,4’-二氨基联苯基、2,2’-双(三氟甲基)-4,4’-二氨基联苯基、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二羧基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’，5,5’-四甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、双(4-氨基苯基)硫化物、4,4’-二氨基苯甲酰苯胺、3,3’-二氯联苯胺、3,3’-二甲基联苯胺、2,2’-二甲基联苯胺、3,3’-二甲氧基联苯胺、2,2’-二甲氧基联苯胺、3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚、3,3’-二氨基二苯基硫化物、3,4’-二氨基二苯基硫化物、4,4’-二氨基二苯基硫化物、3,3’-二氨基二苯基砜、3,4’-二氨基二苯基砜、4,4’-二氨基二苯基砜、3,3’-二氨基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二氯二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二甲氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基二苯基甲烷、3,4’-二氨基二苯基甲烷、4,4’-二氨基二苯基甲烷、2,2-双(3-氨基苯基)丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)丙烷、2,2-双(3-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、3,3’-二氨基二苯基亚砜、3,4’-二氨基二苯基亚砜、4,4’-二氨基二苯基亚砜等的苯核2个的二胺；
(3)1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯、1,4-双(4-氨基苯氧基)苯、1,3-双(3-氨基苯氧基)-4-三氟甲基苯、3,3’-二氨基-4-(4-苯基)苯氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二(4-苯基苯氧基)二苯甲酮、1,3-双(3-氨基苯基硫化物)苯、1,3-双(4-氨基苯基硫化物)苯、1,4-双(4-氨基苯基硫化物)苯、1,3-双(3-氨基苯基砜)苯、1,3-双(4-氨基苯基砜)苯、1,4-双(4-氨基苯基砜)苯、1,3-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(3-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯等的苯核3个的二胺；
(4)3,3’-双(3-氨基苯氧基)联苯基、3,3’-双(4-氨基苯氧基)联苯基、4,4’-双(3-氨基苯氧基)联苯基、4,4’-双(4-氨基苯氧基)联苯基、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷等的苯核4个的二胺。
这些可单独，也可混合2种以上使用。使用的二胺可根据期望的特性等适宜选择。
在这些之中，优选为芳香族二胺化合物，可适宜地使用3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚及对苯二胺、1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯。特别是，优选为选自苯二胺、二氨基二苯基醚及双(氨基苯氧基)苯基的至少一种二胺。
聚酰亚胺多孔质膜，从在耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点，优选是将玻璃转移温度是240℃以上，或者300℃以上的无明确的转移点的四羧酸二酐和二胺组合而得到的自聚酰亚胺形成。
本发明的聚酰亚胺多孔质膜，从在耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点，优选为含以下的芳香族聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。
(i)由选自联苯基四羧酸单位及苯均四酸单位的至少一种四羧酸单位和芳香族二胺单位组成的芳香族聚酰亚胺、
(ii)由四羧酸单位和选自苯二胺单位、二氨基二苯基醚单位及双(氨基苯氧基)苯基单位的至少一种芳香族二胺单位组成的芳香族聚酰亚胺、
及/或，
(iii)由选自联苯基四羧酸单位及苯均四酸单位的至少一种四羧酸单位和选自苯二胺单位、二氨基二苯基醚单位及双(氨基苯氧基)苯基单位的至少一种芳香族二胺单位组成的芳香族聚酰亚胺。
不旨在限定，但作为聚酰亚胺多孔质膜，可在本发明的方法中使用有至少2个表面层(A面及B面)和所述2个的表面层之间所夹的大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔质膜。优选为，聚酰亚胺多孔质膜有上述大空隙层与上述表面层(A面及B面)结合的隔壁，和被所述隔壁以及上述表面层(A面及B面)包围的膜平面方向的平均孔径是10～500μm的多个大空隙，上述的大空隙层的隔壁、以及上述表面层(A面及B面)各自是，厚度是0.01～20μm，有平均孔径0.01～100μm的多个孔，所述细孔之间可连通，再者与上述大空隙连通而部分或前面有多层结构，进而总膜厚是5～500μm，空孔率是不足40％而95％以上的聚酰亚胺多孔质膜。
总膜厚不旨在限定，但作为一实施方式，也可作为25-75μm。由膜厚的差异，可观察到细胞的增殖速度、细胞的形态、面内的细胞的饱和度等有差异。
在一实施方式中，聚酰亚胺多孔质膜的A面是有平均孔径15μm以下的小的孔的网结构，B面是平均孔径20μm以上的大孔结构。
例如，国际公开WO2010/038873、特开2011-219585、或者特开2011-219586中记载的聚酰亚胺多孔质膜也可在本发明的方法中使用。
接种到聚酰亚胺多孔质膜的表面的细胞可在膜的表面及/或内部稳定生长－增殖。细胞根据膜中的生长－增殖的位置，可取各种不同的形态。在本发明的一实施方式中，根据细胞的种类，也有移动聚酰亚胺多孔质膜的表面及内部着使形状变化着增殖的。
【4.细胞的培养方法、细胞培养基】
在本发明的方法中，向聚酰亚胺多孔质膜适用细胞后，可将细胞使用任意的公知的方法培养。适宜于动物细胞、植物细胞、及细菌的各细胞的培养方法是公知的，本领域技术人员可使用任意的公知的方法在聚酰亚胺多孔质膜上培养细胞。也可根据细胞种类而适宜调制细胞培养基。
动物细胞的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在LONZA公司的细胞培养基产品目录中被记载。植物细胞的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在WAKO公司的植物组织培养基系列等中被记载。细菌的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在BD公司的一般细菌用培养基产品目录中被记载。
【II.细胞培养装置】
本发明另外涉及含聚酰亚胺多孔质膜的，用于在本发明的培养方法中使用的细胞培养装置。在本发明的细胞培养装置中，聚酰亚胺多孔质膜可固定使用，或者也可悬浮于细胞培养基中使用。在细胞培养装置中，2个以上的聚酰亚胺多孔质膜也可上下或左右积层。
本发明的细胞培养装置只要满足含聚酰亚胺多孔质膜的要件，就可使用公知的细胞培养装置。培养装置的形状、规模等不特别限定，可从培养皿、试管至大型的箱适宜利用。例如，包括BDFalcon公司制的细胞培养皿或ThermoScientific公司制的Nunc细胞工厂等。再有，通过在本发明中使用聚酰亚胺多孔质膜，对于先天不可能悬浮培养的细胞，也可用悬浮培养装置，进行在悬浮培养类似状态的培养变得可能。作为悬浮培养用的装置，例如，可使用康宁公司制的旋转瓶。
【III.用于在细胞的培养方法中使用的试剂盒】
本发明还涉及含聚酰亚胺多孔质膜的，用于在细胞的培养方法中使用的试剂盒。
本发明的试剂盒，除聚酰亚胺多孔质膜之外，可适宜含对于细胞培养必要的构成要素。例如，包括适用于聚酰亚胺多孔质膜的细胞、细胞培养基、细胞培养装置、试剂盒使用说明书等。
不旨在限定，但作为一实施方式包括，在透明的袋内单独或多个保存灭菌的聚酰亚胺多孔质膜，含可在细胞培养中直接使用的形态的包装，或者，在同袋内与聚酰亚胺多孔质膜一同封入灭菌液体，效率的吸入接种变得可能的膜－液体之一体型形态的试剂盒。
【实施例】
以下，基于实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些的实施例。本领域技术人员基于本说明书的记载可容易地对本发明加修饰－变更，它们包括在本发明的技术的范围内。之后，在不特别记述时，“聚酰亚胺多孔质膜”是指膜厚25μm的聚酰亚胺多孔质膜。
【实施例1：人间质系干细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的自然接种】
在本实施例中，使用人间质系干细胞进行向聚酰亚胺多孔质膜的接种。
向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基0.5ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面或大孔结构的B面朝上而浸渍。另行准备培养基每1ml悬浮3.6×105个的人间质系干细胞(其中，活细胞是3.4×105个、死细胞是2.0×104个、活细胞率94％)的人间质系干细胞悬浮液。将各60μl细胞悬浮液添加到上述正方形容器中的细胞培养基。
用细胞培养装置培养，在1小时、5小时、24小时、48小时、4天、7天、14天、21天后，固定－染色(DAPI、或者肌动蛋白(actin)+DAPI)，确认细胞的生长和增殖。肌动蛋白的染色用鬼笔环肽进行。观测经时细胞的增殖和接种面特异性的形态。结果示于图3。结果显示，作为代表性的干细胞之一的人间质系干细胞也可由本申请发明的方法培养。
【实施例2：人皮肤成纤维细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的自然接种】
在本实施例中，使用人皮肤成纤维细胞，由自然接种进行细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的适用。
向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基0.5ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面或大孔结构的B面朝上而浸渍。另行准备培养基每1ml悬浮8.3×105个的人皮肤成纤维细胞(其中，活细胞是8.1×105个、死细胞是2.0×104个、活细胞率98％)的人皮肤成纤维细胞悬浮液。将各50μl细胞悬浮液添加到上述正方形容器中的细胞培养基。
用细胞培养装置培养，在1小时、5小时、24小时、48小时、4天、7天、14天、21天后，固定－染色(DAPI、或者肌动蛋白+DAPI)，确认细胞的生长和增殖。观测经时细胞的增殖和接种面及观察面特异性的形态。结果示于图4。由此结果显示，作为代表性的成纤维细胞之一的人皮肤成纤维细胞也可由本申请发明的方法培养。
【实施例3：人皮肤成纤维细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的吸入接种(湿膜法)】
在本实施例中，使用人皮肤成纤维细胞，由向湿膜(充分地润湿的膜；接下来详细说明)的吸入接种进行细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的适用。
准备培养基每1ml悬浮1.0×106个的细胞(其中，活细胞是9.1×105个、死细胞是1.0×105个、活细胞率90％)的人皮肤成纤维细胞悬浮液。在10cm×14cm的角型板上不重叠地并排25个预先用细胞培养基1ml润湿的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜，向各聚酰亚胺多孔质膜B面添加各20μl细胞悬浮液。将渗出的液除尽，将聚酰亚胺多孔质膜移到75cm2培养皿而加培养基12ml。在通常培养条件下直接进行培养，次日固定样品。在图5显示24小时后固定－荧光染色(DAPI、或者肌动蛋白+DAPI)的样品的荧光显微镜照片及实体荧光显微镜照片。
再有，接种工序时、回收渗出的液，还将上述角型板用培养基2ml清洗，在板上对残留的细胞进行计数时，总细胞数是6.0×104个，其中生细胞是5.5×104个、死细胞是3.0×104个、活细胞率65％。比较细胞生死，则活细胞的向膜的吸附率是88％、渗出率是12％，死细胞的向膜的吸附率是40％、渗出率成60％。
【实施例4：人间质系干细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的吸入接种(一点湿法)】
在本实施例中，使用人间质系干细胞，由向一点湿膜(浸润于仅中央的一点液滴而简单地固定的膜；接下来详细说明)的吸入接种进行细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的适用。
本实施例显示，使用人间质系干细胞，由润湿膜材料的仅中央部一点的向膜的吸入接种进行细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的适用的例。
在置膜的预定的中央部使10μl左右的液滴形成，通过其上置聚酰亚胺多孔质膜，使膜的部位固定而制作易接种的场所的同时，再利用润湿，旨在细胞液膜透过的迅速化。
准备培养基每1ml悬浮1.0×106个的细胞(其中，活细胞是9.6×105个、死细胞是4.0×104个、活细胞率96％)的，人间质系干细胞悬浮液。在10cm×14cm的角型板上不重叠地并排各10个灭菌－干燥的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜A面及B面，添加各聚酰亚胺多孔质膜各40μl细胞悬浮液。除尽渗出的液，将聚酰亚胺多孔质膜每接种面移到10cm2培养皿，加培养基2ml。直接，在通常培养条件下进行培养，0.5小时、3天、7天、12天后，固定－染色(DAPI、肌动蛋白+DAPI、或者肌动蛋白)，确认细胞的生长和增殖。结果示于图6及7。
再有，接种工序时、回收渗出的液而还将上述角型板用培养基4ml清洗，对板上残留的细胞进行计数时，A面接种时，总细胞数是6.5×104个，其中生细胞是4.0×104个、死细胞是2.5×104个、活细胞率62％。比较细胞生死，则活细胞的向膜的吸附率是89％、渗出率是11％，被认为死细胞几乎不吸附而流出。另外，B面接种的情况，回收总细胞数是6.5×104个，其中生细胞是8.0×104个、死细胞是2.0×104个、活细胞率80％。比较细胞生死，则活细胞的向膜的吸附率是79％、渗出率是21％，被认为死细胞几乎不吸附而流出。
【实施例5：人间质系干细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的含浸接种】
在本实施例中，使用人间质系干细胞，由从细胞悬浮液的含浸进行细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的适用。
将一边10cm的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使用夹细断为大概2～3mm见方的小片，于160℃灭菌10分钟后，放冷却，用2ml的灭菌的培养基润湿。其后，将聚酰亚胺多孔质膜用镊子取出，移到Falcon管中。向Falcon管中的膜上添加培养基每1ml悬浮3.6×105个的细胞(其中，活细胞是3.4×105个、死细胞是2.0×104个、活细胞率94％)的人间质系干细胞悬浮液1.6ml(细胞总数5.7×105个中，活细胞是5.4×105个、死细胞是3.2×104个)。时时振动混合着向培养装置内放置2小时，测定液部的细胞量，则观测到2.0×105个的细胞(其中，活细胞是1.2×105个，死细胞是8.0×104个、活细胞率60％)。取出小片的聚酰亚胺多孔质膜，移到放4ml的培养基的20cm2培养皿，在培养装置中继续培养。将小片在48小时、7天、14天、21天、28天后，固定－染色(DAPI、或者肌动蛋白+DAPI)，确认细胞的生长和增殖。结果示于图8及图9。
【实施例6：株化细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的小片的吸入接种】
在本实施例中，使用株化细胞的PC12细胞，由吸入进行细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的小片的适用。
在10cm×14cm的角型板上，预先用培养基5ml润湿，将除去额外的液体的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜15个上下左右地一部分重复地随机地并排。培养基每1ml悬浮9.0×105个的细胞(其中，活细胞是7.4×105个，使死细胞是1.7×105个、活细胞率82％)，另行准备大鼠肾上腺褐色细胞瘤PC12的细胞悬浮液。一边将所述细胞悬浮液2ml略倾斜板而将渗出液移动到下方，一边缓慢地依次添加到膜上。5分钟后，除尽聚酰亚胺多孔质膜的渗出液，向预先准备的20cm2的培养皿放培养基4ml之中移动，在培养装置中进行培养。
48小时、4天、6天、9天后，将聚酰亚胺多孔质膜固定－染色，确认细胞的增殖。染色用膜荧光染色剂CellMask(CellMask(商标)Orangeplasmamembranestain(LifeTechnologies公司)。之后，简记为CellMask)+DAPI进行。结果示于图10。在本细胞中也观测到，在聚酰亚胺多孔质膜内形成集团着增殖的样式，确认适用的可能性。结果显示，作为代表性的株化细胞之一的PC12细胞也可由本申请发明的方法培养。
【实施例7：培养细胞数的测定】
在本实施例中，将人皮肤成纤维细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方法培养，测定培养细胞数。
【1、使用通常培养细胞的CCK8的细胞数测量】
首先，使用以下的试剂及方法，通常测量培养中的细胞数，求出吸光度和实际的细胞数的相关系数。
[试剂]细胞计数试剂盒8；同人化学研究所制溶液试剂(以下记作“CCK8”。)
[方法]一定期间在5cm2的室型培养皿上准备培养的人皮肤成纤维细胞，除去其培养上清，用加2％的CCK8的一定量的培养基取代，在温育器内保存2小时。其后，移出着色的上清，用480nm的波长测定吸光度(空白使用仅使用培养基测定的条件)。其后，除去同上清后，用磷酸缓冲液清洗2次细胞，用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液处理，对细胞数进行计数。
由此方法求出培养条件和在CCK8浓度的条件的吸光度和实际的细胞数的相关系数。
【2.在聚酰亚胺多孔质膜上增殖的细胞数的测定】
与1同样地，将培养细胞的2cm2(1.4cm＊1.4cm)的聚酰亚胺多孔质膜移到5cm2的室型培养皿，加一定量的加5％的CCK8的培养基，在温育器内保存1～3小时，移出上清，用480nm的波长测定吸光度。此时，使用2.5倍使用的CCK8，另一方面，由于仅面积2.5倍少的面积有聚酰亚胺多孔质膜的面积，可直接进行与在1的阅读值的比较。(在使浓度或面积等的条件变化时，换算变得必要。)使用1中求出的换算系数进行部件上生存的细胞数的计算，其后，用培养基清洗2次，返回到温育器内继续培养。重复此作业，定量解析经时聚酰亚胺多孔质膜上的细胞的增殖的样式。重复实验数，也进行再现性的验证。
进行各3次自然接种及吸入接种的结果示于图11。如图11所示，依赖于接种的方法而细胞的增殖速度不同，但由1个月左右的培养而其差解消，到达类似的每单位面积的细胞数。图中的虚线，由作为比较实验实施的培养皿等显示通常的附着培养时的培养细胞数上限。基于面积比较细胞数时，相比通常的细胞培养，变得可在单位面积中培养更多的细胞。
【实施例8：人皮肤角化细胞的培养】
在本实施例中，将人皮肤角化细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察。
向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基(KGM-Gold角化细胞增殖培养基BulletKit(LONZA公司))0.5ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上而浸渍。将4×104个的人皮肤角化细胞添加到上述正方形容器中的细胞培养基。即，1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜每1个自然接种4×104个的人皮肤角化细胞。
用细胞培养装置培养，在1天、3天、6天后，固定－染色。染色用CellMask+DAPI、或者仅CellMask进行。其后，使用共聚焦激光显微镜(LSM700(CarlZeiss公司制))及实体荧光显微镜(LeicaM165FC(Leica公司制))观察经时细胞的增殖和形态。
结果示于图12。结果显示，作为人的原代培养细胞(原代培养细胞)的人皮肤角化细胞也可由本申请发明的方法培养。
【实施例9：人脐带静脉内皮细胞的培养】
在本实施例中，将人脐带静脉内皮细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察。
向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基(EGM-2BulletKit(LONZA公司))0.5ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上而浸渍。将4×104个的人脐带静脉内皮细胞添加到上述正方形容器中的细胞培养基。即，1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜每1个自然接种4×104个的人脐带静脉内皮细胞。
用细胞培养装置培养，在3天、6天、10天后，固定－染色(CellMask+DAPI及CellMask)。由染色、以及共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜的观察与实施例8同样地进行。
结果示于图13。结果显示，作为人的原代培养细胞(原代培养细胞)的人脐带静脉内皮细胞也可由本申请发明的方法培养。
【实施例10：Vero细胞的培养】
在本实施例中，将Vero细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察。聚酰亚胺多孔质膜使用25μm、40μm、75μm的3种。培养期间是1天-15天。
向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基(向DMEM添加10％FBS及抗生物质的)0.5ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上而浸渍。将4×104个的Vero细胞添加到上述正方形容器中的细胞培养基。即，1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜每1个自然接种4×104个的Vero细胞。
用细胞培养装置培养，在1天、3天、7天、10天、15天后，固定－染色。染色用肌动蛋白+DAPI进行，肌动蛋白的检测由鬼笔环肽进行。由共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜的观察与实施例8同样地进行。
结果示于图14-1～14-3。结果显示，即使对于作为代表性的株化细胞之一的Vero细胞，也可由本申请发明的方法培养。
【实施例11：HeLa细胞的培养】
在本实施例中，将HeLa细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察。聚酰亚胺多孔质膜使用25μm、40μm、75μm的3种。培养期间、使用的显微镜、具体工序等如实施例10中记载。
结果示于图15-1～图15-3。结果显示，即使对于作为代表性的株化细胞之一的HeLa细胞，也可由本申请发明的方法培养。
【实施例12：CHO细胞的培养】
在本实施例中，将CHO细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方法培养，用共聚焦激光显微镜及实体荧光显微镜观察。聚酰亚胺多孔质膜使用25μm、40μm、75μm的3种。在培养期间1天-7天，使用的显微镜、具体工序等如实施例10中记载。
结果示于图16-1～图16-3。结果显示，即使对于作为代表性的株化细胞之一的CHO细胞，可由本申请发明的方法培养。

Claims (23)

1.细胞的培养方法，其包括将细胞适用于聚酰亚胺多孔质膜，进行培养。
2.权利要求1所述的方法，其包括将细胞接种到上述聚酰亚胺多孔质膜的表面的工序。
3.权利要求1所述的方法，其包括下列工序：
在上述聚酰亚胺多孔质膜的干燥的表面载乘细胞悬浮液，
放置上述聚酰亚胺多孔质膜，或者移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促进液的流出，或者刺激表面的一部分，使细胞悬浮液被吸入上述膜，进而
使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。
4.权利要求1所述的方法，其包括下列工序：
将上述聚酰亚胺多孔质膜之一面或两面用细胞培养基或灭菌的液体润湿，
向上述润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液，进而
使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜内，使水分流出。
5.权利要求4所述的方法，其中活细胞停留在上述聚酰亚胺多孔质膜内，死细胞与水分一同流出。
6.权利要求4或5所述的方法，其中上述灭菌的液体是灭菌水或灭菌的缓冲液。
7.权利要求1～6之任一项所述的方法，其包括向细胞培养容器中放入细胞培养基、细胞及1个或其以上的上述聚酰亚胺多孔质膜，其中，聚酰亚胺多孔质膜处于悬浮于细胞培养基中的状态下。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于，使用2个以上的上述聚酰亚胺多孔质膜的小片。
9.权利要求7或8所述的方法，其中细胞自发粘接到上述聚酰亚胺多孔质膜。
10.权利要求1～6之任一项所述的方法，其中将上述聚酰亚胺多孔质膜
(i)折叠，
(ii)卷成卷状，
(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者
(iv)结成绳状
而在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定。
11.权利要求10所述的方法，其中细胞自发粘接到上述聚酰亚胺多孔质膜。
12.权利要求1所述的方法，其包括将2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右积层到细胞培养基中而使用。
13.权利要求1所述的方法，其中将权利要求2～12之任一项所述的方法的2种或更多种方法组合使用。
14.权利要求1～13之任一项所述的方法，其中细胞在聚酰亚胺多孔质膜的表面及内部生长增殖。
15.权利要求1～14之任一项所述的方法，其中细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌及细菌。
16.权利要求15所述的方法，其中动物细胞是属于脊椎动物门的动物来源的细胞。
17.权利要求15所述的方法，其中细菌选自乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及蓝细菌。
18.权利要求1～14之任一项所述的方法，其中细胞选自多能性干细胞、组织干细胞、体细胞及生殖细胞。
19.权利要求1～13之任一项所述的方法，其中细胞选自肉瘤细胞、株化细胞及转化细胞。
20.权利要求1～19之任一项所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是含自四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。
21.用于在权利要求1～20之任一项所述的细胞的培养方法中使用的细胞培养装置，其含聚酰亚胺多孔质膜。
22.权利要求21所述的细胞培养装置，其中2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右积层。
23.用于在权利要求1～20之任一项所述的细胞的培养方法中使用的试剂盒，其含聚酰亚胺多孔质膜。
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