CN111630151A - 细胞培养模块 - Google Patents

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pores
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萩原昌彦
原田崇司
松林昭博
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Abstract

本发明提供一种能够对多个聚合物多孔膜应用均质的培养条件，从而稳定且大量地培养细胞的手段。一种细胞培养模块，其具备：顶部；底部；具有培养液流出流入口的侧部；对由前述顶部、底部和侧部形成的空间进行分隔且具有培养液流出流入口的多个间隔部；分别固定于选自顶部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、底部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、以及邻接的间隔部彼此之间的多个间隙空间中的2个以上的间隙空间的聚合物多孔膜，此处，前述聚合物多孔膜具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在前述表面层A与表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于前述表面层A的孔的平均孔径小于存在于前述表面层B的孔的平均孔径，前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围的多个大孔隙，前述表面层A和B中的孔与前述大孔隙连通。

Description

细胞培养模块
技术领域
本发明涉及细胞培养模块。
背景技术
近年来，治疗、疫苗所使用的酶、激素、抗体、细胞因子、病毒(病毒蛋白质)等蛋白质使用培养细胞进行工业生产。但是，这种蛋白质的生产技术在效率方面存在课题，这会对必须持续且广泛供给的生物医药的及时且稳定的供给造成影响。因此，为了确立有效、稳定且迅速的蛋白质生产方法，寻求高密度地培养细胞的技术、高效率连续生产法等使蛋白质的产量增大那样的革命性且简便的技术。
作为产生蛋白质的细胞，有时使用粘附于培养基材的支架依赖性的粘附细胞。这种细胞以支架依赖性的方式进行增殖，因此，需要使其粘附于培养皿、板或腔室的表面来进行培养。以往，为了大量培养这种粘附细胞而需要增大用于粘附的表面积。然而，为了增大培养面积，必然需要增大空间，其成为在有效生产、制造量的改善中产生课题的主要因素。
作为减小培养空间且大量培养粘附细胞的方法，开发了使用具有微小多孔的载体、尤其是微载体的培养法(例如专利文献1)。使用了微载体的细胞培养体系为了使微载体不会相互聚集而需要充分搅拌/扩散。因此，需要能够使分散有微载体的培养液充分搅拌/扩散的容积，因此，能够培养的细胞的密度存在上限。此外，为了将微载体与培养液进行分离，需要利用能够筛分细微粒的过滤器使其分离，其也会成为使生物医药的生产率降低的原因。从这种状况出发，寻求稳定且简便地培养大量附着细胞的革命性的细胞培养方法论。
<聚酰亚胺多孔膜>
聚酰亚胺多孔膜在本申请之前被用于过滤器、低介电常数薄膜、燃料电池用电解质膜等尤其是以电池相关为主的用途。专利文献2～4特别记载了具有多个大孔隙的聚酰亚胺多孔膜，其气体等物质的透过性优异、空孔率高、两个表面的平滑性优异、强度相对较高，虽然空孔率高，但对于膜厚度方向上的压缩应力的耐力仍然优异。它们均是利用酰胺酸而制作的聚酰亚胺多孔膜。
报告有一种细胞的培养方法，其包括将细胞应用于聚酰亚胺多孔膜来进行培养(专利文献5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2003/054174号
专利文献2：国际公开第2010/038873号
专利文献3：日本特开2011-219585号公报
专利文献4：日本特开2011-219586号公报
专利文献5：国际公开第2015/012415号
发明内容
发明要解决的问题
在1个培养容器或袋中使用多个聚酰亚胺多孔膜对细胞进行振荡培养或搅拌培养时，在该容器或袋中，聚酰亚胺多孔膜各自承受的力不同。因此，难以在均质的条件下对所有聚酰亚胺多孔膜进行细胞培养。此外，使用聚酰亚胺多孔膜进行振荡培养或搅拌培养时，因该膜的形态持续变形而对该膜内生长的细胞施加应力，导致细胞死亡，因此难以实现稳定的细胞培养。
因此，本发明的目的在于，提供能够对多个聚合物多孔膜应用均质的培养条件，从而稳定且大量地培养细胞的手段。
用于解决问题的方案
本发明人等鉴于上述课题进行了深入研究，结果发现：通过使用具备多个聚合物多孔膜且具有特定立体结构的模块，能够稳定且大量地培养细胞，由此完成了本发明。
本发明包括以下的<1>～<15>。
<1>一种细胞培养模块，其具备：
顶部；
底部；
具有培养液流出流入口的侧部；
对由前述顶部、底部和侧部形成的空间进行分隔且具有培养液流出流入口的多个间隔部；以及
分别固定于选自顶部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、底部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、以及邻接的间隔部彼此之间的多个间隙空间中的2个以上的间隙空间的聚合物多孔膜，
此处，前述聚合物多孔膜具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在前述表面层A与表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于前述表面层A的孔的平均孔径小于存在于前述表面层B的孔的平均孔径，前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围的多个大孔隙，前述表面层A和B中的孔与前述大孔隙连通。
<2>根据<1>所述的细胞培养模块，其中，与固定有聚合物多孔膜的间隙空间邻接的间隙空间中的至少一者不含聚合物多孔膜。
<3>根据<1>或<2>所述的细胞培养模块，其中，在选自顶部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、底部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、以及邻接的间隔部彼此之间的多个间隙空间中的2个以上的间隙空间分别层叠配置有3～100片聚合物多孔膜。
<4>根据<1>～<3>中任一项所述的细胞培养模块，其中，前述聚合物多孔膜为聚酰亚胺多孔膜。
<5>根据<1>～<3>中任一项所述的细胞培养模块，其中，前述聚合物多孔膜为聚醚砜多孔膜。
<6>根据<1>～<5>中任一项所述的细胞培养模块，其中，前述顶部和底部具有培养液流出流入口。
<7>根据<1>～<6>中任一项所述的细胞培养模块，其具有长方体形状。
<8>根据<1>～<6>中任一项所述的细胞培养模块，其具有立方体形状。
<9>根据<1>～<6>中任一项所述的细胞培养模块，其具有卵形状。
<10>一种细胞培养模块复合体，其是多个<7>或<8>所述的细胞培养模块连接而成的。
<11>一种细胞培养模块，其具备：
多个细胞培养亚模块；以及
用于层叠并收纳前述多个细胞培养亚模块且具有培养液流出流入口的细胞培养亚模块收纳用壳体，
此处，前述细胞培养亚模块具备：
聚合物多孔膜；以及
具有培养液流出流入口的聚合物多孔膜收纳用壳体，所述聚合物多孔膜收纳用壳体固定并收纳前述聚合物多孔膜，
前述聚合物多孔膜具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在前述表面层A与表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于前述表面层A的孔的平均孔径小于存在于前述表面层B的孔的平均孔径，前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围的多个大孔隙，前述表面层A和B中的孔与前述大孔隙连通。
<12>根据<11>所述的细胞培养模块，其中，在层叠的前述多个细胞培养亚模块与细胞培养亚模块收纳用壳体之间具有间隙空间。
<13>根据<11>或<12>所述的细胞培养模块，其中，在前述聚合物多孔膜收纳用壳体中层叠并收纳有3～100片聚合物多孔膜。
<14>根据<11>～<13>中任一项所述的细胞培养模块，其中，前述聚合物多孔膜为聚酰亚胺多孔膜。
<15>根据<11>～<13>中任一项所述的细胞培养模块，其中，前述聚合物多孔膜为聚醚砜多孔膜。
发明的效果
根据本发明，能够对多个聚合物多孔膜应用均质的培养条件，从而稳定且大量地培养细胞。
附图说明
图1是细胞培养模块1的立体图。其中省略了细胞培养模块中的聚合物多孔膜的图示。
图2是用于说明细胞培养模块1的内部的正面图。
图3是用于说明细胞培养模块1的内部的立体图。
图4是用于说明被图1的A-A线切断的细胞培养模块1的内部的立体图。
图5是准备2个图1～3所示的细胞培养模块1，并通过将一者的顶部与另一者的顶部连接而制造的细胞培养模块复合体10的立体图。其中省略了细胞培养模块中的聚合物多孔膜的图示。
图6是细胞培养模块复合体10的正面图。
图7是细胞培养模块20的立体图。
图8是细胞培养模块20的正面图。
图9是图7和8所示的细胞培养模块20中使用的细胞培养亚模块30的俯视图。
图10是图9的B-B线处的细胞培养亚模块30的截面图。
图11示出通过使用了细胞培养模块20的细胞培养而产生的抗体量的经时变化。
具体实施方式
以下，针对本发明的实施方式，根据需要参照附图进行说明。实施方式的构成是例示，本发明的构成不限定于实施方式的具体构成。
<<聚合物多孔膜>>
本发明所使用的聚合物多孔膜中的表面层A(以下也称为“A面”或“筛网面”)中存在的孔的平均孔径没有特别限定，例如为0.01μm以上且小于200μm、0.01～150μm、0.01～100μm、0.01～50μm、0.01μm～40μm、0.01μm～30μm、0.01μm～25μm、0.01μm～20μm或0.01μm～15μm，优选为0.01μm～25μm。
本发明所使用的聚合物多孔膜中的表面层B(以下也称为“B面”或“大孔面”)中存在的孔的平均孔径只要大于表面层A中存在的孔的平均孔径，就没有特别限定，例如超过5μm且为200μm以下、20μm～100μm、25μm～100μm、30μm～100μm、35μm～100μm、40μm～100μm、50μm～100μm或60μm～100μm，优选为30μm～100μm。
本说明书中，聚合物多孔膜表面的平均孔径为面积平均孔径。面积平均孔径可按照以下的(1)和(2)来求出。需要说明的是，聚合物多孔膜表面之外的部位的平均孔径也可以同样求出。
(1)根据多孔膜表面的扫描型电子显微镜照片，针对200个以上的开孔部测定孔面积S，假设该孔面积为正圆，由式I求出各自的孔径d。
[数学式1]
Figure BDA0002598695220000061
(2)将通过上述式I求出的全部孔径应用于以下的式II，求出将孔的形状设为正圆时的面积平均孔径da。
[数学式2]
面积平均孔径da＝∑(d3)/∑(d2) 式II
表面层A和B的厚度没有特别限定，例如为0.01～50μm，优选为0.01～20μm。
聚合物多孔膜的大孔隙层中的大孔隙的膜平面方向的平均孔径没有特别限定，例如为10～500μm，优选为10～100μm，更优选为10～80μm。此外，该大孔隙层中的分隔壁的厚度没有特别限定，例如为0.01～50μm，优选为0.01～20μm。在一个实施方式中，该大孔隙层中的至少1个分隔壁具有将邻接的大孔隙彼此连通且平均孔径为0.01～100μm、优选为0.01～50μm的1个或多个孔。在另一实施方式中，该大孔隙层中的分隔壁不具有孔。
本发明所使用的聚合物多孔膜表面的总膜厚没有特别限定，可以为5μm以上、10μm以上、20μm以上或25μm以上，也可以为500μm以下、300μm以下、100μm以下、75μm以下或50μm以下。优选为5～500μm，更优选为25～75μm。
本发明所使用的聚合物多孔膜的膜厚的测定可利用接触式的厚度计来进行。
本发明所使用的聚合物多孔膜的空孔率没有特别限定，例如为40％以上且小于95％。
本发明中使用的聚合物多孔膜的空孔率可通过对切成规定大小的多孔薄膜的膜厚和质量进行测定，并按照下式III由单位面积质量来求出。
[数学式3]
空孔率(％)＝(1-w/(S×d×D))×100 式III
(式中，S是指多孔薄膜的面积、d是指总膜厚、w是指测得的质量、D是指聚合物的密度。聚合物为聚酰亚胺时，密度设为1.34g/cm3。)
本发明中使用的聚合物多孔膜优选具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在前述表面层A与表面层B之间的大孔隙层的三层结构的聚合物多孔膜，此处，存在于前述表面层A的孔的平均孔径为0.01μm～25μm，存在于前述表面层B的孔的平均孔径为30μm～100μm，前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围的多个大孔隙，前述大孔隙层的分隔壁以及前述表面层A和B的厚度为0.01～20μm，前述表面层A和B中的孔与大孔隙连通，总膜厚为5～500μm，空孔率为40％以上且小于95％。在一个实施方式中，大孔隙层中的至少1个分隔壁具有将邻接的大孔隙彼此连通且平均孔径为0.01～100μm、优选为0.01～50μm的1个或多个孔。在另一实施方式中，分隔壁不具有这样的孔。
本发明中使用的聚合物多孔膜优选未灭菌。作为灭菌处理，没有特别限定，可列举出干热灭菌、蒸气灭菌、基于乙醇等消毒剂的灭菌、紫外线、伽马射线等的电磁波灭菌等任意灭菌处理等。
本发明所使用的聚合物多孔膜只要具备上述结构上的特征，就没有特别限定，优选为聚酰亚胺多孔膜或聚醚砜(PES)多孔膜。
<聚酰亚胺多孔膜>
聚酰亚胺是指重复单元中包含酰亚胺键的高分子的统称，通常是指芳香族化合物直接借助酰亚胺键连接而成的芳香族聚酰亚胺。芳香族聚酰亚胺由于芳香族与芳香族通过酰亚胺键而具有共轭结构，因此具有刚直且牢固的分子结构，并且，酰亚胺键具有强分子间力，因此具有非常高水平的热性质、机械性质、化学性质。
本发明可使用的聚酰亚胺多孔膜优选为(作为主要成分而)包含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜，更优选由通过四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺形成的聚酰亚胺多孔膜。“作为主要成分而包含”是指：作为聚酰亚胺多孔膜的构成成分，本质上不含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺之外的成分，或者虽然可以包含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺之外的成分，但其是不会对由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质造成影响的附加性成分。
在一个实施方式中，本发明可使用的聚酰亚胺多孔膜还包括：通过将包含着色前体以及由四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液的聚酰胺酸溶液组合物成形后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。
聚酰胺酸是将四羧酸成分与二胺成分进行聚合而得到的。聚酰胺酸是能够通过热酰亚胺化或化学酰亚胺化进行闭环而制成聚酰亚胺的聚酰亚胺前体。
对于聚酰胺酸，即使一部分酰胺酸进行了酰亚胺化，只要是不对本发明造成影响的范围，则也可以使用该聚酰胺酸。即，聚酰胺酸可以部分地进行了热酰亚胺化或化学酰亚胺化。
将聚酰胺酸进行热酰亚胺化时，根据需要，可以向聚酰胺酸溶液中添加酰亚胺化催化剂、含有机磷的化合物、无机微粒、有机微粒等微粒等。此外，将聚酰胺酸进行化学酰亚胺化时，根据需要，可以向聚酰胺酸溶液中添加化学酰亚胺化剂、脱水剂、无机微粒、有机微粒等微粒等。优选在即使向聚酰胺酸溶液中配混前述成分也不会析出着色前体的条件下进行。
本说明书中，“着色前体”是指：通过250℃以上的热处理而一部分或全部碳化并生成着色物的前体。
作为在上述聚酰亚胺多孔膜的制造中可使用的着色前体，优选为均匀地溶解或分散于聚酰胺酸溶液或聚酰亚胺溶液，并通过250℃以上、优选260℃以上、进一步优选280℃以上、更优选300℃以上的热处理，优选通过在空气等氧气存在下的250℃以上、优选260℃以上、进一步优选280℃以上、更优选300℃以上的热处理而发生热分解、碳化并生成着色物的着色前体，更优选为生成黑色系着色物的着色前体，更优选为碳系着色前体。
着色前体在加热时，乍看像是碳化物，但在组织上包含除碳之外的不同种元素，且包含层结构、芳香族交联结构、含有四面体碳的无序结构的物质。
碳系着色前体没有特别限定，可列举出例如石油焦油、石油沥青、煤焦油、煤沥青等焦油或沥青；焦炭、由包含丙烯腈的单体得到的聚合物、二茂铁化合物(二茂铁和二茂铁衍生物)等。这些之中，优选为由包含丙烯腈的单体得到的聚合物和/或二茂铁化合物，作为由包含丙烯腈的单体得到的聚合物，优选为聚丙烯腈。
此外，在其它实施方式中，本发明可使用的聚酰亚胺多孔膜还包括：不使用上述着色前体，而是通过将由四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液成形后，进行热处理而得到的聚酰亚胺多孔膜。
不使用着色前体地制造的聚酰亚胺多孔膜也可如下制造：例如，将包含特性粘度数值为1.0～3.0的聚酰胺酸3～60质量％和有机极性溶剂40～97质量％的聚酰胺酸溶液流延成膜状，使其浸渍于以水作为必须成分的凝固溶剂或与该凝固溶剂接触，制作聚酰胺酸的多孔膜，其后对该聚酰胺酸的多孔膜进行热处理而进行酰亚胺化。在该方法中，以水为必须成分的凝固溶剂可以是水，或者为5质量％以上且小于100质量％的水与超过0质量％且为95质量％以下的有机极性溶剂的混合液。此外，在上述酰亚胺化后，也可以对所得多孔聚酰亚胺膜的至少单面实施等离子体处理。
在上述聚酰亚胺多孔膜的制造中可使用的四羧酸二酐可以使用任意的四羧酸二酐，可根据期望的特性等来适当选择。作为四羧酸二酐的具体例，可列举出均苯四甲酸二酐、3,3’,4,4’-联苯四甲酸二酐(s-BPDA)、2,3,3’,4’-联苯四甲酸二酐(a-BPDA)等联苯四甲酸二酐；氧基二邻苯二甲酸二酐、二苯基砜-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)硫醚二酐、2,2-双(3,4-二羧基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷二酐、2,3,3’,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、3,3’,4,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)甲烷二酐、2,2-双(3,4-二羧基苯基)丙烷二酐、对亚苯基双(偏苯三甲酸单酯酸酐)、对亚联苯基双(偏苯三甲酸单酯酸酐)、间三联苯-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、对三联苯-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、1,3-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二酐、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二酐、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)联苯二酐、2,2-双〔(3,4-二羧基苯氧基)苯基〕丙烷二酐、2,3,6,7-萘四甲酸二酐、1,4,5,8-萘四甲酸二酐、4,4’-(2,2-六氟异丙叉基)二邻苯二甲酸二酐等。此外，还优选使用2,3,3’,4’-二苯基砜四羧酸等芳香族四羧酸。它们可以单独使用，也可以组合使用2种以上。
这些之中，特别优选为选自由联苯四甲酸二酐和均苯四甲酸二酐组成的组中的至少一种芳香族四羧酸二酐。作为联苯四甲酸二酐，可适当地使用3,3’,4,4’-联苯四甲酸二酐。
在上述聚酰亚胺多孔膜的制造中可使用的二胺可以使用任意的二胺。作为二胺的具体例，可列举出以下的二胺。
1)1,4-二氨基苯(对苯二胺)、1,3-二氨基苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯等1个苯核的苯二胺；
2)4,4’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚等二氨基二苯基醚；4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基联苯、2,2’-二甲基-4,4’-二氨基联苯、2,2’-双(三氟甲基)-4,4’-二氨基联苯、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二羧基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’,5,5’-四甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、双(4-氨基苯基)硫醚、4,4’-二氨基苯甲酰苯胺、3,3’-二氯联苯胺、3,3’-二甲基联苯胺、2,2’-二甲基联苯胺、3,3’-二甲氧基联苯胺、2,2’-二甲氧基联苯胺、3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚、3,3’-二氨基二苯硫醚、3,4’-二氨基二苯硫醚、4,4’-二氨基二苯硫醚、3,3’-二氨基二苯基砜、3,4’-二氨基二苯基砜、4,4’-二氨基二苯基砜、3,3’-二氨基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二氯二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二甲氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基二苯基甲烷、3,4’-二氨基二苯基甲烷、4,4’-二氨基二苯基甲烷、2,2-双(3-氨基苯基)丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)丙烷、2,2-双(3-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、3,3’-二氨基二苯基亚砜、3,4’-二氨基二苯基亚砜、4,4’-二氨基二苯基亚砜等2个苯核的二胺；
3)1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯、1,4-双(4-氨基苯氧基)苯、1,3-双(3-氨基苯氧基)-4-三氟甲基苯、3,3’-二氨基-4-(4-苯基)苯氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二(4-苯基苯氧基)二苯甲酮、1,3-双(3-氨基苯硫醚)苯、1,3-双(4-氨基苯硫醚)苯、1,4-双(4-氨基苯硫醚)苯、1,3-双(3-氨基苯基砜)苯、1,3-双(4-氨基苯基砜)苯、1,4-双(4-氨基苯基砜)苯、1,3-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(3-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯等3个苯核的二胺；
4)3,3’-双(3-氨基苯氧基)联苯、3,3’-双(4-氨基苯氧基)联苯、4,4’-双(3-氨基苯氧基)联苯、4,4’-双(4-氨基苯氧基)联苯、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫醚、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫醚、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫醚、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫醚、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷等4个苯核的二胺。
它们可以单独使用，也可以混合使用2种以上。所用的二胺可根据期望的特性等来适当选择。
这些之中，优选为芳香族二胺化合物，可适当地使用3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚和对苯二胺、1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯。特别优选为选自由苯二胺、二氨基二苯基醚和双(氨基苯氧基)苯组成的组中的至少一种二胺。
从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点出发，本发明可使用的聚酰亚胺多孔膜优选由玻璃化转变温度为240℃以上或在300℃以上没有明确的转变点的、将四羧酸二酐和二胺组合得到的聚酰亚胺来形成。
从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点出发，本发明可使用的聚酰亚胺多孔膜优选为由以下的芳香族聚酰亚胺形成的聚酰亚胺多孔膜。
(i)由选自由联苯四甲酸单元和均苯四甲酸单元组成的组中的至少一种四羧酸单元与芳香族二胺单元形成的芳香族聚酰亚胺；
(ii)由四羧酸单元与选自由苯二胺单元、二氨基二苯基醚单元和双(氨基苯氧基)苯单元组成的组中的至少一种芳香族二胺单元形成的芳香族聚酰亚胺；和/或
(iii)由选自由联苯四甲酸单元和均苯四甲酸单元组成的组中的至少一种四羧酸单元与选自由苯二胺单元、二氨基二苯基醚单元和双(氨基苯氧基)苯基单元组成的组中的至少一种芳香族二胺单元形成的芳香族聚酰亚胺。
本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜优选具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在前述表面层A和表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于前述表面层A的孔的平均孔径为0.01μm～25μm，存在于前述表面层B的孔的平均孔径为30μm～100μm，前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围的多个大孔隙，前述大孔隙层的分隔壁以及前述表面层A和B的厚度为0.01～20μm，前述表面层A和B中的孔与大孔隙连通，总膜厚为5～500μm，空孔率为40％以上且小于95％。此处，大孔隙层中的至少1个分隔壁具有将邻接的大孔隙彼此连通且平均孔径为0.01～100μm、优选为0.01～50μm的1个或多个孔。
例如，国际公开第2010/038873号、日本特开2011-219585号公报或日本特开2011-219586号公报中记载的聚酰亚胺多孔膜也可用于本发明。
<聚醚砜(PES)多孔膜>
本发明可使用的PES多孔膜包含聚醚砜，典型而言，实质上由聚醚砜组成。聚醚砜可以利用本领域技术人员公知的方法来合成，可通过例如下述方法等来制造：使二元酚、碱金属化合物和二卤代二苯基化合物在有机极性溶剂中发生缩聚反应的方法；预先合成二元酚的碱金属二盐，并使其与二卤代二苯基化合物在有机极性溶剂中发生缩聚反应的方法。
作为碱金属化合物，可列举出碱金属碳酸盐、碱金属氢氧化物、碱金属氢化物、碱金属醇盐等。特别优选为碳酸钠和碳酸钾。
作为二元酚化合物，可列举出对苯二酚、邻苯二酚、间苯二酚、4,4’-联苯酚、双(羟基苯基)烷烃类(例如2,2-双(羟基苯基)丙烷和2,2-双(羟基苯基)甲烷)、二羟基二苯基砜类、二羟基二苯基醚类、或者它们的苯环中的至少1个氢被甲基、乙基、丙基等低级烷基、或甲氧基、乙氧基等低级烷氧基取代而得的化合物。作为二元酚化合物，可以将两种以上的上述化合物混合使用。
聚醚砜可以为市售品。作为市售品的例子，可列举出Sumika Excel 7600P、SumikaExcel 5900P(以上为住友化学株式会社制)等。
关于聚醚砜的对数粘度，从良好地形成多孔聚醚砜膜的大孔隙的观点出发，优选为0.5以上、更优选为0.55以上，从多孔聚醚砜膜的制造容易性的观点出发，优选为1.0以下、更优选为0.9以下、进一步优选为0.8以下、特别优选为0.75以下。
此外，从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点出发，PES多孔膜或作为其原料的聚醚砜的玻璃化转变温度优选为200℃以上、或观察不到明确的玻璃化转变温度。
本发明可使用的PES多孔膜的制造方法没有特别限定，可以通过例如下述方法来制造，所述方法包括如下工序：
将包含对数粘度为0.5～1.0的聚醚砜0.3质量％～60质量％和有机极性溶剂40质量％～99.7质量％的聚醚砜溶液流延成膜状，并使其浸渍于以聚醚砜的不良溶剂或非溶剂作为必须成分的凝固溶剂或与该凝固溶剂接触，从而制作具有空孔的凝固膜的工序；以及
对通过前述工序得到的具有空孔的凝固膜进行热处理而使前述空孔粗大化，从而得到PES多孔膜的工序，
前述热处理包括使前述具有空孔的凝固膜升温至前述聚醚砜的玻璃化转变温度以上或240℃以上。
本发明可使用的PES多孔膜优选具有表面层A、表面层B、以及夹在前述表面层A与前述表面层B之间的大孔隙层，
前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围且膜平面方向的平均孔径为10μm～500μm的多个大孔隙，
前述大孔隙层的分隔壁的厚度为0.1μm～50μm，
前述表面层A和B各自的厚度为0.1μm～50μm，
前述表面层A和B之中，一者具有平均孔径超过5μm且为200μm以下的多个细孔，且另一者具有平均孔径为0.01μm以上且小于200μm的多个细孔，
表面层A和表面层B中的一者的表面开口率为15％以上，另一个表面层的表面开口率为10％以上，
前述表面层A和前述表面层B的前述细孔与前述大孔隙连通，
前述PES多孔膜的总膜厚为5μm～500μm，且空孔率为50％～95％。
<<细胞培养模块>>
本说明书中，“细胞培养模块”是指可应用于细胞培养容器和细胞培养装置的细胞培养基材。
可使用本发明的细胞培养模块的细胞培养容器和细胞培养装置没有特别限定，可以用于例如市售的细胞培养容器和细胞培养装置。例如，可用于具备由挠性袋形成的培养容器的培养装置，可以在使其浮游在该培养容器内的状态下使用。此外，例如可以应用于转瓶等搅拌培养型容器来进行细胞培养。此外，作为培养容器，可应用于敞口容器也可应用于封闭容器。从例如细胞培养用的培养皿、烧瓶、塑料袋、试管到大型的罐均可适当利用。包括例如BD Falcon公司制的细胞培养皿(cell culture dish)、Thermo Scientific公司制的Nunc细胞工厂等。此外，经灭菌的瓶、例如CORNING公司制的贮藏瓶等单纯的柱状容器也可通过使用轨道摇床、程序摇床等振荡装置而有效地用作培养容器。此外，同样地，培养皿、烧瓶也可通过利用摇床而用作培养容器。
除了聚合物多孔膜之外，本发明的细胞培养模块的构成构件优选具有不会因通常的培养条件、例如搅拌培养、振荡培养条件中的培养液的活动而发生变形这一程度的强度，优选由非挠性原材料形成。此外，该构成构件优选由在细胞培养中不会对细胞的生长造成影响的原材料形成。作为这种材料，可列举出例如聚烯烃(例如聚乙烯、聚丙烯)、尼龙、聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等聚合物、不锈钢网、钛等金属，但不限定于此。
<细胞培养模块A>
本发明的细胞培养模块的一个方式是下述细胞培养模块，其具备：
顶部；
底部；
具有培养液流出流入口的侧部；
对由前述顶部、底部和侧部形成的空间进行分隔且具有培养液流出流入口的多个间隔部；以及
分别固定于选自顶部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、底部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、以及邻接的间隔部彼此之间的多个间隙空间中的2个以上的间隙空间的聚合物多孔膜，
此处，前述聚合物多孔膜具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在前述表面层A与表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于前述表面层A的孔的平均孔径小于存在于前述表面层B的孔的平均孔径，前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围的多个大孔隙，前述表面层A和B中的孔与前述大孔隙连通。以下也称为“细胞培养模块A”。
本发明的细胞培养模块中的“间隔部”是大致平面状。本发明的细胞培养模块中的“顶部”是指在相对于间隔部的延伸方向大致垂直方向的最上部存在的部分，其形状没有特别限定。本发明的细胞培养模块中的“底部”是指在相对于间隔部的延伸方向大致垂直方向的最下部存在的部分，其形状没有特别限定。本发明的细胞培养模块中，“侧部”是指除了顶部和底部之外的构成细胞培养模块周围的部分，其形状没有特别限定。
细胞培养模块A的顶部和底部可以具有培养液流出流入口。只要可对模块内部良好地供给培养液，则存在于顶部和底部的培养液流出流入口的数量和形状没有特别限定。此外，其大小只要不妨碍培养细胞和培养液的通过，就没有特别限定。优选顶部和底部分别具有多个培养液流出流入口。
细胞培养模块A的侧部具有培养液流出流入口。只要可对模块内部良好地供给培养液，则存在于侧部的培养液流出流入口的数量和形状没有特别限定。此外，其大小只要不妨碍培养细胞和培养液的通过，就没有特别限定。优选侧部具有多个培养液流出流入口。
细胞培养模块A的间隔部的数量没有特别限定，优选为2～50片，更优选为2～30片，进一步优选为2～20片，特别优选为2～10片。间隔部所具有的培养液流出流入口的数量和形状只要不妨碍培养液的良好移动，就没有特别限定。此外，其大小只要不妨碍培养细胞和培养液的通过，就没有特别限定。
聚合物多孔膜的固定于间隙空间的方法没有特别限定。例如，通过夹在顶部和与其邻接的间隔部之间、底部和与其邻接的间隔部之间、以及邻接的间隔部彼此之间来进行固定。此外，例如聚合物多孔膜的至少1处通过任意方法(例如基于粘接剂的粘接或使用夹具的固定)与形成该间隙空间的顶部、底部或间隔部中的至少1处进行固定。通过利用间隙空间来固定聚合物多孔膜，从而防止对该聚合物多孔膜内生长的细胞施加应力，细胞凋亡等受到抑制，能够稳定且大量地培养细胞。
聚合物多孔膜可以以任意形态固定于间隙空间。在一个实施方式中，聚合物多孔膜是多个聚合物多孔膜的层叠体。所层叠的聚合物多孔膜可以是小片，其形状可以为例如圆、椭圆形、四边形、三角形、多边形、绳状等任意形状。所层叠的聚合物多孔膜的小片优选为大致正方形。小片的尺寸可以采取任意的尺寸。小片为大致正方形时，其长度没有特别限定，例如为80mm以下、50mm以下、30mm以下、20mm以下或10mm以下。
固定于间隙空间的聚合物多孔膜为多个聚合物多孔膜的层叠体时，优选为2片以上、3片以上、4片以上或5片以上且100片以下、50片以下、40片以下、30片以下、20片以下、15片以下或10片以下的聚合物多孔膜的层叠体，更优选为3～100片的、更优选为5～50片的聚合物多孔膜的层叠体。
固定于间隙空间的聚合物多孔膜为多个聚合物多孔膜的层叠体时，可以在聚合物多孔膜与聚合物多孔膜之间设置垫板。通过设置垫板，从而能够对所层叠的聚合物多孔膜之间高效地供给培养液。垫板只要具有在所层叠的聚合物多孔膜之间形成任意的空间且高效地供给培养液的功能，就没有特别限定，可以使用例如具有筛网结构的平面结构体。垫板的材质可以使用例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、不锈钢制的筛网，但不限定于此。具备具有筛网结构的垫板时，只要具有能够对所层叠的聚合物多孔膜之间供给培养液这一程度的网孔即可，可适当选择。
一个实施方式中，固定于间隙空间的聚合物多孔膜可以不为平面状，而使将形状加工成立体状来使用。例如，可以将聚合物多孔膜i)折叠、ii)卷成卷状、iii)将片材或小片用丝状的结构体连接或者iv)连成绳状来使用。
细胞培养模块A的整体形状没有特别限定。通过变更构成顶部、底部、侧部和间隔部的构件的形状，从而能够制造各种整体形状的细胞培养模块。从培养时的搅拌容易性、制造容易性等观点出发，细胞培养模块A的整体形状优选为n棱柱形状(例如n＝3～6)、圆柱形状、旋转椭圆体形状、卵型形状、球形状，更优选为长方体形状、立方体形状或卵型形状。此外，细胞培养模块为n棱柱形状或圆柱形状时，为了缓和模块相互冲撞时的冲击、避免模块的破损，该模块的角可以进行倒角。
优选与固定有聚合物多孔膜的间隙空间邻接的间隙空间中的至少一者不含聚合物多孔膜。例如，在顶部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间固定有聚合物多孔膜的情况下，由于邻接的间隙空间仅为1个，因此该空间不含聚合物多孔膜。此外，在例如底部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间固定有聚合物多孔膜的情况下，由于邻接的间隙空间仅为1，因此该空间不含聚合物多孔膜。此外，在例如邻接的间隔部彼此之间的间隙空间固定有聚合物多孔膜的情况下，由于存在2个邻接的间隙空间，因此这两者不含聚合物多孔膜或者其中的一者不含聚合物多孔膜。不含聚合物多孔膜的间隙空间作为培养液通过用空隙而发挥功能。培养液从培养液流出流入口供给到存在于细胞培养模块A内部的培养液通过用空隙。供给至该培养液可通过用空隙的培养液穿过存在于间隔部的培养液流出流入口而高效地接触聚合物多孔膜。
为了在顶部和与其邻接的间隔部之间、底部和与其邻接的间隔部之间、以及邻接的间隔部彼此之间设置间隙空间，细胞培养模块A可以具备用于将顶部、间隔部和底部隔开一定距离地配置的配置单元。配置单元的形状没有特别限定，根据细胞培养模块的构成来适当决定。例如，可以是图3和4所示那样的设置于间隔部的、邻接的间隔部的载置台。此外，可以是例如在由底部和侧部形成的容器的侧部内壁设置的用于载置间隔部和顶部的载置台。此外，可以是例如用于将构成顶部、底部和间隔部的构件分别连接的(例如柱状的)连接构件。
图1～4示出细胞培养模块A的构成例。细胞培养模块1具备顶部2、底部3、侧部4、第一间隔部5和第二间隔部6。此外，在细胞培养模块1的顶部2与第一间隔部5之间、以及底部3与第二间隔部6之间夹设有聚合物多孔膜层叠体7a和7b。细胞培养模块1的顶部2、底部3、侧部4、第一间隔部5和第二间隔部6分别具有培养液流出流入口8a～8e。
第二间隔部6的上表面具备用于载置邻接的第一间隔部5的载置台9。载置台9作为用于将第一间隔部5与第二间隔部6隔开一定间隔地配置的配置单元而发挥功能。通过该载置台9，形成在第二间隔部6与第一间隔部5之间未配置聚合物多孔膜的间隙空间。该间隙空间作为培养液通过用空隙而发挥功能。从分别存在于顶部2、底部3和侧部4的培养液流出流入口向培养液通过用空隙供给的培养液能够通过分别存在于第一间隔部5和第二间隔部6的培养液流出流入口8而高效地接触聚合物多孔膜层叠体7a和7b。载置台的数量、位置和形状没有特别限定。载置台可以设置在邻接的第一间隔部5的下表面，用以代替设置在第二间隔部6的上表面。此外，载置台可以设置在由底部3和侧部4形成的容器的侧部内壁面。
细胞培养模块A具有长方体形状或立方体形状时，多个细胞培养模块可连接而形成细胞培养模块复合体。图5和6示出2个长方体形状的细胞培养模块连接而成的细胞培养模块复合体的构成例。图5和6的细胞培养模块复合体10通过准备2个图1～4所示的细胞培养模块1，并将一者的顶部与另一者的顶部连接来制造，具有立方体形状。图5和6的细胞培养模块复合体可以视作下述立方体形状的细胞培养模块，其具备：
具有培养液流出流入口的顶部；
具有培养液流出流入口的底部；
具有培养液流出流入口的侧部；
对由前述顶部、底部和侧部形成的空间进行分隔且具有培养液流出流入口的5个间隔部；以及
分别固定于选自顶部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、底部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、以及邻接的间隔部彼此之间的多个间隙空间中的4个间隙空间的聚合物多孔膜，
与固定有聚合物多孔膜的间隙空间邻接的间隙空间中的至少一者不含聚合物多孔膜。
因此，该细胞培养模块复合体可以视作细胞培养模块A的一个实施方式。
<细胞培养模块B>
一种细胞培养模块，其具备：
多个细胞培养亚模块；以及
用于层叠并收纳前述多个细胞培养亚模块且具有培养液流出流入口的细胞培养亚模块收纳用壳体，
此处，前述细胞培养亚模块具备：
聚合物多孔膜；以及
具有培养液流出流入口的聚合物多孔膜收纳用壳体，所述聚合物多孔膜收纳用壳体固定并收纳前述聚合物多孔膜，
前述聚合物多孔膜具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在前述表面层A与表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于前述表面层A的孔的平均孔径小于存在于前述表面层B的孔的平均孔径，前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围的多个大孔隙，前述表面层A和B中的孔与前述大孔隙连通。以下也称为“细胞培养模块B”。
通过在壳体内固定并收纳聚合物多孔膜，从而能够防止膜状的聚合物多孔膜的形态继续变形。由此，防止对在聚合物多孔膜内生长的细胞施加应力，细胞凋亡等受到抑制，能够稳定地培养大量的细胞。向聚合物多孔膜收纳用壳体内固定聚合物多孔膜的方法没有特别限定。例如，通过夹持在壳体的顶部与底部之间来进行固定。此外，例如聚合物多孔膜的至少1处利用任意方法(例如基于粘接剂的粘接或使用了夹具的固定)与该壳体内的至少1处进行固定。
收纳至壳体内的聚合物多孔膜的形态没有特别限定。一个实施方式中，聚合物多孔膜为多个聚合物多孔膜的层叠体。所层叠的聚合物多孔膜可以是小片，其形状可以是例如圆、椭圆形、四边形、三角形、多边形、绳状等任意形状。所层叠的聚合物多孔膜的小片优选为大致正方形。小片的尺寸可以采取任意的尺寸。小片为大致正方形时，其长度没有特别限定，例如为80mm以下、50mm以下、30mm以下、20mm以下或10mm以下。
收纳至壳体内的聚合物多孔膜为多个聚合物多孔膜的层叠体时，优选为2片以上、3片以上、4片以上或5片以上且100片以下、50片以下、40片以下、30片以下、20片以下、15片以下或10片以下的聚合物多孔膜的层叠体，更优选为3～100片的、特别优选为5～50片的聚合物多孔膜的层叠体。在该层叠体中，可以在聚合物多孔膜与聚合物多孔膜之间设置垫板。通过设置垫板，能够对所层叠的聚合物多孔膜之间有效地供给培养液。垫板只要具有在所层叠的聚合物多孔膜之间形成任意的空间且有效地供给培养液的功能，就没有特别限定，可以使用例如具有筛网结构的平面结构体。垫板的材质可以使用例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、不锈钢制的筛网，但不限定于此。具备具有筛网结构的垫板时，只要具有能够对所层叠的聚合物多孔膜之间供给培养液这一程度的网孔即可，可适当选择。
一个实施方式中，收纳至壳体内的聚合物多孔膜可以不为平面状，而是将形状加工成立体状来使用。例如，可以将聚合物多孔膜i)折叠、ii)卷成卷状、iii)将片材或小片用丝状的结构体连接或者iv)连成绳状来使用。
收纳聚合物多孔膜的聚合物多孔膜收纳用壳体具有培养液流出流入口。通过该流出流入口，细胞培养液被供向壳体的内部且排出至外部。该培养液流出流入口的数量和形状没有特别限定。此外，其尺寸只要不妨碍培养细胞和培养液的通过，就没有特别限定。
聚合物多孔膜收纳用壳体中的培养液流出流入口可以为筛网状的结构。此外，收纳聚合物多孔膜的壳体自身可以为筛网状。筛网形状的结构是指：具有例如纵格、横格和/或斜格状结构，且以流体能够通过各网孔的程度形成培养液流出流入口，但不限定于此。
在细胞培养模块B中，多个细胞培养亚模块被收纳至细胞培养亚模块收纳用壳体中。细胞培养亚模块优选层叠2个以上、3个以上、4个以上或5个以上且30个以下、15个以下、10个以下，更优选层叠2～15个、特别优选层叠3～10个。
细胞培养亚模块收纳用壳体具有培养液流出流入口。通过该流出流入口，细胞培养液被供向壳体的内部且排出至外部。该培养液流出流入口的数量和形状没有特别限定。此外，其尺寸只要不妨碍培养细胞和培养液的通过，就没有特别限定。细胞培养亚模块收纳用壳体优选具有多个培养液流出流入口。
细胞培养模块B优选在所层叠的前述多个细胞培养亚模块与细胞培养亚模块收纳用壳体之间具有间隙空间。该间隙空间作为培养液通过用空隙而发挥功能。培养液从存在于细胞培养亚模块收纳用壳体的培养液流出流入口供给到存在于细胞培养模块B内部的培养液通过用空隙。供给至该培养液通过用空隙的培养液可通过存在于聚合物多孔膜收纳用壳体的培养液流出流入口而与聚合物多孔膜高效地接触。
图7和8示出细胞培养模块B的构成例。在细胞培养模块20中，层叠有细胞培养亚模块30。该层叠体被收纳至细胞培养亚模块收纳用壳体21内。该层叠体被夹持在细胞培养亚模块收纳用壳体21的顶部与底部之间。细胞培养亚模块收纳用壳体21在其顶部和侧部具有培养液流出流入口8f和8g。需要说明的是，虽未图示，但细胞培养亚模块收纳用壳体21在其底部也具有培养液流出流入口。如图8所示那样，在所层叠的多个细胞培养亚模块30与细胞培养亚模块收纳用壳体21之间存在间隙空间22。该间隙空间作为培养液通过用空隙而发挥功能。
图9和10示出在图7和8中示出的细胞培养模块20的构成要素、即细胞培养亚模块的构成例。其具有六片一组的正方形的聚合物多孔膜层叠体7c、7d和7e，在聚合物多孔膜层叠体7c与7d之间以及聚合物多孔膜层叠体7d与7e之间，垫板32a和32b分别被收纳至聚合物多孔膜收纳用壳体31内。聚合物多孔膜收纳用壳体31的上表面具有多个培养液流出流入口8h。需要说明的是，在下表面也同样地具有培养液流出流入口。图9和10所示的细胞培养亚模块通过在2片平板基材之间夹持聚合物膜的层叠体后，固定该平板基材的周围端部来制造。
图1～8所示的本发明的细胞培养模块具有液体在模块内部中的优异的流通性，能够向收纳至该模块内的聚合物多孔膜良好地供给氧气和营养。此外，模块整体具有高浮游力，能够高效地搅拌多个模块。此外，能够对模块内部的聚合物多孔膜应用均质的培养条件。进而，由于聚合物多孔膜被固定，因此，防止对在聚合物多孔膜内生长的细胞施加应力，细胞凋亡等受到抑制，能够稳定地培养大量的细胞。此外，本发明的细胞培养模块具有高强度，对于长期细胞培养和基于培养细胞的长期连续的物质产生而言是有利的。
本说明书中提及的全部文献整体通过引用而援引至本说明书中。
以下说明的本发明的实施例的目的仅在于例示，不对本发明的技术范围作出限定。本发明的技术范围仅受到权利要求书的记载的限定。以不超脱本发明主旨作为条件，可以进行本发明的变更、例如本发明的构成要件的追加、删除和置换。
实施例
以下实施例中使用的聚酰亚胺多孔膜通过如下方法制备：将包含由作为四羧酸成分的3,3’,4,4’-联苯四甲酸二酐(s-BPDA)和作为二胺成分的4,4’-二氨基二苯基醚(ODA)得到的聚酰胺酸溶液以及作为着色前体的聚丙烯酰胺的聚酰胺酸溶液组合物成形后，在250℃以上进行热处理。所得聚酰亚胺多孔膜具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在该表面层A和表面层B之间的大孔隙层的三层结构，存在于表面层A的孔的平均孔径为19μm，存在于表面层B的孔的平均孔径为42μm，膜厚为25μm，空孔率为74％。
实施例1
使用了细胞培养模块复合体10的细胞培养
使用图5和6所示的细胞培养模块复合体10，进行细胞培养。准备2个图1～4所示的细胞培养模块1，使各自的顶部相对，通过焊接将其热熔接并连接，从而制备立方体形状的细胞培养模块复合体10。本实施例中使用的聚酰亚胺多孔膜的尺寸为1.4cm×1.4cm。细胞培养模块复合体10具有4个十片一组的聚酰亚胺多孔膜层叠体，其总面积为80cm2。将细胞培养模块复合体10用稀释后的MILTON溶液(KYORIN PHARM公司制)、超纯水、含70％乙醇的水进行清洗，灭菌干燥后再行使用。
在培养基(BalanCD(商标)CHO Growth A)中浮游培养对抗人IL-8抗体产生CHO-DP12细胞(ATCC CRL-12445)进行了驯化/浮游化而得的细胞，继续培养至每1ml的活细胞数成为3.51×106cells/ml(总细胞数为3.83×106cells/ml、活细胞率为92％)为止。
向内容积150ml的瓶型灭菌容器(CORNING公司制)中添加3个细胞培养模块复合体10，向其中添加CHO细胞单层培养用培养基KBM270(KOHJIN-BIO公司制)53.3ml，在CO2培养箱内使用程序摇床(KENIS公司制)以35rpm的振荡速度浸渍10分钟。添加CHO DP-12浮游细胞培养液(总细胞数为3.83×106cells/ml、活细胞数为3.51×106cells/ml、死细胞数为3.23×105cells/ml、活细胞率为92％)4.0mL与浮游细胞用培养基(BalanCD(商标)CHOGrowth A)22.6mL的混合液，使用程序摇床(KENIS公司制)以35rpm的旋转条件使细胞吸附约14小时(每1张片材的设想平均细胞吸附数为5.30×104cells)。由回收的培养基算出的细胞吸附率为95％。
其后去除培养基，添加CHO细胞单层培养用培养基KBM270(KOHJIN-BIO公司制)40ml并开始培养。自开始培养3天后，将容器转移至电磁式轨道摇床(CO2培养箱用、AS-ONE公司制)中，以200rpm的振荡速度继续培养。每天进行培养基的更换，使用Cedex Bio(ROCHE-DIAGNOSTICS公司制)测定培养基中的每一天的葡萄糖消耗量、乳酸产生量、乳酸脱氢酶量和抗体产生量。确认到葡萄糖经时性地被消耗，并持续性地产生抗体和乳酸。将培养开始时3天内的葡萄糖消耗量和乳酸产生量示于表1。确认到稳定地进行了培养。
[表1]
表1
Figure BDA0002598695220000251
实施例2
使用了细胞培养模块20的细胞培养
使用图7和8所示的细胞培养模块20，进行细胞培养。细胞培养模块20用经稀释的MILTON溶液(KYORIN PHARM公司制)、超纯水、含70％乙醇的水进行清洗，并灭菌干燥后再使用。需要说明的是，本实施例所使用的细胞培养模块20中使用的聚酰亚胺多孔膜的尺寸为1.0cm×1.0cm。准备3组将该聚酰亚胺多孔膜制成6片1组的层叠体，在各自之间夹持垫板。本实施例所使用的细胞培养模块20中的聚酰亚胺多孔膜的总片数为108片，总面积为108cm2。在本实施例中使用了5个细胞培养模块20，因此，聚酰亚胺多孔膜的总片数为540片，总面积为540cm2。所使用的细胞培养模块20的细胞培养亚模块收纳用壳体和聚合物多孔膜收纳用壳体的材质均为聚烯烃系树脂。此外，所使用的垫板为NBC MESHTEC公司制的筛网。
使用培养基(BalanCD(商标)CHO Growth A)，对使抗人IL-8抗体产生CHO-DP12细胞(ATCC CRL-12445)进行了驯化/浮游化的细胞进行浮游培养，继续培养至每1ml的活细胞数成为5.41×106cells/ml(总细胞数为6.16×106cells/ml、活细胞率为88％)为止。
向内容积150ml的瓶型灭菌容器(CORNING公司制)中添加5个经灭菌的细胞培养模块20，向其中添加CHO细胞单层培养用培养基KBM270(KOHJIN-BIO公司制)26.7ml，在CO2培养箱内使用程序摇床(KENIS公司制)，以35rpm的振荡速度浸渍10分钟。其后，添加CHO DP-12浮游细胞培养液(总细胞数为6.16×106cells/ml、活细胞数为5.41×106cells/ml、死细胞数为7.51×105cells/ml、活细胞率为88％)6.0mL与浮游细胞用培养基(BalanCD(商标)CHO Growth A)7.3mL的混合液，使用程序摇床(KENIS公司制)，以35rpm的旋转条件使细胞吸附约14小时(每1张片材的细胞吸附数为5.30×104cells)。由所回收的培养基算出的细胞吸附率为88％。
其后去除培养基，添加CHO细胞单层培养用培养基KBM270(KOHJIN-BIO公司制)40ml来开始培养。自开始培养2天后，将容器转移至电磁式轨道摇床(CO2培养箱用、AS-ONE公司制)中，以200rpm的振荡速度继续培养。每天进行培养基的更换，使用Cedex Bio(ROCHE-DIAGNOSTICS公司制)测定培养基中的每一天的葡萄糖消耗量、乳酸产生量、乳酸脱氢酶量和抗体产生量。确认到葡萄糖经时性地被消耗，并持续性地产生抗体和乳酸。将抗体产生量的经时变化示于图11。
比较例1
准备30个图9和10所示的细胞培养亚模块30，并进行灭菌。聚酰亚胺多孔膜的总片数为540片，总面积为540cm2。向填充有该亚模块的150mL贮藏瓶(CORNING公司制)中添加CHO细胞单层培养用培养基KBM270(KOHJIN-BIO公司制)26.7mL，在CO2培养箱内使用程序摇床(KENIS公司制)以35rpm的旋转条件浸渍10分钟。添加CHO DP-12浮游细胞培养液(总细胞数为6.16×106cells/ml、活细胞数为5.41×106cells/ml、死细胞数为7.51×105cells/ml、活细胞率为88％)6.0mL与浮游细胞用培养基(BalanCD(商标)CHO Growth A)7.3mL的混合液，以35rpm的旋转条件使细胞吸附约14小时(每1张片材的细胞吸附数为5.83×104cells)。根据由回收培养基发现的细胞数量算出的细胞吸附率为97％。每天进行培养基的更换，使用Cedex Bio(roche-diagnostics公司制)测定培养基中的每一天的葡萄糖消耗量、乳酸产生量、乳酸脱氢酶量和抗体产生量(图11)。抗体产生量在使用细胞培养模块时(实施例2)更高。
比较例2
使用培养基(BalanCD(商标)CHO GROWTH A)，对使抗人IL-8抗体产生CHO-DP12细胞(ATCC CRL-12445)进行了驯化/浮游化而得的细胞进行浮游培养，继续培养至每1ml的细胞数成为2.0×106为止。
准备制成0.3cm×2.5cm的细长形状的聚酰亚胺多孔膜并进行干热灭菌后，在20cm2的培养皿内设置11～12片，加注上述浮游培养液4ml，使聚酰亚胺多孔膜被细胞悬浮液充分润湿后，放置在CO2培养箱内。2小时后，将培养皿从培养箱中取出，抽吸去除细胞悬浮液后，添加培养基(添加有2％FBS的IMDM)4ml，进而在CO2培养箱内继续培养。培养基以两天一次的速度进行更换。
自开始培养起7天后，使用CCK8(Cell Countinig Kit8；同仁化学研究所制的溶液试剂)，以单位面积的细胞数的形式算出所培养的3片培养皿内的聚酰亚胺多孔膜上的细胞数。翌日，将3个培养皿内的1个保持原样进一步继续培养2天(以下称为“培养1”)。
针对剩余2个培养皿之中的1个，将发生了细胞生长的聚酰亚胺多孔膜与培养液一同转移至透氧型培养袋(NIPRO公司制)中，用热封器进行灭菌性密封。其后，用设置在CO2培养箱内的摇床进行1分钟发生20～30次摇动的设定，实施2天的振荡培养(以下称为“培养2”)。
进而，将剩余的1个培养皿中包含的聚酰亚胺多孔膜用剪刀灭菌性地剪碎成约0.3cm×0.3cm的细片。其后，准备尺寸为1cm×1cm左右的30#尼龙筛网的外套，在其中收纳所剪碎的聚酰亚胺多孔膜，用热封器灭菌性地密闭。将所得细胞培养模块与培养基一同转移至透氧型培养袋(NIPRO公司制)中，用热封器灭菌性地密闭。其后，用设置在CO2培养箱内的摇床进行1分钟发生20～30次摇动的设定，实施2天的振荡培养(以下称为“培养3”)。
使用CCK8算出实施培养1～3后的细胞密度。将结果示于表2。在以不固定聚酰亚胺多孔膜的方式进行振荡培养的培养2中，观察到细胞数的显著减少。可认为这是因为：由于聚酰亚胺多孔膜的形态持续变形，因此，对在聚酰亚胺多孔膜内生长的细胞施加应力，细胞显示细胞凋亡等。另一方面，在聚酰亚胺多孔膜被收纳在外套内并固定的状态下进行振荡培养的培养3中，在培养2中观察到的细胞数的减少受到抑制。
[表2]
表2
Figure BDA0002598695220000281
产业上的可利用性
本发明的细胞培养模块可适合地用于稳定的细胞培养和物质产生。
附图标记说明
1 细胞培养模块
2 顶部
3 底部
4 侧部
5 第一间隔部
6 第二间隔部
7a～7e 聚合物多孔膜层叠体
8a～8h 培养液流出流入口
9 载置台
10 细胞培养模块复合体
20 细胞培养模块
21 细胞培养亚模块收纳用壳体
22 间隙空间
30 细胞培养亚模块
31 聚合物多孔膜收纳用壳体
32a、32b 垫板

Claims (15)

1.一种细胞培养模块，其具备：
顶部；
底部；
具有培养液流出流入口的侧部；
对由所述顶部、底部和侧部形成的空间进行分隔且具有培养液流出流入口的多个间隔部；以及
分别固定于选自顶部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、底部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、以及邻接的间隔部彼此之间的多个间隙空间中的2个以上的间隙空间的聚合物多孔膜，
此处，所述聚合物多孔膜具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在所述表面层A与表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于所述表面层A的孔的平均孔径小于存在于所述表面层B的孔的平均孔径，所述大孔隙层具有与所述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及所述表面层A和B包围的多个大孔隙，所述表面层A和B中的孔与所述大孔隙连通。
2.根据权利要求1所述的细胞培养模块，其中，与固定有聚合物多孔膜的间隙空间邻接的间隙空间中的至少一者不含聚合物多孔膜。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养模块，其中，在选自顶部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、底部和与其邻接的间隔部之间的间隙空间、以及邻接的间隔部彼此之间的多个间隙空间中的2个以上的间隙空间分别层叠配置有3～100片聚合物多孔膜。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞培养模块，其中，所述聚合物多孔膜为聚酰亚胺多孔膜。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞培养模块，其中，所述聚合物多孔膜为聚醚砜多孔膜。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞培养模块，其中，所述顶部和底部具有培养液流出流入口。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞培养模块，其具有长方体形状。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞培养模块，其具有立方体形状。
9.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞培养模块，其具有卵形状。
10.一种细胞培养模块复合体，其是多个权利要求7或8所述的细胞培养模块连接而成的。
11.一种细胞培养模块，其具备：
多个细胞培养亚模块；以及
用于层叠并收纳所述多个细胞培养亚模块且具有培养液流出流入口的细胞培养亚模块收容用壳体，
此处，所述细胞培养亚模块具备：
聚合物多孔膜；以及
具有培养液流出流入口的聚合物多孔膜收容用壳体，所述聚合物多孔膜收容用壳体固定并收纳所述聚合物多孔膜，
所述聚合物多孔膜具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在所述表面层A与表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于所述表面层A的孔的平均孔径小于存在于所述表面层B的孔的平均孔径，所述大孔隙层具有与所述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及所述表面层A和B包围的多个大孔隙，所述表面层A和B中的孔与所述大孔隙连通。
12.根据权利要求11所述的细胞培养模块，其中，在层叠的所述多个细胞培养亚模块与细胞培养亚模块收容用壳体之间具有间隙空间。
13.根据权利要求11或12所述的细胞培养模块，其中，在所述聚合物多孔膜收容用壳体中层叠并收纳有3～100片聚合物多孔膜。
14.根据权利要求11～13中任一项所述的细胞培养模块，其中，所述聚合物多孔膜为聚酰亚胺多孔膜。
15.根据权利要求11～13中任一项所述的细胞培养模块，其中，所述聚合物多孔膜为聚醚砜多孔膜。
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