CN109715785A - 抑制干细胞的分化的方法、调制干细胞的方法、及分化诱导干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抑制干细胞的分化的方法，包括(1)将上述干细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及(2)培养上述干细胞，使增殖的工序，其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通。

Description

抑制干细胞的分化的方法、调制干细胞的方法、及分化诱导干 细胞的方法

【技术领域】

本发明涉及抑制干细胞的分化的方法、调制干细胞的方法、及分化诱导干细胞的方法。

【背景技术】

【对于干细胞的分化抑制】

再生医疗的重要度加速增加之中，干细胞的发挥的作用变得日益重要。例如，在实施自身细胞移植时大量的干细胞变得必要。但是知，在使增殖的过程中干细胞容易地自发地分化，难以一边维持未分化性，一边培养。

报告了使用固定或包被在表面含属于钙粘素家族的蛋白质或属于钙粘素家族的蛋白质全部或一部分的区域的融合蛋白质、及有糖侧链的聚合物的细胞培养基材而一边抑制分化一边培养干细胞的方法(专利文献1)。

另外报告了，使用中空丝而一边抑制分化一边培养干细胞的方法(专利文献2及3)。

【聚酰亚胺多孔质膜】

聚酰亚胺多孔质膜在本申请前就用于滤器、低介电常数膜、燃料电池用电解质膜等，特别是以电池关系作为中心的用途。专利文献4～6特别记载了尽管气体等的物质透过性优良，空孔率高的两表面的平滑性优良，相对强度高、高空孔率，有多数对于向膜厚度方向的压缩应力的耐力优良的大空隙的聚酰亚胺多孔质膜。这些均是经由酰胺酸而制成的聚酰亚胺多孔质膜。

报告了包括将细胞应用于聚酰亚胺多孔质膜而进行培养的细胞的培养方法(专利文献7)。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：特开2013-126405号公报

专利文献2：特开2014-60991号公报

专利文献3：特开2016-7207号公报

专利文献4：WO2010/038873

专利文献5：特开2011-219585号公报

专利文献6：特开2011-219586号公报

专利文献7：WO2015/012415

【发明的概要】

【发明要解决的课题】

本发明旨在提供使用与以往完全不同的手段而抑制干细胞的分化，能大量地供给所述干细胞的方法。

【用于解决课题的手段】

本发明人鉴于上述课题，锐意探讨的结果，发现通过在有具有多个孔的2个表面层和夹在所述2个表面层之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜上培养干细胞，令人惊讶地，可抑制干细胞的分化，从而完成本发明。

即本发明有以下的实施方式。

[1]抑制干细胞的分化的方法，其包括：

(1)将上述干细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及

(2)培养上述干细胞，使增殖的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通。

[2]上述细胞是ES细胞、EC细胞、EG细胞、核移植ES细胞、ntES细胞、iPS细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、皮肤干细胞、骨髓干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、***、II型肺胞上皮细胞、脂肪干细胞、齿髓干细胞、脱分化脂肪细胞或MUSE细胞的，[1]中所述的方法。

[3][1]或[2]中所述的方法，其中实施上述工序(2)至少30天。

[4]在上述工序(2)中，使细胞增殖至每1平方厘米聚合物多孔质膜达1.0×10⁵个以上的，[1]～[3]之任一项所述的方法。

[5]使2个以上的聚合物多孔质膜上下或左右积层到细胞培养基中而使用的，[1]～[4]之任一项所述的方法。

[6]将上述聚酰亚胺多孔质膜

(i)折叠，

(ii)卷成轮状，

(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者，

(iv)连接成绳状

而在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定而使用的，[1]～[5]之任一项所述的方法。

[7]在工序(2)中，聚酰亚胺多孔质膜的一部分或整体不与细胞培养基的液相接触的，[1]～[6]之任一项所述的方法。

[8]在工序(2)中，细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积含细胞生存域的聚酰亚胺多孔质膜体积的总和的10000倍或比其少的，[1]～[7]之任一项所述的方法。

[9]上述表面层A的平均孔径是0.01～50μm的，[1]～[8]之任一项所述的方法。

[10]上述表面层B的平均孔径是20～100μm的，[1]～[9]之任一项所述的方法。

[11]上述聚合物多孔质膜的膜厚是5～500μm的，[1]～[10]之任一项所述的方法。

[12]上述聚合物多孔质膜是聚酰亚胺多孔质膜的，[1]～[11]之任一项所述的方法。

[13]聚酰亚胺多孔质膜是含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的，聚酰亚胺多孔质膜的，[12]中所述的方法。

[14]聚酰亚胺多孔质膜是通过使从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和含着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜的，[12]或[13]中所述的方法。

[15]上述聚合物多孔质膜是聚醚砜多孔质膜的，[1]～[11]之任一项所述的方法。

[16]调制干细胞的方法，其包括：

(1)将上述干细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及

(2)培养上述干细胞，使增殖的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通，

在上述工序(2)中上述干细胞的分化被抑制。

[17]分化诱导干细胞的方法，其包括：

(1)将上述干细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、

(2)培养上述干细胞，使增殖的工序、及

(3)将培养的上述干细胞在分化诱导条件下培养的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通，

在上述工序(2)中上述干细胞的分化被抑制。

【发明的效果】

根据本发明，可抑制干细胞的分化，大量地供给所述细胞。

【附图的简单的说明】

【图1】图1显示使用聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养的模型图。

【图2】图2显示细胞培养装置的一例。

【图3】图3显示将人间充质干细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养之后的基因解析结果。图中，实线是部件培养3天、70天及182天的细胞样品的结果。虚线是通常培养3天、70天及118天的细胞样品的结果。

【图4】图4显示将人间充质干细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养6天后，13天向脂肪细胞分化诱导，用Oil red O染色时的荧光显微镜照片。

【图5】图5显示将人间充质干细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养182天后，15天向脂肪细胞分化诱导，用BODIPY染色时的荧光显微镜照片。

【图6】图6显示使用或不使用聚酰亚胺多孔质膜而培养人间充质干细胞时的细胞数的经时变化。

【图7】图7显示将人间充质干细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养时的细胞数的经时变化。

【图8】图8显示将人间充质干细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养125天后，10天分化诱导，用BODIPY染色时的荧光显微镜照片。

【图9】图9显示将人间充质干细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养时的细胞数的经时变化。

【图10】图10显示在聚酰亚胺多孔质膜上的培养开始后第15天、第30天及第150天的人间充质干细胞的荧光显微镜照片。

【图11】图11显示将植活人间充质干细胞的聚酰亚胺多孔质膜***固定的试样的电子显微镜图像。

【图12】图12显示将植活人间充质干细胞的聚酰亚胺多孔质膜***固定的试样的荧光显微镜图像。

【图13】图13显示将人间充质干细胞用聚酰亚胺多孔质膜长期间培养时的细胞数的经时变化。

【图14】图14显示将人间充质干细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养463天后，26天向脂肪细胞分化诱导，用BODIPY染色时的荧光显微镜照片。

【图15】图15显示将人间充质干细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养490天后，26天向成骨细胞分化诱导，其后钙化诱导的试样的光学显微镜图像。

【图16A】图16A显示将人间充质干细胞用聚酰亚胺多孔质膜长期培养之后的基因解析结果。

【图16B】图16B显示将人间充质干细胞用聚酰亚胺多孔质膜长期培养之后的基因解析结果。

【图17】图17显示将人II型肺胞上皮细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养时的细胞数的经时变化。

【图18】图18显示将人II型肺胞上皮细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养之后的基因解析结果。

【图19】图19是对培养第22天的人II型肺胞上皮细胞进行免疫染色的照片。DAPI：青、Pro SP-C：绿、平足蛋白：红。

【图20】图20显示将人II型肺胞上皮细胞用聚酰亚胺多孔质膜长期间培养时的细胞数的经时变化。

【图21】图21显示培养用不同的细胞接种法接种到聚酰亚胺多孔质膜上的人II型肺胞上皮细胞时的细胞数的经时变化。

【图22】图22显示将人II型肺胞上皮细胞用聚酰亚胺多孔质膜长期培养之后的基因解析结果。

【具体实施方式】

本发明的一实施方式涉及抑制干细胞的分化的方法，其包括：

(1)将上述干细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及

(2)培养上述干细胞，使增殖的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通。以下也称为“本发明的分化抑制方法”。

另外，本发明的别的实施方式涉及调制干细胞的方法，其包括：

(1)将上述干细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及

(2)培养上述干细胞，使增殖的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通，

在上述工序(2)中上述干细胞的分化被抑制。以下也称为“本发明的干细胞调制方法”。

另外，本发明的别的实施方式涉及分化诱导干细胞的方法，其包括：

(1)将上述干细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、

(2)培养上述干细胞，使增殖的工序、及

(3)将培养的上述干细胞在分化诱导条件下培养的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通，

在上述工序(2)中上述干细胞的分化被抑制。以下也称为“本发明的分化诱导方法”。

以下也将“本发明的分化抑制方法”、“本发明的干细胞调制方法”及“本发明的分化诱导方法”称为“本发明的方法”。

1.对于在本发明的方法中使用的干细胞

在本说明书中“干细胞”是指具有***而制作(self-renewal)与自身相同的细胞的能力(自身复制能)和分化为别的种类的细胞的能力的细胞。近年，能以直接－重编程等的方法将最终分化细胞直接诱导为别的最终分化细胞，在本说明书中的“干细胞”不含最终分化细胞。干细胞可由以下的分化能力的差异分类。

(1)多能性

在本说明书中，“多能性”(pluripotency)是指可分化为属于三胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的细胞系列的全部的能力。例如，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、胚性肿瘤细胞(EC细胞)、胚性生殖干细胞(EG细胞)、核移植ES细胞、体细胞来源ES细胞(ntES细胞)、人工多能性干细胞(iPS细胞)、MUSE细胞(多系分化应激耐受细胞，Multi-lineagedifferentiating Stress Enduring cell)，但不限于这些。

(2)多分化能性

在本说明书中，“多分化能性”(multipotency)是指虽然能分化的细胞系列被限定，但能向多样的细胞种分化的能力。一般而言，无法进行超胚层的分化，但也有例外。多分化能性是组织干细胞(在生物的体内见到的不最终分化的细胞)等所具有的分化能力。例如，可举出造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、皮肤干细胞、齿髓干细胞、脂肪干细胞、脱分化脂肪细胞，但不限于这些。

(3)寡能性

在本说明书中，“寡能性”(oligopotentcy)是指能仅分化为数种细胞种的能力。有寡能性的细胞也有称为前体细胞的情况，在本说明书中包括在干细胞内。例如，可举出骨髓干细胞，但不限于此。

(4)单分化能性

在本说明书中，“单分化能性”(unipotency)是指能分化的细胞种限定于一种的分化能力。有单分化能性的细胞也有称为前体细胞的情况，在本说明书中包括在干细胞内。可作为干细胞***增殖，或分化而变成别的(干细胞以外的)细胞种。例如，可举出肌干细胞、生殖干细胞、***、II型肺胞上皮细胞，但不限于这些。

作为在本发明的方法中使用的干细胞，优选为ES细胞、EC细胞、EG细胞、核移植ES细胞、ntES细胞、iPS细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、皮肤干细胞、骨髓干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、***或II型肺胞上皮细胞，更优选为间充质干细胞或II型肺胞上皮细胞。

可在本发明中利用的干细胞的种类不特别限定，优选为哺乳动物的干细胞，更优选为灵长类(人、猴等)、啮齿类(小鼠、大鼠、豚鼠等)、猫、狗、兔、绵羊、猪、牛、马、驴、山羊或雪貂的干细胞，特别优选为人的干细胞。

2.对于向聚合物多孔质膜应用在本发明中使用的干细胞的工序

向本发明中使用的干细胞的聚合物多孔质膜的应用的具体性的工序不特别限定。能采用本说明书记载的工序、或者，适宜于将干细胞应用于膜状的载体的任意的方法。虽不限定，但在本发明的方法中，向干细胞的聚合物多孔质膜的应用例如，含如下所述的实施方式。

(A)包括向上述聚合物多孔质膜的表面接种干细胞的工序的实施方式；

(B)包括如下工序的实施方式：

向上述聚合物多孔质膜的干燥的表面加载干细胞悬浮液，

放置，或移动上述聚合物多孔质膜而促进液的流出，或刺激表面的一部分而向上述膜吸入干细胞悬浮液，进而，

在上述膜内蓄积干细胞悬浮液中的干细胞，使水分流出；以及，

(C)包括如下工序的实施方式：

将上述聚合物多孔质膜的一面或两面用细胞培养液或灭菌的液体湿润，

向上述湿润的聚合物多孔质膜装填干细胞悬浮液，进而，

在上述膜内蓄积干细胞悬浮液中的干细胞，使水分流出。

(A)的实施方式含向聚合物多孔质膜的表面直接接种细胞、细胞块。或者，也包括向干细胞悬浮液中放入聚合物多孔质膜，从膜的表面浸润细胞培养液的实施方式。

接种到聚合物多孔质膜的表面上的干细胞接附在聚合物多孔质膜上，放入到多孔的内部。优选为即使不特别从外部加物理的或化学的力，干细胞也自发接附在聚合物多孔质膜上。接种到聚合物多孔质膜的表面上的干细胞能在膜的表面和/或内部稳定而生长－增殖。干细胞对应于生长－增殖的膜的位置而可取各种不同的形态。

在(B)的实施方式中，向聚合物多孔质膜的干燥的表面加载干细胞悬浮液。通过放置聚合物多孔质膜，或移动上述聚合物多孔质膜而促进液的流出，或刺激表面的一部分而向上述膜吸入干细胞悬浮液，干细胞悬浮液渗透到膜中。不被理论束缚，这被认为是因来源于聚合物多孔质膜的各表面形状等的性质导致的。由本实施方式，向装填了膜的干细胞悬浮液的位置吸入接种干细胞。

或者，也可如(C)的实施方式一样，将上述聚合物多孔质膜的一面或两面的部分或整体用细胞培养液或灭菌的液体湿润后向湿润的聚合物多孔质膜装填干细胞悬浮液。此时，干细胞悬浮液的通过速度大提升。

例如，可使用以膜的飞散防止作为主目的而使膜极一部分湿润的方法(之后，将其记作“一分湿法”)。一分湿法大致接近实质上不使膜湿润的干法((B)的实施方式)。但是，认为对于湿润的小部分而细胞液的膜透过变得迅速。另外，也可使用向一面或两面的整体被充分地湿润的聚合物多孔质膜(之后，将其记作“湿膜”)装填干细胞悬浮液的方法(之后，将其记作“湿膜法”)。此时，在聚合物多孔质膜的整体中，干细胞悬浮液的通过速度大提升。

在(B)及(C)的实施方式中，在上述膜内蓄积干细胞悬浮液中的干细胞，使水分流出。由此浓缩干细胞悬浮液中的干细胞的浓度，使干细胞以外的不要的成分与水分一同流出的，等的处理也变得可能。

(A)的实施方式有时称为“自然播种”，(B)及(C)的实施方式有时称为“吸入播种”。

虽不限定，但优选在聚合物多孔质膜中活细胞选择性地停留。从而，在本发明的方法的优选的实施方式中，活细胞停留在上述聚合物多孔质膜内，死细胞优先与水分一同流出。

在实施方式(C)中使用的灭菌的液体不特别限定，是被灭菌的缓冲液或灭菌水。缓冲液是例如，(+)及(-)Dulbecco’s PBS、(+)及(-)Hank's Balanced Salt Solution等。缓冲液的例示于以下的表1。

【表1】

成分	浓度(mmol/L)	浓度(g/L)
			NaCl	137	8.00
KCl	2.7	0.20
			Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	10	1.44
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	1.76	0.24
			pH(-)	7.4	7.4

再者，在本发明的方法中，也包括向干细胞的聚合物多孔质膜的应用通过将处于悬浮状态的干细胞与聚合物多孔质膜悬浮共存而使干细胞附着在膜上的实施方式(涂抹)。例如，在本发明的方法中，为了将干细胞应用于聚合物多孔质膜，也可向细胞培养容器中放入细胞培养基、干细胞及1或其以上的上述聚合物多孔质膜。在细胞培养基是液体的情况中，聚合物多孔质膜悬浮于细胞培养基中的状态。从聚合物多孔质膜的性质，干细胞可接附在聚合物多孔质膜上。从而，即使是不先天适宜于悬浮培养的干细胞，也能在聚合物多孔质膜悬浮于细胞培养基中的状态下培养。优选为干细胞自发接附在聚合物多孔质膜上。“自发接附”是指即使不特别从外部加物理的或化学的力，干细胞也停留在聚合物多孔质膜的表面或内部。

向上述的干细胞的聚合物多孔质膜的应用也可组合2种或比其多的方法而使用。例如，实施方式(A)～(C)之中，也可组合2个以上的方法而向聚合物多孔质膜应用干细胞。

3.对于培养增殖在本发明中使用的干细胞的工序

细胞培养，根据细胞培养中的存在形态，培养细胞可分类为接附培养系细胞和悬浮培养系细胞。接附培养系细胞是附着在培养容器上而增殖的培养细胞，在传代中进行培养基更换。悬浮培养系细胞是在培养基中在悬浮状态下增殖的培养细胞，在一般传代时，不进行培养基更换，进行稀释培养。悬浮培养由于能在悬浮状态、即在液体中的培养，能大量培养，当与仅生长在培养容器表面的附着细胞比较时，由于是立体的培养，有每单位空间的能培养细胞数多的益处。

在本发明的方法中，在将聚合物多孔质膜悬浮于细胞培养基中的状态下使用时，也可使用2个以上的上述聚合物多孔质膜的小片。聚合物多孔质膜由于是立体的且柔性的薄膜，通过例如将该小片悬浮于培养液中而使用，带有能在一定容量的细胞培养基中多数培养的表面积的聚合物多孔质膜变得可能。在通常培养的情况中，容器底面积成为能细胞培养的面积的上限，在使用本发明的聚合物多孔质膜的细胞培养中，尖部的带的聚合物多孔质膜的大表面积的全部成为能细胞培养的面积。由于聚合物多孔质膜使细胞培养液通过，例如在被折叠的膜内也能供给营养或氧等。另外，聚合物多孔质膜与以往的平面培养完全不同，由于是有立体的并且柔性的结构的细胞培养基材，不选培养容器的形状，在各种各样的形状、材质、大小的培养容器内也能培养有接附性的细胞(例如，培养皿、瓶、箱、袋等)。

聚合物多孔质膜的小片的大小，形状不特别限定。形状可取圆、椭圆形、四角形、三角形、多角形、绳状等任意的形状。

本发明的聚合物多孔质膜由于有柔软性而可使形状改变而使用。也可将聚合物多孔质膜加工成不是平面状而立体状形状而使用。例如，也可将聚合物多孔质膜(i)折叠，(ii)卷成轮状，(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者(iv)连接成绳状，在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定。通过如(i)～(iv)一样加工形状，可与使用小片时同样地，向一定容量的细胞培养基中放入多的聚合物多孔质膜。再者，因为可以各小片作为集合体对待，使细胞体集合化而移动变得可能，综合的应用性高。

作为与小片集合体同样的想法，也可将2个以上的聚合物多孔质膜上下或左右积层到细胞培养基中而使用。积层也包括聚合物多孔质膜一部分重叠的实施方式。由积层培养，在窄的空间将干细胞培养至高密度变得可能。也可能在已经培育干细胞的膜上还积层膜而设置而形成与别种细胞的多层系。积层的聚合物多孔质膜的数不特别限定。

在本发明的方法中，优选为干细胞在聚合物多孔质膜的表面及内部生长增殖。

在本发明的方法中，可不像以往一样进行胰蛋白酶处理等的传代操作，经至少30天、至少60天、至少120天、至少200天、或者至少300天的长期而一边抑制分化一边培养干细胞。另外，由本发明的方法，可用以往的平面培养进行培养的期间以上、例如，可经平面培养期间的1.5倍以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上的期间，一边抑制分化，一边培养干细胞。根据本发明，不发生通过用培养皿等的平面培养的长期间的细胞培养发生的细胞的剥离或杀灭等，可长期间维持不是休止状态的动态的生命。另外，根据本发明，即使是长期培养的干细胞，细胞活力或干细胞的性质(例如，细胞表面标志物的表达量等)与长期培养前的干细胞比较而几乎不改变。另外，根据本发明，由于干细胞在聚合物多孔质膜内三维地增殖，难发生如在以往的平面培养中见到的培养区域的限制及由平面环境发生的接触抑制，从而使长期间生长的培养变得可能。另外，根据本发明，通过使干细胞所接附的聚合物多孔质膜接触别的聚合物多孔质膜，能任意地增加能培养细胞的空间，不进行伴随如以往一样的胰蛋白酶处理的传代操作，一边回避引起接触抑制的汇合状态，一边使长期间增殖的培养变得可能。另外，根据本发明，还提供不对干细胞进行冷冻等而活着长期间保存的新的保存方法。

4.对于在本发明中使用的聚合物多孔质膜

存在于本发明中使用的聚合物多孔质膜中的表面层A(以下也称为“A面”或“网面”)的孔的平均孔径不特别限定，例如是0.01μm以上且不足200μm、0.01～150μm、0.01～100μm、0.01～50μm、0.01μm～40μm、0.01μm～30μm、0.01μm～20μm、或者0.01μm～15μm，优选为0.01μm～15μm。

存在于本发明中使用的聚合物多孔质膜中的表面层B(以下也称为“B面”或“大孔面”)的孔的平均孔径比存在于表面层A的孔的平均孔径大的限，不特别限定，例如是5μm超200μm以下，20μm～100μm、30μm～100μm、40μm～100μm、50μm～100μm、或者60μm～100μm，优选为20μm～100μm。

聚合物多孔质膜表面的平均孔径可由多孔质膜表面的扫描型电子显微镜照片，对于200分以上的开孔部而测定孔面积，从该孔面积的平均值，根据下式(1)而由计算求出孔的形状是正圆时的平均直径。

【数1】

(式中，Sa是指孔面积的平均值。)

表面层A及B的厚度不特别限定，例如是0.01～50μm，优选为0.01～20μm。

在聚合物多孔质膜中的大空隙层中的大空隙的膜平面方向的平均孔径不特别限定，例如是10～500μm，优选为10～100μm，更优选为10～80μm。另外，所述大空隙层中的隔壁的厚度不特别限定，例如是0.01～50μm，优选为0.01～20μm。在一实施方式中，所述大空隙层中的至少1个隔壁有连通邻接的大空隙彼此的平均孔径0.01～100μm的，优选为0.01～50μm的1个或多个孔。在别的实施方式中，所述大空隙层中的隔壁无孔。

在本发明中使用的聚合物多孔质膜的膜厚不特别限定，可为5μm以上、10μm以上、20μm以上或25μm以上，也可为500μm以下，300μm以下，100μm以下，75μm以下或50μm以下。优选为5～500μm，更优选为25～75μm。

在本发明中使用的聚合物多孔质膜的膜厚的测定可以接触式的厚度计进行。

在本发明中使用的聚合物多孔质膜的空孔率不特别限定，例如是40％以上且不足95％。

在本发明中使用的聚合物多孔质膜的空孔率可对切成指定的大小的多孔质膜的膜厚及质量进行测定，从单位面积重量质量，根据下式(2)而求出。

【数2】

空孔率(％)＝(1-w/(S×d×D))×100 (2)

(式中各自，S是指多孔质膜的面积、d是指膜厚、w是指测定的质量、D是指聚合物的密度。当聚合物是聚酰亚胺时，密度设为1.34g/cm³。)

在本发明中使用的聚合物多孔质膜优选为有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径是0.01μm～15μm，存在于上述表面层B的孔的平均孔径是20μm～100μm，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，上述大空隙层的隔壁、以及上述表面层A及B的厚度是0.01～20μm，在上述表面层A及B中的孔与大空隙连通，总膜厚是5～500μm，空孔率是40％以上且不足95％。在一实施方式中，大空隙层中的至少1个隔壁有连通邻接的大空隙彼此的平均孔径0.01～100μm的，优选为0.01～50μm的1个又多个孔。在别的实施方式中，隔壁无这样的孔。

在本发明中使用的聚合物多孔质膜优选被灭菌。作为灭菌处理，不特别限定可举出干热灭菌、蒸气灭菌、由乙醇等消毒剂的灭菌、紫外线或γ线等的电磁波灭菌等任意的灭菌处理等。

在本发明中使用的聚合物多孔质膜只要是具备上述的结构的特征，就不特别限定，优选为聚酰亚胺、或者聚醚砜(PES)的多孔质膜。

聚酰亚胺是指重复单位含酰亚胺键的高分子的总称，通常是指芳香族化合物直接经酰亚胺键连接的芳香族聚酰亚胺。由于芳香族聚酰亚胺是芳香族和芳香族经酰亚胺键而具有共轭结构，具有刚直且强固的分子结构，并且，由于酰亚胺键具有强的分子间力而有非常高的水平的热的、机械的、化学性质。

可在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜优选为含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺(作为主要的成分)的聚酰亚胺多孔质膜，更优选为由从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺构成的聚酰亚胺多孔质膜。“作为主要的成分含”是指作为聚酰亚胺多孔质膜的构成成分，从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺以外的成分则实质上不含，或者即使含也不影响从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质的附加的成分。

在一实施方式中，可在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜也含，通过使从四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液和含着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。

聚酰胺酸通过聚合四羧酸成分和二胺成分而得到。聚酰胺酸是可通过热亚胺化或化学亚胺化闭环而作为聚酰亚胺的聚酰亚胺前体。

聚酰胺酸只要是即使酰胺酸的一部分被亚胺化也不影响本发明的范围，就可使用。即，聚酰胺酸也可被部分热亚胺化或化学亚胺化。

当使聚酰胺酸热亚胺化时，可根据需要，将亚胺化催化剂、含有有机磷的化合物、无机微粒子、有机微粒子等的微粒子等添加到聚酰胺酸溶液中。另外，当使聚酰胺酸化学亚胺化时，可根据需要，将化学亚胺化剂、脱水剂、无机微粒子、有机微粒子等的微粒子等添加到聚酰胺酸溶液中。即使向聚酰胺酸溶液配合上述成分，也优选在着色前体不析出的条件下进行。

在本说明书中，“着色前体”是指由250℃以上的热处理碳化一部分或全部而生成着色化物的前体。

作为可在上述聚酰亚胺多孔质膜的制造中使用的着色前体，均一地溶解或分散于聚酰胺酸溶液或聚酰亚胺溶液，由250℃以上、优选为260℃以上、再优选为280℃以上、更优选为300℃以上的热处理、优选为空气等的氧存在下的250℃以上、优选为260℃以上、再优选为280℃以上、更优选为300℃以上的热处理热分解，优选碳化而生成着色化物，更优选生成黑色系的着色化物，更优选碳系着色前体。

着色前体经加热则成为看似碳化物的物质，但含组织上含碳以外的异元素，层结构、芳香族交联结构、含四面体碳的无秩序结构。

碳系着色前体不特别限制，例如，可举出石油焦油、石油间距、煤焦油、煤间距等的焦油或间距、焦炭、从含丙烯腈的单体得到的聚合物、二茂铁化合物(二茂铁及二茂铁衍生物)等。在这些之中，优选从含丙烯腈的单体得到的聚合物和/或二茂铁化合物，作为从含丙烯腈的单体得到的聚合物，优选聚丙烯酸类树脂腈。

另外，在别的实施方式中，可在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜也含不使用上述的着色前体而通过使从四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液成形之后热处理得到的聚酰亚胺多孔质膜。

不使用着色前体制造的聚酰亚胺多孔质膜也可例如，通过以膜状流延由极限粘度数是1.0～3.0的聚酰胺酸3～60质量％和有机极性溶剂40～97质量％构成的聚酰胺酸溶液，浸渍或接触于以水作为必须成分的凝固溶剂，制作聚酰胺酸的多孔质膜，其后，热处理所述聚酰胺酸的多孔质膜而亚胺化而制造。在此方法中，以水作为必须成分的凝固溶剂是水，或者也可为5质量％以上且不足100质量％的水和超0质量％且95质量％以下的有机极性溶剂的混合液。另外，也可在上述亚胺化之后，在得到的多孔质聚酰亚胺膜的至少一面实施等离子体处理。

可在上述聚酰亚胺多孔质膜的制造中使用的四羧酸二酐可使用任意的四羧酸二酐，可对应于期望的特性等适宜选择。作为四羧酸二酐的具体例，可举苯均四酸二酐、3,3’，4,4’-联苯基四羧酸二酐(s-BPDA)、2,3,3’，4’-联苯基四羧酸二酐(a-BPDA)等的联苯基四羧酸二酐、氧基二酞酸二酐、二苯基砜-3,4,3’，4’-四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)硫化物二无水物、2,2-双(3,4-二羧基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷二无水物、2,3,3’，4’-二苯甲酮四羧酸二酐、3,3’，4,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)甲烷二无水物、2,2-双(3,4-二羧基苯基)丙烷二无水物、p-亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、p-双亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、m-三联苯基-3,4,3’，4’-四羧酸二酐、p-三联苯基-3,4,3’，4’-四羧酸二酐、1,3-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二无水物、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二无水物、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)联苯基二无水物、2,2-双〔(3,4-二羧基苯氧基)苯基〕丙烷二无水物、2,3,6,7-萘四羧酸二酐、1,4,5,8-萘四羧酸二酐、4,4’-(2,2-六氟异亚丙基)二酞酸二酐等。另外，也优选使用2,3,3’,4’-二苯基砜四羧酸等的芳香族四羧酸。这些可单独使用，也可组合2种以上而使用。

在这些之中，也特别优选选自联苯基四羧酸二酐及苯均四酸二酐的至少一种芳香族四羧酸二酐。作为联苯基四羧酸二酐，可适宜地使用3,3’，4,4’-联苯基四羧酸二酐。

可在上述聚酰亚胺多孔质膜的制造中使用的二胺可使用任意的二胺。作为二胺的具体例，可举以下的。

(1)1,4-二氨基苯(对亚苯基二胺)、1,3-二氨基苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯等的苯核1个苯二胺；

(2)4,4’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚等的二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基联苯基、2,2’-二甲基-4,4’-二氨基联苯基、2,2’-双(三氟甲基)-4,4’-二氨基联苯基、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二羧基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’，5,5’-四甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、双(4-氨基苯基)硫化物、4,4’-二氨基苯甲酰苯胺、3,3’-二氯联苯胺、3,3’-二甲基联苯胺、2,2’-二甲基联苯胺、3,3’-二甲氧基联苯胺、2,2’-二甲氧基联苯胺、3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚、3,3’-二氨基二苯基硫化物、3,4’-二氨基二苯基硫化物、4,4’-二氨基二苯基硫化物、3,3’-二氨基二苯基砜、3,4’-二氨基二苯基砜、4,4’-二氨基二苯基砜、3,3’-二氨基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二氯二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二甲氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基二苯基甲烷、3,4’-二氨基二苯基甲烷、4,4’-二氨基二苯基甲烷、2,2-双(3-氨基苯基)丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)丙烷、2,2-双(3-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、3,3’-二氨基二苯基亚砜、3,4’-二氨基二苯基亚砜、4,4’-二氨基二苯基亚砜等的苯核2个二胺；

(3)1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯、1,4-双(4-氨基苯氧基)苯、1,3-双(3-氨基苯氧基)-4-三氟甲基苯、3,3’-二氨基-4-(4-苯基)苯氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二(4-苯基苯氧基)二苯甲酮、1,3-双(3-氨基苯基硫化物)苯、1,3-双(4-氨基苯基硫化物)苯、1,4-双(4-氨基苯基硫化物)苯、1,3-双(3-氨基苯基砜)苯、1,3-双(4-氨基苯基砜)苯、1,4-双(4-氨基苯基砜)苯、1,3-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(3-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯等的苯核3个二胺；

(4)3,3’-双(3-氨基苯氧基)联苯基、3,3’-双(4-氨基苯氧基)联苯基、4,4’-双(3-氨基苯氧基)联苯基、4,4’-双(4-氨基苯氧基)联苯基、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷等的苯核4个二胺。

这些可单独使用，也可混合2种以上而使用。使用的二胺可对应于期望的特性等适宜选择。

在这些之中，也优选芳香族二胺化合物，可适宜地使用3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚及对亚苯基二胺、1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯。特别优选选自苯二胺、二氨基二苯基醚及双(氨基苯氧基)苯基的至少一种二胺。

可在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点来看，优选由将玻璃转移温度是240℃以上、或者在300℃以上无明确的转移点的四羧酸二酐和二胺组合而得到的聚酰亚胺形成。

可在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点来看，优选为由以下的芳香族聚酰亚胺构成的聚酰亚胺多孔质膜。

(i)由选自联苯基四羧酸单位及苯均四酸单位的至少一种四羧酸单位和芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺、

(ii)由四羧酸单位和选自苯二胺单位、二氨基二苯基醚单位及双(氨基苯氧基)苯基单位的至少一种芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺、

和/或，

(iii)由选自联苯基四羧酸单位及苯均四酸单位的至少一种四羧酸单位和选自苯二胺单位、二氨基二苯基醚单位及双(氨基苯氧基)苯基单位的至少一种芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺。

在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜优选为有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚酰亚胺多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径是0.01μm～15μm，存在于上述表面层B的孔的平均孔径是20μm～100μm，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，上述大空隙层的隔壁、以及上述表面层A及B的厚度是0.01～20μm，在上述表面层A及B中的孔与大空隙连通，总膜厚是5～500μm，空孔率是40％以上且不足95％。其中，大空隙层中的至少1个隔壁有连通邻接的大空隙彼此的平均孔径0.01～100μm的，优选为0.01～50μm的1个或多个孔。

例如，国际公开WO2010/038873、特开2011-219585、或者特开2011-219586中记载的聚酰亚胺多孔质膜也能在本发明中使用。

可在本发明中使用的PES多孔质膜含聚醚砜，典型而言实质上由聚醚砜构成。聚醚砜可由本领域技术人员公知的方法合成，例如，可由使二价苯酚、碱金属化合物及二卤代二苯基化合物在有机极性溶剂中进行缩聚反应的方法、预先合成二价苯酚的碱金属二盐而与二卤代二苯基化合物在有机极性溶剂中缩聚反应的方法等制造。

作为碱金属化合物，可举出碱金属碳酸盐、碱金属氢氧化物、碱金属氢化物、碱金属醇盐等。特别优选碳酸钠及碳酸钾。

作为二价苯酚化合物，举氢醌、儿茶酚、间苯二酚、4,4’-联苯二酚、双(羟基苯基)链烷类(例如2,2-双(羟基苯基)丙烷、及2,2-双(羟基苯基)甲烷)、二羟基二苯基砜类、二羟基二苯基醚类、或者它们的苯环的氢的至少1个被甲基、乙基、丙基等的低级烷基、或者甲氧基、乙氧基等的低级烷氧基取代的。作为二价苯酚化合物，可将上述的化合物两种类以上混合使用。

聚醚砜也可为市售品。作为市售品的例，可举出SUMIKAEXCEL7600P、SUMIKAEXCEL5900P(以上、住友化学(株)制)等。

聚醚砜的对数粘度从良好地形成PES多孔质膜的大空隙的观点来看，优选为0.5以上、更优选为0.55以上，从多孔质聚醚砜膜的制造容易性的观点来看，优选为1.0以下，更优选为0.9以下，再优选为0.8以下，特别优选为0.75以下。

另外，PES多孔质膜、或作为其原料的聚醚砜从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点来看，优选玻璃转移温度是200℃以上，或者观察不到明确的玻璃转移温度。

可在本发明中使用的PES多孔质膜的制造方法不特别限定，例如，也可由包括下列工序的方法制造

以膜状流延含对数粘度0.5～1.0的聚醚砜的0.3质量％～60质量％和有机极性溶剂40质量％～99.7质量％的聚醚砜溶液，浸渍或接触于以聚醚砜的贫溶剂或非溶剂作为必须成分的凝固溶剂，制作有空孔的凝固膜的工序、及

热处理在上述工序中得到的有空孔的凝固膜而使上述空孔粗大化，得到PES多孔质膜的工序，

上述热处理包括使有上述空孔的凝固膜升温至上述聚醚砜的玻璃转移温度以上、或者240℃以上。

可在本发明中使用的PES多孔质膜优选为有表面层A、表面层B、及夹在上述表面层A和上述表面层B之间的大空隙层的PES多孔质膜，

上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的膜平面方向的平均孔径是10μm～500μm的多个大空隙，

上述大空隙层的隔壁的厚度是0.1μm～50μm，

上述表面层A及B各自的厚度是0.1μm～50μm，

上述表面层A及B之中，一方有平均孔径5μm超200μm以下的多个细孔，并且另一方有平均孔径0.01μm以上且不足200μm的多个细孔，

表面层A及表面层B的，一方面的表面开口率是15％以上，另一方面的表面层的表面开口率是10％以上，

上述表面层A及上述表面层B的上述细孔与上述大空隙连通，

上述PES多孔质膜的总膜厚是5μm～500μm，并且空孔率是50％～95％。

5.细胞培养和培养体积

使用聚合物多孔质膜的细胞培养的模型图示于图1。图1是用于辅助理解的图，各要素不是实际尺寸。在本发明的方法中，通过向聚合物多孔质膜应用干细胞，培养，由于大量的干细胞在聚合物多孔质膜所具有的内部的多面的连接多孔部分或表面生长，简便地培养大量的干细胞变得可能。另外，在本发明的方法中，比以往的方法大幅地减少在细胞培养中使用的培养基的量的同时，培养大量的干细胞变得可能。例如，即使聚合物多孔质膜的一部分或整体处于不与细胞培养基的液相接触的状态，也可经长期培养大量的干细胞。另外，相对于含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和而显著地减少细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积也变得可能。

在本说明书中，将不含细胞的聚合物多孔质膜还包括其内部间隙的体积而在空间中所占的体积称为“表观聚合物多孔质膜体积”(参照图1)。进而，向聚合物多孔质膜应用干细胞，在向聚合物多孔质膜的表面及内部负载干细胞的状态下，将聚合物多孔质膜、干细胞、及向聚合物多孔质膜内部浸润的培养基作为整体在空间中所占的体积称为“含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积”(参照图1)。在膜厚25μm的聚合物多孔质膜的情况中，含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积成为最大比表观聚合物多孔质膜体积大50％左右的值。在本发明的方法中，可在1个细胞培养容器中收容多个聚合物多孔质膜而进行培养，此时，有时将含对于负载干细胞的多个聚合物多孔质膜各自的细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和简记载为“含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和”。

通过使用本发明的方法，即使在细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积是含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和的10000倍或比其少的条件下，经长期良好地培养干细胞变得可能。另外，即使在细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积是含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和的1000倍或比其少的条件下，也可经长期良好地培养干细胞。再者，在细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积是含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和的100倍或比其少的条件下，也可经长期良好地培养干细胞。进而，即使在细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积是含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和的10倍或比其少的条件下，也可经长期良好地培养干细胞。

即，根据本发明，使细胞培养的空间(容器)变得与进行以往的二维培养的细胞培养装置比而能至极限小型化。另外，在想要增加培养的干细胞的数的情况中，由增加积层的聚合物多孔质膜的枚数等的简便的操作柔软地增加细胞培养的体积变得可能。只要是在本发明中使用的具备聚合物多孔质膜的细胞培养装置，就分离培养干细胞的空间(容器)和储藏细胞培养基的空间(容器)变得可能，对应于培养的细胞数，准备必要的量的细胞培养基变得可能。储藏细胞培养基的空间(容器)可对应于目的而大型化或小型化，或也可为能更换的容器，不特别限定。

在本发明的方法中，例如，在使用聚合物多孔质膜的培养后细胞培养容器中所含的干细胞的数是指，作为干细胞均一地分散于全部细胞培养容器中所含的细胞培养基的，培养至每1ml培养基达1.0×10⁵个以上、1.0×10⁶个以上、2.0×10⁶个以上、5.0×10⁶个以上、1.0×10⁷个以上、2.0×10⁷个以上、5.0×10⁷个以上、1.0×10⁸个以上、2.0×10⁸个以上、5.0×10⁸个以上、1.0×10⁹个以上、2.0×10⁹个以上、或者5.0×10⁹个以上。

再者，作为测量培养中或培养后的细胞数的方法，可使用各种公知的方法。例如，作为以使用聚合物多孔质膜的培养后细胞培养容器中所含的干细胞的数作为干细胞均一地分散于全部细胞培养容器中所含的细胞培养基的测量的方法，可适宜使用公知的方法。例如，可适宜地使用使用CCK8的细胞数测量法。具体而言，使用Cell Countinig Kit8；同仁化学研究所制溶液试剂(以下，记载为“CCK8”)而测量在不使用聚合物多孔质膜的通常的培养中的细胞数，求出吸光度和实际的细胞数的相关系数。其后，应用干细胞，向含CCK8的培养基移培养的聚合物多孔质膜，在温育器内保存1～3小时，取上清而测定在480nm的波长处的吸光度，从首先求出的相关系数计算细胞数。

另外，从别的观点来看，细胞的大量培养是指例如，在使用聚合物多孔质膜的培养后培养至每1平方厘米聚合物多孔质膜含的细胞数达1.0×10⁵个以上、2.0×10⁵个以上、1.0×10⁶个以上、2.0×10⁶个以上、5.0×10⁶个以上、1.0×10⁷个以上、2.0×10⁷个以上、5.0×10⁷个以上、1.0×10⁸个以上、2.0×10⁸个以上、或者5.0×10⁸个以上。每1平方厘米聚合物多孔质膜中所含的细胞数能使用细胞计数器等的公知的方法而适宜测量。

6.干细胞的培养***及培养条件

在本发明的方法中，干细胞的培养***及培养条件可对应于干细胞的种类等而适宜确定。适宜于各种干细胞的培养方法是公知的，可由本领域技术人员使用任意的公知的方法而培养应用于聚合物多孔质膜的干细胞。细胞培养基也可对应于干细胞的种类而适宜调制。

细胞培养基例如，记载在LONZA公司的细胞培养基产品目录中。在本发明的方法中使用的细胞培养基也可为液体培养基、半固体培养基、固体培养基等之任一者的形态。另外，也可通过将作为液滴状的液体培养基喷喷雾到细胞培养容器中，使培养基接触负载细胞的聚合物多孔质膜。

关于使用聚合物多孔质膜的细胞的培养，也可与微载体或纤维素海绵等其他悬浮型培养载体共存。

在本发明的方法中，在培养中使用的***的形状、规模等不特别限定，能适宜利用于细胞培养用的培养皿、瓶、塑料袋、试管至大型的箱。例如，含BD Falcon公司制的细胞培养皿或Thermo Scientific公司制的Nunc细胞工厂等。再者，通过在本发明中使用聚合物多孔质膜，对于先天不能悬浮培养的细胞而也用悬浮培养用装置进行在悬浮培养类似状态下的培养变得可能。作为悬浮培养用的装置，例如，能使用康宁公司制的旋转瓶或旋转培养等。另外，作为可实现同样的功能的环境，也能使用VERITAS公司的如FiberCell(注册商标)System一样的中空丝培养***。

在本发明的方法中的培养也能使用以向聚合物多孔质膜上连续添加培养基而回收的方式的连续循环或开放型的装置而以使聚合物多孔质膜片露出到空气中的型式执行。

在本发明中，细胞的培养也可用从设置在细胞培养容器外的细胞培养基供给手段向细胞培养容器中连续或间歇地供给细胞培养基的***进行。此时，可为细胞培养基在细胞培养基供给手段和细胞培养容器之间循环的***。

可为细胞培养装置，其用从设置在细胞培养容器外的细胞培养基供给手段连续或间歇地向细胞培养容器中供给细胞培养基的***进行细胞的培养时，该***可为含作为细胞培养容器的培养单元和作为细胞培养基供给手段的培养基供给单元的细胞培养装置，其中

培养单元是收容用于负载细胞的1个或多个聚合物多孔质膜的培养单元，是具备培养基供给口及培养基排出口的培养单元，

培养基供给单元是具备培养基收纳容器、培养基供给线和经培养基供给线连续或间歇输送培养基的送液泵，其中培养基供给线的第一端部与培养基收纳容器内的培养基接触，培养基供给线的第二端部经培养单元的培养基供给口而与培养单元内连通的培养基供给单元。

另外，在上述细胞培养装置中，培养单元可为不具备空气供给口、空气排出口、及氧交换膜的培养单元，另外，可为具备空气供给口及空气排出口、或者氧交换膜的培养单元。即使培养单元不具备空气供给口及空气排出口、以及氧交换膜，对于细胞的培养必要的氧等也通过培养基而充分地向细胞供给。再者，在上述细胞培养装置中，培养单元还可具备培养基排出线，其中培养基排出线的第一端部与培养基收纳容器连接，培养基排出线的第二端部经培养单元的培养基排出口而与培养单元内连通，培养基能在培养基供给单元和培养单元循环。

作为上述细胞的培养***的一例的细胞培养装置的例示于图2，可为了本发明的目的使用的细胞的培养***不限于此。

7.对于本发明的分化诱导方法

在本发明的分化诱导方法中，在聚合物多孔质膜上增殖的干细胞通过在分化诱导条件下培养来进行分化诱导。关于干细胞的分化诱导的具体性的工序不特别限定。含本说明书中记载的工序，能采用适宜于使生长在膜状的载体上的干细胞与分化诱导培养基等的分化诱导环境接触的任意的方法。

虽不限定，但从多能性干细胞向组织干细胞的分化例如，能使用神经生长因子(NGF)或视黄酸等的因子。培养基能使用10％FBS共存αMEM培养基等。

虽不限定，但从组织干细胞向各组织的细胞的分化能使用碱性成纤维细胞生长因子或Forskolin或神经调节素等的因子。虽不限定，但培养基能使用一般的MEM培养基等。

以下，基于实施例而更具体性地说明本发明。再者，本发明不限定于这些实施例。本领域技术人员可基于本说明书的记载而容易地向本发明加修饰－变更，它们包括在本发明的技术性范围内。

【实施例】

在以下的实施例中使用的聚酰亚胺多孔质膜通过使从作为四羧酸成分的3,3’，4,4’-联苯基四羧酸二酐(s-BPDA)和作为二胺成分的4,4’-二氨基二苯基醚(ODA)得到的聚酰胺酸溶液和含作为着色前体的聚丙烯酰胺的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上进行热处理来调制。得到的聚酰亚胺多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在所述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚酰亚胺多孔质膜，存在于表面层A的孔的平均孔径是6μm，存在于表面层B的孔的平均孔径是46μm，膜厚是25μm，空孔率是73％。

实施例1

在聚酰亚胺多孔质膜上培养的人间充质干细胞的基因解析

1.样品的调制

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司、cat.103)加干细胞培养基(LONZA公司制、PT-3001)0.5ml，使灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍。每1个聚酰亚胺多孔质膜接种4×10⁴个人间充质干细胞，一边每周更换2次培养基，一边在CO₂温育器内继续进行培养。以在所述培养皿中培养3天的细胞、培养70天的细胞及培养182天的细胞各自作为基因解析用样品使用。以下将使用聚酰亚胺多孔质膜的上述培养称为“部件培养”，将得到的细胞样品称为“部件培养细胞样品”。

另外，除了未使用聚酰亚胺多孔质膜之外，在同样的条件下，用PLL包被培养皿(住友Bakelite制、口内径10cm)培养间充质干细胞。以培养3天的细胞、培养70天的细胞、培养118天的细胞各自作为基因解析用样品使用。以下将不使用聚酰亚胺多孔质膜的上述培养称为“通常培养”，将得到的细胞样品称为“通常培养细胞样品”。

2.基因解析

关于得到的样品，用以下的顺序进行基因解析。

(1)RNA提取

使用RNeasy Plus micro Kit(Qiagen)而通过附属的流程进行RNA的提取。RNA用30μL的Nuclease Free Water提取，其后，使用TURBO DNA free Kit(Life Technologies)而进行由DNA酶的基因组DNA的分解处理。分解处理后，将RNA溶液的浓度用Nano Drop 2000(Thermo Fishier Scientific)测定。

(2)cDNA合成

将浓度测定后的RNA溶液调制为12.5ng/μL，以100ng作为模板而进行cDNA合成。在合成中使用SuperScript(商标)III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(LifeTechnologies)。将cDNA溶液的浓度用Nano Drop 2000测定。

(3)q-PCR反应

将cDNA溶液调制为200ng/μL，以200ng作为模板而进行由实时PCR的测定。PCR用CFX connect(Bio-Rad)进行，试剂使用SsoAdvanced(商标)Universal SYBR GreenSupermix(Bio-Rad)。对于间充质干细胞阳性标志物(CD166、CD44、CD105、CD146、CD90、CD106、CD29、CD71)、间充质干细胞阴性标志物(CD19、CD45、CD31、CD18、CD56、CD34、CD14、CD80、CD40、CD86)而测定表达量，作为内部标准基因，使用β-肌动蛋白。

(4)测定数据解析

从将测定中求出的各基因的Ct值用作为内部标准基因测定的β-肌动蛋白的Ct值减的值算出相对表达量而进行比较。另外，为了用通常培养细胞样品和部件培养细胞样品比较基因表达的经时变化，各自算出将培养3天的细胞样品的表达量设为1时的变化而进行比较。结果示于图3。

(5)结果

对于间充质干细胞的阳性标志物基因，示部件培养的方比通常培养表达量高的倾向。关于测定的8个阳性标志物中5个标志物，在通常培养中，表达量经时消失。这表示与培养天数的经过一同失间充质干细胞的性质。一方面，在使用聚酰亚胺多孔质膜的部件培养中，由于全部标志物在182天的长期培养中被维持，从而间充质干细胞的性质被保持。相反间充质干细胞的阴性标志物基因显示通常培养的方比部件培养表达量高的倾向。从这些显示，由部件培养抑制间充质干细胞的分化。

实施例2

在聚酰亚胺多孔质膜上培养的人间充质干细胞的分化诱导

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司,cat.103)加干细胞培养基(LONZA公司制、PT-3001)0.5ml，使灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍。每1个聚酰亚胺多孔质膜接种4×10⁴个人间充质干细胞，一边每周更换2次培养基，一边在CO₂温育器内继续进行培养。培养开始后，在第6天、第70天、第118天、第182天将培养基切换为分化诱导培养基(PromoCell公司制)。

在切换为分化诱导培养基的时间点完全未发现的脂肪球从分化诱导开始后第10天左右起开始可见，在14天时间点观察到多的脂肪球。观察的脂肪球用Oil red O染色及BODIPY染色，确认向脂肪细胞的分化诱导。图4显示培养6天后13天分化诱导，Oil red O染色的细胞的显微镜照片。图5显示培养182天后15天分化诱导，BODIPY染色的细胞的显微镜照片。

实施例3

在聚酰亚胺多孔质膜上的人间充质干细胞的培养

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司cat.103)加细胞培养基0.5ml，使灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍。每1个聚酰亚胺多孔质膜接种4×10⁴个间充质干细胞，一边每周更换2次培养基(GIBCO制，DMEM+FBS10％)，一边在CO₂温育器内继续进行培养。以下将所述培养称为“部件培养”，将得到的样品称为“部件培养细胞样品”。在部件培养开始后第7天、第14天、第21天、第28天、第35天及第42天，使用CCK8而测量细胞数，对细胞生长行为进行观察。

作为比较对象，在I型胶原包被皿(口内径10cm²)中，进行与在部件培养中使用的相同批的间充质干细胞的培养，使用CCK8而测量细胞数，对细胞生长行为进行观察。以下将不使用聚酰亚胺多孔质膜的上述培养称为“通常培养”，将得到的细胞样品称为“通常培养细胞样品”。在部件培养及通常培养中使用的培养基及初期细胞接种数示于以下的表。另外，部件培养及通常培养时的人间充质干细胞数的经时变化示于图6。部件培养时，观察到稳定的人间充质干细胞的增殖及生长。

【表2】

	基材	培养基	初期细胞接种数(个细胞/cm<sup>2</sup>)
				部件培养	聚酰亚胺多孔质膜	DMEM+FBS10％	2.0×10<sup>4</sup>
通常培养1	I型胶原包被皿	MSCBM	5.0×10<sup>3</sup>
				通常培养2	I型胶原包被皿	DMEM+FBS10％	5.0×10<sup>3</sup>

实施例4

在聚酰亚胺多孔质膜上的人间充质干细胞的培养

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司、cat.103)加细胞培养基(GIBCO制；DMEM+FBS10％)0.5ml，使灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍。每1个聚酰亚胺多孔质膜接种4×10⁴个间充质干细胞，一边每周更换2次培养基，一边在CO₂温育器内继续进行培养。在培养开始后第7天、第14天、第21天、第35天、第49天、第63天、第77天、第92天、第121天、第143天，使用CCK8而测量细胞数，对细胞生长行为进行观察。结果示于图7。部件培养时，观察到经长期间的稳定的人间充质干细胞的增殖及生长。

在培养开始后第125天，向加间充质干细胞脂肪细胞分化培养基2(PromoCell公司制、C-28016)的容器移植活细胞的聚酰亚胺多孔质膜，再继续培养10天。其间、每周更换2次诱导培养基。其后，将聚酰亚胺多孔质膜***固定，将诱导为脂肪细胞而发生的细胞内油滴用BODIPY染色。尽管诱导期间短，有效率地发生向脂肪细胞的诱导，被荧光绿色染色的油滴散见于聚酰亚胺多孔质膜整体。显微镜图像示于图8。证实即使在长期间培养之后，由于间充质干细胞的分化诱导能也被维持，从而可由本发明的方法抑制干细胞的分化。再者，在未实施在诱导培养基中的培养的部件培养细胞样品中，观察不到被BODIPY染色的油滴。

实施例5

在聚酰亚胺多孔质膜上的人间充质干细胞的培养及显微镜观察

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司、cat.103)加细胞培养基(GIBCO制；DMEM+FBS10％)0.5ml，使灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍。每1个聚酰亚胺多孔质膜接种4×10⁴个间充质干细胞，一边每周更换2次培养基，一边在CO₂温育器内继续进行培养。在培养开始后第7天、第14天、第28天,第42天、第56天、第70天、第85天、第114天、第136天、第143天，使用CCK8而测量细胞数，对细胞生长行为进行观察。结果示于图9。部件培养时，观察到经长期间的稳定的人间充质干细胞的增殖及生长。

在培养开始后第15天、第30天及第150天，固定细胞植活的聚酰亚胺多孔质膜，使用Click-iT(商标)EdU Alexa Fluor(商标)488成像试剂(ThermoFisher公司制)、CellMaskOrange Plasma Membrane Stain及DAPI而进行染色，取得荧光显微镜图像而对于细胞的DNA合成能力力而进行评价。荧光显微镜图像示于图10。即使在长期培养之后，进行DNA合成的Edu阳性的细胞也以一定的比例存在变得明显。

将在培养开始后第146天细胞植活的聚酰亚胺多孔质膜***固定，进行电子显微镜观察。具体而言，用2.5％戊二醛、2％甲醛混合固定液将聚酰亚胺多孔质膜固定后，进行四氧化锇后固定，用依次的乙醇取代法脱水后，在液氮温度进行冷冻割断。使用t-丁基醇的冷冻真空干燥后，由锇等离子体蒸镀进行带电防止处理，实施扫描型电子显微镜(SEM)观察。在观察中使用电场释放型SEM，在加速电压5kV、高真空下作为二次电子像进行观察。结果示于图11。观察到细胞的整列、细胞的积层结构的形成等，多的令人感兴趣的部件培养行为。

将在培养开始后第150天细胞植活的聚酰亚胺多孔质膜***固定，进行荧光显微镜观察。具体而言，将聚酰亚胺多孔质膜***固定后，用Alexa Fluor(注册商标)488鬼笔环肽、CellMask Orange Plasma Membrane Stain、及DAPI染色，由共聚焦激光显微镜取得荧光显微镜图像。结果示于图12。对A面表层和A面附近(内部)层的2个不同的区域独立进行测定，验证细胞的集合状况。在A面表层中，与SEM观察的结果同样地，见到向一方向的细胞的强的取向性的同时，在A面附近(内部)层中，观察到取向性消失，强接附到膜的网面的细胞的形态。

实施例6

在聚酰亚胺多孔质膜上的人间充质干细胞的长期培养、及培养细胞的分化诱导

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司、cat.103)加细胞培养基(LONZA制；间充质干细胞用培养基MSCBM)0.5ml，使灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍。每1个聚酰亚胺多孔质膜接种4×10⁴个间充质干细胞，一边每周更换2次培养基，一边在CO₂温育器内进行14天培养。其后，向加了MSCBM培养基4ml的20cm²皿中移送10个植活细胞的所述聚酰亚胺多孔质膜，进行培养。310天的培养后，向含细胞培养基的2cm×2cm的灭菌的正方形容器移送聚酰亚胺多孔质膜，继续培养。使用CCK8而测量细胞数，对细胞生长行为进行观察。结果示于图13。向正方形容器移送后，观察到稳定的人间充质干细胞的增殖及生长。

在培养开始后第463天向加间充质干细胞脂肪细胞分化培养基2(PromoCell公司制、C-28016)的容器移植活细胞的聚酰亚胺多孔质膜，再继续培养26天。其间、每周更换2次诱导培养基。其后，将聚酰亚胺多孔质膜***固定，将诱导为脂肪细胞而发生的细胞内油滴用BODIPY染色。利用激光共聚焦显微镜的显微镜图像示于图14。有效率地发生向脂肪细胞的诱导，被荧光绿色染色的油滴散见于聚酰亚胺多孔质膜整体。

另外，在培养开始后第490天向加成骨细胞分化诱导培养基(PromoCell公司制、C-28013)的容器移植活细胞的聚酰亚胺多孔质膜，再继续培养26天。其后，向加了成骨细胞钙化培养基(PromoCell公司制、C-28020)的容器移聚酰亚胺多孔质膜，实施14天钙化诱导。其后，用Cosmo Bio制钙化染色试剂盒进行染色，将钙化部分的显著的赤变用显微镜进行观察。光学显微镜图像示于图15。

从自间充质干细胞向脂肪细胞或成骨细胞的诱导的结果确认到，即使在长期间培养之后，间充质干细胞也维持分化诱导能。

实施例7

在聚酰亚胺多孔质膜上长期间培养的间充质干细胞的基因解析

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司、cat.103)加细胞培养基(LONZA制；间充质干细胞用培养基MSCBM)0.5ml，使灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍。每1个聚酰亚胺多孔质膜接种4×10⁴个间充质干细胞，一边每周更换2次培养基，一边在CO₂温育器内进行14天培养。其后，向加了MSCBM培养基4ml的20cm²皿中移送10个植活细胞的所述聚酰亚胺多孔质膜，进行培养。将培养开始后第249天的部件培养细胞样品用与实施例1同样的方法基因解析。另外，将实施例4中的培养开始后第32天的部件培养细胞样品、实施例5中的培养开始后第146天的部件培养细胞样品、实施例6中的培养开始后第496天的部件培养细胞样品用与实施例1同样的方法进行基因解析。关于阳性标志物的结果示于图16A及B。为了比较，将未使用聚酰亚胺多孔质膜而通常培养7天的细胞样品中的各基因的表达量设为1。再者，确认阴性标志物的表达量全部是低值。确认到即使在长期培养后，通过使用本发明的方法，间充质干细胞的特性被维持。

实施例8

在聚酰亚胺多孔质膜上培养的人II型肺胞上皮细胞的基因解析

1.样品的调制

使灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上静置在2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司、cat.103)中。将20周胎儿来源II型肺胞上皮细胞从冷冻液溶解，悬浮于肺胞上皮细胞用培养基(ScienCell ResearchLaboratories公司制、制品编码3201)，以每1个聚酰亚胺多孔质膜1×10⁵个细胞作为悬浮细胞的液滴加载到干的聚酰亚胺多孔质膜上，等待液部的通过(吸入接种法)。液部通过后，注加培养基1ml之后，在CO₂温育器内继续进行培养。每周进行2次培养基(1ml)更换。培养开始后，定期进行使用CCK8的细胞数评价，确认细胞的生长状况。细胞数的变化示于图17。以培养4天的细胞及培养32天的细胞各自作为基因解析用样品使用。以下将使用聚酰亚胺多孔质膜的上述培养称为“部件培养”，将得到的细胞样品称为“部件培养细胞样品”。

另外，除了未使用聚酰亚胺多孔质膜之外，在同样的条件下，培养II型肺胞上皮细胞。以培养4天的细胞作为基因解析用样品使用。以下将不使用聚酰亚胺多孔质膜的上述培养称为“通常培养”，将得到的样品称为“通常培养细胞样品”。

2.基因解析

关于得到的样品，用与实施例1同样的顺序进行基因解析。对于II型肺胞上皮细胞阳性标志物(Pro SP-C、SP-A、SP-B、SP-D、KL-6)、I型肺胞上皮细胞阳性标志物(平足蛋白(Podoplanin)、水通道蛋白(Aquaporin)-5)而测定表达量。结果示于图18。

3.结果

对于II型肺胞上皮细胞的阳性标志物基因，示部件培养的方比通常培养表达量高的倾向。这提示II型肺胞上皮细胞向I型肺胞上皮细胞的分化被部件培养抑制。另外，与培养的细胞数升高一同肺胞上皮II型细胞增加，提示其被维持。为了验证这些，将Pro SP-C和平足蛋白用免疫染色进行评价(Day22)时，确认同样的结果(图19)。

实施例9

在聚酰亚胺多孔质膜上的人II型肺胞上皮细胞的长期培养

继续实施例8的细胞培养约1年。结果示于图20。观察到经长期间的稳定的II型肺胞上皮细胞的增殖及生长。

实施例10

在聚酰亚胺多孔质膜上长期培养的人II型肺胞上皮细胞的基因解析

1.样品的调制

使灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上静置在2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司cat.103)中。将20周胎儿来源人II型肺胞上皮细胞从冷冻液溶解，调制培养基悬浮液。用以下的3种方法向聚酰亚胺多孔质膜接种细胞。

接种法1：将每1个聚酰亚胺多孔质膜2×10⁴个细胞作为悬浮液加到(自然接种法)预先用培养基湿润的聚酰亚胺多孔质膜上。

接种法2：将每1个聚酰亚胺多孔质膜4×10⁴个细胞作为悬浮液加到(自然接种法)预先用培养基湿润的聚酰亚胺多孔质膜上。

接种法3：将每1个聚酰亚胺多孔质膜1×10⁵个细胞作为悬浮细胞的液滴加载到干的聚酰亚胺多孔质膜上，等待液部的通过(吸入接种法)。

用上述的方法细胞接种之后，一边每周进行2次培养基更换，一边在CO₂温育器内继续进行培养。定期进行使用CCK8的细胞数评价，确认细胞的生长状况。细胞数的变化示于图21。

2.基因解析

用上述接种法3进行细胞接种，对培养215天的部件培养细胞样品进行基因解析。再者，作为对照样品，使用实施例9的通常培养细胞样品。结果示于图22。对于II型肺胞上皮细胞的阳性标志物基因，显示部件培养的方比通常培养表达量高的倾向。这提示II型肺胞上皮细胞向I型肺胞上皮细胞的分化被部件培养抑制。

【产业上的利用可能性】

本发明的方法可用于抑制干细胞的分化，大量地供给所述细胞。

Claims (17)

1.抑制干细胞的分化的方法，其包括：

(1)将上述干细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及

(2)培养上述干细胞，使增殖的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通。

2.权利要求1所述的方法，其中上述细胞是ES细胞、EC细胞、EG细胞、核移植ES细胞、ntES细胞、iPS细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、皮肤干细胞、骨髓干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、***、II型肺胞上皮细胞、脂肪干细胞、齿髓干细胞、脱分化脂肪细胞或MUSE细胞。

3.权利要求1或2所述的方法，其中实施上述工序(2)至少30天。

4.权利要求1～3之任一项所述的方法，其中在上述工序(2)中，使细胞增殖至每1平方厘米聚合物多孔质膜达1.0×10⁵个以上。

5.权利要求1～4之任一项所述的方法，其中将2个以上的聚合物多孔质膜上下或左右积层到细胞培养基中而使用。

6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中将上述聚酰亚胺多孔质膜

(i)折叠，

(ii)卷成轮状，

(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者，

(iv)连接成绳状

而在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定而使用。

7.权利要求1～6之任一项所述的方法，其中在工序(2)中，聚酰亚胺多孔质膜的一部分或整体不与细胞培养基的液相接触。

8.权利要求1～7之任一项所述的方法，其中在工序(2)中，细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积是含细胞生存域的聚酰亚胺多孔质膜体积的总和的10000倍或比其少。

9.权利要求1～8之任一项所述的方法，其中上述表面层A的平均孔径是0.01～50μm。

10.权利要求1～9之任一项所述的方法，其中上述表面层B的平均孔径是20～100μm。

11.权利要求1～10之任一项所述的方法，其中上述聚合物多孔质膜的膜厚是5～500μm。

12.权利要求1～11之任一项所述的方法，其中上述聚合物多孔质膜是聚酰亚胺多孔质膜。

13.权利要求12所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。

14.权利要求12或13所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是通过使从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和含着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。

15.权利要求1～11之任一项所述的方法，其中上述聚合物多孔质膜是聚醚砜多孔质膜。

16.调制干细胞的方法，其包括：

(1)将上述干细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及

(2)培养上述干细胞，使增殖的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通，

在上述工序(2)中上述干细胞的分化被抑制。

17.分化诱导干细胞的方法，其包括：

(1)将上述干细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、

(2)培养上述干细胞，使增殖的工序、及

(3)将培养的上述干细胞在分化诱导条件下培养的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通，

在上述工序(2)中上述干细胞的分化被抑制。