JP6225993B2 - 細胞の培養方法、細胞培養装置及びキット - Google Patents

Description

本出願は、２０１３年７月２６日に提出された日本国出願 特願２０１３−１５５５５０に基づく優先権を主張し、その全内容は本明細書中に取り込まれる。

本発明は、細胞の培養方法、細胞培養装置及びキットに関する。

細胞培養
細胞は生体内では一般に三次元的な集団として存在するが、古典的な平面培養では、細胞が容器に張り付く形で単層状に培養される。培養環境の相違により、細胞の性質も大きく異なることが数多く報告されている。また、液体培養培地中で細胞を培養する浮遊培養については、浮遊培養に適した細胞がある一方、適さない細胞もある。

ＳＣＩＶＡＸ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが開発したＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ（登録商標） Ｐｌａｔｅ（ＮＣＰ）は、ナノインプリント技術により、ボトム面に細胞外マトリックスを模倣したパターニング（マイクロスクエアとマイクロハニカム）を施した接着型の３次元培養マルチプレートである。マイクロスクエアは四角形状の、マイクロハニカムは六角形状の規則的な繰り返し構造をとる。細胞はこのマイクロパターンを足場として利用することにより、能動的にスフェロイド（細胞が多数凝集して三次元状態になったもの）を形成する。

また、均一的な極細胞突起（ナノピラー）を規則的に多数配列した細胞培養シート（「ナノピラー細胞培養シート」）を用いて、構造が生体肝臓組織に近い３次元の間細胞組織体（スフェロイド）の培養を行った事例が報告されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ａ．Ｊｕｎｅ ２０１２，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．６，ｐ．１９８３−１９９５）。

特開２００９−２１３４２１は、ハニカム状多孔質フィルム（ハニカムフィルム）を用いたスフェロイドの製造方法及びスフェロイド製造装置を記載している。

これらの細胞培養方法は、規則正しい繰り返しパターンを有するシート（フィルム）を利用するものであること、細胞はシートの表面状に接着して増殖すること、細胞培養により形成されるのは、同様の形状の細胞が多数凝集して三次元状態になったスフェロイドであること、において共通しており、その意味において限定的であった。細胞をより簡便に、効率よく、かつ安定して培養するための方法の開発が希求されていた。

ポリイミド多孔質膜
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。

ポリイミド多孔質膜は、本発明前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。国際公開 ＷＯ２０１０／０３８８７３、特開２０１１−２１９５８５、及び特開２０１１−２１９５８６は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。

特開２００９−２１３４２１ ＷＯ２０１０／０３８８７３ 特開２０１１−２１９５８５ 特開２０１１−２１９５８６

Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ａ．Ｊｕｎｅ ２０１２，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．６，ｐ．１９８３−１９９５

本発明は、細胞の培養方法、並びに、当該培養方法に使用するための細胞培養装置及びキットに関する。

限定されるわけではないが、本発明は好ましくは以下の態様を含む

［態様１］
細胞をポリイミド多孔質膜に適用し、培養することを含む、細胞の培養方法。

［態様２］
細胞を前記ポリイミド多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様１に記載の方法。

［態様３］
前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を乗せ、
前記ポリイミド多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様１に記載の方法。

［態様４］
前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養培地又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様１に記載の方法。

［態様５］
生細胞が前記ポリイミド多孔質膜内に留まり、死細胞は水分とともに流出する、態様４に記載の方法。

［態様６］
前記滅菌された液体が、滅菌水若しくは滅菌された緩衝液である、態様４又は５に記載の方法。

［態様７］
細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリイミド多孔質膜を入れる、ここにおいて、ポリイミド多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である、ことを含む、態様１−６のいずれか１項に記載の方法。

［態様８］
２以上の前記ポリイミド多孔質膜の小片を用いることを特徴とする、態様７に記載の方法。

［態様９］
細胞が、前記ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する、態様７又は８に記載の方法。

［態様１０］
前記ポリイミド多孔質膜を
ｉ）折り畳んで、
ｉｉ）ロール状に巻き込んで、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
ｉｖ）縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させる、態様１−６のいずれか１項に記載の方法。

［態様１１］
細胞が、前記ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する、態様１０に記載の方法。

［態様１２］
２以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いることを含む、態様１に記載の方法。

［態様１３］
態様２−１２のいずれか１項に記載の方法の２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いる、態様１に記載の方法。

［態様１４］
細胞がポリイミド多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する、態様１−１３のいずれか１項に記載の方法。

［態様１５］
細胞が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、態様１−１４のいずれか１項に記載の方法。

［態様１６］
動物細胞が、脊椎動物門に属する動物由来の細胞である、態様１５に記載の方法。

［態様１７］
細菌が、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアからなる群から選択される、態様１５に記載の方法。

［態様１８］
細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から選択される、
態様１−１４のいずれか１項に記載の方法。

［態様１９］
細胞が、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択される、態様１−１３のいずれか１項に記載の方法。

［態様２０］
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、態様１−１９のいずれか１項に記載の方法。

［態様２１］
ポリイミド多孔質膜を含む、態様１−２０のいずれか１項に記載の細胞の培養方法に使用するための細胞培養装置。

［態様２２］
２以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層している、態様２１に記載の細胞培養装置。

［態様２３］
ポリイミド多孔質膜を含む、態様１ないし２０のいずれか１項に記載の細胞の培養方法に使用するためのキット。

本発明は、ポリイミド多孔質膜に細胞を適用すると、細胞が生育する、という発見に基づく。細胞は、ポリイミド多孔質膜に好ましくは自発的に接着し、膜の表面及び内部において増殖しうる。本発明の方法により、細胞を簡便に、効率よく、かつ安定して培養することが可能になった。

図１は、ポリイミド多孔質膜への細胞懸濁液の播種形態の１態様として自然播種を示したものである。 図２は、ポリイミド多孔質膜への細胞懸濁液の播種形態の１態様として、吸込み播種を示したものである。 図３は、ヒト間葉系幹細胞の自然播種時の播種面別経時的変化を示したものである。 図４は、ヒト皮膚線維芽細胞の自然播種の播種面別経時的変化を示したものである。 図５は、ヒト皮膚線維芽細胞Ｂ面播種時の観測結果（２４時間後）（ウェット膜法）を示した、蛍光顕微鏡写真及び実体顕微鏡写真を示す。 図６は、ヒト間葉系幹細胞のＡ面吸込み播種時の経時的変化を示したものである（一点ウェット法）。 図７は、ヒト間葉系幹細胞のＢ面吸込み播種時の経時的変化を示したものである（一点ウェット法）。 図８は、ヒト間葉系幹細胞絡め取り播種時の観測面別経時的変化を示したものである。 図９は、ヒト間葉系幹細胞絡め取り播種時の低倍率写真及び実験の概観に関する写真である。 図１０は、ＰＣ１２細胞吸込み播種時の経時的変化を示したものである。 図１１は、ヒト皮膚線維芽細胞を、膜厚２５μｍのポリイミド多孔質膜を用いて培養した場合の細胞数を示す。横軸は培養後の日数を示し、縦軸は膜１平方センチメートルあたりの細胞数を示す。 図１２は、ヒト皮膚角化細胞をポリイミド多孔質膜を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 図１３は、ヒト臍帯静脈内皮細胞をポリイミド多孔質膜を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 図１４−１は、Ｖｅｒｏ細胞をポリイミド多孔質膜（２５μｍシート）を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 図１４−２は、Ｖｅｒｏ細胞をポリイミド多孔質膜（４０μｍシート）を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 図１４−３は、Ｖｅｒｏ細胞をポリイミド多孔質膜（７５μｍシート）を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 図１５−１は、ＨｅＬａ細胞をポリイミド多孔質膜（２５μｍシート）を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 図１５−２は、ＨｅＬａ細胞をポリイミド多孔質膜（４０μｍシート）を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 図１５−３は、ＨｅＬａ細胞をポリイミド多孔質膜（７５μｍシート）を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 図１６−１は、ＣＨＯ細胞をポリイミド多孔質膜（２５μｍシート）を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 図１６−２は、ＣＨＯ細胞をポリイミド多孔質膜（４０μｍシート）を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。 図１６−３は、ＣＨＯ細胞をポリイミド多孔質膜（７５μｍシート）を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。

Ｉ．細胞の培養方法
本発明は、細胞の培養方法に関する。

本発明の細胞の培養方法は、細胞をポリイミド多孔質膜に適用し、培養することを含む。本発明者らは、ポリイミド多孔質膜が細胞の接着、培養に適していることを見出し、本発明を想到した。本発明の方法は、ポリイミド多孔質膜に細胞を適用し、ポリイミド膜の表面又は内部で細胞を培養することを含むことを特徴とするものである。

細胞のポリイミド多孔質膜への適用
細胞のポリイミド多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法は、例えば、以下のような態様を含む。
（Ａ）細胞を前記ポリイミド多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
（Ｂ）前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を乗せ、
放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
（Ｃ）前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。

（Ａ）の態様は、ポリイミド多孔質膜の表面に細胞、細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリイミド多孔質膜を細胞縣濁液中に入れて、膜の表面から細胞培養液を浸潤させる態様も含む。

ポリイミド多孔質膜の表面に播種された細胞は、ポリイミド多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞はポリイミド多孔質膜に自発的に接着する。ポリイミド多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。

（Ｂ）の態様において、ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を乗せる。ポリイミド多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませることにより、細胞縣濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリイミド多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の細胞縣濁液が装填された箇所に細胞が吸い込まれて播種される。

あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填してもよい。この場合、細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。

例えば、本明細書の実施例４に記載の一点ウェット法は、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法であり、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、本明細書の実施例３に記載のウェット膜法は、ポリイミド多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に細胞懸濁液を装填する方法である。この場合、ポリイミド多孔質膜の全体において、細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。

（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる。これにより細胞縣濁液中の細胞の濃度を濃縮する、細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。

（Ａ）の態様を「自然播種」（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。

限定されるわけではないが、好ましくは、ポリイミド多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の好ましい態様において、生細胞が前記ポリイミド多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。本発明の実施例３において、本発明の前記ポリイミド多孔質膜に適用する前の細胞培養培地（細胞縣濁液）中では生細胞率９０％であったが、ポリイミド多孔質膜に適用し、流出させた液体中では生細胞率６５％であった。細胞生死で比較すると、生細胞の膜への吸着率は８８％、滲出率は１２％で、死細胞の膜への吸着率は４０％、滲出率は６０％であった。本発明の前記ポリイミド多孔質膜には生細胞が選択的に吸着することが理解される。

態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、（＋）及び（−）Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ、（＋）及び（−）Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。

本発明はさらに、浮遊状態にある接着性細胞をポリイミド多孔質膜と縣濁的に共存させることにより細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の細胞の培養方法において、細胞をポリイミド多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリイミド多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合ポリイミド多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である。ポリイミド多孔質膜の性質から、細胞はポリイミド多孔質膜に接着しうる。よって、生来浮遊培養に適さない細胞であっても、ポリイミド多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で培養することが可能である。好ましくは、細胞は、ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞がポリイミド多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。

細胞培養は、細胞培養における存在形態により培養細胞は接着培養系細胞と浮遊培養系細胞に分類することができる。接着培養系細胞は培養容器に付着し増殖する培養細胞であり、継代には培地交換を行う。浮遊培養系細胞は培地中において浮遊状態で増殖する培養細胞であり、一般的には継代の際には培地交換は行わず、希釈培養を行う。浮遊培養は、浮遊状態、即ち液体中での培養が可能なため、大量培養が可能であり、培養容器表面にのみ生育する付着細胞と比較すると、立体的な培養である為に、単位空間当りの培養可能細胞数は多いという利点がある。

本発明により、概念的には、細胞の種類に限定されずに浮遊培養と類似した形態で細胞を育成する事が可能になったことにより、大量の細胞を簡便に培養する方法が提供された。 本発明の細胞培養方法において、ポリイミド多孔質膜を細胞培養培地中に浮遊した状態で用いる場合、２以上の前記ポリイミド多孔質膜の小片を用いてもよい。ポリイミド多孔質膜はフレキシブルな薄膜であるため、例えばその小片を培養液中に浮遊させて用いることにより、一定容量の細胞培養培地中に多くの表面積を有するポリイミド多孔質膜を持ち込むことが可能となる。通常培養の場合、容器底面積が細胞培養可能な面積の上限となるが、本発明のポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養では、先の持ち込まれたポリイミド多孔質膜の大表面積の全てが細胞培養可能な面積となる。ポリイミド多孔質膜は細胞培養液を通過させるので、例えば折りたたまれた膜内にも栄養や酸素等の供給が可能となる。

ポリイミド多孔質膜の小片の大きさ、形状は、特に限定されない。形状は、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など任意の形をとりうる。例えば、一辺の長さが約０．１ｍｍ−約２０ｍｍ、好ましくは約０．２ｍｍ−約１０ｍｍの、より好ましくは、約１ｍｍ−約５ｍｍの四角形（正方形、長方形等）、三角形などが含まれる。あるいは、例えば、好ましくは、直径が約０．１ｍｍ−約２０ｍｍ、より好ましくは約０．５ｍｍ−約１０ｍｍの円形でもよい。これらの小片を液中に分散させることにより、浮遊培養と近似の形態が形成されることになる。

本発明のポリイミド多孔質膜は柔軟性があるため形状を変化させて用いることができる。ポリイミド多孔質膜を平面状ではなく、立体状に形状を加工して用いてもよい。例えば、ポリイミド多孔質膜を、ｉ）折り畳んで、ｉｉ）ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、ｉｖ）縄状に結んで、細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させてもよい。ｉ）−ｉｖ）のように形状を加工することにより、小片を用いる場合と同様に、一定容量の細胞培養培地中に多くのポリイミド多孔質膜を入れることができる。さらに、各小片を集合体として取り扱うことができるため、細胞体を集合化して移動させることが可能となり、総合的な応用性が高い。

小片集合体と同様の考え方として、２以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いてもよい。積層とは、ポリイミド多孔質膜が一部重なる態様も含む。積層培養により、狭いスペースで高密度に細胞を培養することが可能になる。既に細胞が育成している膜上にさらに膜を積層させて設置して別種細胞との多層系を形成することも可能である。さらに、立体環境下での細胞間相互作用検証や、ストレスのない細胞培養方法など、創薬への利用も可能である。積層するポリイミド多孔質膜の数は特に限定されない。

上述した本発明の細胞の培養方法を、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）−（Ｃ）のいずれかの方法を用いて先ずポリイミド多孔質膜に細胞を適用し、次いで、細胞が接着したポリイミド多孔質膜を浮遊培養してもよい。あるいは、ポリイミド多孔質膜に適用する工程として、上記態様（Ａ）−（Ｃ）のいずれかの方法を２種類又はそれより多くを組み合わせて用いてもよい。

本発明の方法において、好ましくは、細胞はポリイミド多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する。細胞が立体構造体の内部に生育して増殖することを示した報告例はない。本発明においてポリイミド多孔質膜の利用により、細胞の継続的な三次元培養が可能になった。限定されるわけではないが、本発明の方法により、細胞は２日以上、より好ましくは４日以上、さらに好ましくは６日以上増殖し続ける。本明細書の記載の実施例１及び４では、２１日間細胞が増加することが観察された。

２．細胞
本発明の方法に利用し得る細胞の種類は特に限定されず、任意の細胞の増殖に利用可能である。

例えば、細胞は、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。動物細胞は、脊椎動物門に属する動物由来の細胞と無脊椎動物（脊椎動物門に属する動物以外の動物）由来の細胞とに大別される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。

本明細書における植物細胞の由来は特に限定されない。コケ植物、シダ植物、種子植物を含む植物の細胞が対象となる。

種子植物細胞が由来する植物は、単子葉植物、双子葉植物のいずれも含まれる。限定されるわけではないが、単子葉植物には、ラン科植物、イネ科植物（イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ソルガム等）、カヤツリグサ科植物などが含まれる。双子葉植物には、キク亜綱、モクレン亜綱、バラ亜綱など多くの亜綱に属する植物が含まれる。

藻類も、細胞由来生物として見なす事が出来る。真正細菌であるシアノバクテリア（藍藻）から、真核生物で単細胞生物であるもの（珪藻、黄緑藻、渦鞭毛藻など）及び多細胞生物である海藻類（紅藻、褐藻、緑藻）などの異なるグループを含む。

本明細書における古細菌及び細菌の種類も特に限定されない。古細菌は、メタン菌・高度好塩菌・好熱好酸菌・超好熱菌等からなる群から構成される。細菌は、例えば、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアなどからなる群から選択される。

本発明の方法に利用しうる動物細胞又は植物細胞の種類は、限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及び生殖細胞からなる群から選択される。

本発明において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開ＷＯ２００９／１２３３４９（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。

「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。

「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、繊維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。

「生殖細胞」は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞を意味する。例えば、有性生殖のための配偶子、即ち卵子、卵細胞、***、精細胞、無性生殖のための胞子などを含む。

細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択してもよい。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌で、軟部肉腫、悪性骨腫瘍などを含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」とは、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ−６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する細胞株が存在する。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。動物細胞、植物細胞、細菌の形質転換については、各々適した方法が公知である。

３．ポリイミド多孔質膜
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。

本発明のポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。

テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理する事により得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。

ポリアミック酸
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。

ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。

ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。

着色前駆体
本発明において着色前駆体とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。

本発明で用いられる着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。

着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。

炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。

テトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。

ジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。

１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのベンゼンジアミン；

２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；

３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；

４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。

これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。

これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。

ポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。

本発明のポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。

限定されるわけではないが、ポリイミド多孔質膜として、少なくとも、２つの表面層（Ａ面及びＢ面）と、当該２つの表面層の間に挟まれたマクロボイド層とを有する多層構造のポリイミド多孔質膜を、本発明の方法に使用することが可能である。好ましくは、ポリイミド多孔質膜は、前記マクロボイド層が、前記表面層（Ａ面及びＢ面）に結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層（Ａ面及びＢ面）に囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０〜５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、前記のマクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層（Ａ面及びＢ面）はそれぞれ、厚さが０．０１〜２０μｍであり、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の孔を有し、当該細孔同士が連通しても良く、更に前記マクロボイドに連通して部分的あるいは前面的に多層構造を有しており、そして、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。

総膜厚は、限定されるわけではないが、一態様として２５−７５μｍとしてもよい。膜厚の相違により、細胞の増殖速度、細胞の形態、面内における細胞の飽和度等に相違が観察されうる。

一態様において、ポリイミド多孔質膜のＡ面が平均孔径１５μｍ以下の小さい穴を有するメッシュ構造であり、Ｂ面が平均孔径２０μｍ以上の大穴構造である。

例えば、国際公開 ＷＯ２０１０／０３８８７３、特開２０１１−２１９５８５、又は特開２０１１−２１９５８６に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明の方法に使用可能である。

ポリイミド多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は膜中の生育・増殖する位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。本発明の一態様において、細胞の種類に応じて、ポリイミド多孔質膜の表面及び内部を移動しながら、形状を変化させながら増殖することもある。

４．細胞の培養方法、細胞培養培地
本発明の方法において、ポリイミド多孔質膜に細胞を適用した後、細胞を任意の公知の方法を用いて培養することができる。動物細胞、植物細胞、及び細菌の各細胞に適した培養方法が公知であり、当業者は任意の公知の方法を用いてポリイミド多孔質膜に細胞を培養することができる。細胞培養培地も細胞の種類に応じて適宜調製することができる。

動物細胞の細胞培養方法、細胞培養培地は、例えば、ロンザ社の細胞培養培地カタログに記載されている。植物細胞の細胞培養方法、細胞培養培地は、例えば、ＷＡＫＯ社の植物組織培地シリーズ等に記載されている。細菌の細胞培養方法、細胞培養培地は、例えば、ＢＤ社の一般細菌用培地カタログに記載されている。

ＩＩ．細胞培養装置
本発明はまた、ポリイミド多孔質膜を含む、本発明の培養方法に使用するための細胞培養装置に関する。本発明の細胞培養装置において、ポリイミド多孔質膜は固定されて用いられても良く、あるいは細胞培養培地中に浮遊して用いられても良い。細胞培養装置において、２以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層してもよい。

本発明の細胞培養装置は、ポリイミド多孔質膜を含む、という要件を満たせば公知の細胞培養装置を用いることが可能である。培養装置の形状、規模などは特に限定されず、シャーレ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ セルファクトリー等が含まれる。なお、本発明においてポリイミド多孔質膜を用いることにより、生来浮遊培養が可能でなかった細胞についても浮遊培養向け装置にて、浮遊培養類似状態での培養を行うことが可能になった。浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコが使用可能である。

ＩＩＩ．細胞の培養方法に使用するためのキット
本発明はさらに、ポリイミド多孔質膜を含む、細胞の培養方法に使用するためのキットに関する。

本発明のキットは、ポリイミド多孔質膜の他に、細胞培養に必要な構成要素を適宜含みうる。例えば、ポリイミド多孔質膜に適用する細胞、細胞培養培地、細胞培養装置、キットの取り扱い説明書などが含まれる。

限定されるわけではないが、一態様として、透明なパウチ内に滅菌されたポリイミド多孔質膜が単独で又は複数枚保存され、そのままで細胞培養に使用可能な形態を含むパッケージや、あるいは、同パウチ内にポリイミド多孔質膜と共に滅菌液体が封入されており、効率的吸込み播種が可能になっている膜・液体の一体型形態のキットを含む。

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。以後、特に記述しない場合には、「ポリイミド多孔質膜」は膜厚２５μｍのポリイミド多孔質膜をいうものとする。

実施例１ ヒト間葉系幹細胞のポリイミド多孔質膜への自然播種
本実施例では、ヒト間葉系幹細胞を用いて、ポリイミド多孔質膜への播種を行った。

２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器に細胞培養培地０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面もしくは大穴構造のＢ面を上にして浸漬させる。別途、培地１ｍｌあたり３．６×１０^５個のヒト間葉系幹細胞（そのうち、生細胞は３．４×１０^５個、死細胞は２．０×１０^４個、生細胞率９４％）を懸濁した、ヒト間葉系幹細胞懸濁液を準備した。細胞懸濁液を６０μｌずつ、上記正方形容器中の細胞培養培地に添加した。

細胞培養装置にて培養し、１時間、５時間、２４時間、４８時間、４日間、７日間、１４日間、２１日間後に固定・染色（ＤＡＰＩ、又はアクチン（ａｃｔｉｎ）＋ＤＡＰＩ）し、細胞の生育と増殖を確認した。アクチンの染色はファロイジンで行った。経時的な細胞の増殖と播種面特異的な形態を観測した。結果を図３に示す。この結果より、代表的な幹細胞のひとつであるヒト間葉系幹細胞も、本願発明の方法により培養できることが示された。

実施例２ ヒト皮膚線維芽細胞のポリイミド多孔質膜への自然播種
本実施例では、ヒト皮膚線維芽細胞を用いて、自然播種により細胞のポリイミド多孔質膜への適用を行った。

２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器に細胞培養培地０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面もしくは大穴構造のＢ面を上にして浸漬させる。別途、培地１ｍｌあたり８．３×１０^５個のヒト皮膚線維芽細胞（そのうち、生細胞は８．１×１０^５個、死細胞は２．０×１０^４個、生細胞率９８％）を懸濁した、ヒト皮膚線維芽細胞懸濁液を準備した。細胞懸濁液を５０μｌずつ、上記正方形容器中の細胞培養培地に添加した。

細胞培養装置にて培養し、１時間、５時間、２４時間、４８時間、４日間、７日間、１４日間、２１日間後に固定・染色（ＤＡＰＩ、又はアクチン＋ＤＡＰＩ）し、細胞の生育と増殖を確認した。経時的な細胞の増殖と播種面及び観察面特異的な形態を観測した。結果を図４に示す。この結果により、代表的な線維芽細胞のひとつであるヒト皮膚線維芽細胞も、本願発明の方法により培養できることが示された。

実施例３ ヒト皮膚線維芽細胞のポリイミド多孔質膜への吸込み播種（ウェット膜法）
本実施例では、ヒト皮膚線維芽細胞を用いて、ウェット膜（十分に湿潤した膜；詳細は以下に説明）への吸込み播種により細胞のポリイミド多孔質膜への適用を行った。

培地１ｍｌあたり１．０×１０^６個の細胞（そのうち、生細胞は９．１×１０^５個、死細胞は１．０×１０^５個、生細胞率９０％）を懸濁した、ヒト皮膚線維芽細胞懸濁液を準備した。１０ｃｍ×１４ｃｍの角型プレート上に、予め細胞培養培地１ｍｌにて湿潤させた１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜２５枚を重ならない様に並べ、各ポリイミド多孔質膜Ｂ面に２０μｌずつ細胞懸濁液を添加した。滲出した液をすり切り、ポリイミド多孔質膜を７５ｃｍ^２シャーレに移し培地１２ｍｌを加える。そのまま、通常培養条件下で培養を行い、翌日に試料を固定した。図５に、２４時間後に固定・蛍光染色（ＤＡＰＩ、又はアクチン＋ＤＡＰＩ）した試料の蛍光顕微鏡写真及び実体蛍光顕微鏡写真を示す。

なお、播種工程の際、滲出した液を回収し更に上記角型プレートを培地２ｍｌで洗浄してプレート上に残留した細胞をカウントしたところ、総細胞数は６．０×１０^４個で、そのうち生細胞は５．５×１０^４個、死細胞は３．０×１０^４個、生細胞率６５％であった。細胞生死で比較すると、生細胞の膜への吸着率は８８％、滲出率は１２％で、死細胞の膜への吸着率は４０％、滲出率は６０％となった。

実施例４ ヒト間葉系幹細胞のポリイミド多孔質膜への吸込み播種（一点ウェット法）
本実施例では、ヒト間葉系幹細胞を用いて、一点ウェット膜（中央の一点のみ液滴に濡らして簡単に固定した膜；詳細は以下に説明）への吸込み播種により細胞のポリイミド多孔質膜への適用を行った。

本実施例では、ヒト間葉系幹細胞を用いて、膜材料の中央部一点のみを湿潤した膜への吸込み播種により細胞のポリイミド多孔質膜への適用を行った例を示す。

膜を置く予定の中央部に、１０μｌ程度の液滴を形成させ、その上にポリイミド多孔質膜を置く事で、膜の部位を固定させ播種し易い場所を作ると共に、更に湿潤を利用して、細胞液膜透過の迅速化を目指した。

培地１ｍｌあたり１．０×１０^６個の細胞（そのうち、生細胞は９．６×１０^５個、死細胞は４．０×１０^４個、生細胞率９６％）を懸濁した、ヒト間葉系幹細胞懸濁液を準備した。１０ｃｍ×１４ｃｍの角型プレート上に、滅菌・乾燥した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜Ａ面及びＢ面各１０枚を重ならない様に並べ、各ポリイミド多孔質膜４０μｌずつ細胞懸濁液を添加した。滲出した液をすり切り、ポリイミド多孔質膜を１０ｃｍ^２シャーレに播種面毎に移し、培地２ｍｌを加える。そのまま、通常培養条件下で培養を行い、０．５時間、３日間、７日間、１２日間後に固定・染色（ＤＡＰＩ、アクチン＋ＤＡＰＩ、又はアクチン）し、細胞の生育と増殖を確認した。結果を図６及び７に示す。

尚、播種工程の際、滲出した液を回収し更に上記角型プレートを培地４ｍｌで洗浄してプレート上に残留した細胞をカウントしたところ、Ａ面播種の場合、総細胞数は６．５×１０^４個で、そのうち生細胞は４．０×１０^４個、死細胞は２．５×１０^４個、生細胞率６２％であった。細胞生死で比較すると、生細胞の膜への吸着率は８９％、滲出率は１１％で、死細胞はほぼ吸着せず流出したと思われる。また、Ｂ面播種の場合、回収総細胞数は６．５×１０^４個で、そのうち生細胞は８．０×１０^４個、死細胞は２．０×１０^４個、生細胞率８０％であった。細胞生死で比較すると、生細胞の膜への吸着率は７９％、滲出率は２１％で、死細胞はほぼ吸着せず流出したと思われる。

実施例５ ヒト間葉系幹細胞のポリイミド多孔質膜への絡め取り播種
本実施例では、ヒト間葉系幹細胞を用いて、細胞縣濁液からの絡め取りにより細胞のポリイミド多孔質膜への適用を行った。

一辺１０ｃｍの正方形のポリイミド多孔質膜を、はさみを用いて凡そ２〜３ｍｍ角の小片に細断し、１６０℃で１０分間滅菌した後に放冷し、２ｍｌの滅菌した培地で湿潤する。その後、ポリイミド多孔質膜をピンセットで取り出し、ファルコンチューブ中に移した。ファルコンチューブ中の膜の上に、培地１ｍｌあたり３．６×１０^５個の細胞（そのうち、生細胞は３．４×１０^５個、死細胞は２．０×１０^４個、生細胞率９４％）を懸濁した、ヒト間葉系幹細胞懸濁液１．６ｍｌを添加した（細胞総数５．７×１０^５個中、生細胞は５．４×１０^５個、死細胞は３．２×１０^４個）。時々振り混ぜながら培養装置内に２時間放置し、液部の細胞量を測定すると、２．０×１０^５個の細胞（そのうち、生細胞は１．２×１０^５個で、死細胞は８．０×１０^４個、生細胞率６０％）が観測された。小片のポリイミド多孔質膜を取り出し、４ｍｌの培地を張った２０ｃｍ^２シャーレに移し、培養装置中で培養を継続した。小片を４８時間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間後に固定・染色（ＤＡＰＩ、又はアクチン＋ＤＡＰＩ）し、細胞の生育と増殖を確認した。結果を図８及び図９に示す。

実施例６ 株化細胞のポリイミド多孔質膜の小片への吸込み播種
本実施例では、株化細胞のＰＣ１２細胞を用いて、吸込みにより細胞のポリイミド多孔質膜の小片への適用を行った。

１０ｃｍ×１４ｃｍの角型プレート上に、予め培地５ｍｌにて湿潤させ、余分な液体を除いた１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜１５枚を上下左右に一部重複する様にランダムに並べた。培地１ｍｌあたり９．０×１０^５個の細胞（そのうち、生細胞は７．４×１０^５個で、死細胞は１．７×１０^５個、生細胞率８２％）を懸濁した、ラット副腎褐色細胞腫ＰＣ１２の細胞懸濁液を別途準備した。当該細胞縣濁液２ｍｌを、プレートをやや傾けて滲出液を下方に移動させる様にしながら、ゆっくりと順次膜上に添加した。５分後にポリイミド多孔質膜の滲出液をすり切り、予め用意した２０ｃｍ^２のシャーレに培地４ｍｌを張った中に移動させ、培養装置中で培養を行った。

４８時間、４日間、６日間、９日間後にポリイミド多孔質膜を固定・染色し、細胞の増殖を確認した。染色は、メンブレン蛍光染色剤セルマスク（ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔａｉｎ（ライフテクノロジーズ社）。以後、単にＣｅｌｌＭａｓｋと記載する）＋ＤＡＰＩで行った。結果を図１０に示す。本細胞でも、ポリイミド多孔質膜内で集団を形成しながら増殖する様子が観測され、適用の可能性が確認された。この結果より、代表的な株化細胞のひとつであるＰＣ１２細胞も、本願発明の方法により培養できることが示された。

実施例７ 培養細胞数の測定
本実施例では、ヒト皮膚線維芽細胞をポリイミド多孔質膜を用いた本願発明の方法により培養し、培養細胞数を測定した。

１、通常培養細胞のＣＣＫ８を用いた細胞数計測
先ず、以下の試薬及び方法を用いて、通常培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求めた。
［試薬］ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ Ｋｉｔ８；同人化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）
［方法］ 一定期間５ｃｍ^２のチャンバー型シャーレ上で培養したヒト皮膚線維芽細胞を用意して、その培養上清を除去し、２％のＣＣＫ８を加えた一定量の培地で置換して、２時間インキュベータ内で保存する。その後、着色した上清を抜き出して４８０ｎｍの波長にて吸光度を測定する（ブランクは、培地のみを用いて測定した条件を使用）。その後、同上清を除去した後にリン酸バッファーで２回細胞を洗浄し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で処理して細胞数をカウントする。
この方法で培養条件とＣＣＫ８濃度の条件おける吸光度と実際の細胞数との相関係数を求めた。

２．ポリイミド多孔質膜上に増殖した細胞数の測定
１と同様に、細胞を培養した２ｃｍ^２（１．４ｃｍ＊１．４ｃｍ）のポリイミド多孔質膜を５ｃｍ^２のチャンバー型シャーレに移し、５％のＣＣＫ８を加えた培地を一定量加え、１〜３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４８０ｎｍの波長にて吸光度を測定する。この場合、使用するＣＣＫ８を２．５倍使用しており、一方で、面積的には２．５倍少ない面積しかポリイミド多孔質膜の面積が無いので、１での読み値との比較を、そのまま行なう事が出来る。（濃度や面積等の条件を変化させた場合には、換算が必要となる。）１、で求めた換算係数を用いて部材上に生存する細胞数の計算を行い、その後、培地で２回洗浄して、インキュベータ内に戻し培養を継続する。この作業を繰り返して、経時的にポリイミド多孔質膜上の細胞が増殖する様子を定量的に解析した。実験数を重ねて、再現性の検証も行なった。

自然播種及び吸込み播種を各々３回行った結果を図１１に示す。図１１に示す通り、播種の方法に依存して細胞の増殖速度は異なるが、１ヶ月程度の培養でその差は解消されて行き、類似した単位面積当たりの細胞数に到達する。図中の点線は、比較実験として実施したシャーレ等で通常の付着培養の際の培養細胞数上限を示している。面積ベースで細胞数を比較した場合、通常の細胞培養よりは多くの細胞を単位面積中に培養する事が可能となった。

実施例８ ヒト皮膚角化細胞の培養
本実施例では、ヒト皮膚角化細胞をポリイミド多孔質膜を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した。

２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器に細胞培養培地（ＫＧＭ−Ｇｏｌｄケラチノサイト増殖培地ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（ロンザ社））０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして浸漬させた。４×１０^４個のヒト皮膚角化細胞を、上記正方形容器中の細胞培養培地に添加した。すなわち、１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜１枚当たり、４×１０^４個のヒト皮膚角化細胞を自然播種した。

細胞培養装置にて培養し、１日間、３日間、６日間後に固定・染色した。染色は、ＣｅｌｌＭａｓｋ＋ＤＡＰＩ、またはＣｅｌｌＭａｓｋのみで行った。その後、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ７００（カールツァイス社製））及び実体蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍ１６５ ＦＣ（ライカ社製））を用いて、経時的な細胞の増殖と形態を観察した。

結果を図１２に示す。この結果より、ヒトの初代培養細胞（プライマリーカルチャーセル）であるヒト皮膚角化細胞も、本願発明の方法により培養できることが示された。

実施例９ ヒト臍帯静脈内皮細胞の培養
本実施例では、ヒト臍帯静脈内皮細胞をポリイミド多孔質膜を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した。

２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器に細胞培養培地（ＥＧＭ−２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（ロンザ社））０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして浸漬させた。４×１０^４個のヒト臍帯静脈内皮細胞を、上記正方形容器中の細胞培養培地に添加した。すなわち、１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜１枚当たり、４×１０^４個のヒト臍帯静脈内皮細胞を自然播種した。

細胞培養装置にて培養し、３日間、６日間、１０日間後に固定・染色（ＣｅｌｌＭａｓｋ＋ＤＡＰＩ及びＣｅｌｌＭａｓｋ）した。染色、ならびに共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡による観察は、実施例８と同様に行った。

結果を図１３に示す。この結果より、ヒトの初代培養細胞（プライマリーカルチャーセル）であるヒト臍帯静脈内皮細胞も、本願発明の方法により培養できることが示された。

実施例１０ Ｖｅｒｏ細胞の培養
本実施例では、Ｖｅｒｏ細胞をポリイミド多孔質膜を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した。ポリイミド多孔質膜は、２５μｍ、４０μｍ、７５μｍの３種類を用いた。培養期間は１日−１５日である。

２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器に細胞培養培地（ＤＭＥＭに１０％ＦＢＳおよび抗生物質を添加したもの）０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして浸漬させた。４×１０^４個のＶｅｒｏ細胞を、上記正方形容器中の細胞培養培地に添加した。すなわち、１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜１枚当たり、４×１０^４個のＶｅｒｏ細胞を自然播種した。

細胞培養装置にて培養し、１日間、３日間、７日間、１０日間、１５日間後に固定・染色した。染色は、アクチン＋ＤＡＰＩで行い、アクチンの検出はファロイジンにより行った。共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡による観察は、実施例８と同様に行った。

結果を図１４−１〜１４−３に示す。この結果より、代表的な株化細胞のひとつであるＶｅｒｏ細胞についても、本願発明の方法により培養できることが示された。

実施例１１ ＨｅＬａ細胞の培養
本実施例では、ＨｅＬａ細胞をポリイミド多孔質膜を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した。ポリイミド多孔質膜は、２５μｍ、４０μｍ、７５μｍの３種類を用いた。培養期間、用いた顕微鏡、具体的工程等は実施例１０に記載した通りである。

結果を図１５−１−図１５−３に示す。この結果より、代表的な株化細胞のひとつであるＨｅＬａ細胞についても、本願発明の方法により培養できることが示された。

実施例１２ ＣＨＯ細胞の培養
本実施例では、ＣＨＯ細胞をポリイミド多孔質膜を用いた本願発明の方法により培養し、共焦点レーザー顕微鏡及び実体蛍光顕微鏡で観察した。ポリイミド多孔質膜は、２５μｍ、４０μｍ、７５μｍの３種類を用いた。培養期間１日−７日間で、用いた顕微鏡、具体的工程等は実施例１０に記載した通りである。

結果を図１６−１〜図１６−３に示す。この結果より、代表的な株化細胞のひとつであるＣＨＯ細胞についても、本願発明の方法により培養できることが示された。

Claims (22)

1. 細胞をポリイミド多孔質膜に播種し、培養することを含み、ここで、前記ポリイミド多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記ポリイミド多孔質膜が液通過性である、細胞の培養方法。
2. 前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞懸濁液を乗せ、
   前記ポリイミド多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
   細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
   工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養培地又は滅菌された液体で湿潤し、
   前記湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞懸濁液を装填し、そして、
   細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
   工程を含む、請求項１に記載の方法。
4. 生細胞が前記ポリイミド多孔質膜内に留まり、死細胞は水分とともに流出する、請求項３に記載の方法。
5. 前記滅菌された液体が、滅菌水若しくは滅菌された緩衝液である、請求項３又は４に記載の方法。
6. 細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリイミド多孔質膜を入れる、ここにおいて、ポリイミド多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である、ことを含む、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
7. ２以上の前記ポリイミド多孔質膜の小片を用いることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 細胞が、前記ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する、請求項６又は７に記載の方法。
9. 前記ポリイミド多孔質膜を
   ｉ）折り畳んで、
   ｉｉ）ロール状に巻き込んで、
   ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
   ｉｖ）縄状に結んで
   細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させる、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
10. 細胞が、前記ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する、請求項９に記載の方法。
11. ２以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いることを含む、請求項１に記載の方法。
12. 請求項２−１１のいずれか１項に記載の方法の２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いる、請求項１に記載の方法。
13. 細胞がポリイミド多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する、請求項１−１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 細胞が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 動物細胞が、脊椎動物門に属する動物由来の細胞である、請求項１４に記載の方法。
16. 細菌が、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
17. 細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から選択される、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法。
18. 細胞が、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択される、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法。
19. ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１−１８のいずれか１項に記載の方法。
20. ポリイミド多孔質膜を含む、請求項１−１９のいずれか１項に記載の細胞の培養方法に使用するための細胞培養装置。
21. ２以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層している、請求項２０に記載の細胞培養装置。
22. ポリイミド多孔質膜を含む、請求項１−１９のいずれか１項に記載の細胞の培養方法に使用するためのキット。