CN109477056A - 虹吸式培养法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具备聚合物多孔质膜的细胞培养装置及使用其的细胞培养方法。提供具有虹吸结构或添水(鹿威)结构的细胞培养装置，所述细胞培养装置具备：聚合物多孔质膜、装纳该聚合物多孔质膜的细胞培养部、内部装纳有细胞培养部的储液部、在储液部的上部配置的培养基供给装置、在储液部的下部配置的培养基排出装置、以及回收滞留在储液部中待间歇性地喷出的培养基的培养基回收装置。

Description

虹吸式培养法
技术领域
本发明涉及具备聚合物多孔质膜的细胞培养装置。另外，涉及使用具备聚合物多孔质膜的细胞培养装置的细胞培养方法。
背景技术
近年来，用于治疗和疫苗的酶、激素、抗体、细胞因子、病毒(病毒蛋白)等蛋白质已经使用培养细胞工业化生产。但是，这样的蛋白质的生产技术的成本高，这增加了医疗费用。因此，为了大幅度削减成本，正在寻求高密度地培养细胞的技术以及增加蛋白质的生产量的创新技术。
作为生产蛋白质的细胞，有时使用粘附于培养基材的贴壁依赖性的贴壁细胞。由于这样的细胞以贴壁依赖性方式增殖，因此必须将它们贴附在培养皿、培养板或培养室的表面来培养。以往，为了大量培养这样的贴壁细胞，必须增加用于粘附的表面积。但是，为了增大培养面积，必然需要增大空间，这是导致成本增加的因素。
作为在减小培养空间的同时大量培养贴壁细胞的方法，正在开发具有微小多孔的载体、特别是使用微载体的培养法(例如，专利文献1)。使用微载体的细胞培养***需要充分搅拌和扩散，以使微载体不会彼此聚集。因此，需要尽可能地充分搅拌和扩散使微载体分散的培养基的容积，因而可培养的细胞的密度存在上限。另外，为了将微载体与培养基分离，需要用能分级微细颗粒的过滤器来分离，这也成为成本增加的原因。基于这种情况，正在寻求培养高密度细胞的创新的细胞培养的方法。
<聚酰亚胺多孔质膜>
在本申请提交之前，聚酰亚胺多孔质膜用于过滤器、低介电常数膜、燃料电池用电解质膜等特别是以电池相关为中心的用途。专利文献2～4中记载了，特别是气体等的物质透过性优异、空孔率高、两个表面的平滑性优异、强度相对较高、尽管空孔率高但对膜厚方向的压缩应力的耐力优异的、具有许多大孔的聚酰亚胺多孔质膜。它们均为经由酰胺酸制作的聚酰亚胺多孔质膜。
报道了包括将细胞应用于聚酰亚胺多孔质膜来培养的细胞的培养方法(专利文献5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2003/054174号
专利文献2：国际公开第2010/038873号
专利文献3：特开2011-219585号公报
专利文献4：特开2011-219586号公报
专利文献5：国际公开第2015/012415号
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的是提供具备聚合物多孔质膜的细胞培养装置。另外，本发明的目的是提供使用具备聚合物多孔质膜的细胞培养装置的细胞培养方法。
解决课题的手段
本发明人等发现，具有规定结构的聚合物多孔质膜不仅能提高可大量培养细胞的最佳空间，而且能提供耐干燥的潮湿环境，由此完成了可将细胞暴露于气相中来培养的装置及使用其的培养方法。即，虽然没有限定，本发明优选包括以下的方式。
[1]细胞培养装置，其特征在于，具备：
聚合物多孔质膜、
装纳上述聚合物多孔质膜的细胞培养部，
内部装纳有上述细胞培养部的储液部，
在上述储液部的上部配置的培养基供给装置，
在上述储液部的下部配置的培养基排出装置，
与上述培养基排出装置连通的倒U字管，和
设置在上述倒U字管的另一端、回收培养基的培养基回收装置；
其中，上述聚合物多孔质膜是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在上述表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中，上述表面层A中存在的孔的平均孔径小于上述表面层B中存在的孔的平均孔径，上述大孔层具有与上述表面层A和B结合的隔壁、以及被该隔壁及上述表面层A和B包围的多个大孔，
其中，从上述培养基供给装置供给到上述储液部的培养基的液面到达上述倒U字管的顶上部时，通过虹吸原理，培养基间歇性地喷出到上述培养基回收装置中。
[2]细胞培养装置，其特征在于，具备：
聚合物多孔质膜，
一端为储液部、另一端为底部的箱状体，其中，上述箱状体在上述储液部中具备装纳上述聚合物多孔质膜的细胞培养部，
在上述箱状体的底面侧的一部分设置的旋转轴，
支撑上述旋转轴的轴承，
在上述储液部的上部配置的培养基供给装置，和
在上述储液部的下部配置的培养基回收装置，
其中，上述聚合物多孔质膜是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在上述表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中，上述表面层A中存在的孔的平均孔径小于上述表面层B中存在的孔的平均孔径，上述大孔层具有与上述表面层A和B结合的隔壁、以及被该隔壁及上述表面层A和B包围的多个大孔，
其中，从上述培养基供给装置供给到上述储液部中的培养基在超过上述箱状体的底部的重量而供给时，上述储液部的培养基间歇性地喷出到上述培养基回收装置中。
[3]上述[1]或[2]所述的细胞培养液装置，其还具备：
一个端部与上述培养基回收装置连通的培养液排出管线，和
一个端部与上述培养基连通的培养液供给管线，
其中，上述排出管线的另一端部通过泵与上述培养液供给管线的另一端部连通，培养液可循环。
[4]上述[1]～[3]任一项所述的细胞培养装置，其中，上述培养液分配装置为雾供给喷嘴。
[5]上述[1]～[4]任一项所述的细胞培养装置，其中，上述聚合物多孔质膜以如下方式配置在上述平面流路中：
i)折叠，
ii)卷成卷状，
iii)将片或小片用线状结构体连接，
iv)系成绳状，和/或
v)2片以上层叠。
[6]上述[1]～[5]任一项所述的细胞培养装置，其中，上述聚合物多孔质膜是具备外壳的模块化聚合物多孔质膜，
其中，具备上述外壳的模块化聚合物多孔质膜以如下方式装纳在上述外壳内：
(i)2片以上独立的上述聚合物多孔质膜聚集在一起，
(ii)上述聚合物多孔质膜折叠，
(iii)上述聚合物多孔质膜卷成卷状，和/或
(iv)上述聚合物多孔质膜系成绳状，
其中，具备上述外壳的模块化聚合物多孔质膜设置在上述平面流路中。
[7]上述[1]～[6]任一项所述的细胞培养装置，其中，上述聚合物多孔质膜具有平均孔径为0.01～100μm的多个细孔。
[8]上述[1]～[7]任一项所述的细胞培养装置，其中，上述表面层A的平均孔径为0.01～50μm。
[9]上述[1]～[8]任一项所述的细胞培养装置，其中，上述表面层B的平均孔径为20～100μm。
[10]上述[1]～[9]任一项所述的细胞培养装置，其中，上述聚合物多孔质膜的平均膜厚为5～500μm。
[11]上述[1]～[10]任一项所述的细胞培养装置，其中，上述聚合物多孔质膜为聚酰亚胺多孔质膜。
[12]上述[11]所述的细胞培养装置，其中，上述聚酰亚胺多孔质膜是包含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。
[13]上述[11]或[12]所述的细胞培养装置，其中，上述聚酰亚胺多孔质膜是通过将包含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液及着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成型后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。
[14]上述[1]～[10]任一项所述的细胞培养装置，其中，上述聚合物多孔质膜为聚醚砜多孔质膜。
[15]细胞的培养方法，其使用[1]～[14]任一项所述的细胞培养装置。
发明效果
本发明通过使用聚合物多孔质膜作为细胞培养载体，即使在培养空间和培养基的量小的条件下，也可以简便且高效地进行连续型细胞培养。另外，由于本发明的聚合物多孔质膜具有微亲水性的多孔质特性，因而可以稳定地在聚合物多孔质膜内保持液体，保持耐干燥的潮湿环境。因此，即使是与以往的细胞培养装置相比极少量的培养基，也能实现细胞的生存和增殖。另外，即使聚合物多孔质膜的一部分或全部处于暴露在空气中的状态，也可以培养，因而可以对细胞进行有效的供氧，可以培养大量的细胞。
根据本发明，通过虹吸机构或添水(鹿威或惊鹿)机构，将细胞培养部直接暴露于气相中，由此能够稳定地实现稳定的氧供给，可以在不使用氧供给***的情况下进行大量的培养细胞。另外，由于是自发地重复液部的移动的***，因此，除了液体流通以外，可以在不使用特别的装置和能量的情况下继续操作。另外，由于细胞和下部的培养基储存部(也称为“细胞回收装置”)是分离的，因此，例如在pH调整和灌注葡萄糖等的调整中，可以使用强力搅拌和发泡等对细胞的禁忌，增加作业场所的选项，除此以外，还能从培养规模的理论上限等中释放出来，可以扩展到超大型的设备等中。
附图说明
[图1]图1是表示实施方式中的虹吸式细胞培养装置的图。
[图2]图2是表示实施方式中的添水式细胞培养装置的图。
[图3]图3中，(A)是表示一实施方式的干热灭菌型虹吸式细胞培养装置(耐热虹吸型反应器)的图，(B)是表示模块的图。
[图4]图4是表示一实施方式的细胞培养装置中的从液滴化培养基供给装置滴下的培养基的模式的概念图。(A)是表示滴落型的图，(B)是表示网型的图，(C)是表示淋浴型的图,(D)是表示用于供给滴落型和网型的液滴的一实施方式的细胞培养装置所采用的盖体的图。其中，在盖体的培养基供给口中***有将不锈钢制的网卷成卷儿而形成的网束。
[图5]图5是表示在一实施方式中，使用本发明的细胞培养装置时的由人皮肤成纤维细胞产生的纤连蛋白的量的图。作为对照，示出用通常的培养皿培养人皮肤成纤维细胞而产生的纤连蛋白的量(培养皿8天)。
[图6]图6是表示使用聚合物多孔质膜的细胞培养的模型图。
具体实施方式
以下，关于本发明的实施方式，根据需要参照附图进行说明。实施方式的构成是示例性的，本发明的构成不限定于实施方式的具体的构成。
1.聚合物多孔质膜
本发明中使用的聚合物多孔质膜中的表面层A(以下，也称为“A面”或“网面”)中存在的孔的平均孔径没有特殊限定，例如为0.01μm以上且小于200μm、0.01～150μm、0.01～100μm、0.01～50μm、0.01μm～40μm、0.01μm～30μm、0.01μm～20μm、或0.01μm～15μm，优选为0.01μm～15μm。
只要本发明中使用的聚合物多孔质膜中的表面层B(以下，也称为“B面”或“大孔面”)中存在的孔的平均孔径大于表面层A中存在的孔的平均孔径，就没有特殊限定，例如为大于5μm且为200μm以下，20μm～100μm、30μm～100μm、40μm～100μm、50μm～100μm、或60μm～100μm，优选为20μm～100μm。
聚合物多孔质膜表面的平均孔径可以通过如下方式求得：根据多孔质膜表面的扫描型电子显微镜照片，对200个点以上的开孔部测定孔面积，由该孔面积的平均值，根据下式(1)，计算孔的形状设为正圆时的平均直径。
[数1]
(式中，Sa是指孔面积的平均值。)
表面层A和B的厚度没有特殊限定，例如为0.01～50μm，优选为0.01～20μm。
聚合物多孔质膜中的大孔层中的大孔的膜平面方向的平均孔径没有特殊限定，例如为10～500μm，优选为10～100μm，更优选为10～80μm。另外，该大孔层中的隔壁的厚度没有特殊限定，例如为0.01～50μm，优选为0.01～20μm。在一个实施方式中，该大孔层中的至少1个隔壁具有连通相邻的大孔彼此的平均孔径为0.01～100μm、优选为0.01～50μm的1个或多个孔。在另一实施方式中，该大孔层中的隔壁不具有孔。
本发明中使用的聚合物多孔质膜表面的总膜厚没有特殊限定，可以为5μm以上、10μm以上、20μm以上或25μm以上，也可以为500μm以下、300μm以下、100μm以下、75μm以下或50μm以下。优选为5～500μm，更优选为25～75μm。
本发明中使用的聚合物多孔质膜的膜厚的测定可以通过接触式的厚度计进行。
本发明中使用的聚合物多孔质膜的空孔率没有特殊限定，例如为40％以上且低于95％。
本发明中使用的聚合物多孔质膜的空孔率可以通过测定被切成规定大小的多孔质膜的膜厚和质量，由单位面积质量，根据下式(2)求得。
[数2]
空孔率(％)＝(1-w/(S×d×D))×100 (2)
(式中，S是指多孔质膜的面积，d是指总膜厚，w是指测定的质量，D是指聚合物的密度。聚合物为聚酰亚胺时，密度为1.34g/cm3)。
本发明中使用的聚合物多孔质膜优选为如下这样的聚合物多孔质膜：其是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在上述表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中，上述表面层A中存在的孔的平均孔径为0.01μm～15μm，上述表面层B中存在的孔的平均孔径为20μm～100μm，上述大孔层具有与上述表面层A和B结合的隔壁、以及被该隔壁及上述表面层A和B包围的多个大孔，上述大孔层的隔壁、以及上述表面层A和B的厚度为0.01～20μm，上述表面层A和B中的孔与大孔连通，总膜厚为5～500μm，空孔率为40％以上且低于95％。在一个实施方式中，大孔层中的至少1个隔壁具有连通相邻的大孔彼此的平均孔径为0.01～100μm、优选为0.01～50μm的1个或多个孔。在另一实施方式中，隔壁不具有这样的孔。
本发明中使用的聚合物多孔质膜优选被灭菌。作为灭菌处理，没有特殊限定，可举出干热灭菌、蒸气灭菌、采用乙醇等消毒剂的灭菌、紫外线或伽玛射线等的电磁波灭菌等任意的灭菌处理等。
本发明中使用的聚合物多孔质膜只要具备上述的结构特征，就没有特殊限定，优选为聚酰亚胺多孔质膜、或聚醚砜(PES)多孔质膜。
1-1.聚酰亚胺多孔质膜
聚酰亚胺是指重复单元中含有酰亚胺键的高分子的统称，通常是指芳族化合物通过酰亚胺键直接连接的芳族聚酰亚胺。由于芳族聚酰亚胺在芳族和芳族之间经由酰亚胺键而具有共轭结构，因此具有刚硬而牢固的分子结构，并且由于酰亚胺键具有强的分子间力，因此具有非常高水平的热、机械和化学性质。
本发明中可使用的聚酰亚胺多孔质膜优选为含有由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺(作为主成分)的聚酰亚胺多孔质膜，更优选为由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺构成的聚酰亚胺多孔质膜。“作为主成分含有”是指作为聚酰亚胺多孔质膜的构成成分，基本上不含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺以外的成分，或者即便可以含有，也是不影响由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质的附加成分。
在一实施方式中，本发明中可使用的聚酰亚胺多孔质膜包括将含有由四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液以及着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成型后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。
聚酰胺酸由将四羧酸成分和二胺成分聚合而得到。聚酰胺酸是可以通过热酰亚胺化或化学酰亚胺化，闭环而形成聚酰亚胺的聚酰亚胺前体。
对于聚酰胺酸来说，即使是酰胺酸的一部分被酰亚胺化，只要是不影响本发明的范围，就可以使用这样的聚酰胺酸。即，可以将聚酰胺酸部分地进行热酰亚胺化或化学酰亚胺化。
在将聚酰胺酸进行热酰亚胺化时，可以根据需要，在聚酰胺酸溶液中添加酰亚胺化催化剂、含有有机磷的化合物、无机微粒、有机微粒等微粒等。另外，在将聚酰胺酸进行化学酰亚胺化时，可以根据需要，在聚酰胺酸溶液中添加化学酰亚胺化剂、脱水剂、无机微粒、有机微粒等微粒等。即使在聚酰胺酸溶液中配合上述成分，也优选在着色前体不析出的条件下进行。
本说明书中，“着色前体”是指通过250℃以上的热处理，部分或全部碳化而生成着色化物的前体。
作为在上述聚酰亚胺多孔质膜的制造中可使用的着色前体，优选为如下的前体：均匀地溶解或分散在聚酰胺酸溶液或聚酰亚胺溶液中，通过在250℃以上、优选260℃以上、更优选280℃以上、进一步优选300℃以上的热处理，优选在空气等的氧气存在下的250℃以上、优选260℃以上、更优选280℃以上、进一步优选300℃以上的热处理来进行热分解，碳化而生成着色化物的前体；更优选为生成黑色系着色化物的前体，进一步优选为碳系着色前体。
着色前体随着逐渐加热乍一看像是碳化物，但其包括组织中含有碳以外的不同元素的、层结构、芳族交联结构、含有四面体碳的无序结构的着色前体。
碳系着色前体没有特殊限制，例如可举出石油焦油、石油沥青、煤焦油、煤沥青等焦油或沥青、焦炭、由含有丙烯腈的单体得到的聚合物、二茂铁化合物(二茂铁和二茂铁衍生物)等。其中，优选为由含有丙烯腈的单体得到的聚合物和/或二茂铁化合物，作为由含有丙烯腈的单体得到的聚合物，优选使用聚丙烯腈。
另外，在另一实施方式中，本发明中可使用的聚酰亚胺多孔质膜也包括不使用上述着色前体，将由四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液成型后，通过热处理而得到的聚酰亚胺多孔质膜。
不使用着色前体而制造的聚酰亚胺多孔质膜例如可以通过如下方式制造：将含有极限粘度数为1.0～3.0的聚酰胺酸3～60质量％和有机极性溶剂40～97质量％的聚酰胺酸溶液流延成膜状，浸渍或接触在以水为必须成分的凝固溶剂中，制作聚酰胺酸的多孔质膜，然后对该聚酰胺酸的多孔质膜进行热处理而酰亚胺化来制造。在该方法中，以水为必须成分的凝固溶剂可以为水，或者是5质量％以上且低于100质量％的水和大于0质量％且95质量％以下的有机极性溶剂的混合液。另外，上述酰亚胺化后，可以对得到的多孔质聚酰亚胺膜的至少单面实施等离子体处理。
上述聚酰亚胺多孔质膜的制造中可使用的四羧酸二酐可以使用任意的四羧酸二酐，可以根据期望的特性等适当选择。作为四羧酸二酐的具体例，可举出均苯四甲酸二酐、3,3',4,4'-联苯四羧酸二酐(s-BPDA)、2,3,3',4'-联苯四羧酸二酐(a-BPDA)等联苯四羧酸二酐、氧二邻苯二甲酸二酐、二苯基砜-3,4,3',4'-四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)硫醚二酐、2,2-双(3,4-二羧基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷二酐、2,3,3',4'-二苯甲酮四羧酸二酐、3,3',4,4'-二苯甲酮四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)甲烷二酐、2,2-双(3,4-二羧基苯基)丙烷二酐、对亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、对亚联苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、间三联苯-3,4,3',4'-四羧酸二酐、对三联苯-3,4,3',4'-四羧酸二酐、1,3-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二酐、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二酐、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)联苯二酐、2,2-双[(3,4-二羧基苯氧基)苯基]丙烷二酐、2,3,6,7-萘四羧酸二酐、1,4,5,8-萘四羧酸二酐、4,4'-(2,2-六氟亚异丙基)二邻苯二甲酸二酐等。另外，优选使用2,3,3',4'-二苯基砜四羧酸等芳族四羧酸。它们可以单独使用或组合使用2种以上。
其中，特别优选选自联苯四羧酸二酐和均苯四甲酸二酐中的至少1种芳族四羧酸二酐。作为联苯四羧酸二酐，可适宜使用3,3',4,4'-联苯四羧酸二酐。
在上述聚酰亚胺多孔质膜的制造中可使用的二胺可以使用任意的二胺。作为二胺的具体例，可举出如下。
1)1,4-二氨基苯(对苯二胺)、1,3-二氨基苯、2,4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯等1个苯核的苯二胺；
2)4,4'-二氨基二苯基醚、3,4'-二氨基二苯基醚等二氨基二苯基醚、4,4'-二氨基二苯基甲烷、3,3'-二甲基-4,4'-二氨基联苯、2,2'-二甲基-4,4'-二氨基联苯、2,2'-双(三氟甲基)-4,4'-二氨基联苯、3,3'-二甲基-4,4'-二氨基二苯基甲烷、3,3'-二羧基-4,4'-二氨基二苯基甲烷、3,3',5,5'-四甲基-4,4'-二氨基二苯基甲烷、双(4-氨基苯基)硫醚、4,4'-二氨基苯甲酰苯胺、3,3'-二氯联苯胺、3,3'-二甲基联苯胺、2,2'-二甲基联苯胺、3,3'-二甲氧基联苯胺、2,2'-二甲氧基联苯胺、3,3'-二氨基二苯基醚、3,4'-二氨基二苯基醚、4,4'-二氨基二苯基醚、3,3'-二氨基二苯基硫醚、3,4'-二氨基二苯基硫醚、4,4'-二氨基二苯基硫醚、3,3'-二氨基二苯基砜、3,4'-二氨基二苯基砜、4,4'-二氨基二苯基砜、3,3'-二氨基二苯甲酮、3,3'-二氨基-4,4'-二氯二苯甲酮、3,3'-二氨基-4,4'-二甲氧基二苯甲酮、3,3'-二氨基二苯基甲烷、3,4'-二氨基二苯基甲烷、4,4'-二氨基二苯基甲烷、2,2-双(3-氨基苯基)丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)丙烷、2,2-双(3-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、3,3'-二氨基二苯基亚砜、3,4'-二氨基二苯基亚砜、4,4'-二氨基二苯基亚砜等2个苯核的二胺；
3)1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯、1,4-双(4-氨基苯氧基)苯、1,3-双(3-氨基苯氧基)-4-三氟甲基苯、3,3'-二氨基-4-(4-苯基)苯氧基二苯甲酮、3,3'-二氨基-4,4'-二(4-苯基苯氧基)二苯甲酮、1,3-双(3-氨基苯基硫醚)苯、1,3-双(4-氨基苯基硫醚)苯、1,4-双(4-氨基苯基硫醚)苯、1,3-双(3-氨基苯基砜)苯、1,3-双(4-氨基苯基砜)苯、1,4-双(4-氨基苯基砜)苯、1,3-双[2-(4-氨基苯基)异丙基]苯、1,4-双[2-(3-氨基苯基)异丙基]苯、1,4-双[2-(4-氨基苯基)异丙基]苯等3个苯核的二胺；
4)3,3'-双(3-氨基苯氧基)联苯、3,3'-双(4-氨基苯氧基)联苯、4,4'-双(3-氨基苯氧基)联苯、4,4'-双(4-氨基苯氧基)联苯、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]醚、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]醚、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]醚、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]醚、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]酮、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]酮、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]酮、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]酮、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]硫醚、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]硫醚、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]硫醚、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]硫醚、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]砜、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]砜、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]砜、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]砜、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]甲烷、2,2-双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2,2-双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2,2-双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2,2-双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2,2-双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷等4个苯核的二胺。
它们可以单独使用或混合使用2种以上。所使用的二胺可以根据期望的特性等适当选择。
其中，优选为芳族二胺化合物，可适宜使用3,3'-二氨基二苯基醚、3,4'-二氨基二苯基醚、4,4'-二氨基二苯基醚和对苯二胺、1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯。特别优选选自苯二胺、二氨基二苯基醚和双(氨基苯氧基)苯基中的至少1种二胺。
从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点考虑，本发明中可使用的聚酰亚胺多孔质膜优选由玻璃化转变温度为240℃以上、或者在300℃以上没有明确转化点的组合四羧酸二酐和二胺而得到的聚酰亚胺形成。
从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点考虑，本发明中可使用的聚酰亚胺多孔质膜优选为含有以下的芳族聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。
(i)由选自联苯四羧酸单元和均苯四甲酸单元中的至少1种四羧酸单元和芳族二胺单元形成的芳族聚酰亚胺，
(ii)由四羧酸单元和选自苯二胺单元、二氨基二苯基醚单元和双(氨基苯氧基)苯基单元中的至少1种芳族二胺单元形成的芳族聚酰亚胺，
和/或
(iii)由选自联苯四羧酸单元和均苯四甲酸单元中的至少1种四羧酸单元和选自苯二胺单元、二氨基二苯基醚单元和双(氨基苯氧基)苯基单元中的至少1种芳族二胺单元形成的芳族聚酰亚胺。
本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜优选为如下这样的聚酰亚胺多孔质膜：其是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在上述表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚酰亚胺多孔质膜，其中，上述表面层A中存在的孔的平均孔径为0.01μm～15μm，上述表面层B中存在的孔的平均孔径为20μm～100μm，上述大孔层具有与上述表面层A和B结合的隔壁、以及被该隔壁及上述表面层A和B包围的多个大孔，上述大孔层的隔壁、以及上述表面层A和B的厚度为0.01～20μm，上述表面层A和B中的孔与大孔连通，总膜厚为5～500μm，空孔率为40％以上且低于95％。其中，大孔层中的至少1个隔壁具有连通相邻的大孔彼此的平均孔径为0.01～100μm、优选为0.01～50μm的1个或多个孔。
例如，国际公开第2010/038873号、特开2011-219585号公报、或特开2011-219586号公报中记载的聚酰亚胺多孔质膜也可以用于本发明。
1-2.聚醚砜(PES)多孔质膜
本发明中可使用的PES多孔质膜含有聚醚砜，典型地，基本上由聚醚砜构成。聚醚砜是本领域技术人员可以通过公知方法合成的，例如可以通过如下方法制造：使二元酚、碱金属化合物和二卤代二苯基化合物在有机极性溶剂中进行缩聚反应的方法；预先合成二元酚的碱金属二盐，再与二卤代二苯基化合物在有机极性溶剂中进行缩聚反应的方法等。
作为碱金属化合物，可举出碱金属碳酸盐、碱金属氢氧化物、碱金属氢化物、碱金属醇盐等。特别优选碳酸钠和碳酸钾。
作为二元酚化合物，可举出对苯二酚、邻苯二酚、间苯二酚、4,4'-联苯酚、双(羟基苯基)烷烃类(例如2,2-双(羟基苯基)丙烷、和2,2-双(羟基苯基)甲烷)、二羟基二苯基砜类、二羟基二苯基醚类、或这些苯环的氢的至少1个被甲基、乙基、丙基等低级烷基、或甲氧基、乙氧基等低级烷氧基取代的化合物。作为二元酚化合物，可以混合使用2种以上的上述化合物。
聚醚砜可以是市售品。作为市售品的例子，可举出スミカエクセル7600P、スミカエクセル5900P(以上，住友化学(株)制)等。
从良好地形成多孔质聚醚砜膜的大孔的观点考虑，聚醚砜的对数粘度数优选为0.5以上，更优选为0.55以上，从多孔质聚醚砜膜的制造容易性的观点考虑，优选为1.0以下，更优选为0.9以下，进一步优选为0.8以下，特别优选为0.75以下。
另外，从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点考虑，PES多孔质膜或作为其原料的聚醚砜优选玻璃化转变温度为200℃以上，或者没有观察到明确的玻璃化转变温度。
本发明中可使用的PES多孔质膜的制造方法没有特殊限定，例如可通过包括如下工序的方法制造：
将含有对数粘度数为0.5～1.0的聚醚砜0.3质量％～60质量％和有机极性溶剂40质量％～99.7质量％的聚醚砜溶液流延成膜状，浸渍或接触在以聚醚砜的不良溶剂或非溶剂为必须成分的凝固溶剂中，制作具有空孔的凝固膜的工序，和
对上述工序得到的具有空孔的凝固膜进行热处理，使上述空孔粗大化，得到PES多孔质膜的工序；
上述热处理包括使上述具有空孔的凝固膜升温至上述聚醚砜的玻璃化转变温度以上或240℃以上。
本发明中可使用的PES多孔质膜优选为具有表面层A、表面层B、以及夹在上述表面层A和上述表面层B之间的大孔层的PES多孔质膜，其中，
上述大孔层具有与上述表面层A和B结合的隔壁、以及被该隔壁及上述表面层A和B包围的膜平面方向的平均孔径为10μm～500μm的多个大孔，
上述大孔层的隔壁的厚度为0.1μm～50μm，
上述表面层A和B的厚度分别为0.1μm～50μm，
在上述表面层A和B中，一方具有平均孔径大于5μm且为200μm以下的多个细孔，另一方具有平均孔径为0.01μm以上且小于200μm的多个细孔，
表面层A和表面层B的一方的表面开口率为15％以上，另一方表面层的表面开口率为10％以上，
上述表面层A和上述表面层B的上述细孔与上述大孔连通，
上述PES多孔质膜的总膜厚为5μm～500μm，且空孔率为50％～95％。
用于本发明的细胞培养装置的作为细胞培养载体的上述聚合物多孔质膜由于具有略微亲水性的多孔质特性，因而可以在聚合物多孔质膜内稳定地保持液体，保持耐干燥的潮湿环境。因此，与以往的使用细胞培养载体的细胞培养装置相比，即使是极少量的培养基，也能实现细胞的生存和增殖。另外，即使聚合物多孔质膜的部分或全部处在暴露于空气中的状态下，也能进行培养，因此可以对细胞进行有效的氧供给，可以培养大量的细胞。
根据本发明，由于所使用的培养基的量极少，而且可以将作为培养载体的聚合物多孔质膜暴露在气相中，因此可以通过扩散充分地向细胞供应氧。因此，本发明不特别需要供氧装置。
2.细胞培养装置
本发明是具有虹吸结构或添水结构(鹿威结构)的细胞培养装置，其特征在于，具备：聚合物多孔质膜，装纳有该聚合物多孔质膜的细胞培养部，内部装纳有细胞培养部的储液部，在储液部的上部配置的培养基供给装置，具备在储液部的下部配置的培养基排出装置的培养基储存部，其中，在储液部暂时储存的培养基间歇性地喷出到培养基储存部中。本发明的细胞培养装置典型地使用虹吸式细胞培养装置和添水式细胞培养装置来例证，但如上所述，只要是特征在于使暂时储存在储液部中的培养基间歇性地喷出到培养基储存部中的培养装置，无需分类成上述名称的任一种。本说明书中，通常，将这些细胞培养装置也称为“本发明的细胞培养装置”。以下，关于本发明的细胞培养装置的实施方式，图示说明。
(1)虹吸式细胞培养装置
本发明的一实施方式涉及细胞培养装置，其特征在于，具备：聚合物多孔质膜，装纳上述聚合物多孔质膜的细胞培养部，内部装纳有上述细胞培养部的储液部，在上述储液部的上部配置的培养基供给装置，与上述储液部的底部连通的倒U字管，在上述倒U字管的另一端的下部设置的培养基回收装置，以及配置在上述培养基回收装置中的培养基排出装置，其中，上述聚合物多孔质膜是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在上述表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中，上述表面层A中存在的孔的平均孔径小于上述表面层B中存在的孔的平均孔径，上述大孔层具有与上述表面层A和B结合的隔壁、以及被该隔壁及上述表面层A和B包围的多个大孔，其中，从上述培养基供给装置供给到上述储液部中的培养基的液面16(图1)达到上述倒U字管的顶上部时，通过虹吸原理，培养基间歇性地喷出到上述培养基回收装置中。在该装置中，可以将聚合物多孔质膜更换为细胞培养模块(例如，图3(B))来使用。
图1是表示本发明的虹吸式细胞培养装置的典型例的图。沿上下方向用支柱23保持1个以上的细胞培养部21a～21f的细胞培养部支撑体2可以装纳在储液部11中，另外可以具备手柄22以将其在培养结束后取出。细胞培养支撑体2的截面的形状可以根据储液部11而适当调整。储液部11的截面的形状没有特殊限定，可例示正方形、长方形、圆形、三角形，优选为圆形。储液部11和细胞培养支撑体2的形状可以根据目的适当变更设计。
细胞培养部21a～21f具有孔结构，使得培养基可以流通，可以设置或装纳聚合物多孔质膜(未图示)。该细胞培养部的段数(节数)没有特殊限定，培养基在储液部11开始储存后，由于从培养基开始浸渍最下段的细胞培养部21f起到培养基浸渍最上段的细胞培养部21a为止具有时间差，因而优选为100段以下，更优选为50段以下，进一步优选为30段以下，予以说明，更优选为10段以下，例如可以为9段、8段、7段、6段、5段、4段、3段、2段、1段。另外，在细胞培养中，由于将在各细胞培养部培养的细胞暴露于气相的时间设为一定，因而优选从培养基供给装置14向储液部11的培养基的每单位时间的供给量与从该储液部中具备的倒U字管12的另一端的培养基的每单位时间的喷出量相等。
储液部11的上部具备培养基供给装置14，底部具备倒U字管12。培养基供给装置14是用于将滞留在培养基储存槽(未图示)或培养基回收装置13中的培养基供给储液部11的手段，还可以具备可调节培养基的流量的调节部。另外，向储液部11的培养基供给装置虽然未图示，但可以是可将培养液以微小液滴的状态供给的雾供给喷嘴。本发明中，雾供给喷嘴为可将培养基以液滴状态供给的装置即可，喷嘴的数量和配置、以及供给的液滴的尺寸没有限定。
在一实施方式中，细胞培养装置还可以具备：一个端部与培养基排出装置15连通的培养基排出管线、以及一个端部与培养基供给装置14连通的培养基供给管线，培养基排出管线的另一端部通过泵与培养基供给管线的另一端部连通，培养基可循环。抽出培养液的泵的种类没有特殊限定，例如可以使用可调节流量的蠕动泵等。上述调节部可以代替这种泵。
由于培养基回收装置13具有暂时储存滞留在储液部11中待喷出的培养基的作用，因而其容量优选为储液部11的容量以上。
(2)添水式细胞培养装置
本发明的一实施方式涉及细胞培养装置，其特征在于，具备：
聚合物多孔质膜，
一端为储液部、另一端为底部的箱状体，其中，上述箱状体在上述储液部中具备装纳上述聚合物多孔质膜的细胞培养部，
在上述箱状体的底面侧的一部分设置的旋转轴，
支撑上述旋转轴的轴承，
在上述储液部的上部配置的培养基供给装置，和
在上述储液部的下部配置的培养基回收装置，
其中，上述聚合物多孔质膜是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在上述表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中，上述表面层A中存在的孔的平均孔径小于上述表面层B中存在的孔的平均孔径，上述大孔层具有与上述表面层A和B结合的隔壁、以及被该隔壁及上述表面层A和B包围的多个大孔，其中，当从上述培养基供给装置供给到上述储液部中的培养基超过上述箱状体的底部的重量平衡而供给时，上述储液部的培养基间歇性地喷出到上述培养基回收装置中。
图2是表示本发明的添水式细胞培养装置的典型例的图。本发明的添水式细胞培养装置在暂时在储液部中滞留培养基，一定期间后培养基被喷出这一点上，具有与虹吸式细胞培养装置相同的功能。箱状体3具备储液部31a和底部31b，对于底部31b而言，在供给到储液部31a的培养基的重量超过阀值、箱状体3开始倾斜、培养基的喷出结束后，具有可恢复到原来的水平位置程度的重量。储液部31a具有装纳聚合物多孔质膜的作用，但为了防止聚合物多孔质膜因箱状体3的倾斜而脱落，在储液部31a内可以具备具有可流通液体的孔、栅栏或网等的隔板31c。予以说明，为了不直接撞击聚合物多孔质膜，从培养基供给装置供给的培养基被隔板31c隔开，使得培养基可以从没有聚合物多孔质膜的另一侧供给，可以适当变更培养基供给装置的配置。
另外，在箱状体3的底侧，可以具备：在底面侧局部存在的旋转轴33、以及根据需要的、在储液部31a从空的状态到培养基的量达到阀值为止，优选用于保持箱状体3的水平性的在底部31b的底面侧局部存在的支撑手段(未图示)。旋转轴33的两端由轴承34支撑，便于箱状体3的翻转操作。作为可翻转箱状体3的操作的装置不限于上述，可以构造成以安装在底面侧的局部的平板状的翻转轴为翻转支点而自由地进行翻操作的装置。本领域技术人员可以认识到，可适当地将构成虹吸式细胞培养装置的培养基供给装置、培养基回收装置、培养基排出装置、各种管线、以及泵用于虹吸式细胞培养装置。
本发明的实施方式中使用的聚合物多孔质膜例如通过如下方式应用于平面流路中：i)折叠，ii)卷成卷状，iii)将片或小片用线状结构体连接，和/或iv)系成绳状。另外，本发明的实施方式中使用的聚合物多孔质膜可以v)2片以上层叠而应用于平面流路中。通过如i)～v)那样加工形状，可以向一定容量的细胞培养基中装入多量的聚合物多孔质膜。
本发明的实施方式中使用的聚合物多孔质膜可以使用模块化的聚合物多孔质膜(以下，称为“模块化聚合物多孔质膜”)。本说明书中，“模块化聚合物多孔质膜”是指装纳在外壳中的聚合物多孔质膜。本说明书中，“模块化聚合物多孔质膜”的记载可以简称为“模块”，即使相互替代使用也表示同一含义。
本发明的实施方式中使用的模块化聚合物多孔质膜所具备的外壳具有2个以上的细胞培养基流出流入口，通过该细胞培养基流出流入口，培养基流入和流出外壳的内外。该外壳的细胞培养基流出流入口的直径优选大于上述细胞的直径以使细胞可以流入外壳的内部。另外，细胞培养基流出流入口的直径优选小于聚合物多孔质膜从该细胞培养基流出流入口流出的直径。小于聚合物多孔质膜流出直径的直径可以根据装纳在外壳中的聚合物多孔质膜的形状、尺寸适当地选择。例如，聚合物多孔质膜为带状时，只要其是小于该聚合物多孔质膜的短边的宽度、且不使该聚合物多孔质膜流出的适当的直径，就没有特殊限定。该细胞培养基流出流入口的数量优选设置得尽可能地多，以使细胞培养基容易供给和/或排出外壳的内外。优选为5以上，优选为10以上，优选为20以上，优选为50以上，优选为100以上。细胞培养基流出流入口的外壳的一部分或全部可以具有网状的结构。另外，该外壳本身可以为网状。本发明中，网状的结构是指例如在纵向、横向和/或倾斜方向上具有格子状结构的结构，每个网眼以使流体能够通过的程度形成细胞培养基流出流入口，但不限定于此。
本发明的实施方式中使用的模块化聚合物多孔质膜的外壳例如可举出聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、不锈钢等金属等，只要是不影响细胞培养的材料，就没有特殊限定。
本发明的实施方式中使用的模块化聚合物多孔质膜可以以如下方式装纳在该外壳内：
(i)2片以上独立的上述聚合物多孔质膜聚集在一起，
(ii)上述聚合物多孔质膜折叠，
(iii)上述聚合物多孔质膜卷成卷状，和/或
(iv)上述聚合物多孔质膜系成绳状；
由此，可将该模块化聚合物多孔质膜应用于平面流路。
本说明书中，“在外壳内聚集装纳2片以上独立的该聚合物多孔质膜”是指相互独立的2片以上的聚合物多孔性膜被聚集并装纳在被外壳包围的一定空间内的状态。本发明中，2片以上独立的该聚合物多孔质膜通过任意方法使该聚合物多孔质膜的至少1个位置与该外壳内的至少1个位置固定，该聚合物多孔质膜可以以在外壳内不动的状态固定。另外，2片以上独立的聚合物多孔质膜可以为小片。小片的形状例如可以采取圆、椭圆形、四边形、三角形、多边形、带状等任意的形状，优选为大致正方形。本发明中，小片的尺寸可以采取任意的尺寸，在为大致正方形时，长度可以为任意的长度，例如，宽度可以为80mm以下，优选为50mm以下，更优选为30mm以下，进一步优选为20mm以下，也可以为10mm以下。另外，当聚合物多孔性膜的小片为大致正方形时，可以以聚合物多孔质膜在外壳内不动的状态，聚合物多孔质膜的一边长度沿着外壳的内壁或者比内壁的一边长度短的方式(例如，短0.1mm～1mm左右)形成。由此，可以防止向在聚合物多孔质膜内生长的细胞施加应力，可以抑制细胞凋亡等、并稳定且大量地培养细胞。予以说明，在带状聚合物多孔质膜的情况下，如后所述，可以以如下方式装纳在该外壳内：(ii)上述聚合物多孔质膜折叠，(iii)上述聚合物多孔质膜卷成卷状，和/或(iv)上述聚合物多孔质膜系成绳状。
本说明书中，“折叠的聚合物多孔质膜”是指通过在该外壳内折叠，利用聚合物多孔质膜的各面和/或外壳内的表面之间的摩擦力而成为在外壳内不动的状态的聚合物多孔质膜。本说明书中，“折叠”是指可以是聚合物多孔膜褶皱的状态，也可以是没有折痕的状态。
本说明书中，“卷成卷状的聚合物多孔质膜”是指将聚合物多孔质膜卷成卷状，利用聚合物多孔质膜的各面和/或外壳内的表面之间的摩擦力而成为在外壳内不动的状态的聚合物多孔质膜。另外，本发明中，编织成绳状的聚合物多孔质膜是指例如将短条状的多个聚合物多孔质膜通过任意方法编织成绳状，利用聚合物多孔质膜彼此之间的摩擦力而成为不互相移动的状态的聚合物多孔质膜。(i)由2片以上独立的上述聚合物多孔质膜聚集在一起的聚合物多孔质膜、(ii)折叠的聚合物多孔质膜、(iii)卷成卷状的聚合物多孔质膜、和(iv)系成绳状的聚合物多孔质膜可以组合而装纳在外壳内。
本说明书中，“该聚合物多孔质膜在外壳内不动的状态”是指在细胞培养基中培养该模块化聚合物多孔质膜时，以该聚合物多孔质膜不会连续形态改变的状态装纳在外壳内的状态。换言之，该聚合物多孔质膜本身为受控的状态，使得不会因流体而连续地进行波动。由于聚合物多孔质膜在外壳内保持不动的状态，因而可以防止对在聚合物多孔质膜内生长的细胞施加应力，可以稳定地培养细胞而不会使细胞凋亡。
(3)干热灭菌型虹吸式细胞培养装置
作为本发明的一实施方式，可以提供对上述(1)中定义的虹吸式细胞培养装置可以整体完全地干热灭菌的细胞培养装置。根据本发明，提供采用玻璃制耐热虹吸反应器、装纳在该反应器内的模块(图3(B))，其为由不锈钢网制作的其内部组装入具有聚酰亚胺多孔质膜的金属模块的干热灭菌型虹吸式细胞培养装置(图3(A))。作为玻璃制耐热虹吸反应器，只要通过虹吸的原理具有使培养基间歇性地喷出的功能，就没有限定，例如可以是基于索氏提取器的装置。
3.使用细胞培养装置的细胞培养方法
<将细胞应用于聚合物多孔质膜的工序>
本发明中使用的将细胞应用于聚合物多孔质膜的具体工序没有特殊限定。可以采用本说明书中记载的工序，或者适于将细胞应用于膜状载体的任意方法。虽然没有限定，但在本发明的方法中，将细胞应用于聚合物多孔质膜例如包括如下的方式。
(A)包括将细胞接种在上述聚合物多孔质膜的表面的工序的方式。
(B)包括以下工序的方式：
在上述聚合物多孔质膜的干燥的表面上载置细胞悬浮液，
使上述聚合物多孔质膜静置，或者移动上述聚合物多孔质膜以促进液体的流出，或者刺激部分表面，使细胞悬浮液被吸入上述膜中，和
使细胞悬浮液中的细胞保留在上述膜内，使水分流出。
(C)包括以下工序的方式：
将上述聚合物多孔质膜的单面或两面用细胞培养液或灭菌的液体润湿，
使上述润湿的聚合物多孔质膜中装填细胞悬浮液，和
使细胞悬浮液中的细胞保留在上述膜内，使水分流出。
(A)的方式包括在聚合物多孔质膜的表面直接接种细胞、细胞块。或者包括向细胞悬浮液中装入聚合物多孔质膜，从膜的表面使细胞培养基浸润的方式。
在聚合物多孔质膜的表面接种的细胞粘附到聚合物多孔质膜，逐渐进入多孔的内部。优选为即使不特别地从外部施加物理或化学力，细胞也与聚合物多孔质膜粘接。在聚合物多孔质膜的表面接种的细胞可以在膜的表面和/或内部稳定地生长和增殖。细胞根据其所生长和增殖的膜的位置，可以采取各种不同的形态。
在(B)的方式中，在聚合物多孔质膜的干燥的表面上载置细胞悬浮液。使聚合物多孔质膜静置，或者移动上述聚合物多孔质膜以促进液体的流出，或者刺激部分表面，使细胞悬浮液吸入上述膜中，由此使细胞悬浮液渗透到膜中。不受理论束缚，认为这是由于源自聚合物多孔质膜的各表面形状等的性质引起的。根据本方式，细胞被吸入接种到膜的装填有细胞悬浮液的部位。
或者如(C)的方式那样，可以在将上述聚合物多孔质膜的单面或两面的部分或全体用细胞培养液或灭菌的液体润湿后，向润湿的聚合物多孔质膜中装填细胞悬浮液。此时，细胞悬浮液的通过速度大幅度提高。
例如，以防止膜的飞散为主要目的，可以使用湿润膜的一部分的方法(以下，将其记为“一点湿法”)。一点湿法实质上基本近似于不使膜湿润的干燥法((B)的方式)。其中，关于湿润的一小部分，认为细胞液的膜透过非常迅速。另外，也可以使用在充分湿润的聚合物多孔质膜的单面或两面的整体(以下，将其记为“湿膜”)中装填细胞悬浮液的方法(以下，将其记为“湿膜法”)。此时，在聚合物多孔质膜整体中，细胞悬浮液的通过速度大幅度提高。
在(B)和(C)的方式中，细胞悬浮液中的细胞保留在上述膜内，使水分流出。由此也可以进行以下处理：浓缩细胞悬浮液中的细胞浓度，使细胞以外的不需要的成分随水分流出等。
有时将(A)的方式称为“自然接种”，将(B)和(C)的方式称为“吸入接种”。
虽然没有限定，但优选为活细胞选择性地留在聚合物多孔质膜中。因此，在本发明方法的优选实施方式中，活细胞留在上述聚合物多孔质膜内，死细胞优先随水分流出。
方式(C)中使用的灭菌的液体没有特殊限定，为灭菌的缓冲液或灭菌水。缓冲液例如为(+)和(-)Dulbecco氏PBS、(+)和(-)Hank氏平衡盐溶液等。缓冲液的例子示于以下表1。
[表1]
成分 浓度(mmol/L) 浓度(g/L)
NaCl 137 8.00
KCl 2.7 0.20
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 10 1.44
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 1.76 0.24
pH(-) 7.4 7.4
进而，在本发明的方法中，将细胞应用于聚合物多孔质膜的方式也包括通过使处于悬浮状态的粘附性细胞以悬浮方式与聚合物多孔质膜共存而使细胞附着于膜上的方式(缠结)。例如，在本发明的方法中，为了将细胞应用于聚合物多孔质膜，可以向细胞培养容器中装入细胞培养基、细胞、及1片或多片的上述聚合物多孔质膜。当细胞培养基为液体时，聚合物多孔质膜处于悬浮在细胞培养基中的状态。由于聚合物多孔质膜的性质，细胞可以与聚合物多孔质膜粘接。因此，即使是原本不适于悬浮培养的细胞，也可以在使聚合物多孔质膜处于悬浮在细胞培养基中的状态下进行培养。优选地，细胞与聚合物多孔质膜粘接。“自发地粘接”是指即使不特别地从外部施加物理或化学力，细胞也能保留在聚合物多孔质膜的表面或内部。
上述的将细胞应用于聚合物多孔质膜可以组合使用2种或2种以上的方法。例如，可以组合方式(A)～(C)中的2种以上的方法而将细胞应用于聚合物多孔质膜。可以将负载有细胞的聚合物多孔质膜应用于上述细胞培养装置中的平面流路来培养。
除此以外，也可以预先将含有悬浮的细胞的培养基从细胞供给装置滴落在设置有聚合物多孔质膜的平面流路中而接种。
本说明书中，“悬浮的细胞”是指例如包括如下细胞：通过胰蛋白酶等蛋白分解酶使贴壁细胞强制地漂浮而悬浮在培养基中得到的细胞、通过公知的驯化工序而可在培养基中悬浮培养的贴壁细胞等。
本发明中可利用的细胞的种类例如选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌和细菌。动物细胞大致分为：来源于属于脊椎动物门的动物的细胞和来源于无脊椎动物(除了属于脊椎动物门的动物以外的动物)的细胞。本说明书中，动物细胞的来源没有特殊限定。优选是指来源于属于脊椎动物门的动物的细胞。脊椎动物门包括无颔纲和有颔纲，有颔纲包括哺乳纲、鸟纲、两栖纲、爬行纲等。优选地，一般来说，是来源于称为哺乳动物的属于哺乳纲的动物的细胞。哺乳动物没有特殊限定，优选包括小鼠、大鼠、人、猴、猪、狗、绵羊、山羊等。
本发明中可利用的动物细胞的种类没有限定，优选选自多能干细胞、组织干细胞、体细胞和生殖细胞。
本说明书中，“多能干细胞”是指具有分化成任何组织的细胞的能力(分化多能性)的干细胞的统称。多能干细胞包括但不限于，胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)、生殖干细胞(GS细胞)等。优选为ES细胞或iPS细胞。iPS细胞因不存在伦理问题等理由而特别优选。作为多能干细胞，可使用公知的任意的干细胞，例如可以使用国际公开第2009/123349号(PCT/JP2009/057041)中记载的多能干细胞。
“组织干细胞”是指可分化的细胞系列被限定为特定的组织，但具有可分化为多样的细胞种类的能力(分化多能性)的干细胞。例如，骨髓中的造血干细胞成为血细胞的来源，神经干细胞分化成神经细胞。除此以外，有构成肝脏的肝脏干细胞、成为皮肤组织的皮肤干细胞等各种各样的种类。组织干细胞优选选自间充质干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、或造血干细胞。
“体细胞”是指构成多细胞生物的细胞中除生殖细胞以外的细胞。在有性生殖中没有被下一代继承。体细胞优选选自肝细胞、胰腺细胞、肌细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、成纤维细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、或淋巴细胞、红细胞、白细胞、单核细胞、巨噬细胞或巨核细胞的血细胞。
“生殖细胞”是指具有在生殖中将遗传信息传递给下一代的作用的细胞。例如，包括用于有性生殖的配子，即卵子、***、***、***，用于无性增殖的孢子等。
细胞可选自肉瘤细胞、株化细胞和转化细胞。“肉瘤”是指在骨、软骨、脂肪、肌肉、血液等非上皮性细胞来源的***细胞中发生的癌，包括软组织肉瘤、恶性骨肿瘤等。肉瘤细胞是来源于肉瘤的细胞。“株化细胞”是指长期保持在体外，具有一定的稳定的性质，可以半永久地继代培养的培养细胞。存在PC12细胞(源自大鼠肾上腺髓质)、CHO细胞(源自中国仓鼠卵巢)、HEK293细胞(源自人胚胎肾)、HL-60细胞(源自人白细胞)、HeLa细胞(源自人***)、Vero细胞(源自非洲绿猴肾上皮细胞)、MDCK细胞(源自犬肾小管上皮细胞)、HepG2细胞(源自人肝癌的细胞株)、BHK细胞(幼仓鼠肾细胞)、NIH3T3细胞(源自小鼠胚胎成纤维细胞)等来自包括人的各种物种的各种组织的细胞株。“转化细胞”是指从细胞外部导入核酸(DNA等)，改变遗传性质的细胞。
本说明书中，“贴壁细胞”通常是指其本身需要粘附到适当的表面来增殖的细胞，也称为粘附细胞或贴壁依赖性细胞。在本发明的几个实施方式中，所使用的细胞为贴壁细胞。用于本发明的细胞为贴壁细胞，更优选为可在悬浮在培养液中的状态下培养的细胞。可悬浮培养的贴壁细胞可以通过公知的方法，将贴壁细胞驯化为适于悬浮培养的状态而得到，例如可举出CHO细胞、HEK293细胞、Vero细胞、NIH3T3细胞等。即使在此没有列举，但用于本发明的细胞只要是贴壁细胞并且可以通过驯化而悬浮培养，就没有特殊限定。
使用聚合物多孔质膜的细胞培养的模型图如图1、2、和3(A)所示。这些图是帮助理解的图，每个要素并非实际尺寸。在本发明的细胞的培养方法中，通过将细胞应用于聚合物多孔质膜来培养，在聚合物多孔质膜所具有的内部的多面的连接多孔部分和表面，大量的细胞生长，因此可以简便地培养大量的细胞。另外，在本发明的细胞的培养方法中，在与以往的方法相比大幅减少用于细胞培养的培养基的量的同时，可以培养大量的细胞。例如，即使是聚合物多孔质膜的一部分或全部不与细胞培养基的液相接触的状态，也能够长期培养大量的细胞。另外，相对于包括细胞生存区域的聚合物多孔质膜体积的总和，可以显著减少细胞培养容器中含有的细胞培养基的总体积。
本说明书中，将不含细胞的聚合物多孔质膜包括其内部间隙的体积在内在空间中所占的体积称为“表观聚合物多孔质膜体积”(参照图6)。然后，将细胞应用于聚合物多孔质膜，在聚合物多孔质膜的表面和内部负载细胞的状态下，将聚合物多孔质膜、细胞、和在聚合物多孔质膜内部浸润的培养基作为整体在空间中所占的体积称为“包括细胞生存区域的聚合物多孔质膜体积”(参照图6)。在膜厚25μm的聚合物多孔质膜的情况下，包括细胞生存区域的聚合物多孔质膜体积是比表观聚合物多孔质膜体积最多大50％左右的值。在本发明的方法中，可以在1个细胞培养容器中装纳多个聚合物多孔质膜来进行培养，此时，有时将负载有细胞的多个聚合物多孔质膜的各个包括细胞生存区域的聚合物多孔质膜体积的总和简称为“包括细胞生存区域的聚合物多孔质膜体积的总和”。
通过使用本发明的方法，当细胞培养容器中含有的细胞培养基的总体积是包括细胞生存区域的聚合物多孔质膜体积的总和的10000倍或以下的条件下，可以长期地良好地培养细胞。另外，当细胞培养容器中含有的细胞培养基的总体积是包括细胞生存区域的聚合物多孔质膜体积的总和的1000倍或以下的条件下，可以长期地良好地培养细胞。进而，当细胞培养容器中含有的细胞培养基的总体积是包括细胞生存区域的聚合物多孔质膜体积的总和的100倍或以下的条件下，可以长期地良好地培养细胞。而且，当细胞培养容器中含有的细胞培养基的总体积是包括细胞生存区域的聚合物多孔质膜体积的总和的10倍或以下的条件下，可以长期地良好地培养细胞。
即，根据本发明，可以将用于细胞培养的空间(容器)与以往的进行二维培养的细胞培养装置相比小型化到极限。另外，当想要增加培养的细胞数时，通过增加层叠的聚合物多孔质膜的片数等简便的操作，可以灵活地增加细胞培养的体积。只要是用于本发明的具备聚合物多孔质膜的细胞培养装置，可以将培养细胞的空间(容器)与储存细胞培养基的空间(容器)分离，可以根据培养的细胞数，来准备所需量的细胞培养基。储存细胞培养基的空间(容器)可以根据目的大型化或小型化，或者是可更换的容器，没有特殊限定。
在本发明的细胞的培养方法中，例如，在使用聚合物多孔质膜的培养后，假设细胞全部均匀地分散在细胞培养容器中含有的细胞培养基中，进行培养至细胞培养容器中含有的细胞的数达到每1mL培养基1.0×105个以上、1.0×106个以上、2.0×106个以上、5.0×106个以上、1.0×107个以上、2.0×107个以上、5.0×107个以上、1.0×108个以上、2.0×108个以上、5.0×108个以上、1.0×109个以上、2.0×109个以上、或5.0×109个以上。
予以说明，作为测量培养中或培养后的细胞数的方法，可以使用各种公知的方法。例如，在使用聚合物多孔质膜的培养后，作为假设细胞全部均匀地分散在细胞培养容器中含有的细胞培养基中时测量细胞培养容器中含有的细胞的数的方法，可适当使用公知的方法。例如，可适当使用采用CCK8的细胞数计测法。具体地，使用细胞计数试剂盒-8(同仁化学研究所制溶液试剂(以下，记为“CCK8”))，测量不使用聚合物多孔质膜的通常培养中的细胞数，求出吸光度与实际的细胞数的相关系数。然后，施加细胞，将培养的聚合物多孔质膜转移至含有CCK8的培养基中，在温育箱内保存1～3小时，提取上清液，在480nm的波长处测定吸光度，由先前求得的相关系数计算细胞数。
另外，从其他观点考虑，细胞的大量培养是指例如在使用聚合物多孔质膜的培养后，进行培养至每1cm2聚合物多孔质膜中含有的细胞数达到1.0×105个以上、2.0×105个以上、1.0×106个以上、2.0×106个以上、5.0×106个以上、1.0×107个以上、2.0×107个以上、5.0×107个以上、1.0×108个以上、2.0×108个以上、或5.0×108个以上。每1cm2聚合物多孔质膜中含有的细胞数可以使用细胞计数器等公知的方法适当计测。
实施例
以下，基于实施例更具体地说明本发明。予以说明，本发明不限定于这些实施例。本领域技术人员可以根据本说明书的记载容易地对本发明加以修饰和变更，这些也包括在本发明的技术范围内。
以下的实施例中使用的聚酰亚胺多孔质膜通过如下方法制备：将含有由作为四羧酸成分的3,3',4,4'-联苯四羧酸二酐(s-BPDA)和作为二胺成分的4,4'-二氨基二苯基醚(ODA)得到的聚酰胺酸溶液、以及作为着色前体的聚丙烯酰胺的聚酰胺酸溶液组合物成型后，在250℃以上进行热处理来制备。得到的聚酰亚胺多孔质膜是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在该表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚酰亚胺多孔质膜，表面层A中存在的孔的平均孔径为6μm，表面层B中存在的孔的平均孔径为46μm，膜厚为25μm，空孔率为73％。
(实施例1)
通过虹吸式反应器的使用聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养法(之1)
使用培养基(BalanCD(商标)CHO GROWTH A)悬浮培养产生抗人IL-8抗体的CHO-DP12细胞(ATCC CRL-12445)的驯化·悬浮化的细胞，持续培养至每1ml的活细胞数为3.9×106。在1个10cm直径的培养皿中分别注入上述悬浮培养液各12ml，然后用尼龙网(30#，网眼547μm)形成外套(外壳)，向该培养皿中加入封有一定量(每1模块20cm2)的灭菌的聚酰亚胺多孔质膜的模块12个。将模块用细胞悬浮液润湿后，在CO2温育箱内静置过夜。
第2天，取出模块，在图1所示的虹吸式反应器的阶梯部分设置10个模块，在储液部中储存350ml培养基(含有2％FBS的IMDM)，将该培养基经由管泵以60ml/分钟的速度循环。2天后结束培养。观察到，细胞密度为5.5×104个细胞/cm2，总细胞数为1.2×107个细胞。
(实施例2)
通过虹吸式反应器的使用聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养法(之2)
使用培养基(BalanCD(商标)CHO GROWTH A)悬浮培养产生抗人IL-8抗体的CHO-DP12细胞(ATCC CRL-12445)的驯化·悬浮化的细胞，持续培养至每1ml的活细胞数为9.9×106。向用于振荡培养的氧渗透袋中装入10个模块，在CO2温育箱内进行振荡培养过夜。第2天，从振荡袋中取出模块，在与实施例1同样的条件下，通过虹吸式反应器进行细胞培养。在储液部中储存350ml的培养基(コージンバイオ制KBM270)，将该培养基经由管泵以60ml/分钟的速度循环。4天后培养结束，此时观察到，细胞密度为1.0×105个细胞/cm2，总细胞数为2.1×107个细胞。
(实施例3)
金属模块和玻璃制耐热虹吸反应器
应该最大限度地利用聚酰亚胺多孔质膜具有的耐热性，通过简单的整体干热灭菌来结束灭菌作业，制作由不锈钢网制的外壳、中衬和聚酰亚胺多孔质膜构成的金属模块(参照图3(B)的一实施方式)。具体地，层叠1cm×1cm的聚酰亚胺多孔质膜和与聚酰亚胺多孔质膜相同面积的不锈钢网(称为“中衬”，未图示)(按照聚酰亚胺多孔质3片、中衬1片、聚酰亚胺多孔质4片、中衬1片、聚酰亚胺多孔质3片的顺序层叠)，将层叠物用不锈钢网制的外壳密封，制作金属模块。作业可以在开放空间下非无菌地实施。
用于操作该金属模块的玻璃制耐热虹吸反应器以索氏提取器为基础来设计，为了具有耐热性，仅用玻璃和金属制作(图3(A))。示出装入了金属模块的玻璃制耐热虹吸反应器。在该反应器内部，非无菌地层叠不锈钢模块30个来组装装置。然后，用铝箔包住反应器部分，在190℃下干热灭菌80分钟，放冷。
接着，通过耐热型虹吸式反应器实施人皮肤成纤维细胞的干燥培养。如图3(A)所示，无菌地组装整个反应器，在CO2温育箱内设置整个装置。将在培养皿中培养的人皮肤成纤维细胞通过用胰蛋白酶处理来剥离，准备细胞悬浮液70ml。进行细胞计数，结果，每1ml活细胞数为1.4×105。将悬浮液70ml加注到设置有金属模块的索氏管内部，静置30分钟。静置后，将内部液体无菌地排出，将排出的液体再次加注到虹吸反应器内部。将该作业重复3次，然后，对液体部分取样，测定细胞数，结果，细胞数为8.0×103。可以说94％的细胞通过在该静置条件下的自然接触吸附。接着，通过使用泵连续地供给培养基(使用コージンバイオ株式会社制的KBM Fibro Assist)来发挥虹吸功能，可以向金属模块内部稳定且循环地供给培养基和空气(氧)。3日一次更换培养基，继续培养。使用タカラバイオ制的人纤连蛋白测定用Elisa-试剂盒测定稳定且大量地产生纤连蛋白，由此确认，高效率的物质生产可以简便且持续地实现(图5)。
如图所示，除了每单位体积的每日物质产生量优异以外，与通常的培养皿培养不同，规模放大非常容易，因此，能够以紧凑的装置提高生产率。示出了如下的方法：以人原代细胞为生产物质的基础，连续制作生产***，可以在不使用具有氧供给等手段的复杂装置的情况下，制造稀有物质和有用物质的方法。
符号说明
1 虹吸式细胞培养装置
11 储液部
12 倒U字管
13 培养基回收装置
14 培养基供给装置
15 培养基排出装置
16 液面
2 细胞培养部支撑体
21a、21b、21c、21d、21e、21f 细胞培养部
22 把手
23 支柱
3 添水(鹿威)式细胞培养装置
31 箱状体
31a 储液部
31b 底部
31c 隔板
32 聚合物多孔质膜
33 旋转轴
34 轴承
35 培养基回收装置
36 培养基供给装置

Claims (15)

1.细胞培养装置，其特征在于，具备：
聚合物多孔质膜，
装纳上述聚合物多孔质膜的细胞培养部，
内部装纳有上述细胞培养部的储液部，
在上述储液部的上部配置的培养基供给装置，
与上述储液部的底部连通的倒U字管，
在上述倒U字管的另一端的下部设置的培养基回收装置，和
在上述培养基回收装置中配置的培养基排出装置；
其中，上述聚合物多孔质膜是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在上述表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中，上述表面层A中存在的孔的平均孔径小于上述表面层B中存在的孔的平均孔径，上述大孔层具有与上述表面层A和B结合的隔壁、以及被该隔壁及上述表面层A和B包围的多个大孔，
其中，当从上述培养基供给装置供给到上述储液部中的培养基的液面到达上述倒U字管的顶上部时，通过虹吸原理，培养基间歇性地喷出到上述培养基回收装置中。
2.细胞培养装置，其特征在于，具备：
聚合物多孔质膜，
一端为储液部、另一端为底部的箱状体，其为在上述储液部中具备装纳有上述聚合物多孔质膜的细胞培养部的上述箱状体，
在上述箱状体的底面侧的一部分设置的旋转轴，
支撑上述旋转轴的轴承，
在上述储液部的上部配置的培养基供给装置，和
在上述储液部的下部配置的培养基回收装置；
其中，上述聚合物多孔质膜是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在上述表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中，上述表面层A中存在的孔的平均孔径小于上述表面层B中存在的孔的平均孔径，上述大孔层具有与上述表面层A和B结合的隔壁、以及被该隔壁及上述表面层A和B包围的多个大孔，
其中，当从上述培养基供给装置供给到上述储液部中的培养基超过上述箱状体的底部的重量而供给时，上述储液部的培养基间歇性地喷出到上述培养基回收装置中。
3.权利要求1或2所述的细胞培养液装置，其还具备：
一个端部与上述培养基回收装置连通的培养液排出管线，和
一个端部与上述培养基连通的培养液供给管线，
其中，上述排出管线的另一端部通过泵与上述培养液供给管线的另一端部连通，培养液可循环。
4.权利要求1～3任一项所述的细胞培养装置，其中，上述培养液分配装置为雾供给喷嘴。
5.权利要求1～4任一项所述的细胞培养装置，其中，上述聚合物多孔质膜以如下方式设置在上述平面流路中：
i)折叠，
ii)卷成卷状，
iii)将片或小片用线状结构体连接，
iv)系成绳状，和/或
v)2片以上层叠。
6.权利要求1～5任一项所述的细胞培养装置，其中，上述聚合物多孔质膜是具备外壳的模块化聚合物多孔质膜，
其中，具备上述外壳的模块化聚合物多孔质膜以如下方式装纳在上述外壳内：
(i)2片以上独立的上述聚合物多孔质膜聚集在一起，
(ii)上述聚合物多孔质膜折叠，
(iii)上述聚合物多孔质膜卷成卷状，和/或
(iv)上述聚合物多孔质膜系成绳状；
其中，具备上述外壳的模块化聚合物多孔质膜设置在上述平面流路中。
7.权利要求1～6任一项所述的细胞培养装置，其中，上述聚合物多孔质膜具有平均孔径为0.01～100μm的多个细孔。
8.权利要求1～7任一项所述的细胞培养装置，其中，上述表面层A的平均孔径为0.01～50μm。
9.权利要求1～8任一项所述的细胞培养装置，其中，上述表面层B的平均孔径为20～100μm。
10.权利要求1～9任一项所述的细胞培养装置，其中，上述聚合物多孔质膜的平均膜厚为5～500μm。
11.权利要求1～10任一项所述的细胞培养装置，其中，上述聚合物多孔质膜为聚酰亚胺多孔质膜。
12.权利要求11所述的细胞培养装置，其中，上述聚酰亚胺多孔质膜是包含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜。
13.权利要求11或12所述的细胞培养装置，其中，上述聚酰亚胺多孔质膜是通过将包含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液及着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成型后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。
14.权利要求1～10任一项所述的细胞培养装置，其中，上述聚合物多孔质膜为聚醚砜多孔质膜。
15.细胞的培养方法，其使用权利要求1～14任一项所述的细胞培养装置。
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