CN109496232A

CN109496232A - 细胞的制备方法、细胞培养装置和试剂盒

Info

Publication number: CN109496232A
Application number: CN201780045820.4A
Authority: CN
Inventors: 萩原昌彦; 大矢修生
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 2016-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2019-03-19
Also published as: EP3489349A4; WO2018021358A1; JP6756368B2; US20190284525A1; KR20210013306A; JPWO2018021358A1; KR102437810B1; EP3489349A1; KR20190023087A

Abstract

本发明涉及包括将细胞应用于聚醚砜多孔质膜来培养的细胞的制备方法。

Description

细胞的制备方法、细胞培养装置和试剂盒

技术领域

本发明涉及细胞的制备方法、细胞培养装置和试剂盒。

背景技术

报道有一种细胞的培养方法，其包括将细胞应用于聚醚砜多孔质膜来培养的工序(专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2015/012415号

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于，使用聚醚砜多孔质膜以外的聚合物多孔质膜，简便、高效且稳定地培养细胞。

解决课题的手段

本发明人等鉴于上述课题，进行了深入研究，结果发现，聚醚砜多孔质膜可用于培养细胞，至此完成了本发明。

即，本发明具有以下方式。

[1]细胞的制备方法，其将细胞应用于聚醚砜多孔质膜来培养。

[2]上述[1]所述的方法，其中，

上述聚醚砜多孔质膜是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在上述表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚醚砜多孔质膜，

其中，上述表面层A中存在的孔的平均孔径小于上述表面层B中存在的孔的平均孔径，

上述大孔层具有与上述表面层A和B结合的隔壁、以及被该隔壁及上述表面层A和B包围的多个大孔，

上述表面层A和B中的孔与上述大孔连通。

[3]上述[1]或[2]所述的方法，其包括将细胞接种在上述聚醚砜多孔质膜的表面。

[4]上述[1]或[2]所述的方法，其包括以下工序：

在上述聚醚砜多孔质膜的干燥的表面上载置细胞悬浮液，

使上述聚醚砜多孔质膜静置，或者移动上述聚醚砜多孔质膜，促进液体的流出，或者刺激部分表面，使细胞悬浮液被吸入上述膜中，和

使细胞悬浮液中的细胞保留在上述膜内，使水分流出。

[5]上述[1]或[2]所述的方法，其包括以下工序：

将上述聚醚砜多孔质膜的单面或两面用细胞培养基或灭菌的液体润湿，

向上述润湿的聚醚砜多孔质膜中装填细胞悬浮液，和

使细胞悬浮液中的细胞保留在上述膜内，使水分流出。

[6]上述[5]所述的方法，其中，活细胞留在上述聚醚砜多孔质膜内，死细胞随水分流出。

[7]上述[5]或[6]所述的方法，其中，上述灭菌的液体为灭菌水或灭菌的缓冲液。

[8]上述[1]～[7]任一项所述的方法，其中，

向细胞培养容器中装入细胞培养基、细胞、及1片或多片的上述聚醚砜多孔质膜，其中，聚醚砜多孔质膜处于悬浮在细胞培养基中的状态。

[9]上述[8]所述的方法，其特征在于，使用2片以上的上述聚醚砜多孔质膜的小片。

[10]上述[8]或[9]所述的方法，其中，细胞与上述聚醚砜多孔质膜自发地粘接。

[11]上述[1]～[7]任一项所述的方法，其中，上述聚醚砜多孔质膜以如下方式在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定：

i)折叠，

ii)卷成卷状，

iii)将片或小片用线状结构体连接，或

iv)系成绳状。

[12]上述[11]所述的方法，其中，细胞与上述聚醚砜多孔质膜自发地粘接。

[13]上述[1]或[2]所述的方法，其包括将2片以上的聚醚砜多孔质膜上下或左右地层叠在细胞培养基中来使用。

[14]上述[1]或[2]所述的方法，其中，组合使用上述[3]～[13]任一项所述方法中的2种或更多种的方法。

[15]上述[1]～[14]任一项所述的方法，其中，细胞在聚醚砜多孔质膜的表面和内部生长增殖。

[16]上述[1]～[15]任一项所述的方法，其中，细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌和细菌。

[17]上述[16]所述的方法，其中，动物细胞为来源于属于脊椎动物门的动物的细胞。

[18]上述[16]所述的方法，其中，细菌选自乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和蓝细菌。

[19]上述[1]～[15]任一项所述的方法，其中，细胞选自多能干细胞、组织干细胞、体细胞和生殖细胞。

[20]上述[1]～[15]任一项所述的方法，其中，细胞选自肉瘤细胞、株化细胞和转化细胞。

[21]用于[1]～[20]任一项所述的细胞制备方法的细胞培养装置，其包括聚醚砜多孔质膜。

[22]上述[21]所述的细胞培养装置，其中，2片以上的聚醚砜多孔质膜上下或左右地层叠。

[23]用于[1]～[20]任一项所述的细胞制备方法的试剂盒，其包括聚醚砜多孔质膜。

发明效果

根据本发明，能够简便、高效且稳定地培养细胞。特别是由于聚醚砜多孔质膜的着色度低，因而可视度优异，能够目测确认细胞的接种和生长附着行为等。进而，由于聚醚砜多孔质膜的着色度低，因而外观性优异。

附图说明

[图1]图1表示使用聚醚砜多孔质膜培养的人皮肤成纤维细胞的细胞数的经时变化。

[图2]图2表示使用聚醚砜多孔质膜培养的人间充质干细胞的细胞数的经时变化。

[图3]图3表示将在聚醚砜多孔质膜上培养的人间充质干细胞诱导为脂肪细胞后的显微镜观察结果。

[图4]图4表示将在聚醚砜多孔质膜上培养的人间充质干细胞诱导为成骨细胞、进一步诱导钙化后的光学显微镜图像。

[图5]图5表示使用聚醚砜多孔质膜长期培养人间充质干细胞后的基因分析结果。

[图6]图6表示使用聚醚砜多孔质膜培养的人成骨细胞的细胞数的经时变化。

[图7]图7表示在聚醚砜多孔质膜上培养的人成骨细胞经钙化诱导后的光学显微镜图像。

[图8]图8表示使用聚醚砜多孔质膜培养的CHO DP-12的细胞数的经时变化。

[图9]图9表示在聚醚砜多孔质膜上培养的CHO DP-12细胞的显微镜观察结果。

具体实施方式

1.关于本发明中使用的聚醚砜多孔质膜

本说明书中，“聚醚砜多孔质膜”(以下，也称为“PES多孔质膜”)是指其表面具有多个孔的膜，含有聚醚砜，典型地，基本上由聚醚砜构成。

作为本发明的细胞的制备方法中使用的聚醚砜多孔质膜，优选为如下这样的聚醚砜多孔质膜：其是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在上述表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚醚砜多孔质膜，其中，上述表面层A中存在的孔的平均孔径小于上述表面层B中存在的孔的平均孔径，上述大孔层具有与上述表面层A和B结合的隔壁、以及被该隔壁及上述表面层A和B包围的多个大孔，上述表面层A和B中的孔与上述大孔连通。以下，将具有这样的结构的聚醚砜膜也称为“本发明中使用的三层结构的聚醚砜多孔质膜”。

本发明中使用的三层结构的聚醚砜多孔质膜中的表面层A(以下，也称为“A面”或“网面”)中存在的孔的平均孔径没有特殊限定，例如为0.01μm以上且小于200μm、0.01～150μm、0.01～100μm、0.01～50μm、0.01μm～40μm、0.01μm～30μm、0.01μm～20μm、或0.01μm～15μm，优选为0.01μm～15μm。

只要本发明中使用的三层结构的聚醚砜多孔质膜中的表面层B(以下，也称为“B面”或“大孔面”)中存在的孔的平均孔径大于表面层A中存在的孔的平均孔径，就没有特殊限定，例如为大于5μm且为200μm以下、20μm～100μm、30μm～100μm、40μm～100μm、50μm～100μm、或60μm～100μm，优选为20μm～100μm。

本发明中使用的三层结构的聚醚砜多孔质膜表面的平均孔径可以通过如下方式求得：根据多孔质膜表面的扫描型电子显微镜照片，对200个点以上的开孔部测定孔面积，由该孔面积的平均值，根据下式(1)，计算孔的形状设为正圆时的平均直径。

[数1]

(式中，Sa是指孔面积的平均值。)

表面层A和B的厚度没有特殊限定，例如为0.01～50μm，优选为0.01～20μm。

本发明中使用的三层结构的聚醚砜多孔质膜的大孔层中的大孔的膜平面方向的平均孔径没有特殊限定，例如为10～500μm，优选为10～100μm，更优选为10～80μm。另外，该大孔层中的隔壁的厚度没有特殊限定，例如为0.01～50μm，优选为0.01～20μm。

本发明中使用的聚醚砜多孔质膜的总膜厚没有特殊限定，可以为5μm以上、10μm以上、20μm以上或25μm以上，也可以为500μm以下、300μm以下、100μm以下、75μm以下、或50μm以下。优选为5～500μm，更优选为25～75μm。

本发明中使用的聚醚砜多孔质膜的膜厚的测定可以通过接触式的厚度计进行。

本发明中使用的聚醚砜多孔质膜的空孔率没有特殊限定，例如为40％以上且低于95％。

本发明中使用的聚醚砜多孔质膜的空孔率可以通过测定被切割成规定大小的多孔质膜的膜厚和质量，由单位面积质量，根据下式(2)求得。

[数2]

空孔率(％)＝(1-w/(S×d×D))×100

(式中，S是指多孔质膜的面积，d是指总膜厚，w是指测定的质量，D是指聚醚砜的密度。聚醚砜的密度为1.37g/cm³)。

本发明中使用的聚醚砜多孔质膜优选被灭菌。作为灭菌处理，没有特殊限定，可举出干热灭菌、蒸气灭菌、采用乙醇等消毒剂的灭菌、紫外线或伽玛射线等的电磁波灭菌等任意的灭菌处理等。

本发明中使用的聚醚砜多孔质膜优选为如下这样的聚醚砜多孔质膜：其是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在上述表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚醚砜多孔质膜，其中，上述表面层A中存在的孔的平均孔径为0.01μm以上且小于200μm，上述表面层B中存在的孔的平均孔径为大于5μm且为200μm以下，上述大孔层具有与上述表面层A和B结合的隔壁、以及被该隔壁及上述表面层A和B包围的多个大孔，上述大孔层的隔壁、以及上述表面层A和B的厚度为0.01～50μm，上述表面层A和B中的孔与大孔连通，总膜厚为5～500μm，空孔率为40％以上且低于95％。

2.关于本发明中使用的聚醚砜多孔质膜的制造方法

作为聚醚砜多孔质膜的原料的聚醚砜可以通过本领域技术人员公知的方法合成，例如可通过如下方法制造：使二元酚、碱金属化合物和二卤代二苯基化合物在有机极性溶剂中进行缩聚反应的方法；预先合成二元酚的碱金属二盐，再与二卤代二苯基化合物在有机极性溶剂中进行缩聚反应的方法等。

作为碱金属化合物，可举出碱金属碳酸盐、碱金属氢氧化物、碱金属氢化物、碱金属醇盐等。特别优选碳酸钠和碳酸钾。

作为二元酚化合物，可举出对苯二酚、邻苯二酚、间苯二酚、4,4’-联苯酚、双(羟基苯基)烷烃类(例如2,2-双(羟基苯基)丙烷、和2,2-双(羟基苯基)甲烷)、二羟基二苯基砜类、二羟基二苯基醚类、或这些苯环的氢的至少1个被甲基、乙基、丙基等低级烷基、或甲氧基、乙氧基等低级烷氧基取代的化合物。作为二元酚化合物，可以混合使用2种以上的上述化合物。

聚醚砜可以是市售品。作为市售品的例子，可举出スミカエクセル7600P、スミカエクセル5900P(以上，住友化学(株)制)等。

从良好地形成聚醚砜多孔质膜的大孔的考虑，聚醚砜的对数粘度数优选为0.5以上，更优选为0.55以上，从聚醚砜多孔质膜的制造容易性的观点考虑，优选为1.0以下，更优选为0.9以下，进一步优选为0.8以下，特别优选为0.75以下。

另外，从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点考虑，聚醚砜多孔质膜或作为其原料的聚醚砜的玻璃化转变温度优选为200℃以上，或者没有观察到明确的玻璃化转变温度。

<本发明中使用的三层结构的聚醚砜多孔质膜的制造>

本发明中使用的三层结构的聚醚砜多孔质膜例如通过包括以下工序的方法制得：

(1)将含有对数粘度数为0.5～1.0的聚醚砜0.3质量％～60质量％和有机极性溶剂40质量％～99.7质量％的聚醚砜溶液流延成膜状，浸渍或接触在以聚醚砜的不良溶剂或非溶剂为必须成分的凝固溶剂中，制作具有空孔的凝固膜的工序，和

(2)将上述工序得到的具有空孔的凝固膜进行热处理，使上述空孔粗大化，得到聚醚砜多孔质膜的工序。

(流延)

首先，将聚醚砜溶液流延成膜状。聚醚砜溶液优选含有聚醚砜0.3～60质量％和有机极性溶剂40～99.7质量％，更优选含有聚醚砜1.0～30质量％和有机极性溶剂70～99质量％，进一步优选含有聚醚砜5～15质量％和有机极性溶剂85～95质量％。

有机极性溶剂可以从能够使聚醚砜溶解的溶剂中选择，例如可举出N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等。从良好地形成大孔的观点考虑，优选为N-甲基-2-吡咯烷酮。

流延方法没有特殊限定，例如，可以将聚醚砜溶液用作流延液(dope)，使用刮刀或T型模头等在玻璃板或不锈钢板等上将聚醚砜溶液流延成膜状。另外，在连续的可动式的传送带上，将聚醚砜溶液断续地或连续地流延成膜状，可以连续地制造单片或长条状的流延物。传送带只要不受聚醚砜溶液和凝固溶剂的影响即可，可以使用不锈钢等金属制、聚四氟乙烯等树脂制。另外，也可以将从T型模头成型为膜状的聚醚砜溶液原样投入到凝固浴中。另外，也可以根据需要使流延物的单面或两面与含有水蒸气等的气体(空气、非活性气体等)接触。

(具有空孔的凝固膜的制作)

接着，将流延物浸渍或接触在以聚醚砜的不良溶剂或非溶剂为必须成分的凝固溶剂中，使聚醚砜析出，进行多孔质化，由此制作具有空孔的凝固膜。将得到的具有空孔的凝固膜根据需要进行洗涤和/或干燥。

聚醚砜的不良溶剂或非溶剂优选为水。凝固溶剂中的水的比率优选为20～100质量％，更优选为20～80质量％，进一步优选为30～70质量％，特别优选为40～60质量％。从良好地形成大孔的观点考虑，优选使用含有水和有机极性溶剂的凝固溶剂。作为有机极性溶剂，可举出N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等。其中，优选的有机极性溶剂为N-甲基-2-吡咯烷酮。凝固溶剂为水和有机极性溶剂的混合液时的凝固溶剂100质量％中的水和有机极性溶剂的含量优选为水20～80质量％和有机极性溶剂20～80质量％，更优选为水30～70质量％和有机极性溶剂30～70质量％，进一步优选为水40～60质量％和有机极性溶剂40～60质量％。

凝固溶剂的温度可以根据目的适当选择，例如为-30℃～70℃、优选为0℃～60℃、进一步优选为10℃～50℃的范围。

接着，将上述得到的具有空孔的凝固膜进行热处理，使空孔、特别是表面层的空孔粗大化(即，增大空孔尺寸)，得到聚醚砜多孔质膜。热处理包括将具有空孔的凝固膜在80℃以上的温度区域，以优选10℃以上/分钟、更优选30℃/分钟以上、进一步优选40℃/分钟以上、更进一步优选50℃/分钟以上、特别优选100℃/分钟以上的升温速度升温。上述升温速度从使空孔良好地粗大化的观点考虑是有利的。从稳定地形成期望形状的大孔的观点考虑，升温速度可优选为300℃/分钟以下，更优选为270℃/分钟以下。

从使空孔良好地粗大化的观点考虑，升温优选进行至聚醚砜的玻璃化转变温度以上，或优选240℃以上、或250℃以上、或260℃以上。另一方面，从防止热处理中的聚醚砜分解的观点考虑，升温优选进行至350℃以下，或300℃以下。

对聚醚砜多孔质膜而言，可以通过适当选择所使用的聚合物的种类、聚合物溶液的聚合物浓度、粘度和溶剂种类、凝固条件(溶剂置换速度的控制、温度、凝固溶剂种类等)等，来调整空孔率、膜厚、平均孔径、最大孔径等。

对聚醚砜多孔质膜而言，可以根据目的对其至少单面实施电晕放电处理、低温等离子体放电或常压等离子体放电等等离子体放电处理、化学蚀刻等，由此进行膜的表面处理。另外，可以对表面层A和/或B进行面切削后来使用。通过这些处理，可以控制膜的物质透过性、表面孔径、润湿性。

3.关于本发明的细胞的制备方法

本发明的细胞的制备方法包括将细胞应用于聚醚砜多孔质膜来培养。本发明方法的特征在于，包括将细胞应用于聚醚砜多孔质膜，在聚醚砜多孔质膜的表面或内部培养细胞。

(1)细胞在聚醚砜多孔质膜中的应用

将细胞应用于聚醚砜多孔质膜的具体工序没有特殊限定。可以采用本说明书中记载的工序，或者适于将细胞应用于膜状载体的任意方法。虽然没有限定，但在本发明的方法中，将细胞应用于聚醚砜多孔质膜例如包括如下所述的方式。

(A)包括将细胞接种在上述聚醚砜多孔质膜的表面的工序的方式。

(B)包括以下工序的方式：

在上述聚醚砜多孔质膜的干燥的表面上载置细胞悬浮液，

使上述聚醚砜多孔质膜静置，或移动上述聚醚砜多孔质膜，促进液体的流出，或者刺激部分表面，使细胞悬浮液被吸入上述膜中，和

使细胞悬浮液中的细胞保留在上述膜内，使水分流出。

以及

(C)包括以下工序的方式：

将上述聚醚砜多孔质膜的单面或两面用细胞培养液或灭菌的液体润湿，

向上述润湿的聚醚砜多孔质膜中装填细胞悬浮液，和

使细胞悬浮液中的细胞保留在上述膜内，使水分流出。

(A)的方式包括在聚醚砜多孔质膜的表面直接接种细胞、细胞块。或者包括向细胞悬浮液中投入聚醚砜多孔质膜，自膜的表面使细胞培养液浸润的方式。

在聚醚砜多孔质膜的表面接种的细胞粘附到聚醚砜多孔质膜上，逐渐进入多孔的内部。优选地，特别是即使从外部施加物理或化学的力，细胞也与聚醚砜多孔质膜自发地粘接。在聚醚砜多孔质膜的表面接种的细胞可以在膜的表面和/或内部稳定地生长和增殖。根据细胞生长和增殖的膜的位置，细胞可以采取各种不同的形态。

在(B)的方式中，在聚醚砜多孔质膜的干燥的表面上载置细胞悬浮液。使上述聚醚砜多孔质膜静置，或者移动上述聚醚砜多孔质膜，促进液体的流出，或者刺激部分表面，使细胞悬浮液吸入上述膜中，由此使细胞悬浮液渗透到膜中。不受理论束缚，认为这是由于源自聚醚砜多孔质膜的各表面形状等的性质。根据本方式，细胞被吸入膜的装填有细胞悬浮液的位置而接种。

或者，如(C)的方式那样，可以在将上述聚醚砜多孔质膜的单面或两面的部分或全部用细胞培养液或灭菌的液体润湿后，在润湿的聚醚砜多孔质膜中装填细胞悬浮液。此时，细胞悬浮液的通过速度大幅提高。

例如，以防止膜的飞散为主要目的，可以使用湿润膜的一部分的方法(以下，将其记为“一点湿法”)。一点湿法实质上基本近似于不湿润膜的干燥法((B)的方式)。其中，关于湿润的一小部分，认为细胞液的膜透过变得迅速。另外，也可以使用在充分湿润的聚醚砜多孔质膜的单面或两面的整体(以下，将其记为“湿膜”)中装填细胞悬浮液的方法(以下，将其记为“湿膜法”)。此时，在聚醚砜多孔质膜的整体中，细胞悬浮液的通过速度大幅提高。

在(B)和(C)的方式中，将细胞悬浮液中的细胞保留在上述膜内，使水分流出。由此也可以进行以下处理：浓缩细胞悬浮液中的细胞的浓度，使细胞以外的不需要的成分随水分流出等。

有时将(A)的方式称为“自然接种”，有时将(B)和(C)的方式称为“吸入接种”。

虽然没有限定，但优选活细胞选择性地留在聚醚砜多孔质膜中。因此，在本发明的优选的方式中，活细胞留在上述聚醚砜多孔质膜内，死细胞优先随水分流出。

方式(C)中使用的灭菌的液体没有特殊限定，为灭菌的缓冲液或灭菌水。缓冲液例如为(+)和(-)Dulbecco氏PBS、(+)和(-)Hank氏平衡盐溶液等。缓冲液的例子示于以下的表1。

[表1]

成分	浓度(mmol/L)	浓度(g/L)
			NaCl	137	8.00
KCl	2.7	0.20
			Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	10	1.44
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	1.76	0.24
			pH(-)	7.4	7.4

进而，在本发明的方法中，将细胞应用于聚醚砜多孔质膜包括通过使处于悬浮状态的粘附性细胞以悬浮方式与聚醚砜多孔质膜共存而使细胞附着于膜上的方式(缠结)。例如，在本发明的细胞的培养方法中，为了将细胞应用于聚醚砜多孔质膜，可以在细胞培养容器中装入细胞培养基、细胞、及1片或多片的上述聚醚砜多孔质膜。细胞培养基为液体时，聚醚砜多孔质膜处于悬浮在细胞培养基中的状态。由于聚醚砜多孔质膜的性质，细胞可以与聚醚砜多孔质膜粘接。因此，即使是原本不适于悬浮培养的细胞，也可以在使聚醚砜多孔质膜处于悬浮在细胞培养基中的状态下培养。优选地，细胞与聚醚砜多孔质膜自发地粘接。“自发地粘接”是指即使不特别地从外部施加物理或化学力，细胞也能保留在聚醚砜多孔质膜的表面或内部。

对于细胞培养而言，根据细胞培养中的存在形态，可将培养细胞分类成贴壁培养系细胞和悬浮培养系细胞。贴壁培养系细胞是贴附于培养容器上增殖的培养细胞，在继代中更换培养基。悬浮培养系细胞是在培养基中以悬浮状态增殖的培养细胞，一般来说，在继代培养时不更换培养基，而进行稀释培养。由于悬浮培养可以在悬浮状态、即液体中培养，因而可以大量培养，与仅在培养容器表面生长的贴壁细胞相比，由于它是立体的培养，因而具有每单位空间的可培养的细胞数量多的优点。

根据本发明，理论上，可以不限定于细胞的种类而以与悬浮培养类似的方式培养细胞，从而提供了简便地培养大量细胞的方法。在本发明的细胞培养方法中，在将聚醚砜多孔质膜以悬浮在细胞培养基中的状态使用时，可以使用2片以上的上述聚醚砜多孔质膜的小片。由于聚醚砜多孔质膜是柔性的薄膜，因此，例如通过将其小片悬浮在培养液中使用，可以在一定容量的细胞培养基中夹入具有大表面积的聚醚砜多孔质膜。在通常培养的情况下，容器底面积成为可培养细胞的面积的上限，但在使用本发明的聚醚砜多孔质膜的细胞培养中，先前夹入的聚醚砜多孔质膜的大表面积全部成为可培养细胞的面积。由于聚醚砜多孔质膜使细胞培养液通过，因此，例如可以向折叠的膜内供给营养和氧等。

聚醚砜多孔质膜的小片的尺寸、形状没有特殊限定。形状可以采取圆、椭圆形、四边形、三角形、多边形、带状等任意的形状。例如，包括一边的长度为约0.1mm～约20mm、优选为约0.2mm～约10mm的，更优选为约1mm～约5mm的四边形(正方形、长方形等)、三角形等。或者，例如，可以为优选直径为约0.1mm～约20mm，更优选约0.5mm～约10mm的圆形。通过将这些小片分散在液体中，形成与悬浮培养近似的形态。

本发明的聚醚砜多孔质膜具有柔软性，因此可以改变形状来使用。聚醚砜多孔质膜可以以立体状而不是平面状来加工形状后使用。例如，可以将聚醚砜多孔质膜以如下方式在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定：i)折叠、ii)卷成卷状、iii)将片或小片用线状结构体连接、或iv)系成绳状。通过如i)-iv)那样加工形状，与使用小片的情况同样地，可以在一定容量的细胞培养基中加入许多聚醚砜多孔质膜。进而，由于可以将各个小片作为集合体来处理，因而可以将细胞体集合化来移动，综合应用性高。

作为与小片集合体同样的想法，可以将2片以上的聚醚砜多孔质膜在细胞培养基中上下或左右地层叠来使用。层叠包括聚醚砜多孔质膜部分重叠的方式。通过层叠培养，可以在狭小的空间中高密度地培养细胞。也可以在细胞已生长发育的膜上进一步层叠设置膜，来形成与其他种类细胞的多层体系。进而，还可用于在立体环境下的细胞间相互作用的验证、无应激的细胞培养方法等、以及药物研发。层叠的聚醚砜多孔质膜的数量没有特殊限定。

可以组合使用上述本发明的细胞培养方法中的2种或更多种的方法。例如，可以使用方式(A)～(C)任一项的方法，首先将细胞应用于聚醚砜多孔质膜，接着，可以将粘附有细胞的聚醚砜多孔质膜悬浮培养。或者，作为应用于聚醚砜多孔质膜的工序，可以组合使用上述方式(A)～(C)任一项的方法中的2种或更多种。

在本发明的方法中，优选地，细胞在聚醚砜多孔质膜的表面和内部生长和增殖。没有显示细胞在立体结构体的内部生长和增殖的报告例。在本发明中，通过利用聚醚砜多孔质膜，可以进行细胞的持续的三维培养。虽然没有限定，但通过本发明的方法，细胞可以持续增殖2天以上，更优选为4天以上，进一步优选为6天以上。

(2)本发明中可使用的细胞

本发明的方法可利用的细胞的种类没有特殊限定，可用于任意的细胞增殖。

例如，细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌和细菌。动物细胞大致分为：来源于属于脊椎动物门的动物的细胞和来源于无脊椎动物(除了属于脊椎动物门的动物以外的动物)的细胞。本说明书中，动物细胞的来源没有特殊限定。优选是指来源于属于脊椎动物门的动物的细胞。脊椎动物门包括无颔纲和有颔纲，有颔纲包括哺乳纲、鸟纲、两栖纲、爬行纲等。优选地，一般来说，是来源于称为哺乳动物的属于哺乳纲的动物的细胞。哺乳动物没有特殊限定，优选包括小鼠、大鼠、人、猴、猪、狗、绵羊、山羊等。

本说明书中的植物细胞的来源没有特殊限定。包括苔藓植物、蕨类植物、种子植物在内的植物的细胞成为对象。

种子植物细胞来源的植物包括单子叶植物、双子叶植物中的任一种。不旨在限定，单子叶植物包括兰科植物、禾本科植物(水稻、玉米、大麦、小麦、高粱等)、莎草科植物等。双子叶植物包括属于菊亚纲、木兰亚纲、蔷薇亚纲等多种亚纲的植物。

藻类可视为细胞来源生物。包括从作为真细菌的蓝细菌(蓝藻)，到作为真核生物且单细胞生物的藻类(硅藻、黄绿藻、涡鞭毛藻等)及作为多细胞生物的海藻类(红藻、褐藻、绿藻)等不同的组。

本说明书中的古细菌和细菌的种类没有特殊限定。古细菌包括产甲烷菌、极度嗜盐菌、嗜热嗜酸菌、超嗜热菌等。细菌例如选自乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和蓝细菌等。

可在本发明方法中利用的动物细胞或植物细胞的种类没有限定，优选选自多能干细胞、组织干细胞、体细胞和生殖细胞。

本发明中“多能干细胞”是指具有分化成任何组织的细胞的能力(分化多能性)的干细胞的统称。多能干细胞包括但不限于，胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)、生殖干细胞(GS细胞)等。优选为ES细胞或iPS细胞。iPS细胞因不存在伦理问题等理由而特别优选。作为多能干细胞，可使用公知的任意的干细胞，例如可使用国际公开WO2009/123349(PCT/JP2009/057041)中记载的多能干细胞。

“组织干细胞”是指可分化的细胞系列被限定于特定的组织，但具有可分化为多样细胞种类的能力(分化多能性)的干细胞。例如，骨髓中的造血干细胞成为血细胞的来源，神经干细胞分化成神经细胞。除此以外，存在构成肝脏的肝脏干细胞、成为皮肤组织的皮肤干细胞等各种各样的种类。组织干细胞优选选自间充质干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、或造血干细胞。

“体细胞”是指构成多细胞生物的细胞中除生殖细胞以外的细胞。在有性生殖中没有被下一代继承。体细胞优选选自肝细胞、胰腺细胞、肌细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、成纤维细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、或淋巴细胞、红细胞、白细胞、单核细胞、巨噬细胞或巨核细胞的血细胞。

“生殖细胞”是指具有在生殖中将遗传信息传递给下一代的作用的细胞。例如，包括用于有性生殖的配子，即卵子、***、***、***，用于无性增殖的孢子等。

细胞可选自肉瘤细胞、株化细胞和转化细胞。“肉瘤”是指在骨、软骨、脂肪、肌肉、血液等非上皮性细胞来源的***细胞中发生的癌，包括软组织肉瘤、恶性骨肿瘤等。肉瘤细胞是来源于肉瘤的细胞。“株化细胞”是指长期保持在体外，具有一定的稳定的性质，可以半永久地继代培养的培养细胞。存在PC12细胞(源自大鼠肾上腺髓质)、CHO细胞(源自中国仓鼠卵巢)、HEK293细胞(源自人胚胎肾)、HL-60细胞(源自人白细胞)、HeLa细胞(源自人***)、Vero细胞(源自非洲绿猴肾上皮细胞)、MDCK细胞(源自犬肾小管上皮细胞)、HepG2细胞(源自人肝癌)等来自包括人的各种物种的各种组织的细胞株。“转化细胞”是指从细胞外部导入核酸(DNA等)，改变遗传性质的细胞。关于动物细胞、植物细胞、细菌的转化，各种适宜的方法是公知的。

(3)细胞的培养***和细胞培养条件

在本发明的方法中，细胞的培养***和培养条件可以根据细胞的种类等适当确定。适于动物细胞、植物细胞和细菌的各细胞的培养方法是公知的，本领域技术人员可以使用任意公知的方法在聚醚砜多孔质膜中培养细胞。细胞培养基可以根据细胞的种类适当地制备。

动物细胞的细胞培养方法、细胞培养基例如记载在LONZA公司的细胞培养基目录中。植物细胞的细胞培养方法、细胞培养基例如记载在WAKO公司的植物组织培养基系列等中。细菌的细胞培养方法、细胞培养基例如记载在BD公司的一般细菌用培养基目录中。本发明方法中使用的细胞培养基可以为液体培养基、半固体培养基、固体培养基等的任一种形态。另外，通过将液滴状的液体培养基喷雾到细胞培养容器中，可以使培养基与负载有细胞的聚醚砜多孔质膜接触。

关于使用聚醚砜多孔质膜的细胞的培养，可以与微载体、纤维素海绵等其他悬浮型培养载体共存。

本发明的方法中，用于培养的***的形状、规模等没有特殊限定，可以从细胞培养用的培养皿、烧瓶、塑料袋、试管到大型的罐中适当利用。例如包括BD Falcon公司制的细胞培养皿、Thermo Scientific公司制的Nunc细胞工厂等。予以说明，本发明中，通过使用聚醚砜多孔质膜，对于本来不能悬浮培养的细胞来说，也能在可进行悬浮培养的装置中以类似悬浮培养的状态进行培养。作为悬浮培养用的装置，例如可以使用康宁公司制的旋转烧瓶或旋转培养等。另外，作为实现同样功能的环境，可以使用VERITAS公司的FiberCell(注册商标)***这样的中空纤维培养。

本发明方法中的培养可以通过使用在聚醚砜多孔质膜上连续添加并回收培养基这样的连续循环或开放式的装置，以在空气中使聚醚砜多孔质膜片露出这样的方式来进行。

本发明中，细胞的培养可以在这样的***中进行，其中，细胞培养基从设置在细胞培养容器外的细胞培养基供给装置连续或间歇地供给到细胞培养容器中。此时，可以是细胞培养基在细胞培养基供给装置和细胞培养容器之间循环的***。

在将细胞培养在细胞培养基从设置在细胞培养容器外的细胞培养基供给装置连续或间歇性供给细胞培养容器中这样的***中进行时，该***可以是包括作为细胞培养容器的培养单元和作为细胞培养基供给装置的培养基供给单元的细胞培养装置，其中，所述细胞培养装置具有如下特征：

培养单元是装纳用于负载细胞的1或多个聚醚砜多孔质膜的培养单元，其具备培养基供给口和培养基排出口，

培养基供给单元具备：培养基装纳容器、培养基供给管线、和经由培养基供给管线连续或间歇地向培养基输送液体的送液泵，其中，培养基供给管线的第一个端部与培养基装纳容器内的培养基接触，培养基供给管线的第二个端部经由培养单元的培养基供给口与培养单元内连通。

另外，在上述细胞培养装置中，培养单元可以是不具备空气供给口、空气排出口和氧更换膜的培养单元，另外，也可以是具备空气供给口和空气排出口、或氧更换膜的培养单元。培养单元即使不具备空气供给口和空气排出口、以及氧更换膜，细胞培养所必须的氧等也能通过培养基充分地供应给细胞。进而，在上述细胞培养装置中，培养单元还具备培养基排出管线，其中，培养基排出管线的第一个端部与培养基装纳容器连接，培养基排出管线的第二个端部经由培养单元的培养基排出口与培养单元内连通，培养基可以在培养基供给单元和培养单元之间循环。

4.关于本发明的细胞培养装置

另外，本发明涉及用于本发明制备方法的细胞培养装置，其包括聚醚砜多孔质膜。在本发明的细胞培养装置中，聚醚砜多孔质膜可以固定使用，或者悬浮在细胞培养基中使用。在细胞培养装置中，2片以上的聚醚砜多孔质膜可以上下或左右地层叠。

5.关于本发明的试剂盒

本发明还涉及用于细胞的制备方法的试剂盒，其包括聚醚砜多孔质膜。

本发明的试剂盒除了聚醚砜多孔质膜以外，可适当包括细胞培养所必须的构成要素。例如，包括应用于聚醚砜多孔质膜的细胞、细胞培养基、细胞培养装置、试剂盒的操作说明书等。

虽然没有限定，作为一实施方式，包括如下方式：包括在透明袋内保存1片或多片灭菌的聚醚砜多孔质膜，可原样用于细胞培养的形态的包装；或者将灭菌液体与聚醚砜多孔质膜一起封入该袋内，可有效地吸入接种的膜和液体一体化的形态的试剂盒。

实施例

参照以下所示的实施例更详细地说明本发明，但本发明的范围不限定于这些实施例。

实施例1

使用聚醚砜多孔质膜培养的人皮肤成纤维细胞的细胞数的经时变化

(1)聚醚砜多孔质膜1和2的制备

在500ml的可分离式烧瓶中，使用N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)作为溶剂，按照使聚合物浓度达10质量％的量称量并投入聚醚砜(スミカエクセル7600P：住友化学(株)制，对数粘度数：0.701)。然后，用安装有搅拌浆、氮气导入管、排气管的可分离式盖子盖上，使用油浴一边保持在50℃一边搅拌24小时，得到作为粘稠而透明的液体的聚醚砜溶液。

在室温下，使用台式的自动涂布机，在表面实施了镜面抛光的不锈钢制的20cm见方的基板上，以约100～300μm的厚度均匀地流延涂布上述制备的聚醚砜溶液。然后，在温度23℃、湿度40％的大气中放置90秒，然后，向作为NMP比率为40质量％的水溶液的混合凝固浴中投入整个基板。投入后，静置10分钟，使聚醚砜膜在基板上析出。然后，将基板从浴中取出，将在基板上析出的聚醚砜膜剥离后，在纯水中浸渍5分钟，得到聚醚砜膜。将该聚醚砜膜在温度23℃、湿度40％的大气中干燥后，贴在10cm见方的针板拉幅机上，设置在电炉内。按照以约10℃/分钟的升温速度加热至80℃、然后以10℃/分钟的升温速度加热至270℃、原样保持3分钟的温度曲线进行热处理，制备厚度不同的聚醚砜多孔质膜1(总膜厚25μm)和聚醚砜多孔质膜2(总膜厚50μm)。以下，将聚醚砜多孔质膜1和2也分别称为“PES多孔质膜1”和“PES多孔质膜2”。它们均为包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在该表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚醚砜多孔质膜。

PES多孔质膜1的表面层A中存在的孔的平均孔径为14μm，表面层B中存在的孔的平均孔径为27μm，空孔率为58％。

PES多孔质膜2的表面层A中存在的孔的平均孔径为16μm，表面层B中存在的孔的平均孔径为31μm，空孔率为61％。

(2)使用PES多孔质膜1和2的人皮肤成纤维细胞的培养

在2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific 公司，cat.103)中加入细胞培养基0.5ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的PES多孔质膜1和2以网结构的A面朝上的方式置于容器中，每1片PES多孔质膜接种4×10⁴个人皮肤成纤维细胞。在CO₂温育箱内继续培养，一周2次定期更换培养基。培养开始后，在3天、7天、15天、22天后，使用细胞计数试剂盒-8(同仁化学研究所制，以下也称为“CCK8”)测量细胞数，观察细胞生长行为。结果示于图1。在PES多孔质膜上观察到稳定的细胞的生长。

实施例2

PES多孔质膜上的人间充质干细胞的长期培养

将人间充质干细胞接种于涂布有I型胶原蛋白的培养皿(IWAKI制，口内径6cm)中培养后，通过胰蛋白酶处理剥离，制备细胞悬浮液。在2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司，cat.103)中加入细胞培养基(GIBCO制，DMEM+FBS10％)0.5ml。将实施例1制备的灭菌的1.4cm见方的正方形的PES多孔质膜1以网结构的A面朝上的方式置于容器中，以每1片PES多孔质膜接种4×10⁴个人间充质干细胞的比例添加到膜上部。在CO₂温育箱内继续培养，一周2次定期更换培养基。培养开始后，定期地使用CCK8测定细胞数，培养143天。结果示于图2。在PES多孔质膜1上观察到稳定的间充质干细胞的生长。以下，将使用PES多孔质膜的上述培养称为“部件培养”，将得到的细胞样品称为“部件培养细胞样品”。

实施例3

在PES多孔质膜上培养的人间充质干细胞向脂肪细胞的诱导

在实施例2的培养开始第99天，将生长附着有细胞的PES多孔质膜转移至脂肪细胞诱导培养基(PromoCell公司制，C-28016)中，培养21天。在向脂肪细胞诱导21天后，将生长附着有细胞的PES多孔质膜用***固定，用BODIPY荧光染色脂肪滴。将光学观察、以及共聚焦激光显微镜对同一视野的光学和荧光观察的结果示于图3。由于具有高可视度的PES多孔质膜的特性，脂肪滴的存在可以容易地光学识别。可知，在PES多孔质膜上长期培养后，也能维持间充质干细胞所具有的诱导特性。

实施例4

在PES多孔质膜上培养的人间充质干细胞向成骨细胞的诱导和钙化诱导

在实施例2的培养开始第99天，将生长附着有细胞的PES多孔质膜转移至成骨细胞分化诱导培养基(PromoCell公司制，C-28013)中，培养21天。然后，再用成骨细胞钙化培养基(PromoCell公司制，C-27020)诱导钙化21天。诱导钙化结束后，将细胞在低温下用甲醇固定，用钙化染色试剂盒(Cosmo Bio)染色。进行光学显微镜观察，观察钙化部位。观察到变成红色的部位，确认了钙化的进展(图4)。与脂肪细胞同样地，确认了可诱导为成骨细胞的间充质干细胞的特性。PES多孔质膜的高可视度有助于提高观察性。

实施例5

在PES多孔质膜上长期间培养的人间充质干细胞的基因分析

1.样品的制备

将实施例2的培养开始第139天的部件培养细胞样品用作基因分析用样品。另外，不使用PES多孔质膜，除此以外，在与实施例2同样的条件下，在涂布有I型胶原蛋白的培养皿(IWAKI制)中培养人间充质干细胞7天。将培养的细胞用作基因分析用样品。以下，将不使用PES多孔质膜的上述培养称为“通常培养”，将得到的细胞样品称为“通常培养细胞样品”。

2.基因分析

关于得到的样品，按照以下步骤进行基因分析。

(1)RNA提取

使用RNeasy Plus micro试剂盒(Qiagen)，按照所附的方案，进行RNA的提取。RNA用30μL不含核酸酶的水提取，然后，使用不含TURBO DNA的试剂盒(Life Technologies)，通过DNase进行基因组DNA的分解处理。分解处理后，用Nano Drop 2000(Thermo FishierScientific公司)测定RNA溶液的浓度。

(2)cDNA合成

将浓度测定后的RNA溶液调节至12.5ng/μL，以100ng为模板，进行cDNA合成。合成使用用于RT-PCR的SuperScript(商标)III第一链合成***(Life Technologies公司)。用Nano Drop 2000测定cDNA溶液的浓度。

(3)q-PCR反应

将cDNA溶液调节至200ng/μL，以200ng为模板，通过实时PCR进行测定。用CFX连接(Bio-Rad公司)进行PCR，试剂使用SsoAdvanced(商标)Universal SYBR Green超混合液(Bio-Rad公司)。对间充质干细胞阳性标记物(CD166、CD44、CD105、CD146、CD90、CD106、CD29、CD71)、间充质干细胞阴性标记物(CD19、CD45、CD31、CD18、CD56、CD34、CD14、CD80、CD40、CD86)，测定表达量，使用β-肌动蛋白作为内标基因。

(4)测定数据分析

由将测定求得的各基因的Ct值减去作为内标基因测定的β-肌动蛋白的Ct值而得到的值，计算相对表达量，进行比较。另外，为了比较通常培养细胞样品与部件培养细胞样品之间基因表达的经时变化，分别计算将7天通常培养的细胞样品的表达量设为1时的变化来进行比较。将关于阳性标记物的表达量的结果示于图5。予以说明，阴性标记物的表达量全部确认为低值。由基因表达量的结果确认，使用PES多孔质膜长期培养后，也能维持干细胞的特性。

实施例6

使用PES多孔质膜的人成骨细胞的培养

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司，cat.103)中加入成骨细胞增殖培养基(PromoCell公司制，C-27001)1ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的PES多孔质膜1(实施例1制备的)浸入培养基中。每1片PES多孔质膜接种4×10⁴个人成骨细胞(PromoCell公司制)，在CO₂温育箱内继续进行培养。继续一周2次更换培养基(1ml)，定期地使用CCK8计测细胞数。结果示于图6。在长期间培养的情况下，也观察到稳定且高密度地人成骨细胞的增殖和生长。

实施例7

在PES多孔质膜上培养的人成骨细胞的钙化诱导

在实施例6的培养开始第224天，将培养基用成骨细胞钙化培养基(PromoCell公司制，C-27020)代替，进行钙化诱导。28天后，使用钙化染色试剂盒(コスモ·バイオ社制)染色细胞。进行光学显微镜观察，观察钙化部位。观察到变成红色的部位，确认了钙化的进展(图7)。确认在PES多孔质膜上长期培养人成骨细胞后，也能维持成骨细胞的特性。PES多孔质膜的高可视度有助于提高红色的观察性。

实施例8

使用PES多孔质膜的CHO DP-12细胞的培养

将产生抗人IL-8抗体的CHO DP-12细胞(ATCC CRL-12445)接种在培养皿(口内径10cm)中培养后，通过胰蛋白酶处理剥离，制备细胞悬浮液。向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司，cat.103)中加入细胞培养基(IMDM，2％FBS)0.5ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的PES多孔质膜1和2(实施例1制备的)以网结构的A面朝上的方式置于容器中，每1片PES多孔质膜接种4×10⁴个CHO DP-12细胞。在CO₂温育箱内继续培养，一周2次定期更换培养基。培养开始后，定期地使用CCK8计测细胞数，持续培养143天。结果示于图8。观察到稳定的CHO DP-12的增殖和生长。

在143天后，将生长有细胞的PES多孔质膜2固定，用Alexa Fluor(注册商标)488鬼笔环肽、CellMask Orange质膜染色和DAPI染色。将光学观察、以及共聚焦激光显微镜对同一视野的光学和荧光观察的结果示于图9。由于具有高可视度的PES多孔质膜的特性，能够容易地目测识别细胞的存在。

产业实用性

本发明的方法可适用于简便、高效且稳定地培养细胞。特别是由于聚醚砜多孔质膜的着色度低，因而可视度优异，能够目测确认细胞的接种和生长行为等，从这方面来说是有用的。另外，由于聚醚砜多孔质膜的着色度低，因而外观性优异，从这方面来说也是有用的。

Claims

1.细胞的制备方法，包括将细胞应用于聚醚砜多孔质膜来培养。

2.权利要求1所述的方法，其中，上述聚醚砜多孔质膜是包括具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹在上述表面层A和表面层B之间的大孔层的三层结构的聚醚砜多孔质膜，

上述表面层A和B中的孔与上述大孔连通。

3.权利要求1或2所述的方法，其包括将细胞接种在上述聚醚砜多孔质膜的表面的工序。

4.权利要求1或2所述的方法，其包括以下工序：

在上述聚醚砜多孔质膜的干燥的表面上载置细胞悬浮液，

使细胞悬浮液中的细胞保留在上述膜内，使水分流出。

5.权利要求1或2所述的方法，其包括以下工序：

向上述润湿的聚醚砜多孔质膜中装填细胞悬浮液，和

使细胞悬浮液中的细胞保留在上述膜内，使水分流出。

6.权利要求5所述的方法，其中，活细胞留在上述聚醚砜多孔质膜内，死细胞随水分流出。

7.权利要求5或6所述的方法，其中，上述灭菌的液体为灭菌水或灭菌的缓冲液。

8.权利要求1～7任一项所述的方法，其包括在细胞培养容器中装入细胞培养基、细胞、及1片或多片的上述聚醚砜多孔质膜，其中，聚醚砜多孔质膜处于悬浮在细胞培养基中的状态。

9.权利要求8所述的方法，其特征在于，使用2片以上的上述聚醚砜多孔质膜的小片。

10.权利要求8或9所述的方法，其中，细胞与上述聚醚砜多孔质膜自发地粘接。

11.权利要求1～7任一项所述的方法，其中，将上述聚醚砜多孔质膜以如下方式在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定：

i)折叠，

ii)卷成卷状，

iii)将片或小片用线状结构体连接，或

iv)系成绳状。

12.权利要求11所述的方法，其中，细胞与上述聚醚砜多孔质膜自发地粘接。

13.权利要求1或2所述的方法，其包括将2片以上的聚醚砜多孔质膜上下或左右地层叠在细胞培养基中来使用。

14.权利要求1或2所述的方法，其中，组合使用权利要求3～13任一项所述方法中的2种或更多种的方法。

15.权利要求1～14任一项所述的方法，其中，细胞在聚醚砜多孔质膜的表面和内部生长增殖。

16.权利要求1～15任一项所述的方法，其中，细胞选自动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌和细菌。

17.权利要求16所述的方法，其中，动物细胞为来源于属于脊椎动物门的动物的细胞。

18.权利要求16所述的方法，其中，细菌选自乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和蓝细菌。

19.权利要求1～15任一项所述的方法，其中，细胞选自多能干细胞、组织干细胞、体细胞和生殖细胞。

20.权利要求1～15任一项所述的方法，其中，细胞选自肉瘤细胞、株化细胞和转化细胞。

21.用于权利要求1～20任一项所述的细胞制备方法的细胞培养装置，其包括聚醚砜多孔质膜。

22.权利要求21所述的细胞培养装置，其中，2片以上的聚醚砜多孔质膜上下或左右地层叠。

23.用于权利要求1～20任一项所述的细胞制备方法的试剂盒，其包括聚醚砜多孔质膜。