CN107406826A - 肺组织来源的细胞培养上清液 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供安全性高的、而且效果高的用于呼吸器疾病的预防及治疗的医药组合物等。本发明通过含肺组织来源的细胞的培养上清液,提供可有效修复伤害的肺组织的医药组合物。再者,提供用于使用该培养上清液,向肺表面活性剂蛋白质阳性细胞分化诱导的方法、试剂盒及方法。
Description
【技术领域】
本发明涉及含肺组织来源的细胞的培养上清液、及该培养上清液的,用于治疗及/或预防呼吸器疾病的医药组合物、以及使用该培养上清液的,用于分化诱导为肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的组合物及方法。
【背景技术】
近年,观察到呼吸器疾病的大幅的增加。呼吸器疾病是所谓的呼吸器(肺、上呼吸道、气管-支气管、胸膜等)中发生的疾病的总称,有伴随胸痛或咳、呼吸困难、喀血、喘鸣等的痛苦的症状,有时都影响生命预后的重要的疾病。呼吸器疾病可由感染、外伤、过敏等的各种的原因发生,治愈、修复呼吸器的组织中的炎症或伤害成为治疗上的重要的目的。
但是,存在例如肺中的炎症组织被纤维化的肺纤维症,或肺胞被破坏的肺气肿或慢性闭塞性肺疾病(COPD)等,多种难以组织学地修复病变的疾病。对于这些非可逆地进行的疾病使用类固醇或免疫抑制药、支气管扩张药等进行防止恶化的治疗(专利文献1),但病态无法根本改善。
构成呼吸器的肺主要由呼吸道、血管、及肺胞构成。呼吸道担负向肺胞导入空气中的氧,向外界排出肺胞内的二氧化碳的任务,由上呼吸道(口腔、鼻腔、咽头、喉头)及下呼吸道(气管、支气管、细支气管)构成。其中,在肺侧存在的是下呼吸道。气管重复向末梢分支,成为细支气管。细支气管进一步分支,成为无气体交换功能的终末细支气管、支气管壁上附着有肺胞而进行气体交换的呼吸细支气管。呼吸细支气管数次分支而至肺胞管、肺胞囊、肺胞。肺胞占肺的容积的85%,是成为与血液的气体交换的场所的器官。
呼吸道或肺胞的内腔上皮除了作为对于侵入内腔的异物的物理屏障发挥功能之外,还担负分泌粘液而使呼吸道内保持在适合的湿度,分泌肺表面活性剂等的各种的生理活性物质的功能。内腔上皮由适宜于这些功能的各种各样的细胞构成。
下呼吸道的内腔上皮(呼吸粘膜上皮)示在更靠近气管的部位,基底板上配置有基底细胞、纤毛细胞(圆柱纤毛上皮细胞)、粘膜分泌细胞(杯细胞或苦参细胞)的称为伪重层圆柱纤毛上皮的厚的结构。但是,随着从气管进一步分支,内腔上皮的结构也变化。在终末细支气管中,内腔上皮示单层立方上皮结构,至呼吸细支气管,则置换为由扁平的I型肺胞上皮细胞构成的上皮。在细支气管区域中的上皮细胞之中,除I型肺胞上皮细胞之外的上皮细胞也称为小呼吸道上皮细胞(SAEC)。肺胞上皮由I型肺胞上皮细胞和II型肺胞上皮细胞构成。其中,II型肺胞上皮细胞除了是作为使肺胞的表面张力减少的物质的肺表面活性剂之外,被知为产生各种的炎症性细胞因子。近年来,在肺纤维化的过程中,II型肺胞上皮细胞作为TGF-β的初期靶发挥功能的可能性,或也提示作为肺来源干/前体细胞(PSPC)发挥功能的可能性,被识别为关于各种肺疾病的重要的肺构成细胞(非专利文献1,2)。上述的肺表面活性剂对于使肺胞的表面张力减少,或防肺胞的虚脱有用(非专利文献3)。在I型肺胞上皮细胞被伤害的病态中,也知II型肺胞上皮细胞及其近亲的细胞增殖后,分化为I型肺胞上皮细胞,实现修复组织的作用(非专利文献4,5)。但是,为了含肺障碍的呼吸器疾病的预防或治疗而直接施用II型肺胞上皮细胞有引起宿主体移植片反应的担忧等,从组织适合性的观点来看有问题。要求用于含肺障碍的呼吸器疾病的预防及治疗的、更有效并且安全的方法。
尽管公知,通过构成肺的细胞被伤害,或引起炎症,可发生各种的肺疾病。在肺疾病中,还存在呈细支气管的不可逆的闭塞导致的呼吸不全的闭塞性细支气管炎(BO)、在肺中的炎症组织被纤维化的肺纤维症、肺胞被破坏的慢性闭塞性肺疾病(COPD)等多种难以组织学地修复病变的疾病。对于这些不可逆地进行的疾病使用类固醇或免疫抑制药、支气管扩张药等进行防止恶化的治疗(专利文献2),但无法根本改善病态。
如上所述,作为肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的II型肺胞上皮细胞及小呼吸道上皮细胞在肺纤维症、闭塞性细支气管炎、慢性闭塞性肺疾病等的不可逆地进行的肺疾病的发症、进行等中也担负重要的作用。例如,在I型肺胞上皮细胞被伤害的病态中,已知II型肺胞上皮细胞分化为I型肺胞上皮细胞而增殖,实现修复组织的作用。另外,为了支气管哮喘或细支气管炎的改善、治愈,修复受伤害的小呼吸道上皮细胞是重要的。再者,通过解明II型肺胞上皮细胞或如小呼吸道上皮细胞一样的肺表面活性剂蛋白质阳性细胞可如何分化发生,可期待解明这些肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的修复结构,可关联到不可逆地进行的肺疾病的病态解明及治疗法的开发。为此,期望可诱导从未负有分化为肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的命运的细胞向肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的分化的技术的开发。
至今,作为得到肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的方法,已知回收已经存在于肺组织的细胞的方法。例如,作为得到II型肺胞上皮细胞的方法,已知酶解肺组织的细胞之后,使用II型肺胞上皮细胞特异性的抗体选择性地单离,回收的方法(非专利文献3)。另外,对于小呼吸道上皮细胞,已知从细支气管直接用刷具刷取,单离、回收的方法等(非专利文献6)。
但是,不知可从未负有分化为肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的命运的细胞分化为肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的方法。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:WO 2006/043655
专利文献2:特表2013-544235
【非专利文献】
非专利文献1:Journal Clinical Investigation(2011)121,277-287
非专利文献2:Journal Clinical Investigation(2013)123,3025-3036
非专利文献3:Laboratory Investigation(2004)84,727-735
非专利文献4:Laboratory Investigation(2014)94,1247-1259
非专利文献5:American Journal Respiratory Critical Care Medicine(2007)176,1261-1268
非专利文献6:Respiratory Research(2009)10:99
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
本发明旨在提供含肺组织来源的细胞的培养上清液的,安全性高、而且效果高的用于呼吸器疾病的预防及/或治疗的医药组合物。再者,本发明旨在提供用于使用该培养上清液,诱导从未负有分化为肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的命运的细胞向肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的分化的组合物、试剂盒及方法。
【解决课题的技术方案】
本发明人至此发现,通过混合培养从肺组织单离的细胞,作为肺表面活性剂蛋白质阳性细胞得到了II型肺胞上皮细胞样细胞(非专利文献4)。进而发现,通过将获得II型肺胞上皮细胞样细胞的时期的培养上清经肺施用于肺障碍模型小鼠而抑制肺障碍。再者发现,培养这些细胞而得到的细胞培养上清液有将未负有分化为末梢血单核细胞等的肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的命运的各种细胞诱导为肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的能力,从而完成本发明。
本发明提供如下技术方案。
[1]肺组织来源的细胞的培养上清液。
[2][1]所述的培养上清液,其中上述肺组织来源的细胞是表达选自肺表面活性剂蛋白质或其前体、CD44及CD45的1种以上的蛋白质或编码这些的mRNA的球状细胞。
[3][2]所述的培养上清液,其中肺表面活性剂蛋白质是肺表面活性剂蛋白质C(SP-C)。
[4][2]所述的医药组合物,其中选自CD34及CD90的1种以上的蛋白质或编码这些的mRNA的表达量是全蛋白质或全mRNA的表达量的5%以下。
[5]调制肺组织来源的细胞的培养上清液的方法,其包括:
(1)将从肺组织单离的细胞悬浮于培养基中而形成细胞悬浮液的工序;
(2)培养细胞悬浮液之后,除去非粘接性细胞的工序;
(3)进一步在培养基中培养残留的细胞,形成球状细胞的工序;及
(4)回收细胞培养上清液的工序。
[6]用于治疗及/或预防呼吸器疾病的医药组合物,其中含[1]~[4]之任一项所述的培养上清液、或者由[5]所述的方法调制的培养上清液。
[7][6]所述的医药组合物,其中呼吸器疾病是肺疾病或支气管哮喘。
[8][7]所述的医药组合物,其中肺疾病选自慢性闭塞性肺疾病(COPD)、肺纤维症、急性呼吸窘迫综合征、肺高血压症、肺炎、及肺结节病。
[9]制造肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的方法,其包括使[1]~[4]之任一项所述的培养上清液、或者由[5]所述的方法调制的培养上清液与选自末梢血单核细胞、间充质干细胞、及胚胎干细胞(ES细胞)的细胞接触。
[10]用于制造肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的试剂盒,其中含[1]~[4]之任一项所述的培养上清液、或者由[5]所述的方法调制的培养上清液。
【发明效果】
通过使用含本发明的肺组织来源的细胞培养上清液或该细胞培养上清液的医药组合物,可有效修复伤害的肺组织。另外,本发明的医药组合物由于不含细胞体或组织片,从组织适合性的观点来看安全性高。这样,含本发明的肺组织来源的细胞培养上清液或该培养上清液的医药组合物可期待用于呼吸器疾病的治疗及预防。
本发明通过使肺组织来源的细胞培养上清液与以末梢血单核细胞等的体细胞或ES细胞等的干细胞为首的各种的细胞接触,可诱导从这些细胞向肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的分化。另外,本发明可诱导从未负有分化为肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的命运的细胞向肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的分化。
本发明的肺组织来源的细胞培养上清液、医药组合物及方法除了对于用于以肺疾病为首的呼吸器疾病的治疗或预防的再生医疗有大贡献之外,对于与肺表面活性剂蛋白质阳性细胞相关的疾病的研究或治疗药的开发也有用。再者,由本发明得到的肺表面活性剂蛋白质阳性细胞由于也可使用自身来源的细胞制造,对于在与自身组织适合性高的移植治疗中使用也适宜。另外,由本发明得到的肺表面活性剂蛋白质阳性细胞由于也可使用末梢血单核细胞等的血液来源细胞制造,低抑制向生物体的侵袭性,同时大量地制造也变得可能。
【附图说明】
【图1】图1显示LMDEC(肺混合培养来源上皮细胞(Lung Mixed culture-DerivedEpithelial Cell)(II型肺胞上皮细胞样细胞))的单离及培养上清液的回收工序。肺来源混合培养的时间依赖性变化。球样细胞凝集块在培养第5天在粘接细胞上呈现,在培养第7天扩散,进而,在培养第9天观察到多数悬浮或在粘接细胞上松弛地附着的球状细胞。
【图2】图2显示LMDEC的流式细胞术解析。直方图各自显示(A)原SP-C阳性、CD44阳性、CD45阳性、CD34阳性及CD90阳性的LMDEC的百分率。带阴影的直方图显示由适合的同种型对照或第二抗体染色的,作为阴性对象的LMDEC。(B)SP-C阳性LMDEC的大半共表达CD44及CD45。FSC是指Forward Scatter(前方散射)。(C)LMDEC的小的集团是SP-C阳性/Sca1阳性/CCSP阳性,这提示BASC。使含BASC的Sca1阳性细胞枯渴不影响SP-C阳性/CD45阳性LMDEC的收量。将从使Sca1阳性细胞枯渴的组的SP-C阳性/CD45阳性LMDEC的收量作为与来自通常的组的SP-C阳性/CD45阳性LMDEC的细胞计数的比表示。带阴影的条表示为平均±标准误差(n=3)。在2个组之间无显著的差异。
【图3】图3显示LMDEC的向I型肺胞上皮细胞的分化能特性。(A)SP-C及T1α的mRNA表达的时间依赖性变化。球状细胞的总RNA在所示的时间点被调制,供于用于小鼠SP-C或T1α的扩增的PCR。(B)刚从混合培养回收后的LMDEC是SP-C阳性,但在培养第7天是gp36阳性。(C)基于LMDEC的培养时间的SP-C阳性及gp36阳性细胞的率显示逆相关。
【图4】图4显示弹性蛋白酶处置后,随即施用肺组织来源的细胞的培养上清液、对照培养基、或者PBS的小鼠的肺的组织学解析。上段显示(1)PBS施用组、(2)对照培养基(10%FBS/DMEM)施用组、及(3)肺组织来源细胞混合培养上清液施用组的小鼠肺的组织染色像。下段显示使在(1)~(3)的各组中的平均肺胞壁间距离坐标图化的数据。
【图5】图5显示使用小鼠LMDEC培养上清的细胞诱导。SP-C以绿色(箭头)表示、gp36以红色(箭尾)表示。
【实施方式】
本发明提供用于治疗及预防呼吸器疾病的医药组合物、以及用于在用于制造肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的组合物及方法等中使用的肺组织来源的细胞的培养上清液。
【A.肺组织来源的细胞的培养上清液】
在本发明中,“肺组织的细胞”是指构成肺组织的细胞。构成肺组织的细胞是构成肺中所含的呼吸道(下呼吸道)、血管、肺胞的细胞。
下呼吸道由气管、支气管、细支气管(小呼吸道)构成。下呼吸道自内腔依次由呼吸粘膜上皮、基底板、粘膜固有层、软骨、进而脂肪组织形成的外膜构成。呼吸粘膜上皮表示在更靠近气管的部位,基底板上配置有基底细胞、纤毛细胞(圆柱纤毛上皮细胞)、粘膜分泌细胞(杯细胞或克拉拉细胞)的称为伪重层圆柱纤毛上皮的厚的结构。但是,随着从气管进一步分支,内腔上皮的结构也变化。在终末细支气管中,内腔上皮表示单层立方上皮结构,至呼吸细支气管,则置换为由扁平的I型肺胞上皮细胞构成的上皮。在细支气管区域中的上皮细胞之中,除I型肺胞上皮细胞之外的上皮细胞也称为小呼吸道上皮细胞(SAEC)。
肺胞由蓄积气体的肺胞腔和包围其的肺胞上皮构成。肺胞上皮由I型肺胞上皮细胞和II型肺胞上皮细胞构成。I型肺胞上皮细胞是也称为呼吸上皮细胞或扁平肺胞上皮细胞的非常薄的扁平的细胞。邻接的细胞质彼此由紧密连接(tight junction)粘接,经毛细血管内皮细胞和基底板粘接,形成血液空气关门。在此部位进行与肺胞内的氧、血液中的二氧化碳的气体交换。II型肺胞上皮细胞也称为大肺胞上皮细胞、颗粒肺胞上皮细胞。在细胞表面存在微绒毛,在细胞质内存在富含磷脂的分泌颗粒。开口分泌作为使肺胞的表面张力减少的表面活性剂的肺表面活性剂,形成肺胞包被层。在形成肺组织的细胞中,除此之外,含肺胞及间质中存在的血管内皮细胞、肺胞中隔细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等。
在本发明中,“肺组织来源的细胞”是指从肺组织得到的细胞。
在本发明中使用的肺组织来源的细胞的培养上清液可由如例如以下一样的方法得到,但不限于此。
(1)将从哺乳动物的肺组织得到的单离细胞悬浮于培养基中而形成细胞悬浮液。
(2)培养细胞悬浮液之后,除去非粘接性细胞。
(3)进一步在培养基中培养残留的细胞而形成球状细胞。
(4)回收细胞培养上清液。
在上述的方法的(1)中,哺乳动物的肺可适宜地使用例如,来源于人、狗、猫、牛、马、家兔、仓鼠、豚鼠(天竺鼠)、猪、猴、小鼠、大鼠等的。
从哺乳动物得到的肺优选是脱血的。
作为从肺得到单离细胞的方法,使用何种方法都可。例如,可适宜地使用由夹等机械地细切肺之后,由酶处理消化的方法。作为在酶处理中使用的酶,只要是可消化***而使细胞互相解离的酶,就使用任何都可。例如,可使用将脱氧核糖核酸酶(DNA酶)、胰蛋白酶或分散酶等的蛋白酶、胶原酶、或者这些之中1种以上混合的。作为DNA酶的例,可举出DNA酶I、DNA酶II等,但不限于这些。作为蛋白酶的例,可举出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶;胃蛋白酶、组织蛋白酶D等的天冬氨酸蛋白酶;木瓜蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、无花果蛋白酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、胱天蛋白酶等的半胱氨酸蛋白酶等,但不限于这些。作为胶原酶的例,可举出I型胶原酶、II型胶原酶、III型胶原酶、IV型胶原酶、V型胶原酶、VI型胶原酶、VII型胶原酶、VIII型胶原酶等,但不限于这些。
作为使得到的肺的单离细胞悬浮的培养基,只要是可培养哺乳动物的细胞的培养基,就也可使用任何。例如,可适宜地使用MEM培养基、DMEM培养基、Ham氏F12培养基、Eagle氏MEM培养基、RPM1640培养基、或者这些的混合培养基。在培养基中,可根据需要,在5重量%~30重量%、优选为10重量%~20重量%的范围内添加胎牛血清(FBS)、牛新生仔血清(NBS)、子牛血清(CS)、马血清(ES)等的血清。另外,根据目的,也可使用PMPro、OptiPro SFM等的无血清培养基。当肺的单离细胞是例如小鼠或大鼠的细胞时,优选悬浮于培养基至成1×106细胞/ml培养基~1×108细胞/ml培养基,更优选悬浮于培养基中至成1×107细胞/ml培养基~2×107细胞/ml培养基。人的情况可悬浮于培养基中至成1×106细胞/ml培养基~1×108细胞/ml培养基,也可悬浮于培养基中至成1×107细胞/ml培养基~2×107细胞/ml培养基。
在上述的方法的(2)中,培养条件只要是可培养哺乳动物的细胞的条件,就使用任何条件都可。例如,可适宜地使用5%CO2、37℃的条件。培养期间,本领域技术人员可根据动物种适宜决定,但优选1天~5日,还优选2天~3日。培养后,由吸引、倾倒等的方法除去非粘接细胞,使用缓冲液清洗2次以上,再用培养基清洗1次以上之后,添加新的培养基。作为在清洗中使用的缓冲液,可适宜地使用例如1×PBS等。
在上述的方法的(3)中,进一步培养残留的细胞。培养条件使用与(2)中使用的条件同样的条件即可。本领域技术人员可根据动物种适宜决定培养期间,但优选3天~90天,更优选7天~60天。可由此工序形成球状细胞。球状细胞是指呈直径1μm-30μm的略球形的形状的细胞,可由显微镜等确认。
在上述的调制方法中,工序(3)之后,在形成的球状细胞中,通过确认选自肺表面活性剂蛋白质或其前体、CD44及CD45的1种以上的蛋白质或编码这些的mRNA的表达,可确认球状细胞是II型肺胞上皮细胞样细胞(本说明书中,与“肺表面活性剂蛋白质阳性细胞”以同义使用)。球状细胞可为不表达选自肺表面活性剂蛋白质、CD44及CD45的1种以上的蛋白质或编码这些的mRNA,再者,表达选自CD34及CD90的1种以上的蛋白质或编码这些的mRNA的。
在本发明中,球状细胞可为表达肺表面活性剂蛋白质或其前体或编码这些的mRNA的。肺表面活性剂是使从II型肺胞上皮细胞分泌的肺胞的表面张力减少的物质,由90%的磷脂和10%的蛋白质构成。在肺表面活性剂蛋白质中已知A-D的4种,这些在黑木等“肺胞表面をおおうサーファクタント-特異蛋白質の構造,機能,病態-”(蛋白质-核酸-酶Vol43,No.7,1998,p834-846)中公开。
确认球状细胞是II型肺胞上皮细胞样细胞可基于肺表面活性剂蛋白质的A-D的任何进行,但可适宜地使用肺表面活性剂蛋白质B及C、或者这些的前体。从作为在II型肺胞上皮细胞及小呼吸道上皮细胞的双方中表达的肺表面活性剂蛋白质的观点来看,优选基于肺表面活性剂蛋白质C(SP-C)或其前体。SP-C辅助作为肺表面活性剂的主成分的磷脂使表面张力减少,再者,也认为贡献于在肺胞腔中的表面活性剂的再循环。在本发明中,为了检测,特别优选使用原SP-C蛋白质。
小鼠原SP-C蛋白质的氨基酸序列及编码小鼠原SP-C蛋白质的mRNA的核苷酸序列各自注册为GenBank的Accession No.NP_035489及Accession No.NM_011359.2。
在本发明中,球状细胞可为表达CD44蛋白质或编码其的mRNA的。CD44是与透明质酸等的细胞外基质结合的粘接分子,除了与细胞-细胞间粘接及细胞-细胞间基质间粘接相关之外,还与形态形成、血管形成、癌细胞的浸润及转移、淋巴细胞的归巢等相关。
CD44的mRNA由于受选择性剪接,在CD44蛋白质中存在几种剪接变体,也可在本发明中确认任何的剪接变体的表达。例如,小鼠CD44蛋白质的氨基酸序列及编码小鼠CD44的mRNA的核苷酸序列各自注册为GenBank的Accession No.CAA46883.1及AccessionNo.BC005676.1等。
在本发明中,球状细胞可为表达CD45蛋白质或编码其的mRNA的。CD45是白细胞共同抗原(Leukocyte Common Antigen,LCA),在除成熟红细胞或血小板之外的全部的造血系来源细胞中表达。
CD45的mRNA由于受选择性剪接,在CD45蛋白质中存在几种剪接变体,也可在本发明中确认任何的剪接变体的表达。例如,小鼠CD45蛋白质的氨基酸序列及编码小鼠CD45的mRNA的核苷酸序列各自注册为GenBank的Accession No.AAA67166.1及AccessionNo.M11934.1等。
在本发明中,球状细胞可为CD34蛋白质或编码其的mRNA的表达量各自是全蛋白质或全mRNA的表达量的5%以下的。即,在上述的调制方法中,在工序(3)之后,通过在形成的球状细胞中确认CD34蛋白质或编码其的mRNA的表达量各自是全蛋白质或全mRNA的表达量的5%以下,可确认球状细胞是II型肺胞上皮细胞样细胞。
CD34在未分化的多能性干细胞,或造血前体细胞等中表达。由于CD34的mRNA受选择性剪接,在CD34蛋白质中存在几种剪接变体,也可在本发明中确认任何的剪接变体的表达。例如,小鼠CD34蛋白质的氨基酸序列及编码小鼠CD34的mRNA的核苷酸序列各自注册为GenBank的Accession No.AAH06607.1及Accession No.BC006607.1等。
在本发明中,球状细胞可为CD90蛋白质或编码其的mRNA的表达量各自是全蛋白质或全mRNA的表达量的5%以下的。即,在上述的调制方法中,工序(3)之后,通过在形成的球状细胞中确认CD90蛋白质或编码其的mRNA的表达量各自是全蛋白质或全mRNA的表达量的5%以下,可确认球状细胞是II型肺胞上皮细胞样细胞。
CD90也称为Thy-1,在胸腺细胞、CD34+前驱胸腺细胞、造血干细胞、神经、人胎儿肝细胞亚组、脐带血细胞、骨髓细胞等中表达。
由于CD90的mRNA受选择性剪接,在CD90蛋白质中存在几种剪接变体,也可在本发明中确认任何的剪接变体的表达。例如,小鼠CD90蛋白质的氨基酸序列及编码小鼠CD90的mRNA的核苷酸序列各自注册为GenBank的Accession No.NP_033408.1及AccessionNo.BC054436.1等。
在本发明中,肺表面活性剂蛋白质、CD44蛋白质、CD45蛋白质、CD34蛋白质、及CD90蛋白质在氨基酸序列上与上述小鼠SP-C蛋白质、小鼠CD44蛋白质、小鼠CD45蛋白质、小鼠CD34蛋白质、及小鼠CD90蛋白质有60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上或97%以上的相同性。
另外,在本发明中,编码肺表面活性剂蛋白质、CD44蛋白质、CD45蛋白质、CD34蛋白质、及CD90蛋白质的mRNA在核苷酸序列上,与编码上述小鼠SP-C蛋白质、小鼠CD44蛋白质、小鼠CD45蛋白质、小鼠CD34蛋白质、及小鼠CD90蛋白质的mRNA有60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上或97%以上的相同性。
2个的氨基酸序列的相同性%也可由视觉检查及数学计算确定。或者,2个的蛋白质序列的相同性百分率也可通过基于Needleman,S.B.及Wunsch,C.D.(J.Mol.Biol.,48:443-453,1970)的算法,进而使用可从Wisconsin大学遗传学计算机组(UWGCG)得到的GAP计算机程序比较序列信息确定。在GAP程序的优选的默认参数中包括:(1)如Henikoff,S.及Henikoff,J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919,1992)中记载的评分矩阵、blosum62;(2)12的空位权重;(3)4的空位长权重;及(4)无对末端空位的罚分。
也可另外使用在本领域技术人员中使用的序列比较的其他程序。相同性的百分率能使用例如Altschul等(Nucl.Acids.Res.,25,p.3389-3402,1997)中记载的BLAST程序与序列信息比较而确定。所述程序在互联网上能从National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)、或者DNA Data Bank of Japan(DDBJ)的网址利用。利用BLAST程序的相同性检索的各种条件(参数)在同位点详细地记载,能适宜变更一部分的设定,但检索通常使用默认值进行。或者,2个的氨基酸序列的相同性%也可使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX制)等的程序、或者,FASTA算法等确定。此时、检索使用默认值好的。
2个的基因(核酸序列)的相同性%能由视觉检查和数学计算确定,或者更优选而言,此比较通过使用计算机-程序对序列信息进行比较而进行。代表性的,优选的计算机-程序是遗传学计算机-组(GCG;Wisconsin州Madison)的Wisconsin·包装、版本10.0程序“GAP”(Devereux,et al.,1984,Nucl.Acids Res.,12:387)。由此“GAP”程序的使用,除了2个核酸序列的比较之外,可进行2个氨基酸序列的比较、核酸序列和氨基酸序列的比较。其中,在“GAP”程序的优选的默认参数中包括:(1)对于核苷酸(对于相同物含1的值、及对于非相同物含0的值)一元(unary)比较基质的GCG执行,和如由Schwartz及Dayhoff监修“多肽的序列及结构的Atlas(Atlas of Polypeptide Sequence and Structure)”国立生物医学研究财团、353-358页、1979记载的Gribskov及Burgess,Nucl.Acids Res.,14:6745,1986的权重氨基酸比较基质;或者其他能比较的比较基质;(2)对于氨基酸的各空位而言30的罚分,和对于各空位中的各记号追加的1的罚分;或者对于核苷酸序列的各空位而言50的罚分,和对于各空位中的各记号追加的3的罚分;(3)不对端空位罚分:及(4)对长的空位无最大罚分。在由本领域技术人员使用的其他序列比较程序中,例如,能从美国国立医学库的网址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html利用的BLASTN程序、版本2.2.7、或者能使用UW-BLAST2.0算法。对于UW-BLAST2.0的标准的默认参数的设定在以下的互联网位点:http://blast.wustl.edu中记载。再者,BLAST算法使用带BLOSUM62氨基酸评分的矩阵,能使用的选择参数如下:(A)含用于罩有低的组成复杂性的查询序列的区段(由Wootton及Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry,1993)确定;Wootton及Federhen,1996“序列数据库中的组成编重区域的解析(也可参照Analysis of compositionally biasedregions in sequence databases)”Methods Enzymol.,266:544-71)、或者,由短周期性的内部重复构成的区段(由Claverie及States(Computers and Chemistry,1993)的XNU程序确定)的滤器,及(B)根据用于报告对数据库序列的适合的统计学显著性的阈值、或者E-评分(Karlin及Altschul,1990)的统计学模型,单偶然发现的适合的期待概率;某适合起因的统计学显著差异大于E-评分阈值时,此适合未报告);优选的E-评分阈值的数值是0.5,或者以优选度增加的顺序是0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75、或者1e-100。
在球状细胞中表达上述的蛋白质或编码它们的mRNA可使用公知的方法确认。例如,蛋白质的表达可使用蛋白质特异性的抗体,由ELISA法、蛋白印迹法、放射免疫测定、免疫染色等的方法确认。SP-C特异性的抗体、CD44特异性的抗体、CD45特异性的抗体、CD34特异性的抗体、及CD90蛋白质特异性的抗体可使用例如由abcam公司市售的。此时,也可使用针对CD45.1、CD45.2、CD90.1、CD90.2等的同类系标志物的抗体。
mRNA的表达可通过检测在细胞内存在的mRNA来确认。mRNA的检测可由RT-PCR、Northern杂交、原位杂交等的方法进行。这些方法均是对于本领域技术人员而言公知惯用的方法可参照例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual Fourth Edition(ColdSpring Harbor Laboratory Press)或Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons)等进行。
球状细胞之中,表达SP-C的细胞的比例优选80%以上,还优选90%以上。
将如上所述得到的肺组织来源的球状细胞称呼为“肺混合培养来源上皮细胞(Lung Mixed culture-Derived Epithelial Cell)(LMDEC)”。
在上述的方法的(4)中,形成了球状细胞之后,由吸引、倾倒等的方法回收细胞培养上清液。
再者,根据需要,工序(4)之后,通过对于残留的细胞,多次重复工序(3)及(4),可将细胞培养上清液经多次回收。第1次的工序(4)之后,重复工序(3)及(4)的次数可根据成为细胞的源的动物种等的条件适宜设定,但例如,可在小鼠来源的细胞中2次~5次、在大鼠来源的细胞中重复2次~12次。
作为确认得到的细胞培养上清液的有效性的方法,只要是在呼吸器疾病的治疗药的药理实验中使用的,就使用任何都可,但可使用如例如以下一样的方法。
(1)将细胞培养上清液直接或者浓缩而施用于肺障碍模型动物。作为阴性对照,将培养细胞之前的培养基直接或者浓缩而施用于肺障碍模型动物。
作为肺障碍模型动物,使用任何都可,但例如,可适宜地使用弹性蛋白酶诱导肺障碍模型小鼠或大鼠、博来霉素诱导肺障碍模型小鼠或大鼠等。
施用阴性对照培养基或细胞培养上清液的动物的饲育期间如果是例如弹性蛋白酶模型,则可为3周、如果是博来霉素模型,则可为2周。
(2)饲育施用后的动物之后,供试,取肺,制作组织标本。
从动物得到的肺的组织标本可根据定法制作。例如,可将肺组织浸渍于***等而进行固定,在石蜡包埋或冷冻后薄切,实施苏木精-伊红染色。
(3)在组织标本中,测定平均肺胞隔壁间距离(mean linear intercept length)。通过使用光学显微镜等观察制作的组织标本,可测定平均肺胞隔壁间距离。
(4)确认与在施用阴性对照培养基的动物的试样中的平均肺胞隔壁间距离相比,在施用细胞培养上清液的动物的试样中的平均肺胞隔壁间距离显著地减少。
【B.医药组合物】
本发明的医药组合物通过含从肺组织得到的细胞的培养上清液,可有效预防或治疗呼吸器疾病。
从肺组织得到的细胞的培养上清液可直接或者浓缩而作为本发明的医药组合物使用。培养上清液的浓缩使用任何方法进行都可,但可适宜地使用例如真空浓缩、冷冻浓缩、膜浓缩、或者将这些组合的方法。可浓缩至回收的培养上清液的约2倍~100倍,但可为浓缩至约2倍~20倍而使用,也可为浓缩至约2倍~7倍而使用。
细胞培养上清液中所含的蛋白质的量可为例如0.1mg/ml~200mg/ml,可为0.3mg/ml~100mg/ml。此上清液在使用的阶段,也能作为例如除去血清蛋白质等的溶液使用。根据需要,作为除去水分及血清蛋白成分的浓缩液,或除去它们后,还能使用再向培养基或溶液等加的再调整液。
另外,也可将干燥细胞培养上清液的粉末直接或者与其他构成成分合并而作为本发明的医药组合物使用。干燥方法使用任何方法都可,但优选冷冻干燥或喷雾干燥。
在可与本发明的医药组合物配合的其他构成成分中,不限定,可含追加的有效成分、药学上能接受的载体、或者这些的组合。
作为追加的有效成分的例,可举出倍氯米松、氟替卡松、布***等的类固醇剂;FK506、环孢菌素等的免疫抑制剂;妥布霉素、阿米卡星等的抗菌药;吡非尼酮等的抗纤维化药;噻托铵、格隆铵、异丙托铵等的抗胆碱药;沙美特罗、茚达特罗、福莫特罗等的β2刺激药,但不限于这些。这些有效成分可根据对象的每种适应症使1种以上与本发明的医药组合物配合。
在药学上能接受的载体中含对施用的对象无害的、不损害作为本发明的医药组合物的有效成分的细胞培养上清液及追加的有效成分的生物活性及特性的缓冲剂、赋形剂、稀释剂、稳定剂、抗氧化剂、保存剂、香味剂或这些的组合,但不限于这些。在缓冲剂的例中,含磷酸盐、柠檬酸盐、及其他有机酸。在赋形剂的例中,含碳酸钙、磷酸钙等的钙盐;白糖、乳糖、淀粉、玉米淀粉等的糖类;羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素等的纤维素衍生物;明胶。在稀释剂的例中含纯化水、生理盐水等的水性溶剂;乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇等的醇;芝麻油、棉籽油、玉米油等的植物油。在稳定剂的例中含EDTA等的鳌合剂;甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或者赖氨酸等的氨基酸类;葡萄糖、甘露糖等的单糖类、海藻糖等的二糖类、葡聚糖、果胶、瓜尔胶、黄原胶、角叉菜胶等的多糖类。在抗氧化剂的例中含抗坏血酸;生长酚类、生育三烯酚类;胡萝卜素类、叶黄素类等的类胡萝卜素;类黄酮类等的多酚类;甲硫氨酸等的氨基酸;叔-丁基氢醌、丁基化羟基甲苯等的合成抗氧化物质。在保存剂的例中含十八烷基二甲基苄基铵氯化物、氯化六甲铵、氯化苯扎铵、氯化苄索铵、苯酚、丁基或苄基醇、甲基或丙基对羟基苯甲酸酯等的烷基对羟基苯甲酸酯类;在香味剂的例中,含甘露糖醇、山梨糖醇等的糖醇;糖精钠;阿司帕坦;乙酰舒泛钾;索马汀;甜菊糖提取物;l-薄荷醇;苧烯;胡椒薄荷油、柠檬油、橙油、鼠尾草油、迷迭香油、桂皮油、桉树油、丁香油等的精油。
本发明的医药组合物的形态无特别限制,可调制成例如,粉末状、颗粒状、锭剂状等的固体状;溶液状、乳液状、分散液状等的液状;或者糊状等的半固体状等的,任意的形态。作为具体的剂形,可例示散剂、颗粒剂、细粒剂、锭剂、丸剂、锭剂、胶囊剂(含软件胶囊剂、硬胶囊剂)、咀嚼型剂、溶液剂等。
本发明的医药组合物的施用方法可根据患者的症状或年龄等选择适合的,但经肺施用、经鼻施用、经口施用、或者局部施用是适宜的。施用量是将,例如,除3kDa以下的蛋白质及30kDa以上的蛋白质之外的细胞培养液浓缩20倍的,可对于第一次的施用而每1kg体重施用0.01ml~100ml,可对于第一次的施用而每1kg体重施用0.1ml~50ml,也可对于第一次的施用而每1kg体重施用0.5ml~5ml。
【C.呼吸器疾病的预防或治疗】
本发明的医药组合物所针对的“呼吸器疾病”是指在含上呼吸道、气管、支气管、肺的呼吸器中发生的疾病。作为呼吸器疾病的例,根据病巢,含气管-支气管疾病、肺疾病、胸膜疾病等。在本发明中,优选为,可举出肺疾病或支气管哮喘,但不限于这些。另外,作为肺疾病的例,可举出慢性闭塞性肺疾病(COPD)、肺纤维症、急性呼吸窘迫综合征、肺高血压症、肺炎、及肺结节病,但不限于这些。
用语“预防”是指在呼吸器疾病的症状发生之前,部分或完全地阻止症状的显现或进行。
用语“治疗”是指反转、缓和、减轻、抑制、或者部分或完全地阻止呼吸器疾病的1种以上的症状的进行。
可施用本发明的医药组合物的对象是哺乳动物即可,例如,可例示人、狗、猫、牛、马、家兔、仓鼠、豚鼠、猪、猴、小鼠、及大鼠等。
本发明的医药组合物可为含从与施用对象的种相同的种或不同的种的肺组织得到的细胞的培养上清液的。具体而言,例如,向人施用的本发明的医药组合物可为含从选自人、狗、猫、牛、马、家兔、仓鼠、豚鼠、猪、猴、小鼠、及大鼠的1种以上的动物的肺组织得到的细胞的培养上清液的。
【D.用于制造肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的组合物】
在本发明的组合物中,除了上述的肺组织的细胞的培养上清液或其浓缩物或干燥物之外,还可配合其他构成成分。在可与本发明的组合物配合的其他构成成分中不限定,可含追加的有效成分、药学上能接受的载体、或者这些的组合。
作为追加的有效成分的例,可举出上皮细胞生长因子(EGF)、***(IGF)、转化生长因子(TGF)等的细胞生长因子;维生素E、维生素C、维生素A等的维生素类;钠、钾、钙、镁等的矿物等,但不限于这些。另外,在药学上能接受的载体基于在上述的医药组合物中使用的实施方式。
本发明的组合物的形态无特别限定,可调制成例如,粉末状、颗粒状、锭剂状等的固体状;溶液状、乳液状、分散液状等的液状;或者糊状等的半固体状等的,任意的形态。
与本发明的组合物配合的细胞培养上清液的量可根据成为诱导对象的细胞的种类或目的适宜设定。例如,可配合成末梢血单核细胞的每细胞数104添加含0.1mg/ml~200mg/ml的蛋白质的培养上清液或其浓缩物或干燥物。
【E.肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的制造方法】
本发明也涉及肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的制造方法,其包括使含上述的肺组织的细胞的培养上清液或该培养上清液的组合物与未负有分化为末梢血单核细胞等的肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的命运的细胞接触的工序。作为未负有分化为肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的命运的对象细胞的例,可举出末梢血单核细胞、间充质干细胞、及胚胎干细胞(ES细胞),但不限于这些。
使本发明的培养上清液等与对象细胞接触的方法不限定,也可简便地在该培养上清液中培养对象细胞。培养时间等的培养时间只要是本领域技术人员,就可适宜调整。另外,在这样的肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的制造中,也可使用后述的试剂盒。
【F.用于肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的制造的试剂盒】
本发明涉及用于表达肺表面活性剂蛋白质的细胞的制造的试剂盒,其含上述的肺组织的细胞的培养上清液。本发明的试剂盒除了上述的肺组织的细胞的培养上清液或其浓缩物或干燥物之外,可含追加的构成要素。再者,也可使用含上述的培养上清液的组合物。
在可含于本发明的试剂盒中的其他构成要素中不限定,可含细胞培养用的培养基、用于向培养基添加的追加的成分、细胞培养用的培养器、及这些的组合。另外,也可含记载该试剂盒的构成及成分、使用法等的使用说明书。
细胞培养用的培养基只要是可培养哺乳类的细胞的培养基即可,但作为不限定的例,可举出PMPro,OptiPro SFM等的无血清培养基、DMEM培养基、EMEM培养基、GMEM培养基、MEM培养基、RPMI培养基、Ham F-12培养基、Eagle氏MEM培养基、RPM1640培养基、或者这些的混合培养基。
作为用于向培养基添加的追加的成分的例,可举出血清、缓冲剂、抗生剂、生长因子、细胞因子、蛋白质或肽、氨基酸、糖或培养上清浓缩液等,但不限于这些。本发明的试剂盒也可根据目的含1种以上这些追加的成分。另外,本发明的试剂盒也可含使这些追加的成分预先与培养基混合的。
在血清的例中,含牛血清、牛胎儿血清、马血清。在缓冲剂的例中,含HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸);磷酸二氢钾、磷酸氢钠等的磷酸盐;或者2以上的这些的混合物。在抗生剂的例中,含青霉素、链霉素、两性霉素B、或者2以上的这些的混合物。在生长因子的例中,含上皮细胞生长因子。在细胞因子的例中含白细胞介素1、白细胞介素2、白细胞介素3、白细胞介素4等。在蛋白质或肽的例中含血清白蛋白、L-丙氨酰L-谷氨酰胺等。在氨基酸的例中含L-谷氨酰胺、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、或者2以上的这些的混合物。在糖的例中,含葡萄糖。
以下,基于实施例,更具体说明本发明。再者,本发明不限于这些实施例。本领域技术人员可基于本说明书的记载容易地向本发明加修饰-变更,它们含在本发明的技术性范围内。
【实施例】
【实施例1:肺混合培养来源上皮细胞(LMDEC)的制作】
【材料和方法】
<动物>
雄及雌的C57BL/6J小鼠从CLEA日本公司(日本国、东京)购入。
<混合培养及LMDEC的调制>
将雄的小鼠(3~4周龄)用戊巴比妥麻醉,由25mL的冰冷却的磷酸缓冲生理盐水(PBS)进行心脏内灌流,完全地洗流肺的血细胞。将肺叶从气管切离,将主支气管细切成小片之后,在添加2mg/mL的I型胶原酶(Worthington公司、New Jersey州、Lakewood)、1mg/ml的分散酶(Life Technologies公司、California州、Carlsbad)、3单位/mL的DNA酶(Qiagen公司、California州、Valencia)、0.1mg/mL的链霉素、及100单位/mL的青霉素的DMEM(和光纯药工业株式会社、日本国、东京)中,一边稳振荡,一边于37℃消化45分钟。接下来,使发生的小片充分地悬浮至成单一细胞悬浮液,进而使细胞通过40μm的细胞滤器(BDBioscience公司、California州、San José)之后,用FBS中和。将细胞用DMEM清洗,在培养基(添加10%FBS、0.1mg/mL的链霉素、100单位/mL的青霉素、及2.5μg/mL的两性霉素B的DMEM)中再悬浮。向培养皿中接种细胞(细胞密度、1.3×106细胞/cm2)、进而加湿气氛(5%CO2)中,于37℃作为“混合培养”温育。培养2天后,将培养皿用PBS清洗数次而完全地除去悬浮细胞,进而接下来使用培养基进行第一次清洗。进一步温育细胞,在培养第9天,通过叩(敲)培养皿,将悬浮或者松弛地附着于粘接细胞的球状细胞作为LMDEC回收。
【结果】
从上述混合培养从纺锤状的粘接细胞发生球状细胞,在培养第5天,培养器底部的粘接细胞汇合,在粘接细胞上还观察到球样细胞的凝集块(图1)。细胞凝集块(见耗的比率:2-3/1.5mm2)在培养第7天更大,更松弛地粘接,平坦。其后,悬浮或者松弛地附着于粘接细胞的球状细胞的数增加,在培养第9天覆盖粘接细胞。球状细胞的收率,在培养第9天是2.4±0.2×106细胞/小鼠。
【实施例2:赋予LMDEC的特性】
【材料和方法】
<抗体>
识别在小鼠的原SP-C的N末端的氨基酸11-27的表位的兔抗原SP-C抗体依赖于Sigma-Aldrich日本Genosis公司(日本国、石狩市)制作。别的兔抗原SP-C抗体从Millipore公司(Massachusetts州、Billerica)购入。再者,使用以下的第一抗体的:抗平足蛋白/gp36抗体(Abcam公司、英国、Cambridge);抗CCSP/CC10抗体(Santa Cruz Biotechnology公司、California州、Santa Cruz);PerCP-Cy(商标)5.5-缀合***抗体混合物(抗CD3ε、抗CD11b、抗CD45R/B220、抗Ly-76、及抗Ly-6G&6C抗体(BDBioscience公司);藻红蛋白(PE)-抗CD34抗体;生物素-、PE-、或者Alexa Fluor(注册商标)647-抗CD44抗体;生物素-、亮紫-、或者PE-抗CD45.2抗体;PE-抗CD73抗体;Alexa Fluor(注册商标)488-抗CD90.2抗体;FITC-、或者PE-抗c-kit抗体;生物素-、或者PE-抗Sca1抗体(Biolegend公司、California州、SanDiego)。
为了荧光缀合第一抗体,以对应于各第一抗体的荧光缀合物同种型对照作为流式细胞术解析中的阴性对照使用。再者,使用以下的第二次试剂及抗体的:Alexa Fluor(注册商标)350-链霉亲和素;Alexa Fluor(注册商标)594-链霉亲和素;Alexa Fluor(注册商标)594-驴抗山羊IgG;Alexa Fluor(注册商标)594-山羊抗仓鼠IgG;Alexa Fluor(注册商标)594-驴抗大鼠IgG;Alexa Fluor(注册商标)594-鸡抗小鼠IgG;Alexa Fluor(注册商标)350-山羊抗兔IgG;Alexa Fluor(注册商标)488-鸡抗兔IgG(Life Technologies公司);及DyLight(商标)680-驴抗兔IgG(Rockland Immunochemicals公司、Pennsylvania州、Gilbertsville)。
<流式细胞术解析>
将新回收的LMDEC及混合培养中的粘接细胞用1:10FcR封闭试剂处理15分钟,供于在4℃的15分钟的细胞表面染色。固定及透过处理(Fix/Perm缓冲液、Biolegend公司)之后,将细胞还供于在4℃的15分钟的细胞内染色。第一抗体及第二次试剂/抗体各自以100分之1及200分之1的稀释率使用。得到的细胞使用70μm的细胞滤器(BDBioscience公司)经过滤器,使用流式细胞仪(FACSCanto(商标)II、BDBioscience公司)解析。使用与适合的同种型标准或第二次试剂/抗体一同温育的阴性对照细胞,选通阳性染色细胞。数据使用FACSDiva(BDBioscience公司)及FlowJo9.6.2软件(Tree Star公司、Oregon州、Ashland)收集,解析。
<RT-PCR>
使用RNAiso Plus(宝生物公司、日本、濑田),根据生产商的指示,从LMDEC调制总RNA。从调制的RNA(3μg),使用Moroney小鼠白血病病毒逆转录酶(Life Technologies公司),使用寡(dT)引物(Life Technologies公司),将总容量设为20μL,合成单链cDNA。将得到的cDNA试样(1μL)供于PCR,使用特异性引物(为了SP-C,作为正义引物使用5’-TGGACATGAGTAGCAAAGAG-3’、作为反义引物使用5’-GTAGCAGTAGGTTCCTGGAG-3’;为了T1α,作为正义引物使用5’-GATCACAGAGAACACGAGAG-3’、作为反义引物使用5’-TCTTTCCTTTGGTACTGCTG-3’),扩增小鼠SP-C或平足蛋白/T1α基因。作为内部标准,将小鼠甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(GAPDH)cDNA使用特异性引物(作为正义引物使用5’-GACCACAGTCCATGACATCACT-3’、作为反义引物使用5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’)扩增。热循环仪的设定是,对于SP-C及T1α设定98℃30秒钟、56℃30秒钟、68℃7分钟的35个循环、及68℃7分钟的35个循环,对于GAPDH设定98℃30秒钟、60℃30秒钟、68℃30秒钟的26个循环。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中分离,由溴化乙锭染色在UV照射下可视化。观察到小鼠SP-C(365bp)、T1α(414bp)、及GAPDH(450bp)的特异性扩增。
<免疫荧光观察>
将从小鼠得到的LMDEC分散于与实施例1同样的培养基,接种到8孔室载玻片(Thermo公司、Massachusetts州、Waltham)上。在第0天,在播种后3小时以内,另外,在图内表示的时间后(但是,超3天时,每3天将培养基与半量新鲜的培养基交换而维持),将细胞用冰冷却的PBS清洗,使用4%PFA/0.1M NaPB固定。接下来,使用0.1%Triton X-100/PBS,将细胞透过处理3分钟,用冰冷却的PBS清洗。由PBS中的SuperBlock(Thermo公司)处理15分钟之后,将细胞由第一抗体(抗原SP-C抗体及/或抗M2标志抗体)和第二抗体(Alexa Fluor(注册商标)488-鸡抗-兔IgG抗体及/或Alexa Fluor(注册商标)594-山羊抗小鼠IgG抗体(LifeTechnologies公司))的组合染色,在荧光显微镜下观察。核使用4’,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(同仁化学研究所、日本国、熊本)染色。
在Sca1阳性细胞枯渴试验中,不存在Sca1细胞的混合培养使用抗Sca1μ珠试剂盒(Miltenyi Biotec公司)调制。接下来,供于由使从通常的混合培养或不存在Sca1细胞的混合培养得到的LMDEC与第二抗体(Alexa Fluor(注册商标)488-鸡抗兔IgG抗体及AlexaFluor(注册商标)594-链霉亲和素(Life Technologies公司))组合的抗原SP-C抗体及生物素-抗CD45.2抗体的双染色。
<增殖测定>
向在LMDEC回收后的混合培养中的粘接细胞装载10μM的5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)6小时,使用PBS清洗之后,使用4%PFA/0.1M NaPB固定。根据Click-iT(注册商标)EdU成像试剂盒(Life Technologies公司)的附带流程,将在DNA中整合的EdU与Alexa Fluor(注册商标)488-或647-叠氮化物一同检测。将有荧光素标记的核的细胞供于使用表1中记载的抗体的荧光免疫染色,使用FACSCantoII检查。
<统计解析>
数据表示为平均±标准误差。统计解析使用Graphpad Prism版本6(GraphpadSoftware Incorporation公司、California州、San Diego)实施。统计的显著差异是由Student的t检验、或者继分散解析之后的Student的t检验检测,不足0.05的p值被认为显著。
【结果】
<流式细胞术解析>
流式细胞术解析的结果,绝大部分LMDEC(96.4%±1.1%)是SP-C阳性(图2A)。
至此已知,在负有分化为肺胞上皮细胞谱系的细胞、即肺胞上皮细胞的命运的细胞中,至少在体外培养中,组成型地表达CD44(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2009,296,L442-452)。对于LMDEC研究CD44的表达时,超90%的LMDEC(图2A)是CD44阳性。
一方面,作为造血细胞标志物的CD45,一般而言被知为在II型肺胞上皮细胞中不表达(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2009,296,L442-452)。令人惊讶地,接近90%的LMDEC对于CD45是阳性(91.1±3.1%)(图2A)。再者,LMDEC的主要的集团(LMDECMaj)共表达SP-C、CD44及CD45(图2B)。
为了使LMDEC是否含肺干细胞/前体细胞的其他细胞集团变得明显,使用以下的各种各样的标志物进行探讨:CD34(涵盖从更初期的多能性前体细胞至约束于后期的细胞谱系的前体细胞的造血干细胞/前体细胞标志物(Proc Natl Acad Sci U.S.A.,2009,106,8278-8283),是用于支气管肺胞上皮细胞(BASC)的浓缩标志物工具);CD90(是组织中存在的间充质干细胞(MSC)的主要的标志物之一(Lab Invest,2011,91,363-378))。在LMDEC中,CD34及CD90的表达几乎观察不到(图2A)。一方面,在LMDEC之中观察到示SP-C阳性/CCSP阳性/Sca1阳性的小的细胞集团。这提示LMDEC含支气管肺胞上皮细胞(BASC)(图2C)。BASC有分化为呼吸道及肺胞的两方的谱系的能力(Cell,2005,121,823-835)。这提示LMDECMaj说不定部分来源于BASC的可能性。
接下来,调制有Sca1阳性细胞或者无Sca1阳性细胞的肺混合培养,在各自的条件下,探讨SP-C阳性/CD45阳性LMDEC的回收率。从混合培养使Sca1阳性细胞枯渴不影响SP-C阳性/CD45阳性LMDEC的回收率(图2C)。这提示,至少在本次使用的培养条件下,BASC说不定不分化为LMDECMaj。
<RT-PCR>
对于LMDEC,探讨SP-C、及作为I型肺胞上皮细胞的标志物的平足蛋白/T1α的mRNA的表达时间依赖性的变化。观察到SP-CmRNA表达的减少,同时观察到与其反比例而T1αmRNA表达的升高(图3A)。当供于使用抗原SP-C抗体及抗平足蛋白抗体(抗gp36抗体)的免疫荧光染色时,尽管刚回收后的LMDEC示原SP-C阳性的免疫反应的(超总细胞的90%的细胞)、但7天培养,则在gp36中成为阳性(超总细胞的80%的细胞)(图3B)。当经时观察此标志物表达变化时,基于mRNA的解析结果,确认了逆相关性(图3C)。这些结果提示,LMDEC可分化为I型肺胞上皮细胞。
<赋予混合培养的粘接细胞的特性>
如图1所示,LMDEC作为培养7天后悬浮的或者松弛地附着的细胞显著地开始增加。为了评价确认为SP-C阳性/CD44阳性/CD45阳性的LMDECMaj的起源及自身复制能,对于混合培养中的粘接细胞的细胞集团,聚焦于干细胞而进行探讨。将LMDEC在培养第7天洗流,对残留的粘接细胞进行EdU标记后,回收,荧光免疫染色和供于EdU检测反应使用,流式细胞术解析。如表1所示,Lin阴性/Sca1阳性/c-kit阳性的LSK细胞(始原造血干细胞)、及CD45阴性/CD90阳性/CD73阳性的MSC各自以1.4%及4.7%的比例含在粘接细胞中。在LSK及MSC中的EdU标记细胞的比例各自是76%及11.3%。BASC是总粘接细胞的6.6%,其44.4%是EdU阳性。
【表1】在混合培养中的粘接细胞中的干细胞/前体细胞及LMDECMaj细胞
命名 | 表征 | 含量(在总细胞中的%) | EdU阳性 |
BASC | SP-C+/CCSP+/Sca1+ | 6.6±0.7 | 44.4% |
LSK(HSC) | Lin-/Sca1+/c-kit+ | 1.4±0.1 | 76.0% |
MSC | CD45-/CD90+/CD73+ | 4.7±0.2 | 11.3% |
LMDECMaj | SP-C+/CD44+/CD45+ | 17.5±0.9 | 36.8% |
(n=4~6)
这些结果提示,从内起源或外起源发生的不同种类的干细胞含在混合培养的粘接细胞中。应关注的是,SP-C阳性/CD44阳性/CD45阳性的LMDECMaj也另外,作为总粘接细胞的17.5%,并且,其36.8%作为EdU阳性含在混合培养的粘接细胞中。
【实施例3:在肺障碍模型小鼠中的肺组织来源细胞混合培养上清液的施用】
<肺组织来源细胞混合培养上清液的调制>
根据实施例1的方法,进行肺组织来源的细胞的混合培养。回收培养上清,以1500rpm离心5分钟之后,回收该上清,用0.22μm滤器过滤。将滤液适用于带超滤滤器的离心沉降管,调制将含分子量3-50KDa的蛋白质的级分浓缩-纯化的溶液(浓缩率:25倍)。将此溶液作为肺组织来源细胞混合培养上清液而在实验中使用。
<向肺障碍模型小鼠施用肺组织来源细胞混合培养上清液>
向小鼠经气管单次施用(第0天)弹性蛋白酶(30μg/小鼠)。其后,将小鼠分为(1)~(3)的3组,对于各自的组,经第3天、第7天、第10天、第14天、第17天的5次经气管各施用(1)PBS、(2)对照培养基(10%FBS/DMEM)、或者(3)肺组织来源细胞混合培养上清液各75μl。其后,供试小鼠而取出肺,固定,作成切片之后,实施苏木精-伊红染色,测定平均肺胞壁间距离。对于各施用组,通过比较由弹性蛋白酶引发的平均肺胞壁间距离的增大的抑制效果,比较探讨对肺气肿化的效果。
<结果>
结果示于图4。
对于用弹性蛋白酶引发的平均肺胞壁间距离的增大(肺的气肿化),仅肺组织来源细胞混合培养上清液显示抑制效果。
【实施例4:使用LMDEC培养上清液的细胞的诱导】
(其1)使用小鼠LMDEC培养上清的细胞诱导
(1)根据定法从小鼠新鲜肺调整小鼠LMDEC。
(2)从小鼠进行采血,使用vacutainer,取出小鼠单核细胞。
(3)以上述小鼠单核细胞作为原料,使用MACS,单离CD45阳性细胞。
(4)向8孔室接种细胞至成4×105。
(5)从(1)中准备的小鼠LMDEC取出培养上清,使用Millipore滤器(5μm),除去细胞及细胞片等,作为LMDEC培养上清液。2次取出上清,各自作为上清1、上清2。
(6)从(4)的各室缓慢地除去培养基,添加200μl在(5)中准备的上清液。
(7)将(6)培养4天之后,进行培养基除去·PBS清洗,用***固定。对第1抗体使用SPC,gp36免疫染色后,实施荧光显微镜观察。结果示于图5。SPC用绿色(箭头)表示、gp36用红色(箭尾)表示。诱导在基因水平也观测到。
(其2)在代替小鼠单核细胞而使用人单核细胞时,也得到了同样的结果。
序列表
<110> Ube Industries, Ltd.
Chiba University
<120> 肺组织来源的细胞培养上清液
<130> P150698
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<151> 2014-12-24
<150> JP2014-259829
<151> 2014-12-24
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (10)
1.肺组织来源的细胞的培养上清液。
2.权利要求1所述的培养上清液,其中上述肺组织来源的细胞是表达选自肺表面活性剂蛋白质或其前体、CD44及CD45的1种以上的蛋白质或编码这些的mRNA的球状细胞。
3.权利要求2所述的培养上清液,其中肺表面活性剂蛋白质是肺表面活性剂蛋白质C(SP-C)。
4.权利要求2或3所述的培养上清液,其中选自CD34及CD90的1种以上的蛋白质或编码这些的mRNA的表达量是全蛋白质或全mRNA的表达量的5%以下。
5.调制肺组织来源的细胞的培养上清液的方法,其包括:
(1)将从肺组织单离的细胞悬浮于培养基中而形成细胞悬浮液的工序;
(2)培养细胞悬浮液之后,除去非粘接性细胞的工序;
(3)进一步在培养基中培养残留的细胞而形成球状细胞的工序;及
(4)回收细胞培养上清液的工序。
6.用于治疗及/或预防呼吸器疾病的医药组合物,其含:
权利要求1~4之任一项所述的培养上清液、或者
由权利要求5所述的方法调制的培养上清液。
7.权利要求6所述的医药组合物,其中呼吸器疾病是肺疾病或支气管哮喘。
8.权利要求7所述的医药组合物,其中肺疾病选自慢性闭塞性肺疾病(COPD)、肺纤维症、急性呼吸窘迫综合征、肺高血压症、肺炎、及肺结节病。
9.制造肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的方法,其包括使权利要求1~4之任一项所述的培养上清液、或者由权利要求5所述的方法调制的培养上清液与选自末梢血单核细胞、间充质干细胞、及胚胎干细胞(ES细胞)的细胞接触。
10.用于制造肺表面活性剂蛋白质阳性细胞的试剂盒,其含:
权利要求1~4之任一项所述的培养上清液、或者
由权利要求5所述的方法调制的培养上清液。
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