CN109563465A - 细胞培养装置及使用该细胞培养装置的细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞培养装置，具备：聚合物多孔质膜；细胞培养部，其收容有所述聚合物多孔质膜；培养基供给机构，其配置于所述细胞培养部的上部；及培养基回收机构，其配置于所述细胞培养部的下部，在此，所述聚合物多孔质膜是三层构造的聚合物多孔质膜，其具有表面层A及表面层B和夹在所述表面层A与所述表面层B之间的大空隙层，所述表面层A及所述表面层B具有多个孔，在此，所述表面层A中存在的孔的平均孔径小于所述表面层B中存在的孔的平均孔径，所述大空隙层具有与所述表面层A及所述表面层B结合的间隔壁和多个大空隙，所述多个大空隙由该间隔壁和所述表面层A及所述表面层B包围，所述表面层A及所述表面层B中的孔与所述大空隙连通，在此，所述细胞培养部具备底部和侧部，所述底部具有1个以上的培养基排出口。

Description

细胞培养装置及使用该细胞培养装置的细胞培养方法

技术领域

本发明涉及具备聚合物多孔质膜的细胞培养装置。另外，涉及使用具备聚合物多孔质膜的细胞培养装置的细胞培养方法。

背景技术

近年来，用于治疗、疫苗的酶、激素、抗体、细胞因子、病毒(病毒蛋白质)等蛋白质使用培养细胞来进行工业产生。但是，这样的蛋白质的生产技术的成本高，这提高了医疗费。因此，以大幅的成本削减为目的，谋求以高密度培养细胞的技术、使蛋白质的产生量增大这样的革新的技术。

作为产生蛋白质的细胞，有时使用与培养基材粘接的支架依赖性的粘接细胞。这样的细胞由于依赖支架进行增殖，因此需要粘接在培养皿、板或腔室的表面进行培养。以往，为了大量培养这样的粘接细胞，需要增大用于粘接的表面积。然而，为了增大培养面积，必然需要增大空间，这成为增大成本的主要原因。

作为减小培养空间并大量培养粘接细胞的方法，开发了使用具有微小多孔的载体、特别是微载体的培养方法(例如专利文献1)。使用了微载体的细胞培养***为了使微载体不相互凝聚而需要充分搅拌、扩散。因此，需要能够使分散有微载体的培养基尽可能充分地搅拌、扩散的容积，所以能够培养的细胞的密度存在上限。另外，为了将微载体与培养基分离，需要利用能够区分微细的粒子的过滤器来进行分离，这也成为使成本增大的原因。根据这样的状况，希望有培养高密度的细胞的革新性的细胞培养的方法。

<聚酰亚胺多孔质膜>

聚酰亚胺多孔质膜在本申请前用于过滤器、低介电常数膜、燃料电池用电解质膜等，特别是用于以电池相关为中心的用途。专利文献2～4特别记载了一种聚酰亚胺多孔质膜，其气体等物质透过性优异，空穴率高，两表面的平滑性优异，相对强度高，不受高空穴率的影响而具有大量大空隙，该大空隙对向膜厚度方向的压缩应力的耐力优异。它们均为经由酰胺酸而制成的聚酰亚胺多孔质膜。

公开了包含将细胞应用于聚酰亚胺多孔质膜来培养的内容在内的细胞的培养方法(专利文献5)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2003/054174号

专利文献2：国际公开第2010/038873号

专利文献3：日本特开2011-219585号公报

专利文献4：日本特开2011-219586号公报

专利文献5：国际公开第2015/012415号

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供具备聚合物多孔质膜的细胞培养装置。另外，本发明的目的还在于提供使用具备聚合物多孔质膜的细胞培养装置的细胞培养方法。

用于解决课题的手段

本发明的发明人们发现，具有规定的结构的聚合物多孔质膜不仅提供能够大量培养细胞的最佳的空间，还提供干燥强的湿润环境，完成了将细胞进行气相暴露培养的装置及使用该装置的培养方法。即，本发明并不限定于此，但本发明优选包含以下的方式。

[1]一种细胞培养装置，其中，具备：

聚合物多孔质膜；细胞培养部，其收容有所述聚合物多孔质膜；培养基供给机构，其配置于所述细胞培养部的上部；及培养基回收机构，其配置于所述细胞培养部的下部，

在此，所述聚合物多孔质膜是三层构造的聚合物多孔质膜，其具有表面层A及表面层B和夹在所述表面层A与所述表面层B之间的大空隙层，所述表面层A及所述表面层B具有多个孔，在此，所述表面层A中存在的孔的平均孔径小于所述表面层B中存在的孔的平均孔径，所述大空隙层具有与所述表面层A及所述表面层B结合的间隔壁和多个大空隙，所述多个大空隙由该间隔壁和所述表面层A及所述表面层B包围，所述表面层A及所述表面层B中的孔与所述大空隙连通，

在此，所述细胞培养部具备底部和侧部，所述底部具有1个以上的培养基排出口，所述侧部与所述底部大致垂直地配置。

[2]根据[1]所述的细胞培养装置，其中，层叠有2个以上的所述细胞培养部。

[3]根据[1]或[2]所述的细胞培养装置，其中，所述侧部还具有1个以上的培养基供给口。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞培养装置，其中，还具备：

培养基排出管线，其在一端部与所述培养基回收机构连通；

培养基贮存槽，其与所述培养基排出管线的另一端部连通；及

培养基供给管线，其在一端部与所述培养基贮存槽连通，

在此，所述培养基供给管线的另一端部与所述培养基供给机构连通，培养基进行循环。

[5]根据[4]所述的细胞培养装置，其中，还具备将所述培养基贮存槽内的培养基向所述培养基供给机构抽起的泵。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述培养基回收机构为漏斗状。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述培养基供给机构具有培养基贮存部和设置于所述培养基贮存部的底部的2个以上的培养基滴下喷嘴。

[8]根据[1]～[6]中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述培养基供给机构为液滴化培养基供给机构。

[9]根据[1]～[8]中任一项所述的细胞培养装置，其中，

还具备***述细胞培养部的外筒，

在此，所述培养基供给机构配置于所述外筒内且所述细胞培养部的上部，

在此，所述培养基回收机构配置于所述外筒内且所述细胞培养部的下部。

[10]根据[1]～[9]中任一项所述的细胞培养装置，其中，

所述聚合物多孔质膜以如下方式收容于所述细胞培养部：

i)被折叠，

ii)卷入成辊状，

iii)用线状的构造体连结片或小片，

iv)结成绳状，和/或

v)层叠2以上。

[11]根据[1]～[9]中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔质膜是具备壳体的模块化聚合物多孔质膜，

在此，所述模块化聚合物多孔质膜以如下方式收容于所述壳体内：

(i)2个以上的独立的所述聚合物多孔质膜被集中，

(ii)所述聚合物多孔质膜被折叠，

(iii)所述聚合物多孔质膜被卷入成辊状，和/或

(iv)所述聚合物多孔质膜结成绳状，

在此，所述模块化聚合物多孔质膜收容于所述细胞培养部。

[12]根据[1]～[11]中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔质膜具有平均孔径0.01～100μm的多个细孔。

[13]根据[1]～[12]中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述表面层A的平均孔径为0.01～50μm。

[14]根据[1]～[13]中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述表面层B的平均孔径为20～100μm。

[15]根据[1]～[14]中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔质膜的总膜厚为5～500μm。

[16]根据[1]～[15]中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔质膜为聚酰亚胺多孔质膜。

[17]根据[16]所述的细胞培养装置，其中，所述聚酰亚胺多孔质膜是包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺在内的聚酰亚胺多孔质膜。

[18]根据[16]或[17]所述的细胞培养装置，其中，所述聚酰亚胺多孔质膜是，在使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体在内的聚酰胺酸溶液组合物形成后，通过在250℃以上进行热处理而得到的已着色的聚酰亚胺多孔质膜。

[19]根据[1]～[15]中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔质膜是聚醚砜(PES)多孔质膜。

[20]一种细胞的培养方法，其中，使用[1]～[19]中任一项所述的细胞培养装置。

[21]一种细胞培养装置，其中，具备：

聚合物多孔质膜；

细胞培养部，其收容有所述聚合物多孔质膜；

培养基供给机构，其配置于所述细胞培养部的上部；及

培养基回收机构，其配置于所述细胞培养部的下部，

在此，所述聚合物多孔质膜是三层构造的聚合物多孔质膜，其具有表面层A及表面层B和夹在所述表面层A与所述表面层B之间的大空隙层，所述表面层A及所述表面层B具有多个孔，在此，所述表面层A中存在的孔的平均孔径小于所述表面层B中存在的孔的平均孔径，所述大空隙层具有与所述表面层A及所述表面层B结合的间隔壁和多个大空隙，所述多个大空隙由该间隔壁和所述表面层A及所述表面层B包围，所述表面层A及所述表面层B中的孔与所述大空隙连通，

在此，所述培养基回收机构是***述细胞培养部的外筒的一部分。

[22]根据[21]所述的细胞培养装置，其中，所述培养基供给机构为液滴化培养基供给机构。

[23]根据[21]或[22]所述的细胞培养装置，其中，

所述聚合物多孔质膜是具备壳体的模块化聚合物多孔质膜，

在此，所述模块化聚合物多孔质膜以如下方式收容于所述壳体内：

(i)2个以上的独立的所述聚合物多孔质膜被集中，

(ii)将所述聚合物多孔质膜折叠，

(iii)所述聚合物多孔质膜被卷入成辊状，和/或

(iv)所述聚合物多孔质膜结成绳状，

在此，所述模块化聚合物多孔质膜载置于所述细胞培养部。

发明的效果

本发明通过使用聚合物多孔质膜作为细胞培养载体，能够削减培养空间。另外，通过采用本发明的细胞培养装置，即使在培养基的量少的条件下，也能够简便且高效地进行细胞培养。进而，本发明中使用的聚合物多孔质膜具有微亲水性的多孔质特性，能够在聚合物多孔质膜内稳定地保持液体，因此提供耐干燥性强的湿润环境。因此，即使与以往的细胞培养装置相比是极少量的培养基，也能够实现细胞的生存和增殖。此外，即使在聚合物多孔质膜的一部分或全部暴露于空气的状态下也能够进行培养，能够对细胞高效地供给氧，适于大量的细胞的培养。

若采用本发明的细胞培养装置，则能够使使用的培养基的量极少。另外，本发明的细胞培养装置中使用的聚合物多孔质膜能够一边在气相中露出一边进行培养，因此向担载于聚合物多孔质膜的细胞的氧供给通过扩散而充分地进行。因此，本发明的细胞培养装置不需要另外的氧供给机构。另外，本发明的细胞培养装置具有用于从任意方向将液滴化的培养基向聚合物多孔质膜供给的供给机构，因此能够向聚合物多孔质膜、细胞培养模块的任意部位中存在的细胞供给均质的培养基。

附图说明

图1是表示实施方式中的细胞培养部的图。上图表示俯视图，下图表示侧视图。

图2是表示实施方式中的细胞培养装置的结构例的剖视图。

图3是表示实施方式中的培养基供给机构的图。图3(A)是俯视图、图3(B)是剖视图、图3(C)是立体图。

图4是表示实施方式中的细胞培养装置的结构例的立体图。

图5是表示实施方式中的细胞培养装置的结构例的剖视图。

图6表示使用了聚合物多孔质膜的细胞培养的模型图。

图7是表示一实施方式中的细胞培养装置的结构例的图。

图8是表示一实施方式的细胞培养装置中的、从液滴化培养基供给机构滴下的培养基的样式的概念图。图8(A)表示点滴型，图8(B)表示网型，图8(C)表示喷淋型。图8(D)是表示为了供给点滴型及网型的液滴而使用的外筒盖体的结构的图。在外筒盖体的培养基供给口***有卷绕不锈钢制的网而形成的网束。

图9是表示一实施方式中的细胞培养装置的结构例的图。图9(A)是细胞培养装置的概要图，图9(B)是表示实际的细胞培养装置的外观的照片。

图10是表示使用于一实施方式的细胞培养装置的模块化聚合物多孔质膜的图。

图11是表示实施例6所示的使用一实施方式的本发明的细胞培养装置时的、从人皮肤成纤维细胞产生的纤连蛋白的量的图表。

具体实施方式

以下，根据需要参照附图对本发明的实施方式进行说明。实施方式的结构为示例，本发明的结构并不限定于实施方式的具体结构。

1.聚合物多孔质膜

本发明中使用的聚合物多孔质膜中的表面层A(以下也称为“A面”或“网面”)中存在的孔的平均孔径没有特别限定，例如为0.01μm以上且小于200μm、0.01～150μm、0.01～100μm、0.01～50μm、0.01μm～40μm、0.01μm～30μm、0.01μm～20μm或0.01μm～15μm，优选为0.01μm～15μm。

本发明中使用的聚合物多孔质膜中的表面层B(以下也称为“B面”或“大孔面”)中存在的孔的平均孔径，只要比表面层A中存在的孔的平均孔径大，则没有特别限定，例如，超过5μm且200μm以下、20μm～100μm、30μm～100μm、40μm～100μm、50μm～100μm、或者60μm～100μm，优选为20μm～100μm。

聚合物多孔质膜表面的平均孔径能够根据如下方法而求出：通过多孔质膜表面的扫描型电子显微镜照片，对200个以上的开孔部测定孔面积，由该孔面积的平均值并根据下式(1)来计算孔的形状为正圆时的平均直径。

(式1)

(式中，Sa是指孔面积的平均值。)

表面层A及B的厚度没有特别限定，例如为0.01～50μm，优选为0.01～20μm。

聚合物多孔质膜中的大空隙层中的大空隙的膜平面方向的平均孔径没有特别限定，例如为10～500μm，优选为10～100μm，更优选为10～80μm。另外，该大空隙层中的间隔壁的厚度没有特别限定，例如为0.01～50μm，优选为0.01～20μm。在一实施方式中，该大空隙层中的至少1个间隔壁具有将邻接的大空隙彼此连通的平均孔径0.01～100μm的、优选0.01～50μm的1个或多个孔。在另一实施方式中，该大空隙层中的间隔壁不具有孔。

本发明中使用的聚合物多孔质膜表面的总膜厚没有特别限定，可以为5μm以上、10μm以上、20μm以上或25μm以上，也可以为500μm以下、300μm以下、100μm以下、75μm以下或50μm以下。优选为5～500μm，更优选为25～75μm。

本发明中使用的聚合物多孔质膜的膜厚的测定可以用接触式的厚度计进行。

本发明中使用的聚合物多孔质膜的空穴率没有特别限定，例如为40％以上且小于95％。

本发明中使用的聚合物多孔质膜的空穴率能够根据如下方法求出：测定切成了规定大小的多孔质膜的膜厚和质量，从单位面积质量并根据下式(2)求出。

(式2)

空穴率(％)＝(1-w/(S×d×D))×100 (2)

(式中，S是指多孔质膜的面积，d是指总膜厚，w是指测定的质量，D是指聚合物的密度。在聚合物为聚酰亚胺的情况下，密度为1.34g/cm³。)

本发明中使用的聚合物多孔质膜优选为三层构造的聚合物多孔质膜，其具有表面层A及表面层B和夹在所述表面层A与表面层B之间的大空隙层，所述表面层A及表面层B具有多个孔，在此，所述表面层A中存在的孔的平均孔径为0.01μm～15μm，所述表面层B中存在的孔的平均孔径为20μm～100μm，所述大空隙层具有与所述表面层A及B结合的间隔壁和多个大空隙，该多个大空隙由该间隔壁和所述表面层A及B包围，所述大空隙层的间隔壁和所述表面层A及B的厚度为0.01～20μm，所述表面层A及B中的孔与大空隙连通，所述聚合物多孔质膜是总膜厚为5～500μm并且空穴率为40％以上且小于95％的聚合物多孔质膜。在一实施方式中，大空隙层中的至少1个间隔壁具有将邻接的大空隙彼此连通的平均孔径0.01～100μm、优选0.01～50μm的1个或多个孔。在另一实施方式中，间隔壁不具有这样的孔。

本发明中使用的聚合物多孔质膜优选被灭菌。作为灭菌处理，没有特别限定，可以列举出利用干热灭菌、蒸汽灭菌、基于乙醇等消毒剂的灭菌、紫外线或γ射线等电磁波灭菌等任意灭菌处理等。

本发明中使用的聚合物多孔质膜只要具备所述的结构特征则没有特别限定，优选为聚酰亚胺多孔质膜或聚醚砜(PES)多孔质膜。

1-1.聚酰亚胺多孔质膜

聚酰亚胺是重复单元中包含酰亚胺键的高分子的总称，通常是指芳香族化合物直接以酰亚胺键连结的芳香族聚酰亚胺。芳香族聚酰亚胺由于芳香族和芳香族经由酰亚胺键而具有共轭结构，因此具有刚性且牢固的分子结构，并且由于酰亚胺键具有强的分子间力，因此具有非常高的水平的热、机械、化学的性质。

本发明中可以使用的聚酰亚胺多孔质膜优选为：(作为主要成分)而包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔质膜，更优选为由从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺构成的聚酰亚胺多孔质膜。所谓“作为主要成分而包含”是指，作为聚酰亚胺多孔质膜的构成成分，本质上不包含或者也可以包含除从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺以外的成分，但该成分是不影响从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质的附加的成分。

在一实施方式中，本发明中可以使用的聚酰亚胺多孔质膜也包含：在使聚酰胺酸溶液组合物形成后，通过在250℃以上进行热处理而得到的着色了的聚酰亚胺多孔质膜，所述聚酰胺酸溶液组合物包含从四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液和着色前体。

聚酰胺酸是将四羧酸成分与二胺成分聚合而得到的。聚酰胺酸是通过进行热酰亚胺化或化学酰亚胺化而能够闭环形成聚酰亚胺的聚酰亚胺前体。

在聚酰胺酸中，即使酰胺酸的一部分酰亚胺化，只要在不影响本发明的范围内，则可以使用该聚酰胺酸。即，聚酰胺酸可以部分地进行热酰亚胺化或化学酰亚胺化。

在将聚酰胺酸进行热酰亚胺化的情况下，根据需要，能够在聚酰胺酸溶液中添加酰亚胺化催化剂、包含机磷化合物、无机微粒、有机微粒等微粒等。另外，在将聚酰胺酸进行化学酰亚胺化的情况下，根据需要，能够在聚酰胺酸溶液中添加化学酰亚胺化剂、脱水剂、无机微粒、有机微粒等微粒等。优选即使在聚酰胺酸溶液中调配所述成分，也在着色前体不析出的条件下进行。

在本说明书中，“着色前体”是指，通过250℃以上的热处理使一部分或全部碳化而生成着色化物的前体。

作为在所述聚酰亚胺多孔质膜的制造中可以使用的着色前体，优选如下着色前体：其可以均匀地溶解或分散在聚酰胺酸溶液或聚酰亚胺溶液中，并通过热处理而进行热分解、碳化而生成着色化物，进一步优选为生成黑色系的着色化物的着色前体，更优选为碳系着色前体，所述热处理是250℃以上、优选为260℃以上、进一步优选为280℃以上、更优选为300℃以上的热处理，优选为在空气等氧存在下的250℃以上、优选为260℃以上、进一步优选为280℃以上、更优选为300℃以上的热处理。

着色前体在加热时乍看上去是碳化物，但在组织上包含除碳以外的异种元素，包含层结构、芳香族交联结构、包含四面体碳在内的无秩序结构的元素。

碳系着色前体没有特别限制，可以列举例如：石油焦油、石油沥青、煤焦油、煤沥青等焦油或沥青、焦炭、从包含丙烯腈在内的单体得到的聚合物、二茂铁化合物(二茂铁和二茂铁衍生物)等。其中，优选从包含丙烯腈在内的单体得到的聚合物和/或二茂铁化合物，作为从包含丙烯腈在内的单体得到的聚合物，优选聚丙烯腈。

另外，在另一实施方式中，本发明中可以使用的聚酰亚胺多孔质膜也包含如下聚酰亚胺多孔质膜：在不使用所述着色前体的情况下，使从四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液形成后，通过进行热处理而得到。

不使用着色前体而制造的聚酰亚胺多孔质膜例如也可以通过如下方法制造：将由极限粘度数为1.0～3.0的聚酰胺酸3～60质量％和有机极性溶剂40～97质量％构成的聚酰胺酸溶液流动延展成膜状，并在以水为必需成分的凝固溶剂中浸渍或接触而制作聚酰胺酸的多孔质膜，然后将该聚酰胺酸的多孔质膜进行热处理而酰亚胺化。在该方法中，以水作为必需成分的凝固溶剂可以是水、或5质量％以上且小于100质量％的水与超过0质量％且95质量％以下的有机极性溶剂的混合液。另外，在进行了所述酰亚胺化之后，也可以对得到的多孔质聚酰亚胺膜的至少单面实施等离子体处理。

所述聚酰亚胺多孔质膜的制造中可以使用的四羧酸二酐能够使用任意的四羧酸二酐，能够根据所期望的特性等来适当选择。作为四羧酸二酐的具体例，能够列举均苯四甲酸二酐、3,3’,4,4’-联苯基四羧酸二酐(s-BPDA)、2,3,3’,4’-联苯基四羧酸二酐(a-BPDA)等联苯基四羧酸二酐、氧二邻苯二甲酸酐、二苯基砜-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、双(3,4-二羧苯基)硫化物酐、2,2-双(3,4-二羧苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷酐、2,3,3’,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、3,3’,4,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、双(3,4-二羧苯基)甲烷酐、2,2-双(3,4-二羧苯基)丙烷酐、p-亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、p-双亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、m-三联苯基-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、p-三联苯基-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、1,3-双(3,4-二羧基苯氧基)苯酐、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)苯酐、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)联苯基酐、2,2-双[(3,4-二羧基苯氧基)苯基]丙烷酐、2,3,6,7-萘四羧酸二酐、1,4,5,8-萘四羧酸二酐、4,4’-(2,2-六氟异亚丙基)二酞酸二酐等。另外，也优选使用2,3,3’,4’-二苯基砜四羧酸等的芳香族四羧酸。它们可以单独使用，也可以组合使用2种以上。

其中，特别优选从由联苯基四羧酸二酐及均苯四甲酸二酐构成的组中选择的至少一种芳香族四羧酸二酐。作为联苯基四羧酸二酐，能够优选使用3,3’,4,4’-联苯基四羧酸二酐。

所述聚酰亚胺多孔质膜的制造中可以使用的二胺可以使用任意的二胺。作为二胺的具体例，可列举以下的二胺。

1)1,4-二氨基苯(对苯二胺)、1,3-二氨基苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯等1个苯核的苯二胺；

2)4,4’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚等二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基联苯、2,2’-二甲基-4,4’-二氨基联苯、2,2’-双(三氟甲基)-4,4’-二氨基联苯、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二羧基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’,5,5’-四甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、双(4-氨基苯基)硫醚、4,4’-二氨基苯并苯胺、3,3’-二氯联苯胺、3,3’-二甲基联苯胺、2,2’-二甲基联苯胺、3,3’-二甲氧基联苯胺、2,2’-二甲氧基联苯胺、3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚、3,3’-二氨基二苯基硫醚、3,4’-二氨基二苯基硫醚、4,4’-二氨基二苯基硫醚、3,3’-二氨基二苯基砜、3,4’-二氨基二苯基砜、4,4’-二氨基二苯基砜、3,3’-二氨基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二氯二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二甲氧基二苯甲酮、3’,3’-二氨基二苯基甲烷、3,4’-二氨基二苯基甲烷、4,4’-二氨基二苯基甲烷、2,2-双(3-氨基苯基)丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)丙烷、2,2-双(3-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、3,3’-二氨基二苯基亚砜、3,4’-二氨基二苯基亚砜、4,4’-二氨基二苯基亚砜等2个苯核的二胺；

3)1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯、1,4-双(4-氨基苯氧基)苯、1,3-双(3-氨基苯氧基)-4-三氟甲基苯、3,3’-二氨基-4-(4-苯基)苯氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二(4-苯基苯氧基)二苯甲酮、1,3-双(3-氨基苯基硫醚)苯、1,3-双(4-氨基苯基硫醚)苯，1,4-双(4-氨基苯基硫醚)苯、1,3-双(3-氨基苯基砜)苯、1,3-双(4-氨基苯基砜)苯、1,4-双(4-氨基苯基砜)苯、1,3-双[2-(4-氨基苯基)异丙基]苯、1,4-双[2-(3-氨基苯基)异丙基]苯、1,4-双[2-(4-氨基苯基)异丙基]苯等3个苯核的二胺；

4)3,3’-双(3-氨基苯氧基)联苯、3,3’-双(4-氨基苯氧基)联苯、4,4’-双(3-氨基苯氧基)联苯、4,4’-双(4-氨基苯氧基)联苯、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]醚、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]醚、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]醚、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]醚、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]酮、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]酮、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]酮、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]酮、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]硫醚、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]硫醚、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]硫醚、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]硫醚、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]砜、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]砜、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]砜、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]砜、双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]甲烷、2,2-双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2,2-双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2,2-双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2,2-双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2,2-双[3-(3-氨基苯氧基)苯基]-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷，2,2-双[3-(4-氨基苯氧基)苯基]-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷，2,2-双[4-(3-氨基苯氧基)苯基]-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷等4个苯核的二胺。

它们可以单独使用，也可以混合2种以上使用。所使用的二胺能够根据所期望的特性等来适当选择。

其中，优选芳香族二胺化合物，能够优选使用3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚及对苯二胺、1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯。特别优选从由苯二胺、二氨基二苯基醚和双(氨基苯氧基)苯基构成的组中选择的至少一种二胺。

从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点出发，本发明中可以使用的聚酰亚胺多孔质膜优选由玻璃化转变温度为240℃以上、或在300℃以上无明确的转变点的四羧酸二酐和二胺组合而得到的聚酰亚胺形成。

从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点出发，本发明中可以使用的聚酰亚胺多孔质膜优选为由以下的芳香族聚酰亚胺构成的聚酰亚胺多孔质膜。

(i)由至少一种四羧酸单位和芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺，所述至少一种四羧酸单位从由联苯四羧酸单位和均苯四甲酸单位构成的组中选择，

(ii)由四羧酸单位和至少一种芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺，所述至少一种芳香族二胺单位从由苯二甲胺单位、二氨基二苯基醚单位及双(氨基苯氧基)苯基单位构成的组中选择，

和/或，

(iii)由至少一种四羧酸单位、以及至少一种芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺，所述至少一种四羧酸单位从由联苯四羧酸单位及均苯四甲酸单位构成的组中选择，所述至少一种芳香族二胺单位从由苯二胺单位、二氨基二苯基醚单位及双(氨基苯氧基)苯基单位构成的组中选择。

本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜优选为三层构造的聚酰亚胺多孔质膜，其具有表面层A及表面层B和夹在所述表面层A与表面层B之间的大空隙层，所述表面层A及表面层B具有多个孔，在此，所述表面层B中存在的孔的平均孔径为20μm～100μm，所述大空隙层具有与所述表面层A及B结合的间隔壁和多个大空隙，该多个大空隙由该间隔壁和所述表面层A及B包围，所述大空隙层的间隔壁和所述表面层A及B的厚度为0.01～20μm，所述表面层A及B中的孔与大空隙连通，所述聚合物多孔质膜是总膜厚为5～500μm并且空穴率为40％以上且小于95％的聚合物多孔质膜。在此，大空隙层中的至少1个间隔壁具有将邻接的大空隙彼此连通的平均孔径0.01～100μm、优选0.01～50μm的1个或多个孔。

例如，也可以在本发明中使用国际公开第2010/038873号、日本特开2011-219585号公报、或日本特开2011-219586号公报中记载的聚酰亚胺多孔质膜。

1-2.聚醚砜(PES)多孔质膜

本发明中可以使用的PES多孔质膜包含聚醚砜，典型地实质上由聚醚砜构成。聚醚砜可以是利用本领域技术人员公知的方法合成的聚醚砜，例如可以通过使二元酚、碱金属化合物及二卤代联苯化合物在有机极性溶剂中进行缩聚反应的方法、使二元酚的碱金属二盐预先合成并在二卤代联苯化合物与有机极性溶剂中进行缩聚反应的方法等来制造。

作为碱金属化合物，可举出碱金属碳酸盐、碱金属氢氧化物、碱金属氢化物、碱金属醇盐等。特别优选碳酸钠和碳酸钾。

作为二元酚化合物，可以列举对苯二酚、邻苯二酚、间苯二酚、4,4’-联苯酚、双(羟基苯基)烷烃类(例如2,2-双(羟基苯基)丙烷、及2,2-双(羟基苯基)甲烷)、二羟基二苯基砜类、二羟基二苯基醚类、或它们的苯环的氢中的至少1个被甲基、乙基、丙基等低级烷基、或甲氧基、乙氧基等低级烷氧基置换的化合物。作为二元酚化合物，可以将两种以上的所述化合物混合使用。

聚醚砜可以是市售品。作为市售品的例子，可以列举SUMIKAEXCEL7600P、SUMIKAEXCEL 5900P(以上为住友化学(株)制)等。

从良好地形成多孔质聚醚砜膜的大空隙的观点出发，聚醚砜的对数粘度优选为0.5以上，更优选为0.55以上，从多孔质聚醚砜膜的易制造性的观点出发，聚醚砜的对数粘度优选为1.0以下，进一步优选为0.9以下，更优选为0.8以下，特别优选为0.75以下。

另外，从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点出发，PES多孔质膜或作为其原料的聚醚砜优选玻璃化转变温度为200℃以上、或未观察到明确的玻璃化转变温度。

本发明中可以使用的PES多孔质膜的制造方法没有特别限定，例如，可以由如下方法制造，该方法包含：

将包含对数粘度0.5～1.0的聚醚砜的0.3质量％～60质量％和有机极性溶剂40质量％～99.7质量％在内的聚醚砜溶液流动延展成膜状，并在以聚醚砜的不良溶剂或非溶剂作为必需成分的凝固溶剂中浸渍或接触，从而制作具有空穴的凝固膜的工序；及

将具有在所述工序中得到的空穴的凝固膜进行热处理而使所述空穴粗大化，从而得到PES多孔质膜的工序，

所述热处理包含使具有所述空穴的凝固膜升温至所述聚醚砜的玻璃化转变温度以上或240℃以上。

本发明中可以使用的PES多孔质膜优选为具有表面层A、表面层B、及夹在所述表面层A与所述表面层B之间的大空隙层的PES多孔质膜，

所述大空隙层具有与所述表面层A及B结合的间隔壁和多个大空隙，所述多个大空隙由该间隔壁和所述表面层A及B包围，且膜平面方向上的平均孔径为10μm～500μm，

所述大空隙层的间隔壁的厚度为0.1μm～50μm，

所述表面层A及B的厚度分别为0.1μm～50μm，

所述表面层A及B中，一方具有平均孔径超过5μm且200μm以下的多个细孔，且另一方具有平均孔径0.01μm以上且小于200μm的多个细孔，

表面层A和表面层B的一个表面开口率为15％以上，另一个表面层的表面开口率为10％以上，

所述表面层A及所述表面层B的所述细孔与所述大空隙连通，

所述PES多孔质膜的总膜厚为5μm～500μm，且空穴率为50～95％。

本发明的细胞培养装置中使用的作为细胞培养载体的所述聚合物多孔质膜具有微亲水性的多孔质特性，因此在聚合物多孔质膜内进行稳定的液体保持，即使干燥也保持强的湿润环境。因此，与使用以往的细胞培养载体的细胞培养装置相比，即使在极少量的培养基也能够实现细胞的生存和增殖。另外，即使在聚合物多孔质膜的一部分或全部暴露于空气的状态下也能够进行培养，因此能够对细胞进行高效的氧供给，能够培养大量的细胞。

根据本发明，由于所使用的培养基的量极少，另外，能够使作为培养载体的聚合物多孔质膜在气相中露出，因此向细胞的氧供给通过扩散而充分地进行。因此，在本发明中，不另外需要氧供给装置。

2.细胞培养装置

本发明的一个方式，细胞培养装置具备：

聚合物多孔质膜；细胞培养部，其收容有所述聚合物多孔质膜；培养基供给机构，其配置于所述细胞培养部的上部；及培养基回收机构，其配置于所述细胞培养部的下部，

在此，所述聚合物多孔质膜是三层构造的聚合物多孔质膜，其具有表面层A及表面层B和夹在所述表面层A与表面层B之间的大空隙层，所述表面层A及表面层B具有多个孔，在此，所述表面层A中存在的孔的平均孔径比所述表面层B中存在的孔的平均孔径小，所述大空隙层具有与所述表面层A及B结合的间隔壁和多个大空隙，所述多个大空隙由该间隔壁和所述表面层A及B包围，

在此，涉及细胞培养装置，所述细胞培养装置的所述细胞培养部具有底部和侧部，所述底部具有1个以上的培养基排出口，所述侧部与所述底部大致垂直地配置。以下，将该细胞培养装置也称为“本发明的细胞培养装置”。以下，参照附图对本发明的细胞培养装置的实施方式进行说明。

图1是表示构成本发明的细胞培养装置的细胞培养部2的图。细胞培养部2具有用于载置所述聚合物多孔质膜的底部22和与底部22大致垂直地配置的侧部21。在底部22具备1个以上的培养基排出口23，培养基排出口23用于排出从后述的培养基供给机构3滴下的培养基。培养基排出口23的形状、数量只要具有如下功能就没有特别限定，即聚合物多孔质膜不脱落、且将培养基向下层的细胞培养部2或培养基回收机构4(后述)排出的功能。在本实施例中，将培养基排出口23设置成狭缝状。为了从细胞培养部2的侧面方向供给培养基，侧部21还可以具备1个以上的培养基供给口26。培养基供给口26的位置、大小也可以根据目的来适当变更设计。在本实施方式中，细胞培养部2的外观为圆筒形，但并不限定于此，例如也可以是三棱柱状、棱柱形等任意的形态。但是，如后所述，细胞培养部2有时层叠地使用，因此细胞培养部2的上表面与下表面(底部22)的形状优选为相同且平行。

在本说明书中，“培养基”是指用于培养细胞、特别是动物细胞的细胞培养培养基。培养基作为与细胞培养液同义的意思使用。因此，本发明中使用的培养基是指液体培养基。培养基的种类可以使用通常使用的培养基，根据培养的细胞的种类来适当决定。

图2是表示本发明的细胞培养装置的结构例的图。细胞培养部2层叠有5层，在最上层的细胞培养部2上载置有盖部27。在盖部27，与设置于底部22的培养基排出口23同样地，呈狭缝状地设置有多个培养基排出口271(参照图4)。培养基排出口271的形状、数量只要具有将培养基向下层的细胞培养部2排出的功能就没有特别限定。

在各层的细胞培养部2中收容有所述的聚合物多孔质膜。层叠的细胞培养部2的最下层载置于在外筒5的内部设置的止动件51。在本实施方式中，外筒5由收容层叠的细胞培养部2的圆筒形部分和漏斗形状的培养基回收机构4形成，培养基回收机构4用于回收在细胞培养部2的各层滴下的培养基。在本实施方式中，在外筒5的一部分包含培养基回收机构4。培养基回收机构4只要是能够回收从上部滴下的培养基的形状就没有限定，但从高效地集中培养基的观点出发，优选为漏斗状。外筒5的形状可以根据所述细胞培养部2的形状来适当变更。在最上层的细胞培养部2的上部配置有培养基供给机构3。通过以设置于细胞培养部2的固定件***口24与设置于培养基供给机构3的固定件***口34的位置垂直的方式配合，并从固定件***口34侧***固定件61，从而将培养基供给机构3及细胞培养部2配置于适当的位置。

图3是表示培养基供给机构3的图。图3所示的培养基供给机构3具备由侧部31和底部32形成的细胞的培养基贮存部30。底部32具有多个培养基滴下孔35，培养基滴下孔35朝向中心呈锥状。另外，在底部32，在培养基贮存部30的相反侧(外侧)形成与培养基滴下孔35连通的培养基滴下喷嘴33。在培养基滴下嘴33的中心，具有与该培养基滴下孔35连通的喷嘴孔330。贮存于培养基贮存部30的培养基通过培养基滴下孔35，并通过培养基滴下喷嘴33的喷嘴孔330而滴下规定量。通过适当调整培养基滴下孔35的直径及锥形形状的角度、培养基滴下喷嘴33的前端的形状、喷嘴孔330的直径等，能够调节从喷嘴孔330滴下的培养基的量、滴下速度。在底部32，培养基滴下孔35从圆的中心呈同心圆状地等间隔地配置。由此，培养基从培养基滴下喷嘴33同等地滴下。

在培养基供给机构3的侧部31的任意位置设置有溢流管36。通过溢流管36而从培养基贮存部30溢出培养基，防止培养基沿着侧部31流出。根据溢流管36的位置，决定收容于培养基贮存部30的培养基的量。腿部37设置在底部32的与培养基滴下喷嘴33相同的一侧，腿部37的长度比培养基滴下喷嘴33长。通过调节腿部37的长度，能够决定向细胞培养部2供给的培养基的位置。设置有至少3个相同长度的腿部37，由此，能够在细胞培养部2的上部设置培养基供给机构3。也可以不设置腿部37，例如，在未设置腿部37的情况下，也可以例如在外筒5的上部嵌合设置。

图4是表示本发明的细胞培养装置1的结构例的立体图，图2的结构例表示使细胞培养部2及培养基供给机构3分别在垂直方向上独立的状态。在本实施方式中，相对于与细胞培养部2a的底部22a平行地设置的狭缝状的培养基排出口23a，与下一层的细胞培养部2b的底部22b平行地设置的狭缝状的培养基排出口23b设置于逆时针旋转30度的位置。培养基排出口23c～23e也同样在上层和下层各旋转30度的位置设置有培养基排出口23。由此，培养基从多个层叠的细胞培养部的上层高效地滴到下层。

图5是表示本发明的细胞培养装置1的另一结构例的图。作为外筒5的一部分的培养基回收机构4为漏斗状，滴下的培养基被集中到培养基排出部41。培养基排出部41与培养基排出管线72的一端部连通，培养基排出管线72的另一端部与培养基贮存槽7连通。培养基贮存槽7还与培养基供给管线73的一端部连通，培养基供给管线73的另一端部与培养基供给机构3连通。由此，培养基贮存槽7贮存从细胞培养装置1排出的培养基，将贮存的培养基再次供给到细胞培养装置1内，使培养基循环。通过使培养基循环，由被聚合物多孔质膜担载的细胞产生的蛋白质的浓度变高，能够提高蛋白质回收效率。通过定期更换排出到培养基贮存槽7内的培养基71，也能够供给新鲜的培养基。在此，虽然未图示，但也可以另外设置供给新鲜的培养基的培养基贮存槽。在该情况下，培养基贮存槽7仅贮存使用完的培养基，从培养基贮存槽经由培养基供给管线73向细胞供给机构3供给新鲜的培养基。在培养基供给管线73的中途具备用于抽起培养基的泵8。泵8的种类没有特别限定，例如可以使用蠕动泵等。

在本发明的另一实施方式中，培养基供给机构3也可以是将培养基作为液滴化培养基供给的液滴化培养基供给机构(例如图7的液滴化培养基供给机构3’)。在本说明书中，“液滴化培养基”是指雾化或水滴化的培养基，是指能够向本发明中使用的聚合物多孔质膜喷射或喷雾的状态的培养基(例如图8(C))。液滴化培养基的直径没有限定，例如，也可以是不因重力自由下落而能够悬浮在空气中的程度的小的雾状的液滴化培养基。雾状的液滴化培养基的直径例如可以是1μm～100μm左右，也可以是更小的直径。另外，液滴化培养基例如也可以是因重力自由下落的水滴状的培养基，例如也可以是100μm以上。关于将培养基液滴化的方法，使用利用公知的方法进行液滴化的方法即可，例如，使用雾状喷嘴、喷淋喷嘴等进行液滴化即可。但是，液滴化方法必须通过不使培养基的成分变化的方法进行液滴化，例如，从液滴化的方法中除去蒸发的方法。

在本发明的实施方式中，液滴化培养基被供给到担载有细胞的聚合物多孔质膜。已液滴化的培养基在到达聚合物多孔质膜之前的期间通过气相，氧溶入培养基中。由此，持续供给具有足够量的氧的培养基，细胞不会陷入缺血而能够进行培养。另外，聚合物多孔质膜始终暴露在气相中，因此附着于聚合物多孔质膜的培养基也能够始终取入氧，能够高效地供给氧。

液滴化培养基供给机构可以配置于细胞培养部2的上部，也可以配置于细胞培养部2的侧面侧，也可以配置于细胞培养部2的下部，还可以设置多个。在本发明的实施方式中，液滴化培养基供给机构也可以设置在密闭的外筒5内。由此，在外筒5的内部充满雾状的培养基，向担载有细胞的聚合物多孔质膜均匀地供给培养基。

本发明的其他实施方式涉及细胞培养装置，具备：

聚合物多孔质膜；

细胞培养部，其收容有所述聚合物多孔质膜；

培养基供给机构，其配置于所述细胞培养部的上部；及

培养基回收机构，其配置于所述细胞培养部的下部，

在此，聚合物多孔质膜是三层构造的聚合物多孔质膜，其具有表面层A及表面层B和夹在所述表面层A和表面层B之间的大空隙层，表面层A及表面层B具有多个孔，在此，所述表面层A中存在的孔的平均孔径小于所述表面层B中存在的孔的平均孔径，所述大空隙层具有与所述表面层A及B结合的间隔壁和多个大空隙，该多个大空隙由该间隔壁和所述表面层A及B包围，所述表面层A及B中的孔与所述大空隙连通，

在此，所述培养基回收机构是***述细胞培养部的外筒的一部分。

如图7(A)所示，在一实施方式的细胞培养装置1’中，培养基回收机构4’是外筒5’的一部分，滴下的培养基被集中到培养基排出部41’。另外，在外筒5’的内部设置有细胞培养部2’，细胞培养部2’用于载置聚合物多孔质膜9并收容于外筒5’的内部。细胞培养部2’具备1个以上的培养基排出口，该培养基排出口用于排出从液滴化培养基供给机构3’滴下的培养基。培养基排出口的形状、数量只要具有聚合物多孔质膜不脱落而培养基向培养基回收机构4’排出的功能就没有特别限定，例如，设置有狭缝状、网状、小孔的培养基排出口。

如图7(B)所示，在其他实施方式的细胞培养装置1’a中，培养基回收机构4’也可以是兼具细胞培养部2’的功能的细胞培养部兼培养基回收机构4’a。在这种情况下，聚合物多孔质膜9能够直接载置于细胞培养部兼培养基回收机构4’a之上。优选在细胞培养部兼培养基回收机构4’a之上载置后述的模块化聚合物多孔质膜90。通过使用模块化聚合物多孔质膜，能够在细胞培养部兼培养基回收机构4’a上容易地收容任意数量的模块化聚合物多孔质膜。

例如，如图8(A)所示，从液滴化培养基供给机构3’供给点滴型的液滴331，如图8(C)所示，从液滴化培养基供给机构3’供给喷淋型的液滴331。液滴331的形状能够通过适当选择公知的喷嘴作为液滴化培养基供给机构3’来变更。另外，如图8(B)所示，通过将从液滴化培养基供给机构3’a放出的液滴331进一步应用于液滴网30’，能够将液滴均匀地供给到聚合物多孔质膜整体。液滴网30’例如能够使用聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、不锈钢制的网，但不限于此。在其他实施方式中，液滴网30’例如可以如图9(A)所示，设置于液滴化培养基供给机构3’的下部。另外，在其他实施方式中，如图9(B)所示，也可以通过在聚合物多孔质膜和/或模块化聚合物多孔质膜之间也使用液滴网30’来进行多层化。液滴网30’的网构造只要具有如下程度的网眼即可，即，在应用了液滴的培养基的情况下，培养基通过培养基的表面张力而向液滴网30’整体扩散，能够向液滴网30’的下表面侧供给培养基。作为液滴化培养基供给机构3’的一实施方式，例如也可以使用卷绕不锈钢制的网而形成的网束31’。如图8(D)所示，网束31’***设置在外筒盖部52的内表面侧的盖部培养基供给口52a。由此，培养基不会沿着外筒的内壁，能够直接向聚合物多孔质膜滴下培养基。另外，还能够防止来自外筒与外筒盖部的嵌合部分的污染。在本实施方式中，使用不锈钢制的网束31’,但只要是发挥培养基不沿着外筒的内壁而直接向聚合物多孔质膜滴下的功能的结构，就并不限定于此。另外，网束31’例如能够使用聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、不锈钢制的网，但并不限定于此。

本发明的实施方式中使用的聚合物多孔质膜例如也可以(i)折叠，(ii)卷绕成卷筒状、(iii)用线状的结构体连结片材或小片、和/或(iv)结成绳状而应用在细胞培养部2的底部22上。另外，本发明的实施方式中使用的聚合物多孔质膜也可以(v)层叠2个以上而应用在细胞培养部2的底部22上。通过如(i)～(v)那样加工形状，从而能够在一定容量的细胞培养培养基中加入大量的聚合物多孔质膜。

本发明的实施方式中使用的聚合物多孔质膜也可以使用模块化的聚合物多孔质膜(以下称为“模块化聚合物多孔质膜”)。在本说明书中，“模块化聚合物多孔质膜”是指收容于壳体的聚合物多孔质膜。在本说明书中，“模块化聚合物多孔质膜”的记载能够仅记载为“模块”，即使相互变更也是指相同的意思。

本发明的实施方式中使用的模块化聚合物多孔质膜所具备的壳体具有2个以上的细胞培养基流入流出口，培养基通过该细胞培养基流入流出口向壳体的内外流入流出。优选该壳体的细胞培养基流入流出口的直径比所述细胞的直径大，以便细胞能够流入壳体的内部。另外，优选细胞培养基流入流出口的直径比从该细胞培养基流入流出口流出聚合物多孔质膜的直径小。比流出聚合物多孔质膜的直径小的直径能够根据收容于壳体的聚合物多孔质膜的形状、大小来适当选择。例如，在聚合物多孔质膜为绳状的情况下，只要是比该聚合物多孔质膜的短边的宽度小、且该聚合物多孔质膜不流出的适度的直径就没有特别限定。该细胞培养基流入流出口的数量优选尽量多地设置，以便细胞培养基容易向壳体内外供给和/或排出。优选为5个以上，优选为10个以上，优选为20个以上，优选为50个以上，优选为100个以上。细胞培养基流入流出口的壳体的一部分或全部可以具有网状的结构。另外，该壳体本身也可以是网状。在本发明中，所谓网状的构造，例如具有纵、横、及/或斜的格子状的构造，各网眼以流体能够通过的程度形成细胞培养基流入流出口，但并不限定于此。例如，具有图10那样的构造。

在本发明的实施方式中使用的模块化聚合物多孔质膜的壳体，例如可以列举聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、不锈钢等金属等，但只要是不影响细胞的培养的原材料就没有特别限定。

在本发明的实施方式中使用的模块化聚合物多孔质膜，

(i)2个以上的独立的所述聚合物多孔质膜被集中，

(ii)所述聚合物多孔质膜被折叠，

(iii)所述聚合物多孔质膜被卷入成辊状，和/或

(iv)所述聚合物多孔质膜结成绳状，

该模块化聚合物多孔质膜收容于该壳体内，能够将该模块化聚合物多孔质膜应用于细胞培养部2。

在本说明书中，“在壳体内集中收容2个以上的独立的该聚合物多孔质膜”是指，相互独立的2个以上的聚合物多孔质膜被集中收容于由壳体包围的一定空间内的状态。在本发明中，2个以上的独立的该聚合物多孔质膜也可以通过任意的方法将该聚合物多孔质膜的至少1处与该壳体内的至少1处固定，该聚合物多孔质膜被固定为在壳体内不移动的状态。另外，2个以上的独立的聚合物多孔质膜也可以为小片。小片的形状例如可以采用圆、椭圆形、四边形、三角形、多边形、绳状等任意的形状，优选为绳状或四边形。在本发明中，小片的大小可以采用任意的大小，但在为绳状的情况下，长度可以为任意的长度，宽度可以为80mm以下，优选为30mm以下，更优选为10mm以下。由此，可以防止对在聚合物多孔质膜内生长的细胞施加应力。在本发明中，在聚合物多孔质膜的小片为四边形的情况下，更优选为大致正方形，其一边的长度形成为沿着壳体的内壁、或比内壁的一边的长度短(例如，短0.1mm～1mm左右)，以便成为聚合物多孔质膜在壳体内不移动的状态即可。另外，在本发明中，在聚合物多孔质膜的小片为大致正方形的情况下，长度可以为任意的长度，例如可以为80mm以下、优选为50mm以下、更优选为30mm以下、进一步优选为20mm以下、10mm以下。

在本说明书中，所谓“折叠的聚合物多孔质膜”是指，通过在该壳体内被折叠，从而成为利用聚合物多孔质膜的各面和/或与壳体内的表面的摩擦力而在壳体内不移动的状态的聚合物多孔质膜。在本说明书中，“被折叠”可以是在聚合物多孔质膜上带有折痕的状态，也可以是没有折痕的状态。

在本说明书中，“被卷入成辊状的聚合物多孔质膜”是指，聚合物多孔质膜被卷入成辊状，利用聚合物多孔质膜的各面和/或与壳体内的表面的摩擦力而在壳体内不移动的状态的聚合物多孔质膜。另外，在本发明中，被编入成绳状的聚合物多孔质膜是指，例如通过任意的方法将长条状的多个聚合物多孔质膜编入成绳状，利用聚合物多孔质膜彼此的摩擦力而成为相互不移动的状态的聚合物多孔质膜。也可以将(i)2个以上的独立的所述聚合物多孔质膜集中而成的聚合物多孔质膜、(ii)被折叠的聚合物多孔质膜、(iii)卷入成辊状的聚合物多孔质膜、及(iv)结成绳状的聚合物多孔质膜进行组合而收容于壳体内。

在本说明书中，“该聚合物多孔质膜在壳体内不移动的状态”是指，在细胞培养培养基中培养该模块化聚合物多孔质膜的情况下，该聚合物多孔质膜以成为不持续变化形态的状态的方式收容于壳体内的状态。换言之，该聚合物多孔质膜本身被抑制为不会因流体而持续地进行起伏运动的状态。由于保持聚合物多孔质膜在壳体内不移动的状态，能够防止对在聚合物多孔质膜内生长的细胞施加应力，细胞不会被杀死而能够稳定地培养细胞。

3.使用细胞培养装置的细胞培养方法

<将细胞应用于聚合物多孔质膜的工序>

应用于本发明中使用的细胞向聚合物多孔质膜的具体的工序没有特别限定。可以采用本说明书中记载的工序或适于将细胞应用于膜状的载体的任意的方法。虽然并不限定于此，但在本发明的方法中，细胞向聚合物多孔质膜的应用例如包含以下的方式。

(A)包含将细胞播种于所述聚合物多孔质膜的表面的工序的方式；

(B)包含将细胞悬浊液载置或放置在所述聚合物多孔质膜的干燥表面上，或者移动所述聚合物多孔质膜来促进液体的流出，或者刺激表面的一部分，使细胞悬浊液吸入到所述膜中，然后，将细胞悬浊液中的细胞留在所述膜内，使水分流出的工序的方式，及

(C)包含将所述聚合物多孔质膜的单面或两面用细胞培养液或灭菌后的液体润湿，在润湿后的所述聚合物多孔质膜中装填细胞悬浊液，然后，将细胞悬浊液中的细胞留在所述膜内，使水分流出的工序的方式。

(A)方式包含在聚合物多孔质膜的表面直接播种细胞、细胞块。或者，还包含将聚合物多孔质膜放入细胞悬浊液中，使细胞培养液从膜的表面浸润的方式。

播种于聚合物多孔质膜的表面的细胞与聚合物多孔质膜粘接，并进入到多孔的内部。优选的是，即使不特别地从外部施加物理或化学性的力，细胞也与聚合物多孔质膜粘接。播种于聚合物多孔质膜的表面的细胞能够在膜的表面和/或内部稳定地生长、增殖。细胞可以根据生长、增殖的膜的位置采取各种不同的形态。

在(B)的方式中，在聚合物多孔质膜的干燥的表面上载置细胞悬浊液。放置聚合物多孔质膜、或移动所述聚合物多孔质膜来促进液体的流出、或者刺激表面的一部分来使细胞悬浊液被吸入到所述膜中，由此，细胞悬浊液渗透到膜中。虽然并不限于理论，但这被认为是基于聚合物多孔质膜的各表面形状等所带来的性质而引起的。根据本方式，在膜的装填有细胞悬浊液的部位吸入细胞并播种。

或者，也可以如(C)的方式那样，将所述聚合物多孔质膜的单面或两面的部分或整体用细胞培养液或灭菌后的液体润湿后，向润湿后的聚合物多孔质膜装填细胞悬浊液。在该情况下，细胞悬浊液的通过速度大幅提高。

例如，以防止膜的飞散为主要目的，可以使用使一部分膜电极湿润的方法(以后，将其记载为“一点湿法”)。一点湿法实质上与不使膜湿润的干法((B)的方式)大致相近。但是，认为对于湿润的小部分，细胞液的膜透过迅速。另外，也可以使用向使聚合物多孔质膜的单面或两面的整体充分湿润后的聚合物多孔质膜(以后，将其记载为“湿膜”)装填细胞悬浊液的方法(以后，将其记载为“湿膜法”)。在该情况下，在聚合物多孔质膜的整体中，细胞悬浊液的通过速度大幅提高。

在(B)及(C)的方式中，将细胞悬浊液中的细胞留在所述膜内，使水分流出。由此，还能够进行浓缩细胞悬浊液中的细胞的浓度、使细胞以外的不需要的成分与水分一起流出等处理。

有时将(A)的方式称为“自然播种”，将(B)及(C)的方式称为“吸入播种”。

虽然并不限定于此，但优选的是，活细胞选择性地留在聚合物多孔质膜上。因此，在本发明的方法的优选实施方式中，活细胞留在所述聚合物多孔质膜内，死细胞优先与水分一起流出。

在方式(C)中使用的灭菌后的液体没有特别限定，是灭菌后的缓冲液或灭菌水。缓冲液例如为(+)和(-)Dulbecco’s PBS、(+)和(-)Hank’s Balanced Salt Solution等。将缓冲液的例子示于以下的表1。

【表1】

成分	浓度(mol/L)	浓度(g/L)
			NaCl	137	8.00
KCl	2.7	0.20
			Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	10	1.44
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	1.76	0.24
			pH(-)	7.4	7.4

另外，在本发明的方法中，细胞向聚合物多孔质膜的应用还包含通过使处于悬浮状态的粘接性细胞与聚合物多孔质膜悬浊地共存而使细胞附着于膜的方式(缠绕)。例如，在本发明的方法中，为了将细胞应用于聚合物多孔质膜，也可以在细胞培养容器中放入细胞培养培养基、细胞及1个或1个以上的所述聚合物多孔质膜。在细胞培养培养基为液体的情况下，聚合物多孔质膜是悬浮于细胞培养培养基中的状态。根据聚合物多孔质膜的性质，细胞可以与聚合物多孔质膜粘接。因此，即使是不适于天然悬浮培养的细胞，聚合物多孔质膜也可以在悬浊于细胞培养培养基中的状态下培养。优选的是，细胞与聚合物多孔质膜粘接。所谓“主动地粘接”是指，即使不特别地从外部施加物理或化学性的力，细胞也留在聚合物多孔质膜的表面或内部。

所述细胞向聚合物多孔质膜的应用也可以组合使用两种或更多的方法。例如，也可以将方式(A)～(C)中的2个以上的方法组合而将细胞应用于聚合物多孔质膜。可以将担载有细胞的聚合物多孔质膜应用于所述细胞培养装置1中的细胞培养部2来进行培养。

除此之外，也可以预先在收容有聚合物多孔质膜的细胞培养部2中，从细胞供给机构3滴下包含悬浊的细胞在内的培养基并播种。

在本说明书中，所谓“悬浊的细胞”是指，例如，包含通过胰蛋白酶等蛋白质分解酶使粘接细胞强制地悬浮而悬浊在培养基中所得到的细胞、通过公知的驯化工序而能够在培养基中悬浮培养的粘接细胞等。

可以用于本发明的细胞的种类例如从由动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌和细菌构成的组中选择。动物细胞大致分为来源于属于脊椎动物门的动物的细胞和来源于无脊椎动物(属于脊椎动物门的动物以外的动物)的细胞。本说明书中的动物细胞的来源没有特别限定。优选是指来源于属于脊椎动物门的动物的细胞。脊椎动物门包含无颌类和有颌类，有颌类包含哺乳纲、鸟纲、两栖纲、爬行纲等。优选的是，一般是来源于所谓哺乳动物的属于哺乳纲的动物的细胞。哺乳动物没有特别限定，优选包含小鼠、大鼠、人、猴、猪、狗、绵羊、山羊等。

可以用于本发明的动物细胞的种类没有限定，但优选从由多功能性干细胞、组织干细胞、体细胞及生殖细胞构成的组中选择。

在本说明书中，“多功能性干细胞”是指具有分化为所有组织的细胞的能力(分化多功能性)的干细胞的总称。虽然没有限定，但多能性干细胞包含胚胎干细胞(ES细胞)、人工多功能性干细胞(iPS细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)、生殖干细胞(GS细胞)等。优选ES细胞或iPS细胞。iPS细胞因为没有伦理上的问题等理由而特别优选。作为多功能性干细胞，可以使用公知的任意的干细胞，例如可以使用国际公开第2009/123349号(PCT/JP2009/057041)中记载的多功能性干细胞。

“组织干细胞”是指可分化的细胞系列限定于特定的组织，但具有可分化为多种细胞种类的能力(分化多功能性)的干细胞。例如，骨髓中的造血干细胞成为血细胞的基础，神经干细胞分化为神经细胞。除此之外还有形成肝脏的肝干细胞、成为皮肤组织的皮肤干细胞等各种各样的种类。优选的是，从间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞或造血干细胞中选择组织干细胞。

“体细胞”是指构成多细胞生物的细胞中的生殖细胞以外的细胞。在有性生殖中不继承到下一代。优选的是，体细胞从肝细胞、胰腺细胞、肌细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞，脂肪细胞、皮肤细胞、成纤维细胞、胰细胞、肾细胞、肺细胞、或淋巴细胞、红细胞、白细胞、单核细胞、巨噬细胞或巨核细胞的血细胞中选择。

“生殖细胞”是指具有在生殖中将遗传信息传递到下一代的作用的细胞。例如，包含用于有性生殖的配偶子即卵子、***、***、***、用于无性生殖的孢子等。

细胞也可以从由肉瘤细胞、株化细胞和转化细胞构成的组中选择。“肉瘤”是指在骨、软骨、脂肪、肌肉、血液等来源于非上皮性细胞的***细胞中产生的癌，包含软组织肿瘤、恶性骨肿瘤等。肉瘤细胞是来源于肉瘤的细胞。“株化细胞”是指，长期在体外维持、具有一定的稳定的性质而能够进行半永久的传代培养的培养细胞。存在来源于PC12细胞(来源于大鼠肾上腺髓质)、CHO细胞(来源于中国仓鼠的卵巢)、HEK293细胞(来源于人胎儿的肾脏)、HL-60细胞(来源于人白血球细胞)、HeLa细胞(来源于人子***)、Vero细胞(来源于非洲绿猴肾脏上皮细胞)、MDCK细胞(来源于狗肾脏尿细管上皮细胞)、HepG2细胞(来源于人肝癌细胞的细胞株)、BHK细胞(仓鼠幼仔肾脏细胞)、NIH3T3细胞(来源于小鼠胚胎成纤维细胞)等包含人在内的各种物种的各种组织的细胞株。“转化细胞”是指从细胞外部导入核酸(DNA等)，使遗传性质变化的细胞。

在本说明书中，“粘接细胞”一般是为了增殖而使自身粘接在适当的表面所需的细胞，也被称为附着细胞或支架依赖性细胞。在本发明的几个实施方式中，所使用的细胞是粘接细胞。本发明中使用的细胞为粘接细胞，更优选为在悬浊于培养基中的状态下也能够培养的细胞。能够悬浊培养的粘接细胞可以通过公知的方法，通过使粘接细胞向适于悬浊培养的状态驯化而得到，例如可以列举CHO细胞、HEK293细胞、Vero细胞、NIH 3T3细胞等或者从这些细胞分化得到的细胞株。

使用聚合物多孔质膜的细胞培养的模型图如图1所示。图1是用于帮助理解的图，各要素不是实际尺寸。在本发明的细胞的培养方法中，通过将细胞应用于聚合物多孔质膜并进行培养，大量的细胞在聚合物多孔质膜所具有的内部的多面的连结多孔部分、表面生长，因此能够简便地培养大量的细胞。另外，在本发明的细胞的培养方法中，与以往的方法相比，能够大幅减少细胞培养中使用的培养基的量，并且培养大量的细胞。例如，即使在聚合物多孔质膜的一部分或整体未与细胞培养培养基的液相接触的状态下，也能够长期培养大量的细胞。另外，相对于包含细胞生存区域在内的聚合物多孔质膜体积的总和，还能够显著减少细胞培养容器中所含的细胞培养培养基的总体积。

在本说明书中，将不含细胞的聚合物多孔质膜也包含其内部间隙的体积而在空间中所占的体积称为“外观上聚合物多孔质膜体积”(参照图1)。然后，将细胞应用于聚合物多孔质膜，在聚合物多孔质膜的表面及内部担载有细胞的状态下，将聚合物多孔质膜、细胞及浸润于聚合物多孔质膜内部的培养基作为整体而在空间中所占的体积称为“包含细胞生存区域在内的聚合物多孔质膜体积”(参照图1)。在膜厚为25μm的聚合物多孔质膜的情况下，包含细胞生存区域在内的聚合物多孔质膜体积与外观上聚合物多孔质膜体积相比，最大为大50％左右的值。在本发明的方法中，可以在1个细胞培养容器中收容多个聚合物多孔质膜而进行培养，在该情况下，有时将担载有细胞的多个聚合物多孔质膜各自的包含细胞生存区域在内的聚合物多孔质膜体积的总和仅记载为“包含细胞生存区域在内的聚合物多孔质膜体积的总和”。

通过使用本发明的方法，即使在细胞培养容器中所含的细胞培养培养基的总体积为包含细胞生存区域在内的聚合物多孔质膜体积的总和的10000倍或更少的条件下，也能够长期良好地培养细胞。另外，即使在细胞培养容器中所含的细胞培养培养基的总体积为包含细胞生存区域在内的聚合物多孔质膜体积的总和的1000倍或更少的条件下，也能够长期良好地培养细胞。而且，即使在细胞培养容器中所含的细胞培养培养基的总体积为包含细胞生存区域在内的聚合物多孔质膜体积的总和的100倍或更少的条件下，也能够长期良好地培养细胞。而且，即使在细胞培养容器中所含的细胞培养培养基的总体积为包含细胞生存区域的聚合物多孔质膜体积的总和的10倍或更少的条件下，也能够长期良好地培养细胞。

即，根据本发明，与以往的进行二维培养的细胞培养装置相比，能够使细胞培养的空间(容器)小型化至极限。另外，在想要增加培养的细胞的数量的情况下，通过增加层叠的聚合物多孔质膜的片数等简便的操作，能够灵活地增加细胞培养的体积。如果是具备本发明中使用的聚合物多孔质膜的细胞培养装置，则能够使培养细胞的空间(容器)与储藏细胞培养培养基的空间(容器)分离，能够根据培养的细胞数来准备所需的量的细胞培养培养基。贮存细胞培养培养基的空间(容器)可以根据目的而大型化或小型化，或者也可以是能够更换的容器，没有特别限定。

在本发明的细胞的培养方法中，例如，关于在使用聚合物多孔质膜的培养后细胞培养容器中所含的细胞的数量，设细胞全部均匀地分散于细胞培养容器中所含的细胞培养培养基中，培养至每1毫升培养基为1.0×10⁵个以上、1.0×10⁶个以上、2.0×10⁶个以上、5.0×10⁶个以上、1.0×10⁷个以上、2.0×10⁷个以上、5.0×10⁷个以上，1.0×10⁸个以上、2.0×10⁸个以上、5.0×10⁸个以上、1.0×10⁹个以上、2.0×10⁹个以上或5.0×10⁹个以上。

另外，作为测量培养中或培养后的细胞数的方法，可以使用各种公知的方法。例如，作为将在使用聚合物多孔质膜的培养后细胞培养容器中所含的细胞的数量设为细胞全部均匀地分散于细胞培养容器中所含的细胞培养培养基中的数量而进行测量的方法，可以适当使用公知的方法。例如，可以适当地使用利用了CCK8的细胞数测量方法。具体而言，使用Cell Countinig Kit 8：同仁化学研究所制溶液试剂(以下记载为“CCK8”)，测量不使用聚合物多孔质膜的通常的培养中的细胞数，求出吸光度与实际的细胞数的相关系数。然后，应用细胞，将培养后的聚合物多孔质膜转移到包含CCK8的培养基中，在培养箱内保存1～3小时，移出上清，由480nm的波长测定吸光度，根据先前求出的相关系数来计算细胞数。

另外，从另外的观点出发，所谓细胞的大量培养是指，例如在使用聚合物多孔质膜的培养后，每1平方厘米聚合物多孔质膜所包含的细胞数培养至1.0×10⁵个以上、2.0×10⁵个以上、1.0×10⁶个以上、2.0×10⁶个以上、5.0×10⁶个以上、1.0×10⁷个以上、2.0×10⁷个以上、5.0×10⁷个以上、1.0×10⁸个以上、2.0×10⁸个以上或5.0×10⁸个以上。聚合物多孔质膜每1平方厘米包含的细胞数能够使用细胞计数器等公知的方法来适当测量。

实施例

以下，基于实施例对本发明进行更具体的说明。此外，本发明并不限定于这些实施例。本领域技术人员能够基于本说明书的记载而容易地对本发明加以修饰/变更，它们包含在本发明的技术范围内。

在以下的实施例中使用的聚酰亚胺多孔质膜是在将包含从作为四羧酸成分的3,3’,4,4’-联苯基四羧酸二酐(s-BPDA)和作为二胺成分的4,4’-二氨基二苯基醚(ODA)得到的聚酰胺酸溶液和作为着色前体的聚丙烯酰胺在内的聚酰胺酸溶液组成物形成后，通过在250℃以上进行热处理来制备。得到的聚酰亚胺多孔质膜是三层构造的聚酰亚胺多孔质膜，其具有表面层A及表面层B和夹在该表面层A与表面层B之间的大空隙层，表面层A及表面层B具有多个孔，表面层A中存在的孔的平均孔径为6μm，表面层B中存在的孔的平均孔径为46μm，膜厚为25μm，空穴率为73％。

(实施例1)

使用基于筒型气相培养装置的聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养方法

使用培养基(BalanCD(商标)CHO GROWTH A)对将抗人IL-8抗体产生CHO-DP12细胞(ATCC CRL-12445)驯化、悬浮化后的细胞进行悬浮培养，继续培养直至每1ml的活细胞数为9.9×10⁶。在面向振荡培养的氧透过袋中放入10个模块，在CO₂培养箱内进行整夜振荡培养。

第二天，取出模块，在图5所示的筒型气相培养装置的细胞培养部(各细胞培养部的培养基排出口为平行的位置关系)设置10个模块，在储液槽(相当于图5的培养基贮存槽7)中，贮存350ml的培养基(COATIBIO生物制KBM270)，使该培养基经由管泵以每分钟20ml的速度循环。在4日后结束培养时，以细胞密度2.5×10⁵Cells/cm²观察到总细胞数为5.0×10⁷个细胞。示出了不使用氧供给装置，能够用紧凑且简便的设备来培养大量的抗体产生细胞的事实。

(实施例2)

使用基于筒型气相培养装置的聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养方法

使用培养基(BalanCD(商标)CHO GROWTH A)对将抗人IL-8抗体产生CHO-DP12细胞(ATCCCRL-12445)驯化、悬浮化后的细胞进行悬浮培养，继续培养直至每1ml的活细胞数为2.4×10⁶。将30个模块灭菌地封入氧透过型培养袋中，并注入30ml所述培养液，所述30个模块用尼龙网(30#、网眼547μm)形成外套(壳体)，灭菌地加入一定量(每1个模块为20cm²)聚酰亚胺多孔质膜并密封。在CO₂培养箱内放置整夜后，第二天取出模块，在图5所示的筒型气相培养装置的细胞培养部(各细胞培养部的培养基排出口为逆时针错开30度的位置关系，参照图4)设置30个模块，在储液槽(相当于图5的培养基贮存槽7)中贮存300ml的培养基(COATIBIO生物制KBM270)，使该培养基经由管式泵以每分钟20ml的速度循环。

在4日后结束培养时，以细胞密度7.1×10⁴Cells/cm²观察到总细胞数5.8×10⁷个细胞。示出了不使用氧供给装置，能够用紧凑且简便的设备来培养大量的抗体产生细胞的事实。

(实施例3)

使用基于具备液滴化培养基供给机构的细胞培养装置(以下称为“雾和喷淋型反应器”)的聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养方法

使用培养基(BalanCD(商标)CHO GROWTH A)对将抗人IL-8抗体产生CHO-DP12细胞(ATCC CRL-12445)驯化、悬浮化后的细胞进行悬浮培养，继续培养直至每1ml的活细胞数为3.9×10⁶。将12个模块加入到该培养皿中，该12个模块在1片直径10cm的培养皿中分别注入12ml所述悬浮培养液后，用尼龙网(30#、网眼547μm)形成外套(壳体)，灭菌地加入一定量(每1个模块为20cm²)聚酰亚胺多孔质膜并密封。将模块用细胞悬浊液润湿后，在CO₂培养箱内放置整夜。

第二天，取出模块，在雾及喷淋型反应器的内部设置模块12个(参照图9(A))，在培养基贮存槽中，贮存(包含FBS 2％的IMDM)200ml的培养基，使该培养基经由管泵以每分钟60ml的速度循环。2在日后结束培养后，以细胞密度3.4×10⁴Cells/cm²观察到总细胞数8.2×10⁶个细胞。

(实施例4)

使用基于雾和喷淋型反应器的聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养方法

使用培养基(BalanCD(商标)CHO GROWTH A)对将抗人IL-8抗体产生CHO-DP12细胞(ATCCCRL-12445)驯化、悬浮化后的细胞进行悬浮培养，继续培养直至每1ml的活细胞数为9.9×10⁶。在面向振荡培养的氧透过袋中放入10个模块，在CO₂培养箱内进行整夜振荡培养。

第二天，从振荡袋取出模块，在与实施例4同样的条件下，进行基于雾和喷淋型反应器的细胞培养。在培养基贮存槽中贮存200ml的培养基(COATIBIO生物制KBM270)，使该培养基经由管泵以每分钟60ml的速度循环。在4日后结束培养时，以细胞密度为8.8×10⁴Cells/cm²观察到总细胞数为1.8×10⁷个细胞。

(实施例5)

基于具有不锈钢制壳体的模块化聚合物多孔质膜(以下，称为“金属模块”)的筒型气相培养装置(以下称为“气缸型生物反应器”)的准备及使用该装置的细胞培养

为了最大限度地利用聚酰亚胺多孔质膜具有的耐热性，通过简单的整体干热灭菌完成灭菌作业，制作由不锈钢网制的壳体、内垫及聚酰亚胺多孔质膜构成的金属模块(参照图10)。具体而言，将层叠有1cm×1cm的聚酰亚胺多孔质膜及与聚酰亚胺多孔质膜相同面积的不锈钢网(称为“内垫”，未图示)的材料(以3片聚酰亚胺多孔质膜、1片内垫、4片聚酰亚胺多孔质膜、1片内垫、3片聚酰亚胺多孔质膜的顺序层叠)用不锈钢网制的壳体密封，制作金属模块(图10)。作业在开放空间下不灭菌地实施。

在用于运用该金属模块的玻璃制耐热气缸型反应器中，在玻璃腔室内安装有金属模块，通过液体滴下，能够将培养基向气缸内提供。由于具备金属模块的气缸型生物反应器仅由耐热原材料制作，因此灭菌能够仅通过简便的干热灭菌来执行。将30个金属模块设置于耐热气缸内之后，用铝箔包裹非灭菌地组装的装置，以摄氏190度将其干热灭菌80分钟，自然冷却，由此完成灭菌作业。

使用已制作的气缸型生物反应器，着手进行人皮肤成纤维细胞的培养实验。

如上所述，将气缸型反应器整体进行灭菌组装，在CO₂培养箱内设置装置整体。将在培养皿中培养的人皮肤成纤维细胞通过胰蛋白酶处理而使其剥离，相对于图8所示的各反应形式，准备各70ml的细胞悬浊液。此时的细胞密度为每1ml的活细胞数为1.4×10⁵。关于吸附后的细胞增殖行为，在表2中进行说明。

【表2】

※1：液体中残留细胞密度表示在使细胞吸附在聚酰亚胺多孔质膜上之后残留在细胞悬浊液中的细胞数(密度)。

※2：细胞吸附率表示播种中使用的细胞悬浊液中的细胞吸附在聚酰亚胺多孔质膜上的程度。

※3：初始预想成熟度是将聚酰亚胺多孔质膜中的细胞的最大生存数作为100％时的、实际细胞的吸附细胞数以％表示的数值。

※4：表示与※3相同的意义(测定培养第5天而算出)。上部表示最上部的模块的值，下部表示最下部的模块的值。

另外，如图8(D)所示，点滴型的液滴通过将卷取后的不锈钢网(久宝金属制作所制、型号E9103、20#)(相当于图8(D)的网束)***设置于盖体的培养基供给口而实现。除了点滴型的方法以外，网型的液滴通过在网束的正下方设置平面状的不锈钢网(久宝金属制作所制、型号E9103、20#)并覆盖模块来实现。喷淋型的液滴是通过使用池内公司制的编号1/8MVVP650PP-IN号的喷嘴而实现。

然后，通过使用泵连续地供给培养基(使用高金生物株式会社制KBM FibroAssist)，由此开始培养基循环，进行连续培养。一边每3日实施一次培养基更换，一边继续培养。关于细胞数的评价，在30个模块中取出1～2个，将在这些模块中生长的人皮肤成纤维细胞由Cell Countinig Kit 8：同仁化学研究所制溶液试剂(以下记载为“CCK8”)的显色反应来测定细胞数。由该实验结果明确可知，在本实验中，培养基液的注入方法决定之后的各***中的模块内细胞数。另外，更有意义的是，基于网的液体渗透均衡化的效果非常大，观察到细胞充分增殖的结果。另一方面，认为在液滴的添加方式中，培养基不在反应器内部整体扩展，由于产生偏流而限定了细胞生长区域，导致细胞数的减少。认为在喷淋式中注入培养基的方法也有助于某种程度的液体均衡化效果。

接着，为了验证作为本培养方法的生物反应器的效率，进行了物质产生能力的评价。使用宝生物制的人纤连蛋白测定用Elisa kit，测定产生的纤连蛋白量。图11表示测定结果。

根据图11也可知，在该物质产生评价中，网培养方法也表现出压倒性优势，且使纤连蛋白产生力可靠地增加。能够实现1个月的稳定运转。另一方面，即使在喷淋型和点滴型中，也实现了稳定的物质，但未能发现产生力的提高。能够证实：通过非常简便的装置，在气相暴露型培养中稳定地培养人初代细胞，能够高效率地实现有用物质的产生。

附图标记说明

1、1’、1’a 细胞培养装置；

2、2a～2e、2’ 细胞培养部；

21、21a～21e 侧部；

22、22a～22e 底部；

23、23a～23e 培养基排出口；

24 固定件***口；

25 上部；

26 培养基供给口；

27 盖部；

271 培养基排出口；

3 培养基供给机构；

30 培养基贮存部；

31 侧部；

32 底部；

33 培养基滴下喷嘴；

330 喷嘴孔；

331 液滴；

34 固定件***口；

35 培养基滴下孔；

36 溢流管；

37 腿部；

3’、3’a、3’b 液滴化培养基供给机构；

30’ 液滴网；

31’ 网束；

4、4’ 培养基回收机构；

4’a 细胞培养部兼培养基回收机构；

41、41’、41’a 培养基排出部；

5、5’、5’a 外筒；

51 止动件；

52 外筒盖部；

52a 盖部培养基供给口；

61 固定件；

7 培养基贮存槽；

71 培养基；

72 培养基排出管线；

73 培养基供给管线；

8 泵；

9 聚合物多孔质膜；

90 模块化聚合物多孔质膜；

900 壳体。

Claims (23)

1.一种细胞培养装置，其中，具备：

聚合物多孔质膜；

细胞培养部，其收容有所述聚合物多孔质膜；

培养基供给机构，其配置于所述细胞培养部的上部；及

培养基回收机构，其配置于所述细胞培养部的下部，

在此，所述聚合物多孔质膜是三层构造的聚合物多孔质膜，其具有表面层A及表面层B和夹在所述表面层A与所述表面层B之间的大空隙层，所述表面层A及所述表面层B具有多个孔，在此，所述表面层A中存在的孔的平均孔径小于所述表面层B中存在的孔的平均孔径，所述大空隙层具有与所述表面层A及所述表面层B结合的间隔壁和多个大空隙，所述多个大空隙由该间隔壁和所述表面层A及所述表面层B包围，所述表面层A及所述表面层B中的孔与所述大空隙连通，

在此，所述细胞培养部具备底部和侧部，所述底部具有1个以上的培养基排出口，所述侧部与所述底部大致垂直地配置。

2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中，层叠有2个以上的所述细胞培养部。

3.根据权利要求1或2所述的细胞培养装置，其中，所述侧部还具有1个以上的培养基供给口。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞培养装置，其中，还具备：

培养基排出管线，其在一端部与所述培养基回收机构连通；

培养基贮存槽，其与所述培养基排出管线的另一端部连通；及

培养基供给管线，其在一端部与所述培养基贮存槽连通，

在此，所述培养基供给管线的另一端部与所述培养基供给机构连通，培养基进行循环。

5.根据权利要求4所述的细胞培养装置，其中，还具备将所述培养基贮存槽内的培养基向所述培养基供给机构抽起的泵。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述培养基回收机构为漏斗状。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述培养基供给机构具有培养基贮存部和设置于所述培养基贮存部的底部的2个以上的培养基滴下喷嘴。

8.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述培养基供给机构为液滴化培养基供给机构。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的细胞培养装置，其中，

还具备***述细胞培养部的外筒，

在此，所述培养基供给机构配置于所述外筒内且所述细胞培养部的上部，

在此，所述培养基回收机构配置于所述外筒内且所述细胞培养部的下部。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的细胞培养装置，其中，

所述聚合物多孔质膜以如下方式收容于所述细胞培养部：

i)被折叠，

ii)卷入成辊状，

iii)用线状的构造体连结片或小片，

iv)结成绳状，和/或

v)层叠2个以上。

11.根据权利要求1～9中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔质膜是具备壳体的模块化聚合物多孔质膜，

在此，所述模块化聚合物多孔质膜以如下方式收容于所述壳体内：

(i)2个以上的独立的所述聚合物多孔质膜被集中，

(ii)所述聚合物多孔质膜被折叠，

(iii)所述聚合物多孔质膜被卷入成辊状，和/或

(iv)所述聚合物多孔质膜结成绳状，

在此，所述模块化聚合物多孔质膜收容于所述细胞培养部。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔质膜具有平均孔径0.01～100μm的多个细孔。

13.根据权利要求1～12中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述表面层A的平均孔径为0.01～50μm。

14.根据权利要求1～13中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述表面层B的平均孔径为20～100μm。

15.根据权利要求1～14中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔质膜的总膜厚为5～500μm。

16.根据权利要求1～15中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔质膜为聚酰亚胺多孔质膜。

17.根据权利要求16所述的细胞培养装置，其中，所述聚酰亚胺多孔质膜是包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺在内的聚酰亚胺多孔质膜。

18.根据权利要求16或17所述的细胞培养装置，其中，所述聚酰亚胺多孔质膜是，在使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体在内的聚酰胺酸溶液组合物形成后，通过在250℃以上进行热处理而得到的已着色的聚酰亚胺多孔质膜。

19.根据权利要求1～15中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔质膜是聚醚砜(PES)多孔质膜。

20.一种细胞的培养方法，其中，使用权利要求1～19中任一项所述的细胞培养装置。

21.一种细胞培养装置，其中，具备：

聚合物多孔质膜；

细胞培养部，其收容有所述聚合物多孔质膜；

培养基供给机构，其配置于所述细胞培养部的上部；及

培养基回收机构，其配置于所述细胞培养部的下部，

在此，所述聚合物多孔质膜是三层构造的聚合物多孔质膜，其具有表面层A及表面层B和夹在所述表面层A与所述表面层B之间的大空隙层，所述表面层A及所述表面层B具有多个孔，在此，所述表面层A中存在的孔的平均孔径小于所述表面层B中存在的孔的平均孔径，所述大空隙层具有与所述表面层A及所述表面层B结合的间隔壁和多个大空隙，所述多个大空隙由该间隔壁和所述表面层A及所述表面层B包围，所述表面层A及所述表面层B中的孔与所述大空隙连通，

在此，所述培养基回收机构是***述细胞培养部的外筒的一部分。

22.根据权利要求21所述的细胞培养装置，其中，所述培养基供给机构为液滴化培养基供给机构。

23.根据权利要求21或22所述的细胞培养装置，其中，

所述聚合物多孔质膜是具备壳体的模块化聚合物多孔质膜，

在此，所述模块化聚合物多孔质膜以如下方式收容于所述壳体内：

(i)2个以上的独立的所述聚合物多孔质膜被集中，

(ii)所述聚合物多孔质膜被折叠，

(iii)所述聚合物多孔质膜被卷入成辊状，和/或

(iv)所述聚合物多孔质膜结成绳状，

在此，所述模块化聚合物多孔质膜载置于所述细胞培养部。