CN105263521B - 免疫调节剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了特异性结合PD‑L1的抗体和包含利用IL15受体结合结构域构建的PD‑L1结合蛋白的融合分子、编码所述抗体或融合分子的核酸分子以及其治疗性组合物。所述试剂抑制PD‑L1介导的免疫抑制并且增强细胞和细胞因子介导的免疫，以用于***性和感染性疾病。

Description

免疫调节剂
发明领域
本发明提供特异性结合PD-L1的单克隆抗体和包含利用IL15和IL15受体αsushi结构域构建的PD-L1结合蛋白的双特异性融合分子、编码所述抗体和融合分子的核酸分子及其治疗性组合物。所述试剂增强T细胞和NK细胞的功能，以增强细胞和细胞因子介导的免疫以用于治疗各种免疫功能障碍相关病症，包括癌症和感染性疾病。
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年1月15日提交的美国临时申请号61/927,907的优先权，所述美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
发明背景
程序化死亡1(PD-1)为CD28受体家族(包括CD28、CTLA-4、PD-1、ICOS和BTLA)的成员(Freeman等人(2000)J Exp Med 192：1027-34；Latchman等人(2001)Nat Immunol 2：261-8)。PD-1是在免疫病理病况的进展过程中主要在活化T细胞和B细胞上被上调的诱导型免疫抑制受体。通过基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的固有PD-1介导的负信号转导，PD-1与其配体PD-L1的相互作用导致TCR和BCR介导的增殖和细胞因子产生的抑制以及抗原特异性T细胞的细胞凋亡的诱导(Agata等人(1996)Int.Immunol.8：765，Unkeless和Jin.(1997)Curr.Opin.Immunol.9：338-343，Okzaki等人(2001)PNAS 98：13866-71，Dong等人(2002)Nat.Med.8：793-800)。PD-L1是细胞表面糖蛋白和PD-1的主要配体。PD-L1在细胞活化后在淋巴样组织和非淋巴样外周组织上也是可诱导的。PD-L1在多种受累细胞类型(除了免疫细胞以外，还包括癌症和基质细胞)中被上调，并且在疾病恶化过程中在免疫抑制中起着活性作用(Iwai等人(2002)PNAS 99：12293-7，Ohigashi等人(2005)Clin Cancer Res11：2947-53)。PD-L1的上调已与多种癌症和病毒感染的不良临床结果相关联(Hofmeyer等人(2011)J.BioMed.Biotech.2011：1-9，McDermott和Atkins.(2013)Cancer Med.2：662-73)。抗体对PD-1或PD-L1的阻断在临床前和临床背景中促进CD8T细胞浸润、CTL活性和增加的Th1细胞因子IFN-γ的存在(Zhou等人(2010)J.Immunol.185：5082-92，Nomi等人(2007)Clin Cancer Res.13：2152-7，Flies等人(2011)Yale J.Bio.Med.48：409-21，Zitvogel和Kroemer.(2012)OncoImmunol.1：1223-25)。当作为单一疗法使用或与其它免疫抑制分子的抗体组合使用时，PD-L1抗体作为免疫调节剂已被证明是有效的。
然而，针对免疫抑制因子的免疫调节干预仅部分解决了与癌症、感染和其它疾病中的受损免疫力相关的问题。仍然高度期望利用生物治疗剂来直接刺激和扩增效应子免疫细胞以提升减弱的先天和适应性免疫应答至更有效的水平，以控制肿瘤和感染。使用细胞因子(包括白细胞介素，即IL-2，IL-12，IL15，IL-21和TNFα，GM-CSF等)的免疫疗法已被证明在癌症和感染的治疗中在某种程度上是有效的，但临床结果往往受到与获得功效所需的细胞因子的高血浓度相关的全身性毒性以及在受累细胞和组织中靶的特异性的缺乏限制。
在被评估的细胞因子中，IL15被公认为专注于刺激效应及中央记忆CD8T细胞(由一个亚组的抗原特异性CD8细胞组成)以发挥抗肿瘤免疫，而不调节对其它T细胞群的作用。此外，与激活Treg的IL-2不同，IL15经显示除了其激活天然杀伤(NK)细胞以及效应和记忆CD8T细胞的能力以外还具有从由Treg和其它免疫抑制细胞诱导的细胞凋亡拯救T细胞的能力(Van Belle等人(2012)PLoS One 7：e45299，Obar和Lefrancois.(2010)J.Immunol.185：263-72，Pelletier和Girard.(2006)J Immunol 177：100-108，Elpek等人(2010)PNAS 107：21647-21652)。
基于其刺激鼠T细胞系CTLL-2的增殖的能力，IL15在1994年被鉴定为γc细胞因子(Grabstein等人(1994)Science 264：965-8，Bamford等人(1996)PNAS 93：2897-902)。人IL15分别与猿猴和食蟹猴IL15共有约97％和96％的氨基酸序列同一性。人与小鼠IL15具有73％的同源性，并且对小鼠细胞的活性相当。IL15为由DC、巨噬细胞和颗粒细胞以14-15kDa的糖蛋白形式分泌的12.5KD的蛋白(114个氨基酸)，并且也是四种含α-螺旋束的细胞因子的成员(Andderson等人(1995)J Biol Chem.270：29862-9，Steel等人(2012)TrendsPharmacol.Sci.33：35-41)。IL15在结合于T细胞和NK细胞上的功能性IL15受体β和γ单位之前通常与在APC上表达的IL15受体α形成复合物。IL15可通过表达其本身结合于受体α链的膜形式的细胞因子的细胞被反式呈递至表达CD122和CD132的应答细胞(Dubois等人(2002)Immunity 17：537-47)。IL15受体α sushi结构域(大小为29.5KD)是在与受体β和γ正确接合(engagement)之前与IL15形成复合物的至关重要的组分(Wei等人(2001)J.Immunol.167：277-82)。IL15与IL15Rα的复合物和IL15/IL15Rα sushi结合域融合蛋白据报导相较于单独的IL15在体外和体内高效地刺激CD8 T细胞和NK细胞(Mortier等人(2005)J Biol Chem.281：1612-19，Stoklasek等人(2006)J.Immunol.177：6072-80)。IL15还诱导被刺激的人B细胞的增殖和分化(Armitage等人(1995)J Immunol.154：483-90)。有人提出IL15通过用于延长T淋巴细胞的存活来主要对抗活化诱导的细胞死亡(AICD)(Marks-Konczalik等人(2000)PNAS 97：11445-50)。IL15具有支持NK细胞以及记忆表型和抗原特异性记忆CD8 T细胞的维持的特殊能力(Ma等人(2006)Annu Rev Immunol.24：657-79)。因此，在于免疫调节中最具活性的细胞因子中，IL15具有介导针对多种肿瘤类型和病毒感染(包括HIV、HBV、HCV、LCMV等)的免疫的许多重要方面的独特能力(Steel等人(2012)TrendsPharmacol.Sci.33：35-41，Verbist和Klonowski，(2012)Cytokine.59：467-478)。
发明概述
本发明提供了结合PD-L1的抗体和结合蛋白。在本发明的某些实施方案中，所述抗体结合PD-L1并阻断与PD-1的相互作用。通过阻断PD-L1与PD-1的相互作用，这样的抗体用于减弱或抑制免疫抑制。
在另一个方面，本发明提供了特异性结合PD-L1和至少一种其它分子的抗体和结合蛋白。这样的实施方案的实例包括也结合一种或多种其它配体和/或受体的PD-L1结合蛋白，所述结合蛋白可以是膜结合的或可溶解的。
在另一个方面，本发明提供了除通过结合于PD-L1来减弱或抑制免疫抑制外，还通过与其它配体或受体相互作用来促进一个或多个免疫应答的分子，诸如结合PD-L1的融合蛋白。在本发明的实施方案中，所述分子结合靶细胞上的PD-L1，并且还例如通过促进T细胞和/或NK细胞的增殖来刺激细胞介导的免疫应答。在本发明的实施方案中，所述分子刺激响应白细胞介素或干扰素诸如但不限于IL2、IL7、IL15和IL21的细胞。在本发明的实施方案中，所述分子包括促进IL15受体(IL15R)的IL15刺激的序列或结构域。在本发明的实施方案中，促进IL15R刺激的分子是包含sushi结构域的IL15Rα链的部分。在本发明的实施方案中，所述分子提供IL15Rα链的sushi结构域。在本发明的实施方案中，所述分子提供IL15与IL15R α链的sushi结构域的复合物，所述复合物可以是共价的或非共价的。本文中公开的实验显示含有阻断PD-L1与PD-1的结合的PD-L1结合结构域和IL15R刺激结构域的单个分子促进比一起使用的单独的分子更好的免疫应答。更具体地，提供具有抗PD-L1抗体结构域以及包含IL15和IL15 α链sushi结构域的混合结构域的分子，相较于在单独的分子中提供所述结构域，促进增加的增殖、Th1细胞因子释放以及NK细胞和T细胞的杀伤活性相关分子。
在一个实施方案中，本发明提供了结合PD-L1的抗体或片段，所述抗体或片段包含具有序列X1YX2MX3(SEQ ID NO：328)的重链CDR-1H，其中X1为A、G、M、Q、S、Y或W，X2为A、L、M、Q、R、S、V、W或Y，并且X3为A、F、L、M、S、T、V或Y；具有SEQ ID NO：243的重链CDR-2H；以及具有SEQID NO：245的序列的重链CDR-3H。在某些这样的实施方案中，所述重链CDR-1H具有选自以下的序列：SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：264、SEQ ID NO：266、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：270、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：280、SEQ IDNO：282、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：286、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：290、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：294、SEQ ID NO：296、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：302、SEQ IDNO：304、SEQ ID NO：306、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：310和SEQ ID NO：312。在这样的实施方案中，所述重链可变结构域与SEQ ID NO：246具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％的同一性。所述抗体还可包含含有具有SEQ ID NO：247的CDR-1L、具有SEQ ID NO：248的CDR-2L和具有SEQ ID NO：249的CDR-3L的轻链可变结构域。在一些这样的实施方案中，所述轻链可变结构域与SEQ ID NO：250具有至少80％，或至少85％，或至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，本发明提供了结合PD-L1的抗体或其片段，其中所述轻链包含具有SEQ ID NO：247的CDR-1L、具有SEQ ID NO：248的CDR-2L和具有SEQ ID NO：249的CDR-3L。
本发明还提供所述抗体与例如但不限于成像剂、治疗剂或细胞毒性剂的缀合物。
本发明还提供包含所述抗体和缀合物以及药学上可接受的载体的组合物。
在另一个方面，本发明提供能够结合PDL1的融合蛋白，所述融合蛋白还刺激由例如T细胞或NK细胞介导的免疫应答。在本发明的实施方案中，所述融合蛋白包含结合IL15受体的部分。在其它实施方案中，所述融合蛋白包含结合例如白细胞介素受体或干扰素受体的部分。在本发明的实施方案中，结合PD-L1的融合蛋白的部分为抗体或其PD-L1结合片段。在本发明的实施方案中，IL15受体结合部分为IL15，其结合可通过IL15R α sushi结构域在融合蛋白中的存在来增强。
本发明提供在受试者中抑制PD1与PD-L1的相互作用的方法，所述方法包括施用有效量的本发明的抗体或片段。本发明还提供抑制由PD-L1介导的免疫抑制的方法，所述方法包括施用有效量的本发明的抗体或片段，或本发明的融合蛋白。
本发明还提供了刺激针对表达PD-L1的细胞或组织的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的抗体或片段，或本发明的融合蛋白。在某些实施方案中，表达PD-L1的细胞或组织是肿瘤性细胞或已被感染的细胞。
附图简述
图1描绘抗体tccR3λF8、tccR3κA11、tccR3λH4、tctR3κA8、sR3λD7和R2κA6的与人hPDL1-Fc的结合(左上图)、对hPDL1与hPD1的结合的阻断(左下图)、与小鼠mPDL1-Fc的结合(右上图)以及对mPDL1与hPD1的结合的阻断(右下图)。
图2描绘抗体sR3λD7、tccR3κB7、tccR3κA4、tccR3λF8、tccR3λD7、tccR3λH4和tccR3κD9的与人hPDL1-Fc的结合(左上图)、对hPDL1与hPD1结合的阻断(左下图)、与小鼠mPDL1-Fc的结合(右上图)以及对mPDL1与hPD1结合的阻断(右下图)。
图3描绘抗体tccR3κF8、tccR3κD9、tccR3λD7、tccR3λD7sR3κF10、sR3λD7和tccR3λF8的与人hPDL1-Fc的结合(左上图)、对hPDL1与hPD1结合的阻断(左下图)、与小鼠mPDL1-Fc的结合(右上图)以及对mPDL1与hPD1结合的阻断(右下图)。
图4描绘抗体R2κA6、sR3λD7、tccR3λD7、tccR3κB7和tccR3κH4的与人hPDL1-Fc的结合(左上图)、对hPDL1与hPD1结合的阻断(左下图)、与小鼠mPDL1-Fc的结合(右上图)以及对mPDL1与hPD1结合的阻断(右下图)。
图5描绘抗体sR3λD7、tctR3κA8、tccR3κA11、tccR3λD7、tccR3κD9、tccR3λF8、tccR3κF8、tccR3κF10、tccR3λH4、tccR3κB7和tccR3κA4的与PDLI-293细胞(上)和MDS-MB-231(下)细胞的结合。
图6描绘结合(A)人单核细胞来源的树突状细胞、(B)表达PD-L1的MDA-MB-231人癌系细胞和(C)表达PD-L1 B16-F10的小鼠细胞系的抗PD-L1抗体。
图7显示通过如下方面测量的抗PD-L1抗体的功能性阻断活性：(A)当被aCD3和PD-L1Fc涂覆的珠粒活化时CD4增殖的增加，(B)SEB-活化的人PBMC中的细胞因子分泌的增加和(C)在与mo-DC的混合淋巴细胞反应中CD4增殖的增加。
图8显示当抗PDL1抗体和IL15都存在于(A)与mo-DC的混合淋巴细胞反应和(B)通过αCD3和PD-L1Fc涂覆的珠粒进行的CD8刺激中时，CD4和CD8的活化。
图9显示抗PD-L1-sushi结构域-IL15(称为抗PDL1-SD15)融合蛋白保持与PD-L1的结合，如通过(A)固相ELISA和(B)与由aCD3涂覆的珠粒活化的CD4的结合测量。
图10显示与抗PD-L1-SD15融合蛋白一起体外培养的PBMC导致增加的NK细胞数目(A)、增加的CD8细胞数目(B)和如通过粒酶B的百分比测量的活化状态(C)。未观察到对CD4细胞的作用(D)。
图11显示当在aCD3涂覆的珠粒存在的情况下添加至体外CD8刺激时，抗PD-L1-SD15融合蛋白与IL15类似地活化CD8(A)。然而，在aCD3和PD-L1Fc涂覆的珠粒存在时，当与IL15相比较时，抗PD-L1-SD15融合蛋白可使CD8增殖增加超过5倍(B)。cD7-SD15neg为用作阴性对照的具有无功能性IL15的抗PD-L1 cD7。
图12显示在抗原呈递细胞上存在PD-L1Fc的情况下CD8的活化。抗PD-L1-SD15融合蛋白cD7-SD15在显著更低的浓度下刺激CD8，如通过(A)粒酶B阳性CD8的百分比增加和(B)总的细胞因子分泌的增加测量的。相较于IL15，CD8的活化的最高水平在通过添加有cD7-SD15的aCD3和PD-L1Fc活化的CD8中得以升高。(C)关于在抗PD-L1抗体和游离IL15(虚线)存在的情况下CD8增殖的数据与在抗PD-L1-SD15融合蛋白(直线)存在的情况下CD8增殖的数据重叠。
图13提供了抗PD-L1抗体的VH(图13A1-3)和VL(图13B1-3)链的氨基酸序列。对于VH序列，加框区域表示CDR。对于CDR-1H，Chothia CDR以斜体字表示，Kabat CDR加以下划线表示。对于CDR-2H，Kabat CDR与加框序列，与以斜体字表示的Chothia CDR同延。对于VL序列，加框区域表示Kabat/Chothia CDR。
图14显示包含IL15Rα sushi结构域和IL15的SD15(SEQ ID NO：261)、tccλD7HC-SD15(SEQ ID NO：262)和tccλD7HC-SD15的LALA突变体(SEQ ID NO：263)的氨基酸序列，所述LALA突变体含有对对于FcγRI来说是重要的重链恒定区中的位置上的两个相邻亮氨酸(Leu234和Leu235)的丙氨酸取代。
图15显示相较于单独的分子的PD-L1结合部分(cD7)和含有对于KLH和IL15结构域是特异性的结合结构域的融合蛋白(KLHSD15)的抗PD-L1-SD15融合蛋白(CD7SD15)的细胞毒性。将人CD8 T细胞和MAD-MB-231肿瘤细胞在补充有10％FBS的IMDM中共培养7天。通过在FACS中测量利用Viability Dye eFluor 780染色的死亡的肿瘤细胞的数目评估肿瘤细胞杀伤活性。
图16显示抗PD-L1-SD15融合蛋白延长具有表达PD-L1的肿瘤的小鼠存活率。用2x105个鼠CT26结肠肿瘤细胞静脉内注射Balb/c小鼠。24小时后，小鼠在第一周每周2次，随后在治疗过程的剩余时间每周1次接受抗PD-L1抗体cD7(紫色线：75ug/剂量)、抗PD-L1-SD15融合蛋白cD7-SD15(绿色线：75ug/剂量，蓝色线：25ug/剂量)或sD7-SD15(灰色线：75ug/剂量，红色线：25ug/剂量)的腹膜内施用。对照组中的小鼠接受等体积的盐水或正常IgG溶液。通过使用卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier Plot)测量存活率。
图17显示两个亲和力成熟抗PDL1抗体与可溶性人PDL1、可溶性小鼠PDL1和可溶性大鼠PDL1的结合以及与人PDL2无结合。
图18显示两个亲和力成熟抗PDL1抗体相较于它们的亲代tccλD7抗体的对人PD1与人PDL1的结合的阻断(左图)和对小鼠PD1与小鼠PDL1的结合的阻断(右图)。
图19显示如通过流式细胞术测量，两个抗PD-L1抗体tccλD7的亲和力成熟变体具有更高的与表达PD-L1的人MDA-MB-231肿瘤细胞的结合活性。
图20显示有增强的促进Th1细胞因子IL2(上图)和IFNγ(下图)的产生的效力的抗PD-L1抗体tccλD7的亲和力成熟变体。
图21显示本发明的融合蛋白与表达PD-L1的MDA-MB-231肿瘤细胞的结合。
图22显示本发明的蛋白对IL15-反应性人成巨核细胞白血病细胞的刺激活性。
图23显示本发明的融合蛋白的hPD-L1结合(左图)和配体阻断(右图)活性。
图24显示本发明的融合蛋白的尺寸排阻层析的结果。
图25显示本发明的融合蛋白的血清稳定性。
详述
免疫细胞上的PD-1与PD-L1的相互作用抑制由免疫细胞进行的增殖和细胞因子产生。PD-L1在各种组织(包括癌症)中也是可诱导的并且被上调。总之，PD-1和PD-L1在免疫抑制中起作用。本发明提供结合PD-L1并阻断与PD-1的相互作用的新型抗体或这样的抗体的抗原结合片段。在本发明的实施方案中，所述抗体减弱或抑制免疫抑制。
本发明的新型抗体示于表1和所附序列表中，所述表和序列表显示重链和轻链CDR(根据Kabat和Chothia的鉴定***鉴定)以及完全重链和轻链可变区的氨基酸序列。根据Kabat和Chothia的共同***鉴定前两个重链CDR，这提供了不同的但重叠的CDR的位置。许多重链和轻链的比较显示许多CDR序列间的显著相似性。因此，将预期可在序列之间混合并匹配许多CDR。
所述抗体可具有一个或多个氨基酸取代、缺失、***和/或添加。在某些实施方案中，所述抗体包含上述重链可变结构域中的一个和上述轻链可变结构域中的一个。在某些实施方案中，所述PD-L1抗体或其结合片段包含具有与表1中所示的CDR和可变结构域序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列的一个或多个CDR或一个或多个可变结构域。
“同一性”是通过考虑需要被引入来进行两个序列的最佳比对的缺口的数目以及每一个缺口的长度，由两个氨基酸或核酸序列共享的相同位置的数目或百分比。“基本上同一的”是指相异仅在于保守氨基酸取代例如用一种氨基酸取代相同种类的另一种氨基酸(例如，用缬氨酸取代甘氨酸、用精氨酸取代赖氨酸等)，或在于一个或多个位于不破坏所述蛋白质的功能的氨基酸序列的位置上的非保守取代、缺失或***的氨基酸序列。在一些情况下，通过选择在它们对维持如下方面的作用上没有显著差异的取代来产生氨基酸取代：(a)取代的区域中的肽骨架的结构，(b)分子在靶位点上的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积。例如、可基于侧链性质将天然存在的残基分为以下的组；(1)疏水性氨基酸(亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)；(2)中性亲水性氨基酸(半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；(3)酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)；(4)碱性氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸和精氨酸)；(5)影响链取向的氨基酸(甘氨酸和脯氨酸)；和(6)芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)。在这些组内产生的取代可被认为是保守性取代。取代的实例包括，但不限于，缬氨酸对丙氨酸的取代，赖氨酸对精氨酸的取代，谷氨酰胺对天冬酰胺的取代，谷氨酸对天冬氨酸的取代，丝氨酸对半胱氨酸的取代，天冬酰胺对谷氨酰胺的取代，天冬氨酸对谷氨酸的取代，脯氨酸对甘氨酸的取代，精氨酸对组氨酸的取代，亮氨酸对异亮氨酸的取代，异亮氨酸对亮氨酸的取代，精氨酸对赖氨酸的取代，亮氨酸对甲硫氨酸的取代，亮氨酸对苯丙氨酸的取代，甘氨酸对脯氨酸的取代，苏氨酸对丝氨酸的取代，丝氨酸对苏氨酸的取代，酪氨酸对色氨酸的取代，苯丙氨酸对酪氨酸的取代和/或亮氨酸对缬氨酸的取代。
优选地，所述氨基酸序列与本文中公开的氨基酸序列具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％的同一性。用于测定序列相似性的方法和计算机程序是公开可用的，包括但不限于GCG程序包(Devereux等人，Nucleic Acids Research 12：387，1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403(1990)和ALIGN程序(2.0版)。公知的Smith Waterman算法也可用于测定相似性。BLAST程序可从NCBI和其它来源公开获得(BLAST Manual，Altschul，等人，NCBI NLM NIH，Bethesda，Md.20894；在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/上的BLAST 2.0)。在比较序列时，这些方法解释各种取代、缺失和其它修饰。保守性取代通常包括在以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。
本发明的抗体还包括已通过直接突变、亲和力成熟、噬菌体展示或链改组的方法对其结合特征进行改进的那些抗体。亲和力和特异性可通过突变CDR和筛选具有期望的特征的抗原结合位点来修饰或改善。以多种方式突变CDR。一种方式是随机化单个残基或残基的组合，以便在一组在其他方面相同的抗原结合位点中，在特定位置上发现所有20种氨基酸。或者，通过易错PCR方法在CDR残基的范围内诱导突变(参见，例如，Hawkins等人，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992))。例如，可在大肠杆菌(E.coli)的增变株中扩增含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体(参见，例如，Low等人，J.Mol.Biol.，250：359-368(1996))。这些诱变方法是对于本领域技术人员来说是已知的许多方法的举例说明。
为了使免疫原性降至最低，包含人恒定结构域序列的抗体是优选的。所述抗体可以是任何免疫球蛋白种类诸如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亚类，或可组合任何所述免疫球蛋白种类及其亚类的成员。还可选择抗体种类来最优化天然抗体的效应功能(例如，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC))。
本发明的某些实施方案包括PD-L1结合抗体片段的使用。Fv是含有完全重链可变结构域和轻链可变结构域(包括所有6个高变环(CDR))的最小片段。由于不存在恒定结构域，因此可变结构域是非共价缔合的。可使用允许VH与VL结构域缔合以形成抗原结合位点的接头将重链和轻链连接成单个多肽链(“单链Fv”或“scFv”)。在本发明的实施方案中，所述接头为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。由于scFv片段不存在完整抗体的恒定结构域，因此它们比完整抗体小许多。scFv片段也不含与在某些实施方案中可能不期望的其它生物分子相互作用的正常重链恒定结构域。
还可使用含有VH、VL和任选地CL、CH1或其它恒定结构域的抗体的片段。通过木瓜蛋白酶消化产生的抗体的单价片段被称为Fab并且不存在重链铰链区。通过胃蛋白酶消化产生的片段(被称为F(ab’)2)保留重链铰链并且是双价的。这样的片段也可重组产生。许多其它有用的抗原结合抗体片段在本领域中是已知的，并且包括但不限于双体抗体、三体抗体、四体抗体、单结构域抗体以及其它单价和多价形式。
本发明还提供多价抗原结合蛋白，其可以以(但不限于)抗体、其抗原结合片段和包含抗体的抗原结合部分的全部或部分的蛋白的形式存在。多价抗原结合蛋白可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。术语特异性是指特定分子可结合于其的不同类型的抗原决定簇的数目。如果免疫球蛋白分子结合于仅一个类型的抗原决定簇，则所述免疫球蛋白分子是单特异性的。如果免疫球蛋白分子结合不同类型的抗原决定簇，则所述免疫球蛋白分子是多特异性的。
在本发明的实施方案中，所述PD-L1结合蛋白具有至少约102M-1s-1、至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、至少约105M-1s-1或至少约106M-1s-1的结合速率常数(Kon)，如通过表面等离子体共振术测量的。在一个实施方案中，PD-L1结合蛋白具有102M-1s-1至103M-1s-1、103M-1s-1至104M-1s-1、104M-1s-1至105M-1s-1或105M-1s-1至106M-1s-1的结合速率常数(Kon)，如通过表面等离子体共振术测量的。
在另一个实施方案中，所述PD-L1结合蛋白具有至多约10-3s-1、至多约10-4s-1、至多约10-5s-1或至多约10-6s-1的解离速率常数(Koff)，如通过表面等离子体共振测量的。在一个实施方案中，所述PD-L1结合蛋白具有10-3s-1至10-4s-1、10-4s-1至10-5s-1或10-5s-1至10-6s-1的解离速率常数(Koff)，如通过表面等离子体共振测量的。
在另一个实施方案中，所述PD-L1结合蛋白具有至多约10-7M、至多约10-8M、至多约10-9M、至多约10-10M、至多约10-11M、至多约10-12M或至多约10-13M的解离常数(KD)。在一个实施方案中，所述结合蛋白具有10-7M至10-8M、10-8M至10-9M、10-9M至10-10M、10-10M至10-11M、10-11M至10-12M或10-12M至10-13M的对其靶的解离常数(KD)。
本文中描述的结合蛋白可以是还包含成像剂、治疗剂或细胞毒性的缀合物。在一个实施方案中，所述成像剂是放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记或生物素。在另一个实施方案中，所述放射性标记是：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu或153Sm。在又一个实施方案中，治疗剂或细胞毒性剂是一种抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝***剂、蒽环类、毒素或凋亡剂。如下文中讨论的，免疫刺激性细胞因子是特别重要的。
本发明还提供了结合PD-L1以抑制免疫抑制的分子，所述分子还通过与其它配体或受体的相互作用来促进免疫反应。如本文中所例示的，这样的分子组合抗体的PD-L1结合结构域与刺激NK细胞或T细胞的功能的结构域。这样的刺激结构域可以是，但不限于，结合并刺激响应于白介素或干扰素诸如但不限于IL2、IL7、IL15和IL21的受体的刺激性结构域。本文例示的刺激性结构域是包含通过接头连接于IL15的IL15R α链的sushi结构域的混合结构域(例如，SEQ ID NO：261)。完整分子的实例示于SEQ ID NO：262。在抗体结构域与IL15R刺激性结构域之间的区域中利用2个氨基酸取代修饰以抑制所述区域的蛋白质水解的几乎相同的分子示于SEQ ID NO：263。如本文中所证明的，包含抑制免疫抑制的PD-L1结合结构域和促进免疫应答的第二结构域的分子提供了相较于单独提供所述功能的两个不同的分子增强的免疫细胞活性。
如本文中所例示的，所述分子的PD-L1结合部分是抗体的抗原结合结构域。提供了几种新型抗体重链和轻链可变结构域以及包含它们的抗体。根据本发明，所述PD-L1结合蛋白可以是结合PD-L1并且阻断免疫抑制的任何试剂。这些试剂包括抗PD-L1抗体及片段，不限于本文中公开的那些新型抗体，以及来源于PD1的肽和蛋白质、PD-L1的天然配体。
如本文中公开的，所述PD-L1结合结构域连接于刺激NK和T细胞活性的结构域。所述结构域包含IL15，并且通过柔性接头联接于其，所述“sushi”结构域来自IL15受体的α链。所述sushi结构域以高亲和力结合IL15，并且IL15与sushi结构域的复合物对于刺激NK和T细胞增殖，活性特别高。特别值得注意的是，如实施例中显示的，利用在与IL15刺激性结构域相同的分子中组合PD-L1结合结构域的试剂的治疗比使用PD-L1结合结构域和IL15刺激性结构域作为单独的分子的联合治疗更有效。
因此，在某些实施方案中，本发明涵盖包含结合PD-L1并阻断与PD1的结合的结构域和刺激IL15R从而刺激免疫细胞的增殖的结构域的杂种分子。如所例示的，所述IL15R刺激性结构域包含通过柔性接头联接于IL15的IL15R α链的sushi结构域，所述柔性接头与用于单链Fv分子的那些接头相似(即，含有15-20个主要为丝氨酸和甘氨酸的氨基酸。在实践中，存在可使用的其它方法，所述方法例如对于制造程序可以是优选的。此外，有人认识结构域结构，从而认识公开的杂种蛋白的模块方面和其它性质。例如，将sushi结构域联接于IL15的接头用于将所述杂种蛋白表达为一个多肽，但同样地也可被其它试剂、接头或交联剂替代。或者，IL15对于IL15R α链的含sushi部分的高亲和力表明sushi结构域与IL15可形成不一定是共价的稳定复合物。类似地，虽然所述例示蛋白包含完整抗体恒定区，但PD-L1结合抗体的其它抗原结合片段也可以是足够的。
因此，本发明提供了连接于IL15R刺激性结构域的PD-L1结合结构域，所述IL15R刺激性结构域包含IL15R α链的sushi结构域或其变体和IL15或其变体。在某些实施方案中，所述变体可与本文中公开的序列具有80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性。在一个实施方案中，IL15R α链的sushi结构域与IL15形成共价复合物。在另一个实施方案中，IL15R α链的sushi结构域和IL15形成非共价复合物。所述PD-L1结合结构域可包含本文中公开的其抗体的1、2、3、4、5或6个CDR，或重链和/或轻链可变结构域，或其抗原结合片段或其变体，诸如与其具有80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性的变体，或本领域中已知的阻断与PD-1的结合的PD-L1抗体或其抗原结合片段。
应理解，本发明的抗PD-L1抗体和杂种蛋白，当为了预防或治疗目的而用于哺乳动物时，将以另外地包含药学上可接受的载体的组合物的形式进行施用。合适的药学上可接受的载体包括，例如，水，盐水，磷酸盐缓冲盐水，葡萄糖，甘油，蔗糖，聚山梨醇酯，乙醇等的一种或多种以及其组合。药学上可接受的载体还可包含少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强所述抗体的保存期限或效力。
在本发明的方法中，向有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的本发明的杂种蛋白质的抗体。如本文中所用的，术语“施用”是指通过可实现所寻求的结果的任何方法将本发明的抗体和融合蛋白递送至哺乳动物。它们可以例如静脉内或肌内施用。虽然本发明的示例性抗体对于向人施用是特别有用的，它们也可向其它哺乳动物施用。如本文中所用，术语“哺乳动物”意欲包括，但不限于人、实验室动物、家庭宠物和农场动物。“治疗有效量”是指当向哺乳动物施用时，在产生期望的治疗效果诸如抑制激酶活性方面是有效的量的本发明的抗体。
本发明的抗体和杂种蛋白用于抑制肿瘤和其它肿瘤性疾病，以及治疗与免疫抑制相关的其它病理病况。可以治疗的肿瘤包括原发性肿瘤、转移瘤以及难治性肿瘤。难治性肿瘤包括对利用单独的化学治疗剂、单独的抗体、单独的辐射或其组合的治疗不起反应或具有抗性的肿瘤。难治性肿瘤还包括似乎被利用这样的试剂的治疗抑制，但在中断治疗后达至5年、有时达到10年或更长时间复发的肿瘤。所述抗体对于治疗血管化肿瘤和未血管化的或尚未显著血管化的肿瘤是有效的。
可相应地被治疗的实体瘤的实例包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤和淋巴瘤。这样的肿瘤的一些实例包括表皮样肿瘤、鳞状肿瘤诸如头颈部肿瘤、结直肠肿瘤、***肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤(包括小细胞和非小细胞肿瘤)、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤和肝肿瘤。其它实例包括卡波西氏肉瘤、中枢神经***肿瘤、神经母细胞瘤、毛细血管母细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑色素瘤、胃肠道和肾癌及肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤，优选地多形性胶质母细胞瘤和平滑肌肉瘤。本发明的拮抗剂对于其是有效的血管化皮肤癌的实例包括鳞状细胞癌、基底细胞癌和可通过抑制恶性角质形成细胞诸如人恶性角质形成细胞的生长来治疗的皮肤癌。
非实体肿瘤的实例包括白血病、多发性骨髓瘤和对细胞因子诸如IL15无应答的淋巴瘤。白血病的一些实例包括急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)，红细胞白血病或单核细胞白血病。淋巴瘤的一些实例包括霍奇金和非霍奇金氏淋巴瘤。
本发明的PD-L1抗体和免疫细胞刺激性杂种蛋白也用于病毒感染的治疗。T细胞上的PD-1表达与HIV和HCV感染的患者的病毒载量相关，并且PD-1表达已被鉴定为耗尽的病毒特异性CD8+T细胞的标志。例如，PD-1+CD8+T细胞显示可通过阻断PD-1/PD-L1相互作用来恢复的受损的效应功能和PD-1相关T细胞耗尽。这导致病毒特异性CD8+T细胞介导的免疫的恢复，从而表明使用拮抗性抗体中断PD-1信号转导可恢复T细胞效应功能。基于PD-1/PD-L1的阻断的免疫疗法导致不仅针对肿瘤抗原的T细胞耐受性的瓦解，而且还提供了再活化病毒特异性效应T细胞和根除慢性病毒感染中的病原体的策略。因此，本发明的抗体和杂种蛋白可用于治疗慢性病毒感染，包括但不限于，HCV和HIV，以及淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)。
可有利地将本发明的抗体和杂种蛋白与第二试剂一起向有此需要的受试者施用。例如，在一些实施方案中，将本发明的抗体或杂种蛋白与抗肿瘤试剂一起向受试者施用。在一些实施方案中，将本发明的的抗体或杂种蛋白与第二血管生成抑制剂一起向受试者施用。在一些实施方案中，将本发明的抗体或杂种蛋白与抗炎剂或免疫抑制剂一起施用。
抗肿瘤剂包括细胞毒性化学治疗剂、靶向小分子和生物分子以及辐射。化学治疗剂的非限制性实例包括顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、伊立替康、氮芥(mechlorethamine)(氮芥(nitrogen mustard))、链佐星、环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(泰索帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、干扰素α、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、紫杉醇及其组合。
靶向小分子和生物分子包括，但不限于，信号转导途径的组分的抑制剂，诸如酪氨酸激酶的调节剂和受体酪氨酸激酶抑制剂，以及结合肿瘤特异性抗原的试剂。参与肿瘤发生的生长因子受体的非限制性实例是血小板衍生的生长因子(PDGFR)、***(IGFR)、神经生长因子(NGFR)和成纤维细胞生长因子(FGFR)的受体，以及表皮生长因子受体家族的受体，包括EGFR(erbB1)、HER2(erbB2)、erbB3和erbB4。
EGFR拮抗剂包括结合EGFR或EGFR配体的抗体，并抑制配体结合和/或受体的活化。例如，所述试剂可阻断受体二聚体或与其它EGFR家族成员的异二聚体的形成。EGFR的配体包括，例如，EGF、TGF-α双调蛋白、肝素结合EGF(HB-EGF)和βregullulin。EGFR拮抗剂可从外部结合EGFR的细胞外部分(其可以抑制或可以不抑制配体的结合)，或在内部结合酪氨酸激酶结构域。EGFR拮抗剂还包括例如，通过抑制EGFR信号转导途径的组分的功能来抑制EGFR依赖性信号转导的试剂。结合EGFR的EGFR拮抗剂的实例包括，但不限于，生物分子，诸如对于EGFR是特异性的抗体(及其功能等同物)，和小分子，诸如直接作用于EGFR的胞质结构域的合成激酶抑制剂。
小分子和生物抑制剂包括表皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂，包括吉非替尼、埃罗替尼和西妥昔单抗、HER2的抑制剂(例如，曲妥单抗，曲妥单抗emtansine(曲妥单抗-DM1；T-DM1)和帕妥珠单抗)、抗VEGF抗体及片段(例如，贝伐单抗)、抑制CD20的抗体(例如，利妥昔单抗、替伊莫单抗)、抗VEGFR抗体(例如，雷莫芦单抗(IMC-1121B)、IMC-1C11和CDP791)，抗PDGFR抗体和伊马替尼。小分子激酶抑制剂可对于特定酪氨酸激酶是特异性的或为两种或多种激酶的抑制剂。例如，化合物N-(3，4-二氯-2-氟苯基)-7-({[(3aR，6aS)-2-甲基八氢环戊并[c]吡咯-5-基]甲基}氧基)-6-(甲氧基)喹唑啉-4-胺(也称为XL647、EXEL-7647和KD-019)是几种受体酪氨酸激酶(RTK)，包括EGFR、EphB4、KDR(VEGFR)、Flt4(VEGFR3)和ErbB2的体外抑制剂，并且也是SRC激酶的抑制剂，所述SRC激酶参与导致肿瘤对某些TKI的无应答的途径。在本发明的实施方案中，有此需要的受试者的治疗包括施用式I的rho-激酶抑制剂和施用KD-019。
达沙替尼(BMS-354825；Bristol-Myers Squibb，New York)是另一种口服生物可用的ATP位点竞争性Src抑制剂。达沙替尼还靶向Bcr-Abl(被FDA批准用于患有慢性髓性白血病(CML)或费城染色体阳性(Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)的患者)以及c-Kit、PDGFR、C-FMS、EphA2和SFK。Src和Bcr-Abl的两种其它口服酪氨酸激酶抑制剂是伯舒替尼(SKI-606)和沙拉替尼(AZD0530)。
在本发明的实施方案中，将本发明的PD-L1抗体或缀合物与抗病毒剂组合用于治疗慢性病毒感染。例如，对于HCV，可使用下列药剂。HCV蛋白酶抑制剂包括，但不限于，波普瑞韦、特拉匹韦(VX-950)、ITMN-191、SCH-900518、TMC-435、BI-201335、MK-7009、VX-500、VX-813、BMS790052、BMS650032和VBY376。HCV非结构蛋白4B(NS4B)抑制剂包括，但不限于，氯苄咪唑(clemizole)以及其他NS4B-RNA结合抑制剂，包括但不限于苯并咪唑RBI(B-RBI)和吲唑RBI(I-RBI)。HCV非结构蛋白5A(NS5A)抑制剂包括，但不限于，BMS-790052、A-689、A-831、EDP239、GS5885和PP1461。HCV聚合酶(NS5B)的抑制剂包括，但不限于核苷类似物(例如，伐洛他滨(valopicitabine)、R1479、R1626、R7128)，核苷酸类似物(例如，IDX184、PSI-7851、PSI-7977和非核苷类似物(例如，非利布韦、HCV-796、VCH-759、VCH-916、ANA598、VCH-222(VX-222)、BI-207127、MK-3281、ABT-072、ABT-333、GS9190、BMS791325)。此外，可使用利巴韦林或利巴韦林类似物诸如他立韦林(viramidine；ICN 3142)、咪唑立宾、Merimepodib(VX-497)，吗替麦考酚酯和麦考酚酯。
在某些实施方案中，每天一次，每隔1天一次，每2天一次，每3天一次，每周一次，每周两次，每周三次，或每2周一次向受试者施用一个剂量的本发明的抗体或杂种蛋白。在其它实施方案中，每天一次、每2天一次、每3天一次、每周一次或每2周一次向受试者施用2、3或4个剂量的化合物或组合物。在一些实施方案中，施用化合物或组合物的剂量持续2天、3天、5天、7天、14天或21天。在某些实施方案中，施用一个的化合物或组合物的剂量持续1个月、1.5个月、2个月、2.5个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更多个月。
施用方法包括但不限于肠胃外、真皮内、玻璃体内、肌内，腹膜内，静脉内，皮下，鼻内，硬膜外，口服，舌下，鼻内，脑内，***内，经皮，经粘膜，直肠，通过吸入，或局部施用(特别是对耳，鼻，眼或皮肤的施用)。施用模式由医师来酌处。在大多数情况下，施用将导致化合物释放至血液中。对眼疾病的治疗，生物制剂的玻璃体内施用是优选的。
在具体的实施方案中，可能期望局部施用化合物。这可例如(但非通过限制的方式)通过局部输注、局部施用、通过注射、通过导管或通过植入物(所述植入物为多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜，如硅橡胶膜，或纤维)来实现。在这种情况下，施用可以选择性地靶向局部组织而不将化合物大量释放至血流中。
也可采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，和具有雾化剂的制剂，或通过碳氟化合物或合成肺表面活性剂的灌注。在某些实施方案中，使用常规粘合剂和媒介物诸如三酸甘油酯将化合物配制为栓剂。
在另一个实施方案中，将化合物在囊泡中，特别地在脂质体中进行递送(参见Langer，1990，Science 249：1527-1533；Treat等人，Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Bacterial infection，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss，New York，第353-365页(1989)；Lopez Berestein，同上，第317-327页；通常参见如上)。
在另一个实施方案中，将化合物在控释***中进行递送(参见，例如，Goodson，Medical Applications of Controlled Release，同上，第2卷，第115-138页(1984))。控释***的实例在由Langer撰写的综述，Science 249：1527-1533中进行了论述，可使用所述受控释放的实例。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，同上；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等人，1980，Surgery 88：507；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(参见MedicalApplications of Controlled Release，Langer和Wise(编辑)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；也参见Levy等人，1985，Science 228：190；During等人，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71：105)。
上述施用方案被提供仅用于说明目的，而不应被认为是限制性的。本领域普通技术人员将容易理解，所有剂量都在本发明的范围之内。
应当理解和预期，本文中公开的本发明的原理可由本领域技术人员作出，并且意欲将这样的修改包括在本发明的范围之内。
在本申请通篇中，各种出版物被引用。这些出版物在此通过引入以其整体并入本申请，以更全面地描述本发明所属领域的现有技术的状态。下列实施例进一步说明本发明，但不应该被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
混合淋巴细胞反应：
使用RosetteSep人单核细胞富集试剂盒(StemCell technologies)通过阴性选择从全血分离CD14阳性单核细胞。通过用150ng/mLGM-CSF和50ng/mL IL-4在补充有10％FBS的IMDM中培养CD14阳性细胞6至7天来产生未成熟单核细胞来源的树突状细胞(mo-DC)。使用RosetteSep人CD4富集试剂盒(StemCell technologies)从全血负分离CD4阳性细胞。随后分别以1∶10的mo-DC与CD4细胞的比率共培养来自不同供体的Mo-DC和CD4阳性细胞。为了评估抗PDL1抗体的阻断功能，在共培养开始时添加递增量的抗PDL1抗体。在一些情况下，也在共培养开始时添加递增量的IL15。在第6或7天，收集上清液以用于通过ELISA测量分泌的IL-2和IFNγ。通过流式细胞术评价CD4细胞的数目和增殖标志Ki67的表达。
PBMC的活化：
使用Histopaque-1077(Sigma)从全血分离PBMC，将其培养在补充有10％FBS的IMDM中，随后用SEB(0.1ug/mL)、PHA(1ug/mL)或抗CD3克隆HiT3a(1ug/mL，eBioscience)活化3至7天。3天后通过流式细胞术在活化的PBMC中评价抗PDL1抗体或抗PDL1-SD15融合蛋白的结合。在利用SEB的PBMC活化过程中通过添加递增量的抗PDL1抗体进行抗PDL1抗体的功能性评估。在第2或3天，收集上清液以测量IL-2和IFNγ。在抗PDL1-SD15融合蛋白的情况下，在抗PDL1-SD15或抗PDL1抗体存在并且无其它活化的情况下培养PBMC。在第6天，收集细胞，并且通过流式细胞术评估CD8和粒酶B、CD8以及穿孔蛋白和CD4细胞的数目。
CD4和CD8细胞的活化：
使用RosetteSep富集试剂盒(StemCell technologies)从全血负分离CD4和CD8阳性细胞。在抗PDL1抗体存在的情况下在IMDM，10％FBS中通过抗CD3或抗CD3和PDL1Fc涂覆的珠粒活化CD4细胞。在第5天，收集上清液以通过ELISA进行IFNγ测量，并且使用流式细胞术评价细胞的增殖标志Ki67的表达。通过抗CD3涂覆的珠粒和IL15或抗PDL1-SD15融合蛋白活化CD8细胞。在一些情况下，用抗CD3和PDL1Fc替代抗CD3涂覆的珠粒。在第6或7天，收集上清液以通过ELISA测量IFNγ和TNFα的分泌。收集所述细胞以使用流式细胞术通过粒酶B和穿孔蛋白标志测量CD8的活化。
抗体-融合蛋白的命名法：
在利用抗PD-L1 IL15融合蛋白的实验中，在图例中确定了所述融合蛋白的更短的名称。融合蛋白tcclD7HC-SD15在图例中被鉴定为cD7-SD15。融合蛋白tcclF8HC-SD15在图例中被鉴定为F8-SD15。
针对来自噬菌体展示文库的PD-L1的特异性高亲和力抗体
使用噬菌体展示文库获得具有高亲和力的抗PD-L1抗体。在一种方法中，针对固定在免疫管上的重组人PDL1-Fc(PDL1 ECD和人Fc融合蛋白Q9NZQ7)或鼠PDL1-Fc(Q9EP73)淘选从Dyax文库扩增的噬菌体Fab，进行3轮。对来自第2轮(R2)和第3轮(R3)的ELISA阳性克隆进行测序。
在第二种方法中，针对重组人PDL1-Fc(PDL1 ECD和人Fc融合蛋白，Q9NZQ7)对从Dyax文库扩增的噬菌体Fab进行第一轮淘选，随后针对活化的T细胞对所述噬菌体Fab进行第2轮淘选。对于第3轮，将所述活化的T细胞或重组人PDL1-Fc用于淘选。对可结合于可溶性PDL1-Fc和细胞表达的PDL1-Fc的克隆进行测序。这些抗体的VH和VL可变结构域序列示于图13和表1的第1-26行中。
将独特的克隆转化成IgG以进一步表征。将可变结构域***Dyax表达载体pBh1。以IgG形式制备野生型CH1-CH2-CH3结构域和突变型CH1-CH2-CH3(L234A和L235A，在本文中也称为LALA突变体)。
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Figure BDA0000733532830000261
这些抗体经验证具有对PD-L1(通过固相ELISA(图1-4))和HEK-293细胞(图5)的特异性结合。在这些抗体存在的情况下PD-1：PD-L1相互作用的阻断通过固相ELISA和通过表达PD-L1的293-HEK细胞来确定。将Biacore用于计算每一种抗体的亲和力常数。
Figure BDA0000733532830000262
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Figure BDA0000733532830000272
还通过对未成熟单核细胞来源的树突状细胞(图6A)、表达人PD-L1的乳腺癌系MDA-MB-231细胞(图6B)、表达小鼠PD-L1的肿瘤系B16-F10细胞(图6C)以及活化的人CD4和CD8T细胞的结合，验证了这些抗体的在表达PD-L1的天然细胞上的结合。
功能活性抗PD-L1抗体阻断PD-1 PD-L1相互作用并且增加T细胞增殖和活化
评价高亲和结合抗PD-L1抗体的阻断PD-1 PD-L1相互作用和增加T细胞增殖的功能。在体外在抗PD-L1抗体存在的情况下用αCD3或αCD3和PD-L1Fc涂覆的珠粒活化负纯化的CD4T细胞。相较于仅用αCD3涂覆的珠粒刺激的CD4细胞，用αCD3和PD-L1Fc涂覆的珠粒刺激的CD4细胞显示较低的增殖以及IFNγ和IL-2分泌。相较于无抗体添加的培养物，向利用αCD3和PD-L1Fc涂覆的珠粒刺激的CD4培养物中添加功能活性抗PD-L1抗体增加CD4增殖(通过总的CD4数目或增殖标志Ki67的百分比测量)(图7A)。向CD4培养物中添加具有功能活性的阻断性抗PD-L1抗体以及αCD3和PD-L1Fc涂覆的珠粒也增加CD4的细胞因子分泌(通过上清液中积累的IFNγ和IL-2的ELISA测量)。
当在抗PD-L1阻断性抗体存在的情况下用超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激从全血分离的PBMC时，观察到细胞因子分泌的增加。收集与SEB培养48小时的PBMC(先前冷冻的)的上清液，并且通过ELISA测量IFNγ和IL-2。当与其中未添加抗体的对照相比较时，在几种抗PD-L1抗体的培养物中未观察到T细胞数目的增加，但观察到IFNγ和IL-2的水平的显著升高(图7B)。
此外，还在于抗PD-L1阻断性抗体存在的情况下培养的CD4T细胞和mo-DC的混合淋巴细胞反应(MLR)中观察到CD4增殖和活化的增加。当与其中未添加抗体的培养物相比较时几种抗PD-L1抗体在MLR中增加CD4的增殖(图7C)。这些抗体还增加IFNγ和IL-2的分泌，如通过ELISA评价的。
IL15增强抗PD-L1抗体在体外对T细胞增殖和活化的作用
当与仅具有抗PD-L1抗体的CD4和mo-DC的培养物相比较时，在抗PD-L1阻断性抗体和细胞因子IL15存在的情况下CD4T细胞和mo-DC的MLR导致CD4细胞增殖(图8A)、IFNγ和IL-2分泌的显著增加。在这些测定中以与抗PD-L1抗体等摩尔的浓度添加IL15。在更低的抗PD-L1抗体和IL15浓度(0.5nM，图8A)下，观察到一定的对CD4增殖协同作用。
来自利用aCD3和PD-L1Fc涂覆的珠粒刺激的全血的负纯化的CD8也以剂量依赖性方式响应IL15。将IL15添加至CD8与αCD3和PD-L1Fc涂覆盖的珠粒和抗PD-L1抗体的培养物中导致CD8增殖的极大增加(图8B)。
抗PD-L1-IL15融合蛋白将IL15靶向表达PD-L1的抗原呈递细胞并且增加响应CD8细胞的增殖和活化
通过将抗体的Fc结构域连接于IL15R的sushi结构域和IL15分子本身来构建抗PD-L1抗体和IL15融合蛋白。IL15Rα sushi结构域、IRD-11 exone3、接头与IL15的融合物(命名为“SD15”)被提供为SEQ ID NO：261。将SD15附接至常规IgG的重链c-末端。将具有IL15Rαsushi结构域、IRD-11 exone3、接头和IL15的融合蛋白附接至tccλD7可变结构域和IgG1CH1-CH2-CH3可变结构域的重链c末端(SEQ ID NO：262)。所述构建体还在IgG1重链的末端上包含K至S的替代(1)以消除“G-K”切割的可能性；(2)以将克隆位点(BamHI)添加至载体。
所述轻链是常规抗体的轻链。将所述轻链和具有或不具有LALA突变体的融合重链都***Dyax pBh1载体以进行表达。
该融合分子被命名为抗PD-L1-sushi结构域-IL15或抗PD-L1-SD15。还构建了其中IL15连接于Fc而非sushi结构域的融合蛋白的不同形式，并且由于该融合蛋白不具有IL15功能活性，因此我们将该蛋白在一些测定中用作阴性对照(称为抗PD-L1-SD15neg)。
当在固相PD-L1Fc结合ELISA测定中将抗PD-L1-SD15融合蛋白的结合与抗PD-L1抗体相比较时，未观察到显著变化(图9A)。当将抗PD-L1-SD15蛋白的结合与它们各自的原始抗PD-L1抗体相比较时，观察到对表达PD-L1的活化的CD4细胞的结合亲和力的一定变化(图9B)。当与它们各自的抗PD-L1抗体相比较时，抗PD-L1-SD15蛋白具有较低的对表达PD-L1的细胞的亲和力；尽管可能存在第二抗体与细胞表面上的结合的抗PD-L1-SD15与结合的抗PD-L1的结合的差异。
为了评价抗PD-L1-SD15融合蛋白的IL15的功能，在抗PD-L1-SD15融合蛋白或IL15的存在的情况下培养从全血分离的PBMC。不向培养物添加其它刺激。与IL15类似地，抗PD-L1-SD15融合蛋白增加NK细胞数目(图10A)、增加CD8增殖(图10B)和活化(通过粒酶B阳性CD8的百分比测量，图10C)。对于所有培养物未观察到CD4数目的显著增加(图10D)。
为了评估抗PD-L1-SD15对CD8的活性，在αCD3或αCD3和PDL1Fc涂覆的珠粒存在的情况下将这些融合蛋白添加至CD8培养物中。当PDL1Fc存在于抗原呈递细胞(在该情况下αCD3和PDL1Fc涂覆的珠粒)上时，抗PD-L1-SD15显著增加CD8的增殖(图11A，无PD-L1Fc相对图11B，在珠粒上具有PD-L1Fc)。此外，还观察到CD8的活化的显著增加。cD7-SD15降低活化CD8所需的有效剂量，如通过粒酶B阳性CD8细胞的百分比的增加(图12A)和IFNγ分泌增加约10倍(图12B)测量的。当与IL15相比较时，cD7-SD15还升高CD8的活化的最大水平(图12A和B)。当与抗PD-L1抗体+游离IL15的添加相比较时，抗PD-L1-SD15融会蛋白使CD8增殖升高至比单独添加的组合更高的水平(图12C)。抗PD-L1-SD15融合蛋白的这些性质在免疫疗法的背景中将是有益的，因为可将更低剂量的抗PD-L1-SD15融合蛋白用于实现更高水平的CD8活化和增殖。在其中抗原呈递细胞表达PD-L1的情况下CD8对抗PD-L1-SD15融合蛋白的高度放大的反应在实现选择性CD8的活化方面将是有利的。
抗PD-L1-IL15融合蛋白细胞毒性
为了确定抗PD-L1-SD15融合蛋白将是否增强IL15诱导的CD8 T细胞对表达PD-L1的肿瘤细胞的细胞毒性，在测量肿瘤细胞死亡之前，在抗PD-L1-SD15融合蛋白或抗KLH-SD15存在的情况下将CD8T细胞与表达人PD-L1的MAD-MB-231肿瘤细胞共培养7天，所述抗PD-L1-SD15融合蛋白或抗KLH-SD15不具有与表达PD-L1的肿瘤细胞的结合活性。将人CD8T细胞和肿瘤细胞在补充有10％FBS的IMDM中共培养7天。通过在FACS中测量利用ViabilityDye eFluor 780染色的死亡肿瘤细胞的数目来评估肿瘤细胞杀伤活性。相较于在共培养中利用抗KLH-SD15的处理，抗PD-L1-SD15融合蛋白显著增强CD8T细胞介导的MDA-MB-231的细胞毒性(图15)。此外，相较于用媒介物或PD-L1-SD15融合蛋白sD7-SD15(其不具有与鼠PD-L1的结合活性)处理的小鼠，PD-L1-SD15融合蛋白cD7-SD15在静脉内注射鼠CT26结肠肿瘤细胞的小鼠的肿瘤模型中显著增加具有表达PD-L1的肿瘤细胞的小鼠的存活率(图16)。这些结果表明通过双功能抗PD-L1-SD15融合蛋白将IL15刺激的免疫效应细胞靶向过表达PD-L1的肿瘤部位具有增强抗肿瘤免疫同时使副作用降至最低的有利方面。这种类型的双功能抗体细胞因子融合蛋白具有作为在肿瘤进展的控制中实现更大的抗肿瘤功效的新型免疫调节治疗剂的潜能。
亲和力成熟
通过在CDR-1H的3个甲硫氨酸位置上引入氨基酸取代，并且筛选增强的亲和力来产生tccλD7重链的变体。更具体地，产生其中同时改变第一、第二和第四甲硫氨酸位置的含有约1x108个tccλD7的CDRH1的变体的文库。针对固定在免疫管上的重组人PDL1-Fc(PDL1ECD和人Fc融合蛋白，Q9NZQ7)或鼠PDL1-Fc(Q9EP73)淘选文库，进行4轮。对来自第3和4轮的ELISA阳性克隆进行测序。通过竞争ELISA比较独特的克隆。表4显示在获自筛选的25个变体中观察到的氨基酸取代，以SEQ ID NO表示亲和力成熟的CDR-1H序列和含有所述CDR的重链可变区。这些变体的氨基酸序列也列出如表1中指示的序列表。
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如本文中其它地方所描述的，将两个变体tccD7_#114和tccD7_#102(在本文中也分别被称为tccD7_#1和tccD7_#2)转化成IgG以及还转化成在铰链区中含有2个Leu-Ala取代的IgG形式以减小ADCC。表达并纯化所述抗体以供进行进一步表征。对于两个亲和力成熟的变体，增强的与可溶性PDL1的结合示于图17中。图18显示2个变体阻断人PD1与人PDL1的结合(左图)以及阻断小鼠PD1与小鼠PDL1的结合(右图)。所述变体还显示相较于亲代更高的与MDA-MB-231细胞的结合活性(图19)。
测试亲和力成熟的变体的促进Th1细胞因子IL2和IFNγ的产生的能力。在抗PD-L1抗体存在的情况下，利用超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB，0.1ug/mL)刺激从全血分离的PBMC。收集与SEB培养7天的PBMC的上清液，并且通过ELISA测量IFNγ和IL-2。当与cD7相比较时，在具有抗PD-L1抗体cD7#1和#2的变体的培养物中观察到IFNγ和IL-2的水平的显著升高(图20)。
构建几种包含PD-L1结合结构域、IL15R α sushi结构域和IL15的融合蛋白变体。某些构建体在IL15R α sushi结构域与IL15部分之间包含接头。在一个构建体中，用具有不同长度的“GS”接头替代存在于IL15受体αsushi结构域的c末端中的外显子3的11个氨基酸。GS接头分别在具有SEQ ID NO：325、315、317、319、321和323的构建体中含SGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO：324；18个氨基酸)、SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ(SEQ ID NO：314；20个氨基酸)、SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO：316；25个氨基酸)、SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO：318；30个氨基酸)、SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO：320；40个氨基酸)和SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO：322；50个氨基酸)。
在HEK293细胞中瞬时或稳定地表达融合蛋白，并且按照制造商说明书通过蛋白A柱层析纯化所述融合蛋白。在某些实施方案中，为了稳定分子的抗PD-L1部分的Ig重链与轻链恒定结构域之间的缔合，缺失λ轻链的C末端丝氨酸，在本文中通过名称“ds”来提及。
通过流式细胞术测试含有具有sushi结构域的tccλD7亲和力成熟的变体#102和IL15(SEQ ID NO：325)的融合蛋白的与MDA-MB-231的结合。所有融合蛋白都显示相较于含有tccλD7的融合蛋白增强的结合(图21)。含有tccλD7亲和力成熟的变体#102的融合蛋白也经确认对IL15-应答性人成巨核细胞白血病细胞具有刺激活性。将细胞与抗PD-L1-SD15融合蛋白在补充有10％FBS和20％人膀胱癌5637细胞的条件培养基的RPMI 1640中培养48小时。利用
Figure BDA0000733532830000341
Luminescent细胞活力测定将细胞增殖测量为相对发光单位(RLU)(图22)。
利用尺寸排阻层析的分析显示表达的融合蛋白的少于5％的聚集(图24)和改善的血清稳定性(图25)。
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Claims (17)

1.一种融合蛋白，其包含
(i) 包含PD-L1抗体或其抗原结合片段的第一结构域，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO: 121中所示的重链CDR-1H、SEQ ID NO: 123中所示的重链CDR-2H和SEQID NO: 125中所示的重链CDR-3H以及SEQ ID NO: 127中所示的轻链CDR-1L、SEQ ID NO:128中所示的轻链CDR-2L和SEQ ID NO: 129中所示的轻链CDR-3L，
(ii) 结合IL-15受体(“IL-15R”)的第二结构域，其中所述第二结构域包含IL-15，或与IL-15具有至少95%的同一性的氨基酸序列，或其IL-15R结合片段，和
(iii) IL15受体α sushi结构域。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其包含SEQ ID NO：315、SEQ ID NO：317、SEQ IDNO：319、SEQ ID NO：321、SEQ ID NO：323或SEQ ID NO:261。
3.一种根据权利要求1至2中任一项所述的融合蛋白的缀合物，其还包含成像剂、治疗剂或细胞毒性剂。
4.一种分离的核酸序列，其编码根据权利要求1至2中任一项所述的PD-L1抗体可变结构域或其抗原结合片段。
5.一种核酸载体，其包含根据权利要求4所述的核酸。
6.一种原核或真核宿主细胞，其包含根据权利要求4所述的核酸。
7.一种组合物，其包含根据权利要求1至2中任一项所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。
8.根据权利要求1至2中任一项所述的融合蛋白在制备用于在受试者中抑制PD1与PD-L1的相互作用的药物中的用途。
9.根据权利要求1至2中任一项所述的融合蛋白在制备用于在受试者中抑制由PD-L1介导的免疫抑制的药物中的用途。
10.根据权利要求1至2中任一项所述的融合蛋白在制备用于刺激针对表达PD-L1的细胞的免疫应答的药物中的用途。
11.根据权利要求9或10所述的用途，其中表达PD-L1的所述细胞是肿瘤细胞。
12.根据权利要求9或10所述的用途，其中表达PD-L1的所述细胞被病毒感染。
13.根据权利要求1所述的融合蛋白，其进一步包含将IL-15Rα的sushi结构域与IL-15或IL-15R结合片段连接的柔性接头。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述柔性接头包含15-20个氨基酸，其主要是丝氨酸和甘氨酸。
15.根据权利要求1所述的融合蛋白，其包含SEQ ID NO: 261。
16.根据权利要求1、2、13或14中任一项所述的融合蛋白，其中PD-L1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO: 126中所示的重链可变结构域和/或SEQ ID NO: 130中所示的轻链可变结构域。
17.根据权利要求1、2或13-16中任一项所述的融合蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
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