CN105198997A - Cd37免疫治疗剂及其与双功能化学治疗剂的联合 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了用于治疗或预防B细胞相关的自身免疫、炎症或过度增殖性疾病的人源化抗CD37小模块化免疫药物(SMIP)分子以及可以同时给药或相继给药的CD37特异性结合分子(例如抗CD37SMIP蛋白或抗体)与双功能化学治疗剂(例如苯达莫司汀)的协同联合治疗。

Description

CD37免疫治疗剂及其与双功能化学治疗剂的联合
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2008年4月11日提交的美国临时专利申请第61/190,067号的权益，其中该临时申请通过引用的方式以其整体并入本文。
关于序列表的声明
以文本格式代替纸质版本提供了本申请相关的序列表，并且该序列表在此通过引用并入本说明书。含有本序列表的文本文件的名称是910180_420PC_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为286KB，于2009年4月10日创建，并且通过EFS-Web电子提交，其与本书明书的提交是同时的。
背景
技术领域
本公开内容一般地提供了用于治疗B细胞病症的组合物和方法，并且更具体地，提供了用于治疗或预防B细胞相关的自身免疫、炎症或过度增殖性疾病的人源化抗CD37小模块化免疫药物(SMIP)分子以及CD37特异性结合分子与双功能化学治疗剂的协同联合治疗。
相关领域描述
人免疫***通常保护机体免受外源物质和病原体侵袭。免疫***的一个组分是B淋巴细胞，也称为B细胞，其产生抗体，所述抗体通过与外源物质或病原体结合并且在某些情况下介导外源物质或病原体的破坏来保护机体。但是，在某些情况下，免疫***功能可能出错并引起疾病。例如，存在很多涉及B细胞不受控制的增殖的癌症、自身免疫性疾病和炎症疾病。
B细胞可以通过其细胞表面上的分子例如CD37进行鉴定。CD37是大量糖基化的40-52kDa蛋白，属于四次跨膜蛋白的细胞表面抗原家族，其在正常产生抗体的B细胞上高表达，但不在前B细胞或浆细胞上表达。除正常B细胞以外，几乎所有B细胞来源的恶性肿瘤的CD37表达也都是阳性的，包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多毛细胞性白血病(Mooreetal.,J.Pathol.152:13(1987)；Merson和Brochier,Immunol.Lett.19:269(1988)；以及Faureetal.,Am.J.Dermatopathol.12:122(1990))。
已经开发出一些CD37特异性免疫疗法。特异性针对CD37的IgG1鼠源性单克隆抗体MB-1用131I进行标记并在在治疗NHL的临床试验中测试(参见，Pressetal.,J.Clin.Oncol.7:1027(1989)；Bernsteinetal.,CancerRes.(Suppl.)50:1017(1990)；Pressetal.,Front.Radiat.Ther.Oncol.24:204(1990)；Pressetal.,Adv.Exp.Med.Biol.303:91(1991)和Brownetal.,Nucl.Med.Biol.24:657(1997))。MB-1抗体缺乏Fc效应功能，例如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)，以及在体内异种移植物模型中，裸露的MB-1抗体不抑制肿瘤生长(Buchsbaumetal.,CancerRes.52:6476(1992))。此外，具有连接到另一鼠源性单克隆抗CD37，G28-1的阿霉素的免疫偶联物(immunoconjugate)被给予小鼠并且表现出被内化，阿霉素细胞内在细胞内被释放(参见，Braslawskyetal.,CancerImmunol.Immunother.33:367(1991))。目前，在人体中测试了针对CD37的经改造的融合蛋白，其被称为小模块化免疫药物(SMIPTM)产品(参见，例如美国专利申请公布第2003/0133939号和第2007/0059306号)。
尽管对基于抗体的治疗已经进行了大量的研究，但本领域仍需要用于治疗B细胞相关病症或疾病的可选的或改进的组合物和方法。
概述
在一方面中，本公开内容提供了人源化CD37特异性结合分子和减少B细胞或治疗与异常B细胞活性相关的疾病的方法，所述方法包括给予个体有效量的本文提供的人源化CD37特异性结合分子，所述个体需要减少B细胞或治疗与异常B细胞活性相关的疾病。
在某些实施方案中，本公开内容提供了人源化CD37特异性结合分子，其从氨基末端到羧基末端包含：(i)人源化重链可变区、(ii)如SEQIDNO:229所示的连接子、(iii)人源化轻链可变区、(iv)IgG1铰链、(v)人IgG1CH2区和(vi)人IgG1CH3区，其中(a)人源化重链可变区从氨基末端到羧基末端包含：人源化重链FR1、如SEQIDNO:63所示的重链CDR1、人源化重链FR2、如SEQIDNO:65所示的重链CDR2、人源化重链FR3、如SEQIDNO:67、68或69所示的重链CDR3和人源化重链FR4，并且(b)人源化轻链可变区从氨基末端到羧基末端包含：人源化轻链FR1、如SEQIDNO:61或62所示的轻链CDR1、人源化轻链FR2、如SEQIDNO:64所示的轻链CDR2、人源化轻链FR3和如SEQIDNO:66所示的轻链CDR3，以及人源化轻链FR4。
在上述人源化CD37特异性结合分子的某些实施方案中，人源化重链FR1包含SEQIDNO:144，人源化重链FR2包含SEQIDNO:151，重链FR3包含SEQIDNO:158以及重链FR4包含SEQIDNO:161或162。
在上述人源化CD37特异性结合分子的任何一个的某些实施方案中，人源化轻链FR1包含SEQIDNO:171，轻链FR2包含SEQIDNO:182，轻链FR3包含SEQIDNO:195以及轻链FR4包含SEQIDNO:206。
在相关方面中，本公开内容提供了包含如SEQIDNO:253所示的氨基酸序列的CD37特异性结合分子。
在某些实施方案中，CD37特异性结合分子基本上由如SEQIDNO:253所示的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，CD37特异性结合分子由如SEQIDNO:253所示的氨基酸序列组成。
在相关方面中，本公开内容还提供了包含编码本文提供的人源化CD37特异性结合分子的核苷酸序列的分离的核酸分子。
在另一相关方面中，本公开内容提供包含编码本文提供的人源化CD37特异性结合分子的分离的核酸分子的载体。
在另一相关方面中，本公开内容提供包含上述载体的宿主细胞。
本公开内容还提供包含本文提供的人源化CD37特异性结合分子和药学上可接受的载体的组合物。
在另一方面中，本公开内容提供了用于减少B细胞或治疗与异常B细胞活性相关的疾病的方法，所述方法包括给予个体有效量的本文提供的人源化CD37特异性结合分子，所述个体需要减少B细胞或治疗与异常B细胞活性相关的疾病。
在某些实施方案中，与异常B细胞活性相关的疾病是B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、B细胞骨髓瘤、特征为自身抗体产生的疾病或特征为与B细胞途径相关的不适当T细胞激活的疾病。
在某些实施方案中，特征为自身抗体产生的疾病是特发性炎症性肌病、类风湿性关节炎、重症肌无力、格雷夫斯氏病(Grave’sdisease)、I型糖尿病、多发性硬化、自身免疫性疾病、皮肌炎、多肌炎或Waldenstrom巨球蛋白血症。
在某些实施方案中，与异常B细胞活性相关的疾病是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
在另一方面中，本公开内容提供了用于CD37特异性结合分子和双功能化学治疗剂的联合使用以减少B细胞或治疗与异常B细胞活性相关的疾病的组合物和方法。该组合的令人意想不到的结果是这些化合物协同作用，这导致了增加的B细胞减少。
例如，本公开内容提供了包含CD37特异性结合分子和苯达莫司汀(bendamustine)的组合物。
在某些实施方案中，CD37特异性结合分子是CD37特异性抗体或SMIP，例如人源化抗体或人源化SMIP。
在某些实施方案中，CD37特异性结合分子在CD37特异性结合中与G28-1mAb竞争。
在某些实施方案中，CD37特异性结合分子是本文提供的人源化CD37特异性结合分子，例如包含SEQIDNO:253所示的氨基酸序列的、基本上由SEQIDNO:253所示的氨基酸序列组成的或由SEQIDNO:253所示的氨基酸序列组成的人源化CD37特异性结合分子。
在相关方面中，本公开内容提供了减少B细胞或治疗与异常B细胞活性相关的疾病的方法，所述方法包括给予个体有效量的CD37特异性结合分子和苯达莫司汀，所述个体需要减少B细胞或治疗与异常B细胞活性相关的疾病。
在某些实施方案中，与异常B细胞活性相关的疾病是B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、B细胞骨髓瘤、特征为自身抗体产生的疾病或特征为与B细胞途径相关的不适当的T细胞激活的疾病。
在某些其他实施方案中，特征为自身抗体产生的疾病是特发性炎症性肌病、风湿性关节炎、重症肌无力、格雷夫斯氏病病、I型糖尿病、多发性硬化、自身免疫性疾病、皮肌炎、多肌炎或Waldenstrom巨球蛋白血症。
在某些其他实施方案中，与异常B细胞活性相关的疾病是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
在某些实施方案中，CD37特异性结合分子和苯达莫司汀是同时给药。
在某些其他实施方案中，CD37特异性结合分子和苯达莫司汀是相继给药。
在某些实施方案中，CD37特异性结合分子和苯达莫司汀一起配制。
在某些实施方案中，CD37特异性结合分子是CD37特异性抗体或SMIP，例如人源化抗体或人源化SMIP。
在某些实施方案中，CD37特异性结合分子在CD37特异性结合中与G28-1mAb竞争。
在某些实施方案中，CD37特异性结合分子是本文提供的人源化CD37特异性结合分子，例如包含SEQIDNO:253所示的氨基酸序列的、基本上由SEQIDNO:253所示的氨基酸序列组成的或由SEQIDNO:253所示的氨基酸序列组成的人源化CD37特异性结合分子。
附图简要说明
图1显示小鼠G28.1和CAS-024序列的重和轻链可变区氨基酸序列比对，以及共有的同一性序列。
图2A-2D显示CAS-001、CAS-002、CAS-003和CAS-024的尺寸排阻色谱法(SEC)色谱图。目的峰(POI)具有98-99％的被纯化的SMIP分子。CAS-024具有非常尖锐的并且对称的峰(表明同质性)，而CAS-001、CAS-002和CAS-003的峰具有缓的肩部(通过积分运算，肩部占有约35％的POI)，这表明异质的分子群体。
图3是显示多种抗CD37特异性SMIP蛋白如何与母体CAS-006分子(嵌合抗CD37SMIP蛋白，mVLmVH)竞争结合Ramos细胞上的CD37的图，其提供与母体分子相比的结合的亲和力的指示。CAS-024(hVHhVL)与CAS-006具有基本相同的对于CD37的亲和力，然而其他分子(CAS-001、CAS-002和CAS-003，都是hVLhVH)的亲和力降低2至4倍。
图4A和4B是相对于CAS-006(在这些图中标为SMIP-016)的另外的结合竞争检测的图。这里，小鼠-人杂交SMIP分子(CAS-014mVHhVL和CAS-017hVLmVH)具有高于CAS-006的亲和力，然而CAS-024显示出与CAS-006相同的结合亲和力并且CAS-003(hVLhVH)具有更低的结合亲和力。
图5A-5E显示出多种不同抗CD37抗体和CAS-006(嵌合的抗CD37SMIP分子)之间的竞争性结合。
图6A和6B显示在滤泡性淋巴瘤的动物模型的体内治疗中，CAS-024在统计学上优于利妥昔单抗()，正如通过(A)存活率和(B)无肿瘤百分比所示出。
图7显示出CAS-024与化学治疗剂氟达拉滨(fludarabine)和长春新碱协同作用杀死套细胞淋巴瘤(MCL)细胞Rec-1细胞。
图8是显示用本公开内容的抗CD37SMIP分子治疗的人患者外周血淋巴细胞的消减水平的柱形图。
图9显示出淋巴细胞消减和患者BJB的治疗进程。在第一周期中，在第一周的第1天、第3天和第5天以3.0mg/kg治疗BJB(队列7的部分)，然后是3次每周一次的给药；并且在第二周期中给予相同的治疗。患者BJB表现出淋巴细胞的显著减少(48小时内)，到第4天表现出可触***的减少，并持续响应于治疗。
图10显示出淋巴细胞消减和患者GRP的治疗进程。以每周一次的1.0mg/kg持续4周治疗GRP(队列4的部分)作为第一周期；然后在两个月后，第二周期中以相同方式进行治疗。患者GRP表现出淋巴细胞显著减少(2周内)，***大小通过CT扫描表现出36％的降低、脾体积降低、血红蛋白水平升高，并且持续响应于治疗。
图11显示出CAS-024和苯达莫司汀对Rec-1细胞生长的抑制作用的联合指数(CI)图。
图12显示出单独的苯丁酸氮芥(chlorambucil)和与CAS-024联合的苯丁酸氮芥对SU-DHL-6细胞生长的抑制作用。
图13显示出CAS-024和苯丁酸氮芥对SU-DHL-6细胞生长的抑制作用的联合指数图。
图14A显示出荷瘤小鼠中肿瘤体积的比较，所述荷瘤小鼠由注射DOHH2细胞导致并随后用huIgG(人IgG，R&DSystems)、CAS-024、苯达莫司汀以及CAS-024与苯达莫司汀的组合治疗。图14B显示出第13天相对于第0天的个体小鼠的肿瘤体积。
图15显示出荷瘤小鼠随时间变化的平均肿瘤体积，所述荷瘤小鼠由注射DOHH2细胞导致并随后用huIgG、CAS-024、苯达莫司汀以及CAS-024与苯达莫司汀的组合治疗。值为每个测量日的平均值±平均值标准误差。对每组内一只或多只小鼠实施安乐死后，结束该组的曲线。
图16显示出荷瘤小鼠随时间变化的存活百分比，所述荷瘤小鼠由注射DOHH2细胞导致并随后用huIgG、CAS-024、苯达莫司汀以及CAS-024与苯达莫司汀的组合治疗。
图17显示出用huIgG、CAS-024、苯达莫司汀以及CAS-024与苯达莫司汀的组合治疗后，无肿瘤小鼠随时间变化的发生率。
详细描述
在一方面，本公开内容提供了CD37特异性结合分子CAS-024(SEQIDNO:253)，其是人源化形式的CAS-006(具有来自小鼠抗人CD37单克隆抗体G28-1的免疫球蛋白可变区的小模块化免疫药物(SMIP)蛋白)。出乎意料地，CAS-024SMIP蛋白(1)以高于其他人源化形式的CAS-006(例如CAS-002，CAS-003；参见实施例2和5)高达约25倍的水平表达，(2)能够结合CD37以及CAS-006，而其他人源化形式则不能(参见实施例4和5)，以及(3)与其他人源化形式的异质性相比，是以同质的分子群体产生(参见实施例3)。此外，本公开内容提供CD37特异性结合分子CAS-024(SEQIDNO:253)用于减少B细胞或治疗与异常B细胞活性相关的疾病的方法，所述方法包括给予个体有效量的本文提供的CAS-024，所述个体需要减少B细胞或治疗与异常B细胞活性相关的疾病。
在另一方面，本公开内容提供了用于任何CD37特异性结合分子和双功能化学治疗剂(例如苯达莫司汀)的联合使用以减少B细胞或治疗与异常B细胞活性相关的疾病的组合物和方法。该组合出人意料的结果是，化合物的这种联合协同作用并产生了本质上更有效的治疗方案。
更详细地阐明本公开内容之前，提供本文使用的某些术语的定义对于本公开内容的理解是有帮助的。其他定义在本公开内容各处阐明。
在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括所列举的范围中的任何整数的值，以及如果适当，包括其分数(例如整数的1/10和1/100)，除非另作说明。此外，除非另作说明，本文列举的涉及任何物理特征例如聚合物亚基、大小或厚度的任何数值范围应理解为包括所列举的范围中的任何整数。如本文使用，“约”或“基本上由···组成”表示所指出的范围、值或结构的±20％，除非另作说明。应当理解，如本文使用的术语“a”和“an"”是指“一个或多个”所列举的组分。可选的使用(例如“或”)应理解为表示供替代的选择中的一个、两者或其任何组合。如本文使用，术语“包括(include)”和“包含(comprise)”是同义使用的。此外，应当理解，本文所述的源自结构和取代基的不同组合的个体化合物或化合物组被本申请公开的程度如同每个化合物或化合物组被单独地展示的程度。因此，特定结构或特定取代基的选择在本公开内容的范围内。
按照本公开内容，“结合结构域”或“结合区”可以是，例如具有以下能力的任何蛋白、多肽、寡肽或肽：特异性地识别和结合生物分子(例如CD37)或多于一个的相同或不同分子的复合物或组装体(assembly)或聚集体(aggregate)，无论是稳定的或瞬时的。结合区包括任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的生物分子或其他目的靶标的结合伴侣。已知有多种用于鉴定特异性地结合特定靶标的本公开内容的结合结构域的检测，包括Western印迹、ELISA或Biacore分析。
本公开内容的结合结构域及其融合蛋白能够结合至所需的程度，包括“特异性地或选择地结合”靶标，而不显著结合测试样品中存在的其他组分，如果它们以例如大于或等于约105M-1、106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1的亲和力或Ka(即特定结合相互作用的平衡结合常数，单位为1/M)结合靶分子。“高亲和力”结合结构域是指具有至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更高的Ka的那些结合结构域。“低亲和力”结合结构域是指具有高达5×107M-1、高达107M-1，高达106M-1，高达105M-1或更低的Ka的那些结合结构域。可选地，亲和力可以定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)，单位为M(例如10-5M至10-13M)。按照本公开内容，结合结构域多肽和融合蛋白的亲和力可以使用常规技术容易地确定(参见，例如Scatchardetal.(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；和美国专利第5,283,173号、第5,468,614号，或等同的)。
术语“CD37特异性结合分子”是指以至少约106M-1(例如至少约107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1)的Ka特异性地结合CD37的蛋白、多肽、寡肽或肽。
术语“CD37特异性结合结构域”是指CD37特异性结合分子的部分或结构域，所述部分或结构域负责该分子的特异性CD37结合。CD37特异性结合结构域自身(即没有CD37特异性结合分子的任何其他部分)以至少约106M-1(例如至少约107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1)的Ka结合CD37。CD37特异性结合结构域自身可以足以作为CD37特异性结合分子。示例性的CD37特异性结合结构域包括CD37特异性scFv和Fab片段，其可以来自例如单克隆抗体G28-1的抗CD37抗体。
本领域技术人员所理解的关于抗体技术的术语每个都按照该领域内获得的含义，除非本文特别限定。例如，术语“VL”和“VH”分别指来自抗体轻和重链的可变结合区。可变结合区是由称为“互补决定区“(CDR)和“框架区”(FR)的分离的、明确界定的亚区所组成。术语“CL”和“CH”是指“免疫球蛋白恒定区”，即分别来自抗体轻和重链的恒定区，重链恒定区被理解为进一步分为CH1、CH2、CH3和CH4恒定区结构域，这取决于该区所源自的抗体同种型(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)。部分的恒定区结构域组成Fc区(“可结晶段”区)，其含有负责诸如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)、CDC(补体依赖性细胞毒性)和补体结合的免疫球蛋白的效应功能、结合Fc受体、相对于缺乏Fc区的多肽有更长的体内半衰期、蛋白A结合以及甚至可能胎盘转移(参见Caponetal.,Nature,337:525(1989))的结构域。此外，含有Fc区的多肽允许多肽的二聚化和多聚化。
“铰链区”是在融合蛋白中***CD37特异性结合结构域和另一区(例如CH2区)之间并连接它们的氨基酸序列，以致所述融合蛋白仍能够特异性结合CD37(即以至少约106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1的Ka)。在某些实施方案中，铰链区是免疫球蛋白铰链区。
“免疫球蛋白铰链区”是指野生型免疫球蛋白铰链区或改变的野生型免疫球蛋白铰链区。
按照晶体学研究，免疫球蛋白铰链区可以在功能上进一步再分为三个区：上游铰链区、核心区和下游铰链区。上游铰链区包括从CH1的羧基末端至铰链中限制运动的第一个残基的氨基酸，所述第一个残基通常是在两条重链之间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基。上游铰链区的长度与抗体的节段柔性有关。核心铰链区含有重链间二硫桥，以及下游铰链区连接CH2结构域的氨基末端并且包括CH2中的残基。同上。人IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys(SEQIDNO:264)，当通过二硫键形成而成为二聚体时，该序列形成被认为作为轴的环状八肽，从而提供柔性。
如本文使用的“野生型免疫球蛋白铰链区”是指天然存在的***抗体单链的CH1和CH2区之间并连接CH1和CH2区的氨基酸序列。它含有上游铰链区、核心铰链区和非CH2区的部分的下游铰链区的部分。示例性的野生型免疫球蛋白铰链区是如SEQIDNO:90所示的人IgG1铰链区，其中从它的氨基末端至它的羧基末端，前10个氨基酸(EPKSCDKTHT，SEQIDNO:263)形成上游铰链区，接下去的4个氨基酸(CPPC，SEQIDNO:264)形成核心铰链区并且最后的氨基酸(即脯氨酸)是下游铰链区中的第一个氨基酸并且不是CH2的部分。
“改变的野生型免疫球蛋白铰链区”或“改变的免疫球蛋白铰链区”是指(a)具有多达30％的氨基酸改变的野生型免疫球蛋白铰链区(例如多达25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)，(b)长度至少为10个氨基酸(例如至少12、13、14或15个氨基酸)的野生型免疫球蛋白铰链区的部分，具有多达30％的氨基酸改变(例如多达25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)，或(c)包含核心铰链区的野生型免疫球蛋白铰链区的部分(其长度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。当改变的野生型免疫球蛋白铰链区被***融合蛋白中CD37特异性结合结构域和另一区(例如CH2区)之间并连接它们时，它允许所述融合蛋白特异性地结合CD37(即具有至少约106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1的Ka)。在某些实施方案中，野生型免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基可以被一个或多个其他氨基酸残基(例如一个或多个丝氨酸残基)所取代。改变的免疫球蛋白铰链区可以可选地或另外地使野生型免疫球蛋白铰链区的脯氨酸残基被另一氨基酸残基(例如丝氨酸残基)所取代。
“连接子(linker)”是指将重链可变区和轻链可变区连接在一起并提供与两个亚结合结构域的相互作用相容的间隔子功能的氨基酸序列，这样使得到的多肽能够特异性结合CD37。
如本文使用“衍生物(derivative)”是指化合物的以化学或生物方式修饰的形式，其在结构上与母体化合物相似并且(实际上或理论上)可以从母体化合物获得。通常，“衍生物”与“类似物(analogue)”的不同在于，母体化合物可以是生成“衍生物”的起始原料，然而母体化合物不必用作生成“类似物”的起始原料。衍生物可以具有不同于母体化合物的化学或物理性质。例如，与母体化合物或序列相比，衍生物可以是更亲水的或其可以是具有改变的反应性的突变的序列(例如具有氨基酸改变的CDR，所述氨基酸改变改变其对于靶标的亲和力)。
“B细胞相关的病症或疾病”是指异常的B细胞活性或偏离正常的、合适的或预期的进程的活性。例如，B细胞相关的病症或疾病可以包括具有受损的或缺陷的DNA或其他细胞组分的细胞的不适当增殖。异常的B细胞活性可以包括特征在于不适当高水平的细胞***、不适当低水平的凋亡或两者的细胞增殖。这些疾病可以具有例如细胞、细胞群或组织的单一或多重局部异常增殖，无论癌性或非癌性，良性的或恶性的。B细胞相关的病症或疾病还可以包括异常的抗体产生，例如自身抗体的产生或更希望以正常水平产生的抗体的过度产生。本文还考虑到异常的B细胞活性可以发生在B细胞的某些亚群中并不发生在其他亚群中，或可以包括T细胞的不适当的激活，例如通过将不适当的抗原呈递给T细胞或通过其他B细胞途径。
“治疗(Treatment)”或“治疗(treating)”是指治疗性(therapeutic)治疗或预防性(prophylactic/preventative)治疗。治疗性治疗可以改善接受治疗的个体的至少一个疾病症状或可以延缓个体进行性疾病的恶化，或预防其他相关疾病的发作。
特异性结合分子或化合物的“治疗有效量(或剂量)”或“有效量(或剂量)”是指足以引起正被治疗的疾病的一个或多个症状的改善的化合物的量。当用于单独活性成分，单独给药时，治疗有效剂量是指单独的该成分。当用于组合时，治疗有效剂量是指引起治疗效果的活性成分的组合量，无论是连续给药或同时给药。本发明特别考虑到，一个或多个特异性结合分子可以按照本发明的方法进行给药，每个都以有效剂量。
“具有或疑似具有与异常B细胞活性相关的疾病的个体”是个体，所述个体中的疾病或病症症状可以由异常的B细胞活性或B细胞增殖所导致，可以通过异常的B细胞活性而恶化，或可以通过B细胞活性的调节而减轻。这些疾病的实例是B细胞恶性肿瘤或B细胞癌(例如B细胞淋巴瘤、B细胞白血病或B细胞骨髓瘤)、以自身抗体产生为特征的疾病或以由不适当的B细胞抗原呈递给T细胞所导致或由其他涉及B细胞的途径所导致的不适当的T细胞刺激为特征的疾病。
其他定义提供在本公开内容的以下详细描述中。
人源化CD37特异性结合分子
在一方面中，本公开内容提供人源化CD37特异性结合分子。这些分子可以是含有人源化CD37特异性结合结构域的任何形式，包括人源化抗CD37抗体、人源化抗CD37抗体的Fab片段、人源化CD37特异性单链Fv(scFv)、人源化CD37特异性SMIP蛋白、人源化CD37特异性PIMS蛋白(在反方向包含SMIP组分的融合蛋白)、人源化CD37特异性SCORPION蛋白和包含至少一个人源化CD37特异性结合结构域的其他双特异性或多特异性结合蛋白。SMIP蛋白和制备SMIP蛋白的方法的详细描述可以见于，例如美国专利公布第2003/0133939号、第2003/0118592号和第2005/0136049号以及WO2005017148。制备PIMS蛋白的构建体和方法描述于美国申请第12/168,875号中。制备SCORPION蛋白的方法可以见于，例如PCT申请公布第WO2007/146968号。其他示例性的多功能融合蛋白可以见于，例如美国专利申请公布第2006/0051844号和美国专利第7,166,707号。某些双特异性或多特异性结合蛋白可以包含CD37特异性scFv和一个或多个不是源自免疫球蛋白的其他结合结构域。
人源化CD37特异性结合结构域
示例性的“人源化CD37特异性结合结构域”是特异性针对CD37的免疫球蛋白可变区，其包含至少一个人框架区。
“人框架区”是指人免疫球蛋白可变区的野生型(即天然存在的)框架区，具有该区内少于约50％(例如优选地少于约45％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)的氨基酸缺失或被取代(例如在对应位置用一个或多个非人免疫球蛋白框架区的氨基酸残基进行取代)的人免疫球蛋白可变区的改变的框架区，或具有该区内少于约50％(例如少于45％、40％、30％、25％、20％，15％、10％或5％)的氨基酸缺失或被取代(例如在暴露的残基位置的和/或在对应位置用一个或多个人免疫球蛋白框架区的氨基酸残基进行取代)的非人免疫球蛋白可变区的改变的框架区，这样，在一方面中，降低了免疫原性。
在某些实施方案中，人框架区是人免疫球蛋白可变区的野生型框架区。在某些其他实施方案中，人框架区是具有在1个、2个、3个、4个或5个位置的氨基酸缺失或取代的人免疫球蛋白可变区的改变的框架区。在某些实施方案中，人框架区是具有在1个、2个、3个、4个或5个位置的氨基酸缺失或取代的非人免疫球蛋白可变区的改变的框架区。
在某些实施方案中，人源化CD37特异性结合结构域包含至少1个、2个、3个、4个、5个，6个，7个或8个选自人轻链FR1、人重链FR1、人轻链FR2、人重链FR2、人轻链FR3、人重链FR3、人轻链FR4和人重链FR4的人框架区(FR)。
示例性的人FR如以下所示：SEQIDNOS:140-146(人重链FR1)、SEQIDNOS:147、150和151(人重链FR2)、SEQIDNO:154-160(人重链FR3)、SEQIDNOS:161-163、168和169(人重链FR4)、SEQIDNOS:170-172、175和177-181(人轻链FR1)、SEQIDNOS:182、184-188和191(人轻链FR2)、SEQIDNOS:194-198、203和205(人轻链FR3)和SEQIDNOS:206-210(人轻链FR4)。其他示例性的人FR区可以见于本文提供的CD37特异性SMIP蛋白中的FR区，所述SMIP蛋白例如CAS-001、CAS-002、CAS-003或CAS-024。
可能存在于CD37特异性结合结构域的人FR还包括本文提供的示例性的FR的变体，其中示例性的FR的1个或2个氨基酸被取代或缺失。
在某些实施方案中，人源化CD37特异性结合结构域包含(a)包含人轻链FR1、人轻链FR2、人轻链FR3和人轻链FR4的人源化轻链可变区，和(b)包含人重链FR1、人重链FR2、人重链FR3和人重链FR4的人源化重链可变区。
本文提供的CD37特异性结合结构域还包含1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR。这些CDR可以是选自轻链的CDR1、CDR2和CDR3以及重链的CDR1、CDR2和CDR3的非人CDR或改变的非人CDR。在某些实施方案中，CD37特异性结合结构域包含(a)包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的轻链可变区，和(b)包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的重链可变区。
示例性的CDR包括如SEQIDNO:61(RASENVYSYLA)或SEQIDNO:62(RTSENVYSYLA)所示的轻链的CDR1、如SEQIDNO:63(GYMNM)所示的重链的CDR1、如SEQIDNO:64(FAKTLAE)所示的轻链的CDR2、如SEQIDNO:65(NIDPYYGGTTYNRKFKG)所示的重链的CDR2、如SEQIDNO:66(QHHSDNPWT)所示的轻链的CDR3、如SEQIDNO:67(SVGPFDY)所示的重链的CDR3，如SEQIDNO:68(SVGPFDS)所示的重链的CDR3和如SEQIDNO:69(SVGPMDY)所示的重链的CDR3。优选的轻链CDR1是SEQIDNO:61(RASENVYSYLA)并且优选的重链CDR3包括SEQIDNO:68(SVGPFDS)或SEQIDNO:69(SVGPMDY)。
其他示例性的CDR包括如SEQIDNO:128(RTSQNVYSYLA)、129(RTSESVYSYLA)、130(RASQSVYSYLA)、131(RASQSVSSYLA)和132(RASQSVSYYLA)所示的轻链的CDR1，如SEQIDNOS:133(SYMNM)和134(SYWIG)所示的重链的CDR1，如SEQIDNOS:135(AASSLQS)、136(GASTRAT)和137(DASNRAT)所示的轻链的CDR2，如SEQIDNOS:138(IIYPGDSDTRYSPSFQG)和139(RIDPSDSYTNYSPSFQG)所示的重链的CDR2，如SEQIDNO:220(QHHSDNPWT)所示的轻链的CDR3以及如SEQIDNOS:211(SVGPMDY)、212(SVGPFDY)、213(SVGPMDV)、214(SVGPFDS)、215(SVGPFDP)、216(SVGPFQH)、217(SVGPFDV)、218(SVGPFDI)和219(SVGPFDL)所示的重链的CDR3。其他示例性的CDR包括本文提供的CD37特异性SMIP蛋白中的CDR。
在某些实施方案中，CD37特异性结合结构域包含人源化轻链可变区，所述人源化轻链可变区从其氨基末端至羧基末端包含：人轻链FR1、轻链CDR1、人轻链FR2、轻链CDR2、人轻链FR3、轻链CDR3和人轻链FR4。
在某些实施方案中，CD37特异性结合结构域包含人源化轻链可变区，所述人源化轻链可变区从其氨基末端至羧基末端包含：人轻链FR1、如SEQIDNO:61或62所示的轻链CDR1、人轻链FR2、如SEQIDNO:64所示的轻链CDR2、人轻链FR3、如SEQIDNO:66所示的轻链CDR3和人轻链FR4。在其他实施方案中，CD37特异性结合结构域包含以下人源化轻链可变区，基本上由以下人源化轻链可变区组成或由以下人源化轻链可变区组成，所述人源化轻链可变区从其氨基末端至羧基末端包含：如SEQIDNO:171所示的人轻链FR1、如SEQIDNO:61所示的轻链CDR1、如SEQIDNO:182所示的人轻链FR2、如SEQIDNO:64所示的轻链CDR2、如SEQIDNO:195所示的人轻链FR3、如SEQIDNO:66所示的轻链CDR3、和如SEQIDNO:206所示的人轻链FR4。其他示例性的人源化轻链如SEQIDNOS:237-240所示并且包括本文提供的人源化CD37特异性SMIP蛋白中的轻链。
在某些实施方案中，CD37特异性结合结构域包含人源化重链可变区，所述人源化重链可变区从其氨基末端至羧基末端包含：人重链FR1、重链CDR1、人重链FR2、重链CDR2、人重链FR3、重链CDR3和人重链FR4。
在某些实施方案中，CD37特异性结合结构域包含人源化重链可变区，所述人源化重链可变区从其氨基末端至羧基末端包含：人重链FR1、如SEQIDNO:63所示的重链CDR1、人重链FR2、如SEQIDNO:65所示的重链CDR2、人重链FR3、如SEQIDNO:67、68或69所示的重链CDR3和人重链FR4。在其他实施方案中，CD37特异性结合结构域包含以下人源化重链可变区，基本上由以下人源化重链可变区组成或由以下人源化重链可变区组成，所述人源化重链可变区包含从其氨基末端至羧基末端包含：如SEQIDNO:144所示的人重链FR1、如SEQIDNO:63所示的重链CDR1、如SEQIDNO:151所示的人重链FR2、如SEQIDNO:65所示的重链CDR2、如SEQIDNO:158所示的人重链FR3、如SEQIDNO:67、68或69所示的重链CDR3和如SEQIDNO:161所示的人重链FR4。其他示例性的人源化轻链如SEQIDNOS:242-245所示并且包括本文提供的人源化CD37特异性SMIP蛋白中的轻链。
在某些实施方案中，CD37特异性结合结构域可以是Fab或scFv片段的形式。在优选的实施方案中，CD37特异性结合结构域是人源化CD37特异性scFv，所述scFv包含通过连接子连接在一起的轻链可变区和重链可变区。在其他实施方案中，轻和重链可变区是人源化的，并且可以包含如SEQIDNO:238所示的人源化轻链可变区和如SEQIDNO:245所示的人源化重链可变区两者。
在其他实施方案中，仅轻或重链可变区是人源化的。例如，CD37特异性结合结构域可以包含人源化轻链可变区(即包含至少1个人FR的轻链可变区)和非人重链可变链区(例如小鼠或大鼠)。可选地，CD37特异性结合结构域可以包含非人轻链可变区(例如小鼠或大鼠)和人源化重链可变链区(即包含至少1个人FR的重链可变区)。两种类型的CD37特异性结合结构域都可以称为“杂交的人-非人CD37特异性结合结构域”或“嵌合的CD37特异性结合结构域”。
在某些实施方案中，人源化CD37特异性scFv中轻链可变区的羧基末端通过连接子连接到重链可变区的氨基末端。因此，得到的scFv从其氨基末端至其羧基末端具有：轻链可变区、连接子和重链可变区。在某些其他实施方案中，人源化CD37特异性scFv中重链可变区的羧基末端通过连接子连接到轻链可变区的氨基末端。因此，得到的scFv从其氨基末端至其羧基末端具有：重链可变区、连接子和重链可变区。
在某些实施方案中，连接子具有5-30个氨基酸，例如15-25个氨基酸。在某些实施方案中，连接子包含(GlynSer)m，其中n和m可以是独立选自1至5的整数。例如，在某些实施方案中，n为4并且m为1、2、3、4或5。在某些实施方案中，1个或2个除了Gly或Ser的氨基酸可以存在于氨基末端、羧基末端或两个末端。在某些其他实施方案中，1或2个除了Gly或Ser的氨基酸可以用于取代连接子中的Gly或Ser，所述连接子包含(GlynSer)m，m和n如上文所述。示例性的连接子具有如SEQIDNO:229所示的序列(Gly4S)5。其他示例性的连接子序列展示在SEQIDNOS:225-228中。
在某些实施方案中，人源化CD37特异性结合结构域或CD37特异性结合分子与G28-1mAb竞争对CD37的结合。换言之，在这些实施方案中，与CD37特异性结合结构域或CD37特异性结合分子不存在时的G28-1mAb的CD37结合相比，在其他CD37特异性结合结构域(例如抗CD37单克隆抗体)或CD37特异性结合分子存在时，G28-1mAb的CD37结合减少。竞争性结合检测是本领域内已知的，诸如实施例4-6中描述的那些，并且可以用于确定给定的CD37特异性结合结构域或CD37特异性结合分子是否能够与G28-1mAb竞争对CD37的结合。
人源化CD37特异性SMIP多肽
在某些实施方案中，CD37特异性结合分子是CD37特异性小模块化免疫药物(SMIP)多肽。SMIP蛋白是结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，所述SMIP蛋白通常从其氨基末端至羧基末端包含：源自免疫球蛋白的结合结构域(例如scFv)、铰链区和效应结构域(例如IgGCH2和CH3区)。在优选的实施方案中，所述CD37特异性结合SMIP多肽是人源化的。
人源化CD37特异性结合SMIP多肽的铰链区可以是免疫球蛋白铰链区。在某些实施方案中，所述铰链区是野生型免疫球蛋白铰链区，诸如IgG铰链、IgA铰链、IgD铰链、IgE铰链或其包含核心铰链区的片段(例如长度为4至20或5至15个氨基酸)。在某些优选的实施方案中，铰链区可以是选自人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4或其片段或变体的抗体铰链区。在一些实施方案中，所述铰链区是野生型免疫球蛋白铰链区或其部分，例如人免疫球蛋白铰链区。这些实施方案的示例性的铰链是如SEQIDNO:90所示的野生型人IgGI铰链区、如SEQIDNO:115所示的野生型人IgA1铰链、如SEQIDNO:116所示的野生型人IgA2铰链、如SEQIDNO:118所示的野生型人IgG3铰链、如SEQIDNO:258所示的人IgG3铰链的部分和如SEQIDNO:127所示的人IgD铰链。在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸残基添加到野生型免疫球蛋白铰链区的氨基或羧基末端作为融合蛋白构建体设计的部分。这些氨基酸残基被称为“接头(junction)氨基酸”(参见表4)。
在某些实施方案中，所述铰链区是改变的(突变的)野生型免疫球蛋白铰链区，诸如改变的野生型IgG免疫球蛋白铰链区或野生型免疫球蛋白铰链区的改变的部分。例如，所述野生型人IgG1铰链区含有3个半胱氨酸残基-最N末端的半胱氨酸被称为第一半胱氨酸，而铰链区中最C末端的半胱氨酸是第三半胱氨酸。在某些实施方案中，突变的人IgG1铰链区仅具有两个半胱氨酸残基，例如第一半胱氨酸被丝氨酸取代的人IgG1铰链区。在某些其他实施方案中，突变的人IgG1铰链区仅具有一个半胱氨酸残基。在某些实施方案中，人IgG1铰链区中的第三半胱氨酸C-末端的脯氨酸被例如丝氨酸取代。示例性的突变的人IgG1铰链区如SEQIDNOS:92、94、102、104、255、256、106、108、257、96、110、112、98和100所示。示例性的突变的部分的人IgG3铰链区如SEQIDNOS:120、126、259-261、122和124所示。在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸残基添加到突变的免疫球蛋白铰链区的氨基或羧基末端作为融合蛋白构建体设计的部分。这些修饰的铰链区的实例在SEQIDNOS:231-235中以斜体字表示。
在某些实施方案中，铰链区包含或具有与野生型免疫球蛋白铰链区至少80％，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一的序列，所述野生型免疫球蛋白铰链区例如野生型人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD和IgE铰链。
在其他实施方案中，改变的铰链区可以基于野生型免疫球蛋白铰链区(例如IgG1铰链区)并且当与野生型免疫球蛋白铰链区相比，含有一个或多个(例如1、2、3或4)***、一个或多个(例如1、2、3或4)缺失、一个或多个(例如1、2、3或4)氨基酸取代(例如保守型氨基酸取代或非保守型氨基酸取代)，或上述突变的组合，但前提是修饰的铰链保留适于使融合结合蛋白的结合结构域正确定向以与其靶标相互作用的柔性或刚性。所述***、缺失或取代可以在野生型免疫球蛋白铰链区的任何位置，包括位于氨基或羧基末端或两者。
如本文所述，CD37特异性SMIP多肽可以包含免疫球蛋白CH2区。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白CH2区是野生型免疫球蛋白CH2区，诸如野生型人免疫球蛋白CH2区，包括野生型人IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgMCH2区。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白CH2区是人IgG1CH2区。
在某些其他实施方案中，所述免疫球蛋白CH2区是改变的野生型免疫球蛋白CH2区。例如，所述改变的野生型免疫球蛋白CH2区可以是人IgG1CH2区，但在位置234至238、253、279、310、318、320、322和331具有1个、2个、3个、4个或5个突变(EU编号，Wardetal.，1995Therap.Immunol.2:77-94)。这些位置的突变降低或消除抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，Fc受体结合能力和/或补体结合。
如本文所述，人源化CD37特异性SMIP多肽可以包含免疫球蛋白CH3区。在某些实施方案中，免疫球蛋白CH3区多肽是野生型免疫球蛋白CH3区多肽，包括来自不同物种(即人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物)的不同免疫球蛋白同种型(例如IgA、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE或IgM)的任何一个的野生型CH3区。在其他实施方案中，免疫球蛋白CH3区多肽是突变的免疫球蛋白CH3区多肽。免疫球蛋白CH3区中的突变可以在一个或多个参与补体结合的位置，例如位于H433或N434。
在某些实施方案中，人源化CD37特异性SMIP多肽可以含有一个或多个其他区。这些其他区可以是位于氨基末端用于表达的SMIP多肽的分泌的前导序列、其他Fc亚区(例如IgM或IgE的野生型或突变的CH4区)、位于其羧基末端用于鉴定或纯化用途的尾部序列(例如用于检测或纯化的表位标签，包括6组氨酸标签或FLAG表位)或由特异性表达***的使用产生的其他氨基酸残基。本公开内容的示例性的前导肽包括天然前导序列或其他，例如如SEQIDNOS:223和224所示的那些序列。
本公开内容包括表现出与SEQIDNO:2中所示的多肽至少80％同一性(例如82％、84％、85％、86％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的CD37特异性SMIP多肽，其中所述CD37特异性SMIP多肽结合CD37。在其他实施方案中，与SEQIDNO:2具有至少80％同一性的这些多肽还可以被人源化。示例性的人源化CD37特异性SMIP多肽包含选自以下的任何氨基酸序列、基本上由选自以下的任何氨基酸序列组成或由选自以下的任何氨基酸序列组成：SEQIDNOS:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、80、82、84、86、88和222，其中所述前导序列是缺失的，以及SEQIDNOS:247-254和266-269。
如本文所用的“序列同一性”是指在比对序列并且如果需要的话引入空位以达到最大序列同一性百分比后,并且不将任何保守型取代视为序列同一性的部分，一个序列中的氨基酸残基与另一参考多肽序列中的氨基酸残基一致的百分比。通过NCBIBLAST2.0软件，如Altschuletal.(1997)"GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms",NucleicAcidsRes.25:3389-3402所定义的，使用设定为默认值的参数，生成所述序列同一性百分比值。
在优选的实施方案中，本公开内容提供了人源化CD37特异性SMIP多肽，其从氨基末端至羧基末端包含：人源化重链可变区(VH)、(G4S)5连接子(SEQIDNO:229)、人源化轻链可变区(VL)、改变的IgG1铰链、人IgG1CH2区和人IgG1CH3区。所述人源化重链可变区从其氨基末端至其羧基末端包含：人重链FR1、如SEQIDNO:63所示的重链CDR1、人重链FR2、如SEQIDNO:65所示的CDR2、人重链FR3、如SEQIDNO:67、68或69所示的CDR3和人重链FR4。所述人源化轻链可变区从其氨基末端至其羧基末端包含：人轻链FR1、如SEQIDNO:61或62所示的轻链CDR1、人轻链FR2、如SEQIDNO:64所示的轻链CDR2、人轻链FR3和如SEQIDNO:66所示的轻链CDR3和人轻链FR4。
在某些以上优选的实施方案中，人重链FR1、FR2和FR3分别包含SEQIDNOS:144、151和158，并且所述重链FR4包含SEQIDNO:161或162。在其他优选的实施方案中，人轻链FR1、FR2、FR3和FR4分别包含SEQIDNOS:171、182、195和206。可选地，所述重链和轻链都含有这些序列。
出人意料地，CAS-024SMIP蛋白(1)以比其他人源化形式的CAS-006(例如CAS-002、CAS-003；参见实施例2和5)高达约25倍的水平表达，(2)能够结合CD37以及CAS-006，而其他人源化形式则不能(参见实施例4和5)，和(3)相比于其他人源化形式的异质性，以同质的分子群产生(参见实施例3)。在优选的实施方案中，本公开内容提供了CD37特异性结合蛋白，其包含CAS-024(SEQIDNO:253)或由CAS-024(SEQIDNO:253)组成。特别是，该人源化CD37特异性结合分子与其他人源化分子相反，与其母体嵌合分子(CAS-006，具有来自小鼠抗人CD37单克隆抗体G28-1的免疫球蛋白可变区的SMIP蛋白)具有基本相同的CD37结合亲和力，与其他人源化分子相比，以高水平表达，和/或与其他人源化分子相反，当例如通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化时，显示出高度的同质性。此外，该CAS-024CD37特异性结合分子已显示出在抑制肿瘤生长和导致长期肿瘤消退中是有效的。
本公开内容还包括分离的核酸分子，其包含编码人源化CD37特异性结合分子及其组分的核苷酸序列，所述组分包括人或人源化FR、CDR、人源化轻链可变区、人源化重链可变区、人源化scFv和人源化SMIP多肽。编码人源化CD37特异性SMIP多肽的示例性的分离的核酸分子包括包含SEQIDNOS:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、79、81、83、85、87和221的那些核酸分子。在一个实施方案中，本公开内容包括包含这些核酸分子的载体和包含所述载体的宿主细胞。
本公开内容还包括产生本文所述的多肽的过程，其包括在适合的条件下培养所述宿主细胞以表达所述多肽，并任选地从培养物分离所述多肽。
用于联合治疗的化合物
本公开内容还提供了使用本领域已知的或本文公开的任何CD37特异性结合分子和双功能化学治疗剂的联合治疗(例如苯达莫司汀)。
用于联合治疗的CD37特异性结合分子可以是含有CD37特异性结合结构域的任何形式，包括抗CD37抗体、抗CD37抗体的Fab片段、CD37特异性单链Fv(scFv)、CD37特异性SMIP、CD37特异性PIMS、CD37特异性SCORPION和其他包含至少一种CD37特异性结合蛋白的双特异性或多特异性结合蛋白。
在某些实施方案中，用于与双功能化学治疗剂的联合治疗的CD37特异性结合分子是CD37特异性抗体。这种抗体包括在第3届人类白细胞分化抗原国际会议(ThridHLDAWorkshop)中用于表征CD37抗原的那些抗体，即HD28、G28-1、HH1、BI14、WR17和F93G6(参见，LingandMacLennan，pp.302-335于LeucocyteTypingIII.WhiteCellDifferentiationAntigens(III型白细胞.白细胞分化抗原)，OxfordUniversityPress(1987))。其他用于联合治疗的CD37特异性抗体包括RFB-7、Y29/55、MB-1、M-B371、M-B372和IPO-24(参见，Moldenhaurer,J.Biol.,Regul.Homeost.Agents,14:281-283(2000),说明了所有这些抗体仅识别一个CD37表位,和Schwartz-Albiezetal.,14:905-914(1988)，指出了所述表位位于CD37的糖类部分中)。可以用于联合治疗的另一CD37特异性抗体是S-B3(Biosys)。
在某些实施方案中，用于与双功能化学治疗剂的联合治疗的CD37特异性结合分子是CD37特异性SMIP多肽。示例性的SMIP多肽包含SEQIDNO:2。其他示例性的SMIP多肽包括WO2005017148中描述的那些多肽，诸如(1)包含G28-1scFv、改变的人IgG1铰链和野生型人IgG1CH2和CH3结构域的G28-1scFv(SSS-S)HWCH2WCH3，在所述改变的人IgG1铰链中，人IgG1铰链区中所有三个半胱氨酸残基和第三半胱氨酸羧基末端的脯氨酸被突变为丝氨酸残基；(2)包含G28-1scFv、人IgA铰链的部分和人IgG1CH2和CH3结构域的G28-1scFvIgAHWCH2WCH3；(3)包含G28-1scFv、改变的人IgG1铰链和人IgG1CH2和CH3结构域的G28-1scFvVHL11S(SSS-S)HWCH2CH3，其中位于重链可变区的位置11的亮氨酸被丝氨酸取代，在所述改变的人IgG1铰链中，铰链区中所有三个半胱氨酸残基和第三半胱氨酸羧基末端的脯氨酸被突变为丝氨酸残基；(4)包含G28-1scFv、改变的人IgG1铰链和人IgG1CH2和CH3结构域的G28-1scFvVHL11S(CSS-S)HWCH2CH3，其中位于重链可变区的位置11的亮氨酸被丝氨酸取代，在所述改变的人IgG1铰链中，位于第二和第三位置的半胱氨酸残基和第三半胱氨酸羧基末端的脯氨酸被丝氨酸残基取代；(5)包含G28-1scFv、改变的人IgG1铰链和人IgG1CH2和CH3结构域的G28-1scFvVHL11S(CSC-S)HWCH2CH3，其中位于重链可变区的位置11的亮氨酸被丝氨酸取代，在所述改变的人IgG1铰链中，位于第二位置的半胱氨酸残基和位于第三位置的半胱氨酸羧基末端的脯氨酸被丝氨酸残基取代；(6)包含G28-1scFv、改变的人IgG1铰链和人IgG1CH2和CH3结构域的G28-1scFvVH11S(SSC-P)HWCH2WCH3，其中位于重链可变区的位置11的亮氨酸被丝氨酸取代，在所述改变的人IgG1铰链中，铰链区中第一和第二半胱氨酸残基被突变为丝氨酸残基；(7)包含G28-1scFv、改变的人IgG1铰链和人IgG1CH2和CH3结构域的G28-1scFvVH11S(SCS-S)HWCH2WCH3，其中位于重链可变区的位置11的亮氨酸被丝氨酸取代，在所述改变的人IgG1铰链中，铰链区中第一和第三半胱氨酸残基和第三半胱氨酸羧基末端的脯氨酸被突变为丝氨酸残基；(8)包含G28-1scFv、改变的人IgG1铰链和人IgG1CH2和CH3结构域的G28-1scFvVHL11S(CCS-P)HWCH2WCH3，其中位于重链可变区的位置11的亮氨酸被丝氨酸取代，在所述改变的人IgG1铰链中，铰链区中第三半胱氨酸残基被丝氨酸取代；(9)包含G28-1scFv、改变的人IgG1铰链和人CH2和CH3结构域的G28-1scFvVHL11S(SCC-P)HWCH2WCH3，其中位于重链可变区的位置11的亮氨酸被丝氨酸取代，在所述改变的人IgG1铰链中，第一半胱氨酸残基被丝氨酸取代；(10)G28-1scFvVHL11SmIgECH2CH3CH4，其包含G28-1scFv和小鼠IgECH2、CH3和CH4区，其中位于重链可变区的位置11的亮氨酸被丝氨酸取代；(11)G28-1scFvVHL11SmIgAWIgACH2T4CH3，其包含G28-1scFv、小鼠IgA铰链和野生型IgACH2和缺乏4个羧基氨基酸GTCY的截短的IgACH3结构域(SEQIDNO:265)；(12)G28-1scFvVHL11ShIgECH2CH3CH4，其包含G28-1scFv和人IgECH2、CH3和CH4区；其中位于重链可变区的位置11的亮氨酸被丝氨酸取代；和(13)G28-1scFvVHL11ShIgAHWIgACH2TCH3，其包含G28-1scFv、人IgA铰链的部分、野生型IgACH2和缺乏4个羧基氨基酸GTCY的截短的IgACH3结构域(SEQIDNO:265)，其中位于重链可变区的位置11的亮氨酸被丝氨酸取代。
在某些实施方案中，用于与双功能化学治疗剂的联合治疗的CD37特异性结合分子是本文所述的人源化CD37特异性结合分子，包括人源化抗CD37抗体、人源化抗CD37抗体的Fab片段、人源化CD37特异性PIMS蛋白、人源化CD37特异性SCORPION蛋白和其他包含至少一种人源化CD37特异性结合蛋白的双特异性或多特异性结合蛋白，特别是人源化CD37特异性单链Fv(scFv)和人源化CD37特异性SMIP多肽。
本公开内容中考虑的某些CD37特异性结合分子具有对于CD37的约0.5至约10nM的亲和力。本公开内容中考虑的某些CD37结合分子的另一特征是它们表现出约5至约30天的循环半衰期。
在某些实施方案中，CD37特异性结合分子能够在CD37特异性结合中与G28-1mAb竞争。
苯达莫司汀(4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸)是具有烷化剂(alkylator)和抗代谢物活性的氮芥。苯达莫司汀具有烷化基团和苯并咪唑环。该烷化基团允许苯达莫司汀代谢产物烷基化和交联大分子，这导致DNA、RNA和蛋白合成抑制，以及随后的凋亡。苯并咪唑环可以允许苯达莫司汀作为嘌呤类似物。盐酸苯达莫司汀具有商品名和
尽管苯达莫司汀或其盐类是可以与CD37特异性结合分子联合使用的优选的治疗剂，但包含一个或多个烷化基团并能够作为嘌呤类似物发挥功能的其他治疗剂也可以与按照本公开内容的CD37特异性结合分子联合使用。
如本文所用的术语“烷化基团”是指能够使包含该基团的化合物将烷基基团连接到DNA的基团。所述包含烷化基团的化合物可以被称为“烷化剂”。在某些实施方案中，烷化剂是氮芥。
术语“嘌呤类似物”是指抗代谢物，其模拟代谢嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)的结构并在嘌呤环具有不同于代谢嘌呤的1个、2个、3个或4个取代基。示例性的嘌呤类似物包括硫唑嘌呤、疏基嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁和克拉曲滨。
治疗剂“能够作为嘌呤类似物发挥功能”，如果其具有嘌呤类似物的至少一个功能。示例性的嘌呤类似物的功能包括干扰或抑制嘌呤核苷酸合成、嘌呤核苷酸代谢、核酸合成、核酸加工或核酸功能，诸如抑制核糖核苷酸还原酶、DNA聚合酶、腺苷脱氨酶，和被合并入DNA或RNA。
组合物和方法
在一方面中，本公开内容提供了减少B细胞或治疗与异常的B细胞活性相关的疾病的方法，所述方法包括给予个体(即具有或疑似具有与异常的B细胞活性相关的疾病的个体)有效量的本文提供的人源化CD37特异性结合分子(例如CAS-024)，所述个体需要减少B细胞或治疗与异常的B细胞活性相关的疾病。
在另一方面，本公开内容提供了减少B细胞或治疗与异常的B细胞活性相关的疾病的方法，所述方法包括给予个体有效量的CD37特异性结合分子(例如CAS-024)和双功能化学治疗剂(例如苯达莫司汀)，所述个体需要减少B细胞或治疗与异常的B细胞活性相关的疾病。如上文所述，用于与双功能化学治疗剂的联合治疗的CD37特异性结合分子不限于人源化CD37特异性结合分子，还包括其他未被人源化的CD37特异性结合分子。
在一个实施方案中，包含CD37治疗剂和双功能化学治疗剂的组合物在减少B细胞或治疗与异常的B细胞活性相关的疾病中协同作用。协同作用的2种或更多化合物相互作用，这样使得化合物的联合效应大于每种化合物单独给药时的个别效应之和(参见，例如Berenbaum,Pharmacol.Rev.41:93,1989)。例如，可以通过多种机械和经验模型分析靶向CD37的小模块化免疫药物和另一试剂或化合物之间的相互作用(参见，例如Ouzounovetal.,Antivir.Res.55:425,2002)。分析试剂组合之间相互作用的常用方法采用构建等效图(等效曲线，也称为等效线图解法)，其中所述试剂组合(da、db)在图上由点表示，所述图的轴是个别试剂的剂量轴(参见，例如Ouzounovetal.，同上；也可参见Tallarida,J.Pharmacol.Exp.Therap.298:865,2001)。
本领域已知的用于分析药物-药物相互作用的另一方法(拮抗作用、相加作用、协同作用)包括按照中效原理测定联合指数(CI)，从而提供化合物单独给药和联合给药的IC50值的估计(参见，例如Chou.InSynergismandAntagonismChemotherapy(协同作用和拮抗作用化学治疗).Eds.ChouandRideout.AcademicPress,SanDiegoCalif.,pages61-102,1991；CalcuSynTM软件)。小于1的CI值代表协同活性，等于1代表相加活性，并且大于1代表拮抗作用。
仍然另一示例性的方法是独立效应法(PritchardandShipman,AntiviralRes.14:181,1990；PritchardandShipman,AntiviralTherapy1:9,1996；MACSYNERGYTMII软件,UniversityofMichigan,AnnArbor,Mich.)。MACSYNERGYTMII软件通过将计算的相加表面与观察到的数据比较以生成显示统计学上大于预期(协同)或小于预期(拮抗)的化合物相互作用的区(以体积的形式)的差异绘图，允许化合物相互作用的3维(3-D)检测。例如，包含CD37特异性结合分子和改变病毒复制的双功能化学治疗剂的组合物会被视为具有协同活性或具有协同效应，当通过协同峰的体积计算而产生的协同的体积优选地大于相加效应(即，每种试剂单独的效应加在一起)约15％，或优选地大于相加效应约2倍至10倍，或优选地约大于相加效应3倍至5倍或更多倍。
在其他实施方案中，可以给予CD37特异性结合分子和双功能化学治疗剂，从而在B细胞恶性肿瘤或B细胞癌症的治疗中协同作用。B细胞恶性肿瘤或B细胞癌症包括B细胞淋巴瘤[诸如不同形式的霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤(NHL)或中枢神经***淋巴瘤]、白血病[诸如急性成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多毛细胞性白血病和慢性成髓细胞白血病]和骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)。其他B细胞癌症包括小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血浆细胞骨髓瘤，骨的孤立性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、粘膜相关(MALT)淋巴样组织的结外边缘区B细胞淋巴瘤，结边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤/白血病，不确定恶性潜能的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病和移植后淋巴增殖性病症。
伯基特淋巴瘤(或“伯基特B细胞恶性肿瘤”或“伯基特肿瘤”或“恶性淋巴瘤，伯基特型”)是淋巴***癌症(特别是B淋巴细胞)。其可以分为三种主要临床变异型：地方性、散发性和免疫缺陷相关变异型。
非伯基特B细胞恶性肿瘤包括但不限于，B-细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(包括但不限于，Waldenstrom巨球蛋白血症)、边缘区淋巴瘤(包括但不限于，脾边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区淋巴瘤和粘膜相关淋巴组织(MALT)的结外边缘区B细胞淋巴瘤型)，多毛细胞性白血病、浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、转化性大B细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤和非伯基特非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
以自身抗体产生为特征的病症通常视为自身免疫性疾病。自身免疫性疾病包括但不限于：关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、多软骨炎、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、皮炎、多肌炎/皮肌炎、包涵体肌炎、炎性肌炎、中毒性表皮坏死松解症、***性硬皮病和硬化症、CREST综合征、炎性肠病相关应答、克罗恩病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑(脊)膜炎、脑炎、眼色素层炎、结肠炎、肾小球肾炎、变应性疾病状态、湿疹、哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎症应答的疾病状态、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、***性红斑狼疮(SLE)、亚急性皮肤红斑狼疮、盘状狼疮、狼疮脊髓炎、狼疮脑炎、青少年发作型糖尿病、多发性硬化、变应性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、风湿热、小舞蹈病(Sydenham’schorea)、细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和延迟性超敏反应相关的免疫应答、结核病、结节病、包括韦格纳(氏)肉芽肿病和Churg-Strauss病在内的肉芽肿病、粒细胞缺乏症、血管炎(包括超敏反应血管炎/脉管炎、ANCA和类风湿性脉管炎)、再生障碍性贫血、戴-布二氏贫血(DiamondBlackfananemia)、包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的免疫性溶血性贫血、恶性贫血、纯红细胞再生障碍(PRCA)、因子VIII缺陷、血友病A、自身免疫性嗜中性白血球减少症、全血细胞减少症、白血球减少症、涉及白细胞血细胞渗出的疾病、中枢神经***(CNS)炎症病症、多器官损伤综合征、重症肌无力、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、变应性神经炎、***、Castleman综合征、Goodpasture综合征、Lambert-Eaton肌无力综合征、Reynaud综合征、Sjorgen综合征、Stevens-Johnson综合征、实体器官移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、大疱性类天疱疮、天疱疮、自身免疫性多内分泌腺病、血清阴性脊柱关节病、Reiter病、僵人综合征、巨细胞动脉炎、免疫复合物肾炎、IgA肾病、IgM多神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、自身免疫性血小板减少症、包括自身免疫性***和***的睾丸和卵巢的自身免疫性疾病、原发性甲状腺机能低下；自身免疫性内分泌疾病，包括自身免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺机能减退(症)、爱迪生氏病(Addison'sdisease)、格雷夫斯氏病(Grave'sdisease)、自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)、也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的I型糖尿病和Sheehan综合征；自身免疫性肝炎、淋巴细胞间质性肺炎(HIV)、梗阻性细支气管炎(非移植)vsNSIP、Guillain-Barre综合征、大血管血管炎(包括风湿性多肌病和巨细胞(高安氏(Takayasu's))动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎氏病(Kawasaki'sdisease)和结节性多动脉炎)、结节性多动脉炎(PAN)强直性脊柱炎、伯格氏病(IgA肾病)、急进性肾小球性肾炎、原发性胆汁性肝硬变、乳糜泻(麸质肠病)、冷球蛋白血症、肝炎相关的冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS)、冠状动脉病、家族性地中海热、显微镜下多血管炎、Cogan综合征、Whiskott-Aldrich综合征和血栓闭塞性血管炎、自身免疫性甲状腺疾病(例如格雷夫斯氏病病和桥本甲状腺炎)、Sjogren综合征和特发性炎症性肌病(MM)、包括皮肌炎(DM)和多肌炎(PM)。也可以用人源化CD37特异性结合分子或CD37特异性结合分子和双功能化学治疗剂的组合治疗以上自身免疫性疾病。
在本公开内容的一方面，人源化CD37特异性结合分子或CD37特异性结合分子与双功能化学治疗剂的组合在药物组合物中给药。为了将人源化CD37特异性结合分子或CD37特异性结合分子与双功能化学治疗剂的组合给予人或测试动物，优选将所述结合分子或所述组合配制在包含一个或多个药学上可接受的载体的组合物中。短语“药学上或药理学上可接受的”如下文所述，是指当使用本领域熟知的途径给药时，不产生变应性或其他不利反应的分子实体和组分。“药学上可接受的载体”包括任何和全部临床上有用的溶剂、分散介质、包被、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。此外，化合物可以与水或常见有机溶剂形成溶剂化物。也包括这些溶剂化物。
取决于给药途径，含有本公开内容方法中使用的人源化CD37特异性结合分子或CD37特异性结合分子与双功能化学治疗剂的组合本公开内容的药物组合物可以含有药学上可接受的载体或添加剂。这些载体或添加剂的实例包括水、药学可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、羧基乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、丙烯酸钠、藻酸钠、水溶葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄胞胶、***胶、酪素、明胶、琼脂、双甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、药学可接受的表面活性剂等。取决于本公开内容的剂型，使用的添加剂选自，但不限于以上的物质或其组合，视情况而定。
药物组合物的剂型根据选择的给药途径会不同(例如溶液、乳状液)。包含待给予的抗体的合适的组合物可以在生理上可接受的媒介或载体中制备。对于溶液或乳状液，合适的载体包括，例如，水溶液或醇/水溶液、乳状液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介可以包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡糖糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油。静脉内媒介可以包括各种添加剂、防腐剂或流体、营养素或电解质补充剂。
多种水性载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸或水性悬浮液可以含有与适于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性化合物。这种赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯酮、西黄蓍胶和***胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七乙烯氧基十六醇(heptadecaethyl-eneoxycetanol)，或氧化乙烯与源自脂肪酸和己糖醇的部分酯类的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或氧化乙烯与源自脂肪酸和己糖醇酸酐的部分酯类的缩合产物，例如聚乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。所述水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如乙基、或正丙基、对羟基苯甲酸酯。
CD37特异性结合分子、CD37特异性结合分子与双功能化学治疗剂的组合或包含所述结合分子或所述组合的组合物可以冻干用于储存，并且使用前在合适的载体中复原(reconstitution)。该技术已显示出对于常规免疫球蛋白有效。可以使用任何合适的冻干和复原技术。本领域技术人员应当理解到，冻干和复原可能导致不同程度的活性丢失,因此可能需要调整使用水平来补偿。
适于通过添加水制备水性悬浮液的可分散的粉末和颗粒提供活性化合物，与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂形成混合物。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂由上文已提及的那些作为举例说明。
这些制剂中CD37特异性结合分子或双功能化学治疗剂的浓度可以广泛变化，例如按重量计从少于约0.5％，通常为1％或至少约1％到多至15或20％，主要根据液体体积、粘度等，按照选择的特定给药模式进行选择。因此，用于胃肠外注射的典型药物组合物可以配制为含有1ml无菌缓冲水和50mg抗体。用于静脉内输注的典型组合物可以配制为含有250ml无菌林格氏液和150mg抗体。制备胃肠外可给药的组合物的实际方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的，并且更详细地描述于，例如Remington'sPharmaceuticalScience(雷明顿药物科学)，15thed.，MackPublishingCompany，Easton，Pa.(1980)中。每次给药的有效剂量的CD37特异性结合分子(包括人源化CD37特异性结合分子)在0.01mg至1000mg每公斤体重的范围内。
所述药物组合物可以是以下形式：无菌可注射的水性、油状悬液，用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的分散剂或无菌粉末。可以按照已知领域，使用上文提及的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制所述悬液。所述无菌可注射制剂也可以是无毒的胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液，例如1,3-丁二醇中的溶液。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物，植物油，林格氏液和等渗氯化钠溶液的溶剂或分散介质。此外，无菌、不挥发性油常规作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，例如油酸的脂肪酸可用于制备可注射剂。
在所有情况下，所述剂型必须是无菌的并且必须流动的，流动的程度是存在易注射性。例如，通过使用例如卵磷脂的包被、通过在分散的情况下保持所需颗粒的大小和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。所述剂型在生产和储存条件下必须是稳定的并且必须针对例如细菌和真菌的微生物的污染作用进行防腐。通过各种抗细菌剂或抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等，实现微生物作用的预防。在很多情况下，包括例如糖类或氯化钠的等渗剂是理想的。通过在组合物中使用例如单硬脂酸铝和明胶的延迟吸收的试剂可以实现可注射组合物的延长的吸收。
用于给药的组合物可以与摄取或吸收增强剂配制以增加其功效。这些增强剂包括，例如水杨酸盐、甘氨胆酸盐/亚油酸盐、乙醇酸盐、抑酞酶、杆菌肽、SDS、葵酸盐等。参见，例如J.Pharm.Sci.,85:1282-1285,1996)和OliyaiandStella(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.,32:521-544,1993)。
此外，使考虑在本公开内容中使用的组合物的亲水性和疏水性性质良好平衡，从而增强其体外并且特别是体内用途的效用，而缺乏此平衡的其他组合物具有显著降低的效用。具体而言，考虑在本公开内容中使用的组合物在水性介质中具有合适程度的可溶性，这允许体内的吸收和生物利用度；在脂质中也具有一定程度的可溶性，这允许所述化合物穿过细胞细胞膜到达推定的作用位点。因此，所考虑的抗体组合物，当它们可以被递送到靶抗原活性的位点时，是最大程度上有效的。
在一方面中，本公开内容的方法包括CD37特异性结合分子组合物的给药的步骤。在某些实施方案中，所述化合物的组合可以同时给药，在同一药学上可接受的载体一起给药或分别地(但同时)给药。在其他实施方案中，CD37免疫治疗剂(即CD37特异性结合分子)和双功能化学治疗剂可以以任何顺序以及任何组合相继给药。
结合分子、双功能化学治疗剂或联合组合物可以口服给药、局部给药、经皮给药、胃肠外给药、通过吸入喷雾给药、***给药、经直肠给药或通过颅内注射给药或其任何组合进行给药。在一个实施方案中，所述CD37特异性结合分子和双功能化学治疗剂经胃肠外同时或相继给药。如本文使用的术语胃肠外包括皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、脑池内注射或输注技术。也考虑通过静脉内注射、真皮内注射、肌肉内注射、***内注射、腹膜内注射、鞘内注射、眼球后注射、肺内注射和或在特定部位的手术植入的给药。通常，组合物基本上无热原质以及可能对接受体有害的其他杂质。优选为注射，特别是静脉内注射。
在一个实施方案中，通过直接注射入所述部位或通过可以内部递送制剂的持续递送或持续释放机制，在癌症部位或需要治疗的受侵袭的组织进行给药。例如，生物可降解微球或胶囊或能够持续递送组合物的其他生物可降解聚合物构型(例如可溶多肽、抗体或小分子)可以包括在癌症附近植入的本公开内容的制剂中。
还可以将治疗组合物递送到患者多个部位。所述多重给药可以同时给予或在一段时间给药。在某些情况下，提供治疗组合物的连续供给是有利的。可以周期性给予其他治疗，例如每小时、每天、每周或每月。
结合分子、双功能化学治疗剂或本公开内容的联合组合物可以包含一个或多个结合分子、双功能化学治疗剂或其任何组合。本公开内容也考虑的是结合分子、双功能化学治疗剂或联合组合物与其他治疗剂的联合给药。本公开内容考虑的其他治疗在下文段落中列出。
其他治疗剂可以是B细胞相关分子。本公开内容考虑的其他B细胞相关分子包括与不是CD37的B细胞表面分子结合的结合分子。B细胞相关分子包括CD19(B淋巴细胞抗原CD19，也称为B淋巴细胞表面抗原B4或Leu-12)、CD20、CD21、CD22(B细胞受体CD22，也称为Leu-14、B淋巴细胞细胞粘附分子或BL-CAM)、CD23、CD40(B细胞表面抗原CD40，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5、CD40L受体或Bp50)、CD80(T淋巴细胞活化抗原CD80，也称为活化B7-1抗原、B7、B7-1或BB1)、CD86(T淋巴细胞活化抗原CD86，也称为活化B7-2抗原、B70、FUN-1或BU63)、CD137(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9)、CD152(也称为细胞毒性T淋巴细胞蛋白4或CTLA-4)、L6(肿瘤相关抗原L6，也称为跨膜4超家族成员1，膜组分表面标记1或M3S1)、CD30(淋巴细胞活化抗原CD30，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员8、CD30L受体或Ki-1)、CD50(也称为细胞间粘附分子3(ICAM3)或ICAM-R)、CD54(也称为细胞间粘附分子1(ICAM1)，或主要类别鼻病毒属受体)、B7-H1(活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞表达的免疫抑制受体的配体，也称为PD-L1；参见Dong,etal.,"B7-H1,athirdmemberoftheB7family,co-stimulatesT-cellproliferationandinterleukin-10secretion,"Nat.Med.,5:1365-1369(1999)，CD134(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4、OX40、OX40L受体、ACT35抗原或TAX转录活化糖蛋白1受体)、41BB(4-1BB配体受体、T细胞抗原4-1BB或T细胞抗原ILA)、CD153(也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员8、CD30配体或CD30-L)、CD154(也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员5、TNF相关活化蛋白、TRAP或T细胞抗原Gp39)、Toll受体等。
考虑为其他治疗剂的化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如氮芥(例如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺、异磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥)；亚硝基脲(例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基CCNU))；乙撑亚胺和甲基氰尿酰胺(例如三亚胺嗪(TEM)、三亚乙基硫代磷酰胺(塞替派)和六甲密胺(hexamethylmelamine)(HMM、六甲密胺(altretamine))；烷基磺酸盐(例如白消安)；和三嗪(例如达卡巴嗪(dacabazine)(DTIC))；抗代谢物、例如叶酸类似物(例如甲氨喋呤、曲美沙特和培美曲塞(多靶向抗叶酸剂))；嘧啶类似物(例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿嘧啶脱氧核苷、吉西他滨、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)(AraC、阿糖胞苷(cytarabine))、5-氮胞苷和2,2'-二氟脱氧胞苷酸)；和嘌呤类似物(例如、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2'-脱氧柯福霉素(喷司他丁)、赤羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine)(EHNA)、磷酸氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨、2-CdA))；I型拓扑异构酶抑制剂，例如喜树碱(CPT)、托泊替康和伊立替康；天然产物、例如表鬼臼毒素(例如依托泊苷和替尼泊苷)；和长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱和长春瑞滨)；抗肿瘤抗生素，例如放线菌素D、阿霉素和博来霉素；放射增敏剂，例如5-溴脱氧尿苷、5-碘去氧尿苷和溴脱氧胞苷；铂配位络合物，例如顺铂、碳铂和奥沙利铂；取代脲，例如羟基脲；和甲基肼衍生物，例如N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼。
本公开内容考虑的用于自身免疫性疾病治疗的其他治疗剂称为免疫抑制剂，其作用为抑制或屏蔽所治疗的个体的免疫***。免疫抑制剂包括，例如，非甾体抗炎症药物(NSAID)、镇痛药、糖皮质激素、用于关节炎治疗的缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)或生物反应调节剂。DMARD说明中的组分还可以用于治疗除RA之外的许多其他自身免疫性疾病。
示例性的NSAID选自布洛芬、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸钠、例如万络(Vioxx)和西乐葆(Celebrex)的Cox-2抑制剂和唾液酸化剂(sialylates)。示例性的镇痛药选自对乙酰氨基酚、羟考酮、盐酸丙氧芬的曲马多。示例性的糖皮质激素选自可的松、***、氢化可的松、甲基氢化***、***龙或***。示例性的生物反应调节剂包括针对细胞表面标记(例如CD4，CD5等)的分子，细胞因子抑制剂，例如TNF拮抗剂(例如依那西普(Enbrel)，阿达木单抗(Humira)和英夫利昔单抗(Remicade))，化学因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物反应调节剂包括单克隆抗体以及重组形式分子。示例性的DMARD包括硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢霉素、甲氨喋呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺吡啶、羟氯喹、金(口服(金诺芬)和肌肉内)和米诺环素。
考虑到结合分子组合物和其他治疗剂可以在同一制剂中同时给药。可选地，药剂在分别的制剂中同时给药，同时是指例如药剂彼此在数分钟内、数小时内或数天内给药。
在另一方面，在结合分子、双功能化学治疗剂或联合组合物给药前，给予所述其他治疗剂。在先给药是指在用所述结合分子、双功能化学治疗剂或联合组合物治疗之前数分钟、数小时或一周的范围内给予所述其他治疗剂。还考虑到在所述结合分子组合物的给药之后给予所述其他治疗剂。在后给药意在描述结合分子、双功能化学治疗剂或联合组合物治疗或给药后多于数分钟、数小时或数周的给药。
还考虑到当结合分子与其他治疗剂联合给药时，其中所述其他治疗剂是细胞因子或生长因子或化学治疗剂，所述给药还可以包括使用放射治疗剂或放射疗法。与抗体组合物联合给予的放射疗法按照治疗医师决定的给予，剂量为通常给予治疗癌症的患者的剂量。
可以以单一剂量或多剂量给予这些组合物。首先在动物模型中并且然后在临床试验中的标准剂量反应研究揭示对于特定疾病状态和患者群体的的最佳剂量。
单一剂量治疗后，结合分子、双功能化学治疗剂或联合组合物的给药减少了至少20％的B细胞群体。在一个实施方案中，B细胞群体减少了至少约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100％。B细胞减少定义为绝对B细胞计数减少至低于正常范围的下限。B细胞恢复定义为绝对B细胞计数恢复至个体的基线值或正常范围的例如70％、80％、90％。此外，本公开内容的结合分子、双功能化学治疗剂或联合组合物的给药带来接受治疗的疾病或病症中的理想临床效应。
在一些实施方案中，根据本领域内熟知的并常用的临床标准以及如下文所述的临床标准，接受按照本公开内容的治疗的患有异常的B细胞活性相关疾病的患者可以表现出对于所述治疗的总体有益反应。
例如，在受累于风湿性关节炎的患者中，所述给药可以以临床显著程度改善患者的疾病状态[例如达到AmericanCollegeofRheumatologyPreliminaryDetectionofImprovement(美国风湿病学院改善的初步检测)(ACR20)]，和/或触痛的和肿胀的关节中20％的改善和3/5其他ACR测量中20％的改善(Felsonetal.,ArthritisRheum.1995,38:727-35)。在CD37特异性和CD20特异性结合分子的给药后，RA患者中对于改善的生物测量包括通过蛋白或RNA水平测量的细胞因子水平的测量改变。感兴趣的细胞因子包括但不限于，TNF-α、IL-1、干扰素、Blys和APRIL。细胞因子改变可以是由于减少的B细胞数或减少的活化的T细胞。在RA患者中，在CD20特异性结合分子的给药之前和之后，测量骨更新(骨再吸收或侵蚀)相关的标记。相关的标记包括但不限于，碱性磷酸酶、骨钙蛋白、胶原分解片段、羟基脯氨酸、耐酒石酸盐酸性磷酸酶,和RANK配体(RANKL)。RA的改善相关的其他指标包括C反应蛋白(CRP)水平、红细胞沉降率(ESR)、类风湿因子、CCP(瓜氨酸环肽)抗体的测量和通过流式细胞仪的***B细胞水平和淋巴细胞计数的评价。也可以从RA患者的滑膜测量特异性因子，包括来自滑膜活检的滑膜中B细胞水平、RANKL和上文列出的其他骨因子和细胞因子的水平的评价。
在相关方面，可以按照本领域内已知标准测量联合给药对于其他疾病的效果。例如，考虑到按照本发明治疗的克罗恩病患者实现克罗恩病活动指数(Crohn’sDiseaseActivityIndex)(CDAI)中的约50至约70单位的范围的改善，其中缓解是在150单位(Simonisetal,Scand.JGastroent.1998,33:283-8)。150或200的评分视为正常，而450的评分视为严重疾病评分。更理想的是CD37特异性和CD20特异性结合分子的给药导致受累于炎性肠病的个体中核周抗嗜中性粒细胞抗体(pANCA)和抗酿酒酵母抗体(ASCA)的减少。
还考虑到按照本公开内容治疗的成年和青少年肌炎患者可以实现核心系列评价的改善，例如所测量的核心系列的6个中的3个改善约20％，伴随不多于2个核心测量值恶化约25％(参见Rideretal.,ArthritisRheum.2004,50:2281-90)。
还考虑到按照本公开内容治疗的SLE患者可以实现至少1分的***性红斑狼疮活动测定(SystemicLupusActivityMeasure)(SLAM)或***性红斑狼疮疾病活动性指标(SLEDiseaseActivityIndex)(SLEDAI)评分的改善(Gladmanetal,JRheumatol1994,21:1468-71)(Tanetal.,ArthritisRheum.1982,25:1271-7)。>5的SLAM评分或>2的SLEDAI评分被视为临床活动性疾病。对于治疗的反应可以定义为2种疾病活动性测量(SLE疾病活动性指标[SLEDAI]和***性红斑狼疮活动测定)和2种生活质量测量(患者整体评价和Krupp疲劳程度量表(KruppFatigueSeverityScale))的改善或稳定(Petrietal.,ArthritisRheum.2004,50:2858-68.)。还考虑到将结合分子给予SLE患者导致抗双链DNA抗体的减少。可选地，可以使用使用大不列颠群岛狼疮评估组标准(BritishIslesLupusAssessmentGroupCriteria(BILAG))评估改善。
还考虑到按照本公开内容治疗的多发性硬化症患者可以实现至少0.5的Kurtzke扩充致残量表(KurtzkeExpandedDisabilitystatusscale)(EDSS)(Kurtzke,F.,Neurology1983,33:1444-52)上的临床评分的改善，或Kurtzke量表(Rudicketal.,Neurology1997,49:358-63)上至少1.0的临床疾病恶化的延迟。
还考虑到按照本公开内容治疗的患有IIM的患者可以实现特发性炎症性肌病标准(IIMC)(Miller,F.,同上)评价中列出的5个标准中的至少1个的减少。还考虑到对于IIM患者的给药可以导致选自以下的IIM相关因子的减少：肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶、醛缩酶，C反应蛋白，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)，和抗细胞核自身抗体(ANA)、肌炎特异性抗体(MSA)和对于可提取核抗原的抗体。可选地，患者满足Rideretal.，ArthritisRheum.，50(7):2281-2290(2004)中列出6个标准中的3个，而有不超过2个的标准恶化。
在一些实施方案中，根据本领域内熟知的和常用的临床标准以及如下文所述的临床标准，接受按照本公开内容的治疗的患有B细胞癌症的患者可以表现出对于所述治疗的总体有益的反应，例如肿瘤体积的减小、肿瘤数量的减少和/或疾病症状的改善。
示例性的临床标准由美国国立癌症研究所(U.S.NationalCancerInstitute(NCI))提供，美国国立癌症研究所已将某些种类的癌症分为“惰性(indolent)”和“侵略性(aggressive)”淋巴瘤的临床类别。惰性淋巴瘤包括滤泡细胞淋巴瘤，其被分为细胞学“等级(grades)”，弥散小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病(CLL)、淋巴浆细胞样/Waldenstrom巨球蛋白血症、边缘区淋巴瘤和多毛细胞性白血病。侵略性淋巴瘤包括弥散混合和大细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤/弥散小无核裂细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和AIDS相关淋巴瘤。在某些情况下，国际预后指数(InternationalPrognosticIndex(IPI))被用于侵略性和滤泡性淋巴瘤的情况。IPI中考虑的因素包括年龄(<60岁的年龄对>60岁的年龄)、血清乳酸脱氢酶(正常水平对升高水平)、体力状况(0或1对2-4)(参见下文定义)、疾病阶段(I或II对III或IV)和结外部位受累(0或1对2-4)。具有2种或更多风险因素的患者具有少于50％的无复发和5年的总存活时间的机会。
侵略性IPI中的表现状态按照以下定义：分级描述：0活动能力完全正常，能够进行所有疾病前活动而不受限制；1身体重体力活动受限，但能够走动并且能够进行轻松性质或坐式性质的工作，例如轻家务劳动、办公室工作；2能够走动并且能够全部自理但不能进行任何工作活动，达到和约大于50％的清醒时间；3仅能够有限的自理，受限于床或椅子，大于50％的清醒时间；4完全丧失劳动力，不能进行任何自理，完全受限于床或椅子；以及5死亡。(参见，TheInternationalNon-Hodgkin’sLymphomaPrognosticFactorsProject.Apredictivemodelforaggressivenon-Hodgkin’slymphoma(国际非霍奇金淋巴瘤预后因素计划.侵略性非霍奇金淋巴瘤的预测模型).N.Engl.J.Med.329:987–94,1993.)
通常，使用以下标准在临床上评估淋巴瘤的分级：低分级淋巴瘤通常表现为结节性疾病并且通常为惰性的或缓慢生长的。中分级和高分级疾病通常表现为更具侵略性的疾病，伴随大的结外大块肿瘤。
AnnArbor分类***也用于测量肿瘤的进展，特别是非霍奇金淋巴瘤。在该***中，根据患者具有(B)还是不具有(A)界定明确的全身症状，成人NHL的阶段I、II、III和IV可以被分为A和B类别。具有以下症状的患者指定为B：诊断前的6个月中不明原因的大于10％的体重丢失、不明原因的温度高于38℃的发热和湿透性盗汗。阶段的定义如下：阶段I-单一***区的受累或单一淋巴外器官或部位的的局部受累。阶段II-膈膜同侧2个或更多***区域的受累或单一相关淋巴外器官或部位及其区域性***的局部受累，伴随或不伴随膈膜同侧的其他***区域。阶段III-膈膜双侧的***区域的受累，可能伴随淋巴外器官或部位的局部受累、脾的受累或以上两者。阶段IV-一个或多个淋巴外部位的散布的(多病灶)受累，伴随或不伴随相关***受累或伴随远处(非区域性)结节受累的孤立的淋巴外器官受累。对于更多细节，参见TheInternationalNon-Hodgkin’sLymphomaPrognosticFactorsProject.Apredictivemodelforaggressivenon-Hodgkin’slymphoma(国际非霍奇金淋巴瘤预后因素计划.侵略性非霍奇金淋巴瘤的预测模型).N.Engl.J.Med.(1993)329:987-994。
在一方面中，通过反应水平测定按照本公开内容的方法的治疗效果，例如，部分反应被定义为肿瘤减小至小于其原始大小的1/2。完全反应被定义为通过临床或放射学评价的疾病的全部根除。在一个实施方案中，接受按照本发明的治疗的个体表现出至少对于治疗的部分反应。
按照与国家癌症研究所(NationalCancerInstitute)合作开发的用于评价NHL的Cheson标准(Chesonetal.,JClinOncol.1999,17:1244；Grillo-Lopezetal.,AnnOncol.2000,11:399-408)，当疾病和疾病相关症状的所有可检测的临床和放射照相证据完全消失、所有***恢复正常大小、脾体积退回和骨髓清除淋巴瘤时，获得完全反应。
当患者显示出疾病的完全消失和脾体积退回，但***退回大于75％并且骨髓不确定时，获得未经确认的完全反应。未经确认的完全反应满足并超出用于部分反应的标准。全部反应被定义为全部肿瘤负担的至少50％的减少。
已经开发用于各种其他形式的癌症或过度增殖性疾病的相似的标准并且对于本领域技术人员是可容易获得的。参见，例如Chesonetal.,ClinAdvHematolOncol.2006,4:4-5,其描述了用于评估CLL的标准；Chesonetal.,JClinOncol.2003,21:4642-9，其描述了用于AML的标准；Chesonetal.,Blood2000,96:3671-4，其描述了用于骨髓发育不良综合征的标准。
在另一方面，与未接受治疗的患者相比，患有B细胞癌症的患者中的治疗反应显示为疾病进展的减缓。可以使用本领域熟知的技术进行减缓的疾病进展或任何以上因素的测量，包括骨扫描、CT扫描、镓扫描、***造影照片、MRI、PET扫描、超声等。
作为其他方面，本公开内容包括试剂盒，其包含一种或多中在本公开内容的方法中有用的化合物或组合物，所述化合物或组合物按照便于其用于实践本公开内容的方法的方式进行包装。在最简单的实施方案中，该试剂盒包括本文所述的用于实践本公开内容的方法的化合物或组合物，其包装在例如密封瓶或容器的容器中，具有附着在所述容器的标签或包括在所述包装内的标签，所述标签描述所述化合物或组合物以实践本公开内容的方法的用途。优选地，所述化合物或组合物被包装在单位剂型中。所述试剂盒还可以包括适于按照优选的给药途径给予所述组合物或适于实践筛选检测的装置。所述试剂盒可以包括描述结合分子组合物在本公开内容的方法中的用途的标签。
实施例
实施例1
CD37特异性结合分子
可以用表2-4中提供的示例性的组分制备多种CD37特异性结合蛋白。例如，可以制备抗体或SMIP分子，并且这些分子可以是嵌合的、人源化的或人的。更具体地，优选的轻链可变区CDR见于SEQIDNOS:236-240和247-254并且优选的重链可变结构域CDR包括SEQIDNOS:241-245和247-254。同样，优选的轻和重链可变区分别提供在SEQIDNOS:236-240和SEQIDNOS:241-245中。优选的轻和重链可变区还可以见于SEQIDNOS:247-254。优选的可变结构域连接子包括SEQIDNOS:225-229，同时优选的铰链包括SEQIDNOS:230-235。
特别优选的实施方案是CAS-024[G28-1VH(M99F,Y102S)-VL(T25A)scFv(SSC-P)HWCH2WCH3]，其是结合人CD37的重组的483个氨基酸单链融合蛋白。该结合结构域包含基于G28-1抗体可变区CDR的人源化scFv，包括重链CDR3和轻链CDR1中的突变。所述可变结构域由(G4S)5(25个氨基酸)序列(SEQIDNO:229)连接，其通过三个氨基酸的接头(GDQ)连接到修饰的上游和核心IgG1铰链区的氨基末端(其中存在于这些铰链区的3个半胱氨酸的前2个每个都被丝氨酸取代)。该铰链的羧基末端融合到包含IgG1的CH2和CH3结构域的效应结构域。CAS-024的氨基酸序列在SEQIDNO:253中列出。图1显示出小鼠G28.1和CAS-024序列的重链和轻链可变区氨基酸序列比对，以及共有的同一性序列。
表1.示例性的CD-37特异性SMIP构建体
*词目代表关于IgG1铰链的缩写，所述IgG1铰链具有见于上游区和核心区内的仅第一半胱氨酸或第一和第二半胱氨酸的突变。仅有的例外是SEQIDNO:84，其描述了使用的全长铰链氨基酸(CPPCP，SEQIDNO:230)序列(基本上，仅为在末端具有脯氨酸的核心IgG1序列).
突变编码是基于Kabat编码制。
下表中提供可以用于例如SMIP分子或抗体的CD-37特异性结合分子的其他铰链区。
表2.CD37特异性结合蛋白的示例性铰链区
下表中提供可以用于例如SMIP分子或抗体的CD-37特异性结合分子的其他框架区。
表3A.CD-37特异性结合蛋白的人重链框架区
表3B.CD-37特异性结合蛋白的人轻链框架区
表4中提供优选的示例性的CD-37特异性SMIP分子(包括用于表达和输出的前导序列，但是当从细胞输出时，从成熟融合蛋白移除；用于连接轻链和重链可变结构域以形成scFv结合结构域的连接子序列；用于将scFv结合结构域连接到效应结构域的铰链；和效应结构域)的组成部分，以及包括优选的CAS-024融合蛋白的某些CD-37特异性SMIP分子。
表4.SMIP组成部分和选择CD37特异性SMIP多肽
实施例2
CAS-024和其他CD37特异性结合蛋白的表达
将CAS-024和其他CD37特异性结合SMIP分子克隆到中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞表达***中。产生SMIP分子的转染的CHO细胞在摇瓶中培养并且使用OctecQ蛋白A感应器滴定收获的细胞培养上清。
表5显示出CAS-024构建体(具有25个氨基酸的可变结构域连接子的VHVL形式)具有预料不到的高的表达水平，高达强于其他人源化抗CD37SMIP分子(大部分是具有15个氨基酸的可变结构域连接子的VLVH形式)约10倍。实际上，所有完全人源化的VLVH构建体弱表达(数据未显示)，以任一方向的小鼠-人杂交分子同样弱表达(参见实施例5)。
表5.SMIP表达
SMIP蛋白 筛选的克隆 蛋白滴定度范围(μg/ml)
CAS-001 492 65–80
CAS-002 425 200–280
CAS-003 611 300–360
CAS-024 203 500–650
实施例3
CAS-024和其他CD37特异性结合蛋白的纯化和尺寸排阻色谱法
为了产生更多蛋白，将编码CAS-024和数个其他CD37特异性结合SMIP分子的核酸克隆到中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞表达***中。产生SMIP分子的转染的CHO细胞在摇瓶中培养。
通过蛋白A亲和力色谱法从CHO培养物上清纯化所有的CD37特异性结合SMIP分子。用dPBS以5.0mls/min(150cm/hr)平衡50ml的rProteinAFF琼脂糖柱(GEHealthcare)，平衡1.5倍柱体积(CV)。使用AKTAExplorer100Air(GEhealthcare)以1.7mls/min的流速将培养物上清上样至rProteinA琼脂糖FF柱，捕获重组SMIP分子。用dPBS洗涤该柱5倍柱体积(CV)，然后用1.0MNaCl、20mM磷酸钠、pH6.0洗涤，并且然后用25mMNaCl、25mMNaOAc，pH5.0洗涤。用100mM甘氨酸、pH3.5从柱中洗脱重组CD37特异性结合分子。回收洗脱产物的组分(10mL)，然后用20％的洗脱体积的0.5M2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、pH6.0调整到pH5.0。将该洗脱产物浓缩至约25mg/mL蛋白并过滤灭菌。
通过GPC尺寸排阻色谱法(SEC)进一步纯化该浓缩灭菌蛋白以实现从较高分子量聚集物分离SMIP(二聚体)分子。用dPBS以12.6ml/min(38cm/min)平衡含有1L的Superdex200FF琼脂糖的XK50/100柱(GEhealthcare)，平衡1.5倍柱体积(CV)。将54ml(3％CV)样品的最大体积施加到柱上。该柱以12.6ml/min持续运行并且洗脱的蛋白被分在40ml组分中。使用分析HPLC分析每种组分的产物质量，并且将洗脱的蛋白合并为大于约95％的目的蛋白(非聚集的)。得到的合并物以0.22μm进行过滤灭菌、浓缩，然后用20mM磷酸钠、240mM蔗糖、pH6.0进行配制。
CAS-001(SEQIDNO:6)、CAS-002(SEQIDNO:48)、CAS-003(SEQIDNO:52)和CAS-024(SEQIDNO:253)显示含有目的蛋白(POI)的峰的SEC追踪分别显示在图2A-2D中。CAS-024峰比CAS-001、CAS-002和CAS-003样品(更宽并且不对称)更窄并且更为对称。CAS-006(嵌合的)分子产生类似于CAS-024的尖锐峰。CAS-001、CAS-002和CAS-003样品都具有缓的拖尾肩部，如果进行积分，其占据约35％的POI区域。该“肩部”难以从POI分离并且可能代表错误折叠的构象异构体或异质分子群体(例如具有不同糖基化水平)。这表明CAS-024不仅表达得较高，而且该构健体还产生更同质的分子群体。
实施例4
CAS-024细胞结合出乎意料地高于其他CD37特异性结合蛋白
竞争检测被用于比较不同抗CD37特异性小模块化免疫药物(SMIP)分子对存在于Ramos细胞(源自伯基特淋巴瘤的B成淋巴细胞细胞系)上的CD-37的结合亲和力。SEC纯化的嵌合抗CD37SMIP分子(CAS-006，SEQIDNO:247)用FMAT荧光染料(AppliedBio***)标记并用作标准物与纯化的未标记的嵌合抗CD37SMIP分子(阳性对照)和纯化的未标记的人源化抗CD37SMIP测试分子竞争。较高的亲和力显示为较弱的荧光信号，并且FL1荧光值被用于产生竞争曲线。简言之，试剂FMAT标记的嵌合抗CD37SMIP分子在FACS封闭缓冲液被稀释到2μg/ml并且将纯化的蛋白样品(CAS-001(SEQIDNO:6)、CAS-002(SEQIDNO:48)、CAS-003(SEQIDNO:52)和CAS-024(SEQIDNO:253))以1:2连续稀释至范围为50μg/ml至0.02μg/ml的浓度。以1000rpm收获Ramos细胞5分钟并以4×106细胞/10ml缓冲液重悬于FACS封闭缓冲液。将下述物质添加至避光96孔板的每个孔中：50μl样品、50μlFMAT标记的嵌合抗CD37SMIP分子和50μlRamos细胞(4×104/孔)。将板在室温孵育30分钟并在8200细胞检测***(AppliedBiosystems)上读取，将门设为中等细胞大小和低信号。
该FMAT竞争检测显示出CAS-024(具有VHVLscFv的人源化抗CD37SMIP分子，具有25个氨基酸的可变结构域连接子)具有与母体嵌合抗CD37SMIP分子相同的对CD37的亲和力，与之相对，CAS-024具有预料不到的超过人源化抗CD37SMIP分子高达4倍的对CD37的亲和力(参见图3)，所述人源化抗CD37SMIP分子具有反向VLVH结构和较短的16个氨基酸的可变结构域连接子。最好的结合，尽管仍显著弱于CAS-006或CAS-024，见于VLVH构建体，其不具有任何CDR突变(CAS-001)。但是，CAS-001始终是最差的表达构建体并且产生纯化的分子的非同质群体-即使对于该构建体，CAS-024结合强于CAS-0011.5至2倍。
该结果令人意外还因为CAS-024的重链CDR3中的M99和Y102被突变-Y102位置通常是保守的，并且预测该位置单独的改变会减少或甚至消除结合(例如在位置Y102突变的CAS-062，与CAS-001或CAS-024相比，具有可检测的但严重降低的结合，而当添加位置M99或D101突变时，CAS-063至CAS-067的每个在该检测中具有几乎检测不到的结合活性至没有结合活性，数据未显示)。因此，CAS-024的结构提供出人意料结合的分子以及嵌合的分子，CAS-006。
实施例5
CAS-024与小鼠-人杂交CD37特异性结合蛋白相比的表达和细胞结合
CAS-024和其他CD37特异性结合SMIP分子通过重组DNA技术产生，并被转染到HEK293细胞中7天。第7天收获细胞培养物上清并使用OctecQ蛋白A感应器进行滴定。
与实施例2中所见结果相似，表6显示出CAS-024(具有25个氨基酸的可变结构域连接子的VHVL形式)表达高于其他人源化或小鼠-人杂交抗CD37SMIP分子约5倍至约27倍。小鼠-人杂交分子未良好表达，无论是VHVL方向或VLVH方向。
表6.SMIP表达
SMIP蛋白 蛋白滴定度(μg/ml)
CAS-002(hVLhVH) 0.47
CAS-003(hVLhVH) 2.39
CAS-014(mVHhVL) 2.16
CAS-017(hVLmVH) 0.70
CAS-006(mVLmVH) 9.3
CAS-024(hVHhVL) 12.7
如实施例4中所示的竞争检测被用于比较不同小鼠-人杂交抗CD37SMIP分子相比CAS-024与Ramos细胞的结合的结合亲和力。SEC纯化的嵌合抗CD37SMIP分子(CAS-006，SEQIDNO:247)用FMAT荧光染料(AppliedBiosystems)标记，并被用作标准物与纯化的未标记的嵌合抗CD37SMIP分子(CAS-006，阳性对照)和纯化的未标记的人源化抗CD37SMIP测试分子-CAS-002(SEQIDNO:48)、CAS-003(SEQIDNO:52)、CAS-014(SEQIDNO:251)、CAS-017(SEQIDNO:252)和CAS-024(SEQIDNO:253)竞争。
该FMAT竞争检测再次显示出CAS-024(具有25个氨基酸的连接子的VHVL人源化分子)具有与母体嵌合抗CD37SMIP分子(CAS-006)相同的对CD37的亲和力，而CAS-002和CAS-003(具有16个氨基酸的连接子的VLVH人源化分子)没有很好结合(显示出2至3倍的减少)(参见图4A)。小鼠-人杂交分子，不管可变结构域方向(具有22个氨基酸的连接子的小鼠VH-人源化VL或具有16个氨基酸的连接子的人源化VL-小鼠VH)，结合与CAS-006和CAS-024同样好或甚至好于CAS-006和CAS-024(1.5至2倍)(参见图4B)。这些数据显示，无突变的小鼠-人杂交分子结合与CAS-006同样好或甚至好于CAS-006，不管方向如何，并且无CDR突变的完全人源化的VLVH构建体比其他人源化分子更好地结合，但与CAS-006或CAS-024相比仍具有减少的结合。总之，这些数据提示对于该分子，CDR中没有突变会是更好的结合剂。同样，特定顺序(VLVH或VHVL)看起来未解决表达问题，即使在使用更长的可变结构域连接子时(参见CAS-014)。因此，选择具有CAS-024结构和相似于母体分子CAS-006的性质的分子是预料不到的。
实施例6
CAS-006和多种CD37特异性抗体结合CD37上的相同或重叠表位
进行实验来鉴定CAS-006和其他之前描述的CD37特异性抗体所结合的CD37表位。未偶联的MB371(#555457)和FITC偶联的MB371(#555456)获自BDPharmingen(SanJose,CA)，FITC偶联的BL14(#0457)来自Immunotech/BeckmanCoulter(Fullerton,CA)，FITC偶联的NMN46(#RDI-CBL136FT)和未偶联的NMN46(#RDI-CBL136)来自RDI(Flanders,NJ)，FITC偶联的IPO24(#186-040)和未偶联的IPO-24(#186-020)来自AncellCorporation(Bayport,MN)，FITC偶联的HHI(#3081)和未偶联的HH1(#3080)来自DiaTec.Com(Oslo,Norway)以及FITC偶联的WR17(YSRTMCA483F)和未偶联的WR17(YSRTMCA483S)来自AccurateChemical&Scientific(Westbury,NY)。按照实施例2中所述产生CAS-006SMIP蛋白。
使用分子探针荧光报告子FITC标记试剂盒(MolecularProbesFluororeporterFITCLabelingKit，F6434)，按照生产商的使用说明书如下将CAS-006与FITC偶联：用PBS将13.5mg/mL的CAS-006蛋白目的峰(POI)调整至5mg/mL。用搅拌棒将1mg(200μl)添加到试剂盒管中，并加入1MNaHCO3(用6NNaOH调整至pH8.5)至0.1M的终浓度。将50μlDMSO添加到370μgFITC并以15、20、30和40FITC:蛋白的摩尔比添加到管中，使用以下公式确定加入的FITC的微升数：[加入的FITC溶液的微升数＝5mg/mL蛋白×0.2ml×389×100×所需摩尔比/CAS-006的分子量(110,000)]。
避光进行反应并在室温持续搅动75分钟。将反应添加到按照试剂盒描述制备的离心柱并以1100g离心5分钟，从而缓冲液更换至含有叠氮化物的PBS并去除未偶联的FITC。用2μl小滴在Nanodrop上测定280nM和494nM的OD；通过读取起始未偶联的SMIP分子的稀释液，实验测定CAS-016对于该仪器的消光系数，每种偶联物的浓度为4.25mg/ml并且测定以下FITC:蛋白比例：2.7FITC/CAS-016的比例为15；3.7FITC/CAS-016的比例为20；4.4FITC/CAS-016的比例为30；并且5.1FITC/CAS-016的比例为40。
添加BSA至3mg/mL以帮助稳定蛋白。以100-24300×的稀释范围评价每种组分在Ramos上的结合，以及以3200-25600的稀释范围评价每种组分在人PBMC上的结合。所有都结合，但是选择MR30比用于进一步使用，因为它给出在使用的滴定范围被良好保持的高MFI，这表明结合活性在该反应中受最少的影响。
在开始的结合研究中，从10ng/mL至10μg/mL滴定FITC标记的抗体偶联物以确定在阻断研究中使用的最佳量。选择的水平恰低于饱和量，并在后续检测中保持不变，同时阻断抗体的水平增加至超过10倍范围。以最大结合的百分比对阻断抗体的浓度将数据绘图，这样较高水平表示较无效的阻断，而较低水平表示较有效的阻断活性。所有测试的抗体显示出无未标记的试剂所观察到的最大结合的阻断活性(图5)。
然后用一组抗CD37mAb的不同克隆对BJAB细胞，一种成淋巴细胞样B细胞系进行染色，所述不同克隆包括MB371、BL14、NMN46、IPO24、HH1、WR17和嵌合的CAS-006SMIP。
对于竞争性结合检测，2.5×105BJAB细胞在96孔V型底板、在染色培养基(具有2％小鼠血清的PBS)中用1.25μg/mL的FITC偶联的抗CD37mAb(在指示浓度(2.5、1.25、0.6或0.3μg/ml)的未偶联的抗CD37MAb存在下)或用染色培养基于冰上避光孵育45分钟。在添加细胞前，将阻断抗体和FITC标记的抗体偶联物加入反应。然后，用PBS洗涤细胞2.5次并且用1％多聚甲醛(USB,Cleveland,Ohio)固定。通过流式细胞仪、使用FACsCalibur仪器和CellQuest软件(BDBiosciences,SanJose,CA)分析处理过的细胞。
对于FACs交叉阻断检测，2.5×105BJAB细胞在96孔V型底板、在5μg/ml的未偶联的抗CD37MAb存在下的染色培养基(具有2％小鼠血清的PBS)中或染色培养基中于室温避光孵育45分钟。添加FITC偶联的抗CD37mAb至2μg/ml的终浓度，导致未标记的试剂稀释至3.3μg/ml。将反应在室温避光再孵育45分钟，然后用PBS洗涤2.5次，并最终在PBS中的1％多聚甲醛中(USB,Cleveland,Ohio)固定。通过流式细胞仪、在FACsCalibur仪器上、使用CellQuest软件(BDBiosciences,SanJose,CA)分析细胞。
对于细胞结合检测，在含有2％FBS(Gibco/Invitrogen)的PBS(Gibco/Invitrogen,GrandIslandNY)，(染色培养基)以约4×106细胞/mL的浓度悬浮细胞。然后，将细胞铺板，然后将在染色培养基中稀释的测试样品以1:1添加至最终指定的浓度。在冰上孵育反应45分钟。离心样品并用PBS洗涤2次。以1:50的最终稀释添加FITC山羊抗人IgG(CalTag，BurlingameCA)，并且在冰上孵育45分钟。离心样品，在PBS中洗涤，然后在200μl的PBS中的1％多聚甲醛(USB，Cleveland，Ohio)中固定。通过流式细胞仪、在FACsCalibur仪器上、使用CellQuest软件(BDBiosciences,SanJose,CA)分析细胞。
每种抗体显示出剂量依赖性的结合抑制，表明所有测试分子与相同的或密切相关的表位结合。对于每种抗体，观察到不同的对于结合抑制的效价。CAS-006SMIP具有所有测试分子中的最高水平的阻断活性，同时HH1给出中等水平的阻断活性，并且WR17、IPO24比MB371更好地阻断，但显示出比另外两个未标记的分子更低效的阻断(图5)。
在阻断活性的分析之外，进行相似系列的实验，其中测试多种CD37靶向的抗体彼此竞争与CD37受体的结合的能力。来自这些实验的结果，与对于所有测试分子的阻断研究中获得的结果相似，表明多种CD37靶向的抗体和CAS-006具有相同或紧密重叠的表位。
实施例7
SCID小鼠中建立的皮下人肿瘤(DOHH2)异种移植物模型中的CAS-024的剂量反应
该实验的目的是测定在SCID小鼠中建立的皮下人肿瘤(DOHH2)异种移植物模型中用CAS-024处理的剂量反应。DOHH2是源自患有滤泡性淋巴瘤的患者的CD20+CD37+人B成淋巴细胞样细胞系(Kluin-Nelemansetal.,Leukemia5:221,1991)。因此，DOHH2源自患有非伯基特NHL的患者。
将5百万个DOHH2细胞皮下注射至雌性CB-17SCID小鼠(Harlan,Somerville,NJ)的侧腹，所述小鼠为6.5周龄，平均重量为18.0±0.1g(范围从14.6至22.6g)。肿瘤接种后第8天，多数小鼠中出现可触及的肿瘤。将荷瘤小鼠分为具有相当平均肿瘤体积的4组(每组n＝14；对于每组，2笼5只小鼠和1笼4只小鼠)。分组当天定义为第0天。用一对测径器测量肿瘤直径并使用以下公式计算肿瘤体积：V＝1/2[长度×(宽度)2]。基线平均肿瘤体积为228mm3，中位基线肿瘤大小为224mm3，并且范围为179至284mm3。
表7.体内使用的试剂
在第0天、第4天和第8天，通过IP注射0.2ml含有200μghuIgG(阴性对照)或200、100、30、10或3μgCAS-024的PBS治疗荷瘤组SCID小鼠。在注射当天配制两个最低剂量的CAS-024溶液以避免需要向最大稀释的溶液添加载体蛋白。药物溶液按照下文所述进行颜色编码(参见下文表8)。
表8.实验设计
a表示huIgG和CAS-024是按照μg/小鼠，而不是mg/kg进行递送的。标注大约的mg/kg是为了方便，并基于第0天小鼠的平均体重(18.0±0.1g)。本实验中的体重范围是14.6至22.6g。
按相似体积制备剂量溶液并且在可去除的标签上记录管中的内容物。未进行治疗或评估小鼠的研究者在每只管上放置颜色编码并且在实验记录本上记录编码和管内容物的名份。每天通过视觉检查监测小鼠。每周测定重量，并且每周至少3次(M、W、F)由对于治疗组不知情的观察者(参见上文)测定肿瘤直径。如上文所述计算肿瘤体积。如果小鼠的肿瘤体积达到大于1500mm3(或星期五时(onFridays)1200mm3)，则小鼠被施以安乐死。在肿瘤实验设计中死亡不是终点，并且除非另外说明，由小鼠因为它的肿瘤体积达到预定限度而被施以安乐死的时间确定小鼠的“存活”。(如果(1)小鼠的肿瘤体积超出上文所述的参数，(2)发生肿瘤的溃疡，(3)肿瘤抑制小鼠的活动度，和(4)体重降低超过20％的体重，实验设计指示对小鼠施以安乐死)。
在第35天，CAS-024100μg治疗组中的1只小鼠由于体重降低>20％被施以安乐死。该小鼠在当时具有266mm3的肿瘤体积，被作为对于存活分析的检剔数据对待(不是在第35天时由于肿瘤生长而被施以安乐死)。对于研究结束时无肿瘤发生率的计算，该小鼠被归为在研究期间由于其肿瘤的生长而被施以安乐死的一只(其肿瘤在死亡时正在生长回来)。未发现其他小鼠死亡并且没有小鼠因为体重降低、肿瘤溃疡或受损的活动度而被施以安乐死。在任何治疗组中未观察到毒性或体重降低的明显迹象(数据未显示)。
使用GraphPadPrism软件进行所有统计分析。利用采用Dunn's验后多重比较的用于非参数数据的单向方差分析(Kruskal-Wallis检验)来确定平均肿瘤体积和平均相对肿瘤体积的显著差异。为了检测CAS-024治疗组和huIgG组每个之间的差异，比较所有组。对于仅CAS-024组之间的比较，排除huIgG组。此外，将高和中剂量(200、100和30μg)组作为一个数据集进行分析，并且将中和低剂量(30、10和3μg)组作为另一数据集进行分析。使用Kaplan-Meier存活分析确定随时间小鼠存活的显著差异，所述Kaplan-Meier存活分析利用用于比较存活曲线的对数秩检验。使用Fisher's精确检验确定无肿瘤小鼠的发生率的显著差异，p值<0.05被视为具有显著性。
CAS-024对于DOHH2肿瘤的生长具有剂量依赖性抑制效应。除低(3μg)剂量方案组外，每个CAS-024治疗组的平均肿瘤体积早至第5天就显著低于人IgG治疗组的平均肿瘤体积，并且保持较低直至第12天。第12天起huIgG治疗的小鼠被施以安乐死；因此，对于较后的时间点，未进行CAS-024治疗组与huIgG组的肿瘤体积的比较。在剂量反应方面，在研究中的任何点，两个最高剂量组的平均肿瘤体积无显著差异。相反，从第12天直至第16天(对于低剂量组，第16天是最后一个评价时间点)，这两个组的平均肿瘤体积与三个较低剂量组中的每一组的平均肿瘤体积显著不同。相似地，在该相同的时间段，30μg和10μg剂量组的小鼠的平均肿瘤体积彼此不同并且不同于低剂量组。
用huIgG治疗的小鼠中的肿瘤快速生长，并且在第19天对该组中所有小鼠施以安乐死。如下文表9和10中所总结，相对于huIgG治疗组，用任何CAS-024剂量方案治疗的小鼠的存活延长(在所有病例中p<0.0001)。在剂量反应反面，用最高(200和100μg)剂量方案治疗的小鼠的存活曲线无显著差异(p＝0.7091)。除了该组比较之外，每个剂量组的存活曲线和用较低剂量方案治疗的每个组的存活曲线之间存在显著差异(p值范围从0.0132至小于0.0001)。
表9.中位存活时间和无肿瘤小鼠的发生率
a在第0天、第4天和第8天通过腹膜内注射用所示的蛋白治疗小鼠。数字表示每天注射的蛋白的量(μg)。
b由小鼠因为肿瘤生长而被施以安乐死的那天确定小鼠的“存活”。在第35天，CAS-024100μg剂量组中的1只小鼠由于体重降低>20％而被施以安乐死。该小鼠在当时具有266mm3的肿瘤体积，并且对于KaplanMeier分析作为检剔数据对待(到第35天肿瘤体积未达到预定限度)。没有其它小鼠因为除了其肿瘤体积未达到预定限度之外的原因而被施以安乐死。
c“无肿瘤”小鼠没有可触及的SC肿瘤；未通过组织学确认肿瘤细胞不存在。该研究至第61天时结束。
d每组与HuIgG治疗对照组比较。
e当大于50％的小鼠在观察期结束时存活时，中位存活时间是不明确的。.
f粗体的值表示标明的组的存活曲线显著不同于HuIgG对照的存活曲线(每个病例中p<0.0001，对数秩检验)。
g粗体的值显著不同于huIgG治疗的对照组。
h在第35天，1只小鼠由于体重降低>20％而被施以安乐死。该小鼠在当时具有266mm3的肿瘤体积，并且对于KaplanMeier分析作为检剔数据对待。
表10.CAS-024治疗组之间存活曲线和无肿瘤发生率的比较的p值
a对于各组的信息，参见表7的说明。
b粗体的p值<0.05是用于强调。
huIgG治疗组和两个最低(10和3μg)CAS-024剂量组中的所有小鼠由于其肿瘤的生长而被施以安乐死。相反，用200或100μg的CAS-024治疗的小鼠组中的大部分肿瘤消退到不存在可触及的肿瘤的情况。研究结束时，两个最高剂量组的每一组中11/14(79％)的小鼠和30μg剂量组中5/14(36％)的小鼠仍然无肿瘤(与huIgG组相比，p分别小于0.0001和0.0407)。
因此，CAS-024表现出对SCID小鼠中建立的皮下人肿瘤(DOHH2)异种移植物的生长的剂量依赖性抑制作用。两个最高剂量方案(每次IP注射100或200μg；累积剂量为300或600μg，分别相当于约16.7或33mg/kg)具有相似的抑制作用并且在抑制肿瘤生长、延长存活和引起完全肿瘤消退方面是测试方案中最有效的。
实施例8
CAS-024和利妥昔单抗作为单一试剂在SCID小鼠中建立的人肿瘤(DOHH2)异种移植物模型中的功效
本研究的目的是检测CAS-024和利妥昔单抗作为单一试剂在SCID小鼠中建立的人肿瘤(DOHH2)异种移植物模型中的功效。如上文所述，DOHH2是源自患有滤泡性淋巴瘤的患者的CD20+CD37+人B成淋巴细胞样细胞系。
将5百万个DOHH2细胞皮下注射到6.5周龄的雌性CB-17SCID小鼠(Harlan,Somerville,NJ)的侧腹。肿瘤接种后第8天，在大部分小鼠中出现可触及的肿瘤。将荷瘤小鼠分为具有相当平均肿瘤体积的4个组(每组n＝15；对于每组，每笼5只小鼠，共3笼)。分组当天被定义为研究的第0天。用一对测径器测量肿瘤直径并使用以下公式计算肿瘤体积：V＝1/2[长度×(宽度)2]3。基线平均肿瘤体积为228mm3；中位基线肿瘤体积为227mm；并且范围从181至272mm3。在第0天、第4天和第8天，通过IP注射0.2ml的含有200μg人IgG、CAS-024或利妥昔单抗(三次治疗后总共600μg)的PBS治疗小鼠(每治疗组15只)。对于huIgG、CAS-024和利妥昔单抗IP治疗组，以相似体积制备溶液并且在可去除的标签上记录管的内容物。未进行治疗或评估小鼠的研究者在每个管上放置颜色编码并且在实验记录本上记录编码和管内容物的名份。
每天通过视觉检查监测小鼠。每周测定重量，并且每周至少3次(M、W、F)由对于治疗组不知情的观察者(参见上文)测定肿瘤直径。如上文所述计算肿瘤体积。每组中所有小鼠都活着的最后一天的肿瘤体积还使用以下公式表示为相对于第0天的肿瘤体积：第目的天的相对肿瘤体积＝(第目的天的体积-第0天的体积)/第0天的体积
如果小鼠的肿瘤体积达到大于1500mm3(或星期五时1200mm3)，则对小鼠施以安乐死。在我们的肿瘤实验设计中死亡不是终点，并且除非另外说明，由小鼠因为它的肿瘤体积达到预定限度而被施以安乐死的时间确定小鼠的“存活”。(如果小鼠的肿瘤体积超出上文所述的参数、发生肿瘤的溃疡、肿瘤抑制小鼠的活动度或体重降低超过20％，我们的实验设计指示对小鼠施以安乐死)。
使用GraphPadPrism软件进行所有统计分析。使用采用Dunn's验后多重比较的用于非参数数据的单向方差分析(Kruskal-Wallis检验)来确定平均肿瘤体积和平均相对肿瘤体积的显著差异。使用Kaplan-Meier存活分析确定随时间小鼠存活的显著差异，所述Kaplan-Meier存活分析利用用于比较存活曲线的对数秩检验。使用Fisher's精确检验确定无肿瘤小鼠的发生率的显著差异(p值<0.05被视为具有显著性)。
当小鼠的肿瘤体积达到上文所述限度时，小鼠被施以安乐死。在第45天，CAS-024治疗组中的1只小鼠由于体重降低>20％被施以安乐死。该小鼠在当时不具有明显的SC肿瘤，对于存活分析作为检剔数据对待(不是在第45天时由于肿瘤生长而被施以安乐死)，并且不包括在研究结束时无肿瘤发生率的比较中。未发现其他小鼠死亡并且没有小鼠因为体重降低、肿瘤溃疡或受损的活动度而被施以安乐死。在任何治疗组中未观察到毒性或体重降低的明显迹象(数据未显示)。
CAS-024和利妥昔单抗治疗的小鼠表现出对于治疗的快速反应。早至第4天(单次药物注射后)，CAS-024和利妥昔单抗治疗组的平均肿瘤体积显著低于人IgG治疗组的平均肿瘤体积并且仍然低于人IgG治疗组的平均肿瘤体积直至第11天。直至第11天，CAS-024和利妥昔单抗治疗组之间的平均肿瘤体积或平均相对肿瘤体积无显著差异。第11天起对huIgG治疗的小鼠施以安乐死；因此，在更后的时间点未进行肿瘤体积的比较。
用huIgG治疗的小鼠中的肿瘤快速生长，并且到第15天对该组中所有小鼠施以安乐死。相反，到第15天，CAS-024和利妥昔单抗治疗组中的大部分肿瘤已消退到不存在可触及的肿瘤的情况。特别是，仅在CAS-024治疗组中对于治疗的反应是持久的。到研究结束时，所有利妥昔单抗治疗的小鼠由于其肿瘤生长而被施以安乐死，然而CAS-024治疗组中的10/14(71％)的小鼠仍然是无肿瘤的。参见表9。因此，在实验结束时，CAS-024治疗组中的存活曲线和无肿瘤小鼠的发生率与huIgG对照组和利妥昔单抗治疗组显著不同。图6显示出在滤泡性淋巴瘤的该动物模型的体内治疗中，CAS-024统计学上优于利妥昔单抗。
表11.中位存活时间和无肿瘤小鼠的发生率
a通过小鼠因为肿瘤生长而被施以安乐死的那天确定小鼠的“存活”。除CAS-024剂量组中的1只小鼠外(参见(f))，没有小鼠因为除了其肿瘤体积达到预定限度之外的原因而被施以安乐死。
b每组与HuIgG治疗的对照组比较。
c“无肿瘤”小鼠没有可触及的SC肿瘤；未通过组织学确认肿瘤细胞不存在。
d当大于50％的小鼠在观察期结束时存活时，中位存活时间是不明确的。
e粗体的值显著不同于HuIgG对照的值。
f在第45天，1只小鼠由于体重降低>20％而被施以安乐死。该小鼠在当时没有明显的SC肿瘤，并且被排除在第81天时用于无肿瘤小鼠比较的组之外。
综上，CAS-024和利妥昔单抗作为单一试剂在SCID小鼠中的人肿瘤(DOHH2)异种移植物模型中是有效的。尽管两种试剂都引起大部分小鼠中的初始肿瘤消退，仅在用CAS-024治疗的小鼠组中观察到长期的肿瘤消退，因为最佳的抗CD20治疗后肿瘤复发。因此，CAS-024，人源化抗CD37SMIP，表现出在临床前肿瘤异种移植物模型中的显著功效，所述模型包括证明了利妥昔单抗治疗随时间无效的模型。因此，这些结果表明，B细胞淋巴瘤和白血病患者的CAS-024治疗是有益的，并且对于利妥昔单抗治疗无效的患者是可行的替代治疗。
实施例9
CAS-024联合化学治疗剂的体外评价
之前已证明，CAS-006与化学治疗剂氟达拉滨联合时协同作用，在体外杀死慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞(参见，例如美国专利申请公布第2007/0059306号)。由于CLL细胞在体外细胞培养中***不活跃，所以对于CAS-006或CAS-024与化学治疗剂的协同作用，该数据表明细胞增殖不是CAS-006或CAS-024的促凋亡作用所需要的。因此本研究的目的是确定CAS-024和各种化学治疗剂对于在体外细胞培养中活跃生长和***的套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系Rec-1是否有效，以及CAS-024和化学治疗剂(药物)的联合会使套细胞淋巴瘤细胞对于不同化学治疗剂的反应脱敏还是增强该反应。测试的化学治疗剂为用于治疗非霍奇金淋巴瘤和其他淋巴样恶性肿瘤的阿霉素、长春新碱和氟达拉滨。
测试了从患有套细胞淋巴瘤的患者建立的CD37+人B细胞系Rec-1细胞在存在或不存在阿霉素、长春新碱或氟达拉滨的情况下应答交联的CAS-024的生长抑制(参见图7)。CAS-024与抗人IgGF(ab)'2预先孵育以交联蛋白。单独用培养基培养细胞或用含有不同浓度的交联的CAS-024蛋白的培养基、在存在或不存在不同浓度的阿霉素、长春新碱或氟达拉滨的情况下培养细胞。孵育细胞96小时并且使用ATP活性细胞检测***评价生长抑制(即通过ATP释放定量活性细胞)。
使用Chou和Talalay(Adv.EnzymeRegul.22:27,1984)的中位效应/联合指数(CI)方法用于数据分析。以预先定义的剂量水平分配给每种药物组合的数值使得能够进行不同药物组合之间的定量的药物/药物相互作用比较。结果表示为联合指数(CI)相比于效应水平，其中效应水平代表细胞生长的抑制百分比。将三次实验平均得到对于每个效应水平的平均CI±平均数标准误差(SEM)。CI<1.0被视为协同作用，CI＝1.0为相加作用，以及CI>1.0为拮抗作用。提供的值为将三个独立检测进行平均的对于每个效应水平的平均值±SEM。
CAS-024与长春新碱或氟达拉滨的组合是协同的(CI<1.0)并且CAS-024和阿霉素的组合是相加的(CI与1.0无显著差异)。在所有效应水平中，CAS-024和化学治疗剂组合都不是拮抗的(CI>1.0)。因此，CAS-024与三种测试化学治疗剂中每一种的组合均未使靶细胞对于药物诱导的生长抑制不敏感，而是导致了对于靶细胞生长的协同或相加抑制作用。优选的实施方案为CAS-024(SEQIDNO:253)与长春新碱或氟达拉滨的组合。这些数据表明当已建立的化学治疗与CAS-024联合使用时，其功效增加。
实施例10
初步临床1/2期结果
如本文所提供的，临床前研究已表明，与CLL中使用的其他治疗抗体相比，CD37SMIP分子介导显著增强的慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞的直接杀伤和自然杀伤(NK)细胞介导的杀伤。因此，在患有复发的慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者中开始1/2期开放式剂量递增研究。
患有复发/难治性CLL或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)的、具有足够的器官功能的、血小板>30,000/mm3的患者是合格的。已研究了或将会研究6个剂量和2个不同安排(队列1-10)。计划的剂量范围从0.03mg/kg至10mg/kg，每周一次静脉内给药，进行4次剂量(队列1-6和9)。第二安排(队列7、8和10)将在第一周的第1天、第3天和第5天测试3.0、6.0或10.0mg/kg，然后是3次每周剂量。剂量递增和剂量递减是基于常见毒性标准不良反应(CommonToxicityCriteriaAdverseEvents(CTCAE))毒性分级。患者可以接受2个额外的周期，如果第一周期后是阳性生物效应。
结果：迄今为止，22名患者已经进行登记(队列1-7和9)并完成治疗(所有都接受了事先氟达拉滨和利妥昔单抗治疗)。6名患者已进入第二周期并且2名患者已进入第三周期。正被治疗的患者已经经历了很多事先方案(例如队列4患者具有从6至10(中位数为6)个事先方案并且队列5具有5至13(中位数为9.5)个事先方案)。10个中的8个具有高风险基因组特征[del(17p13.1)，n＝5和del(11q22.3)，n＝3]。未发生限制剂量的毒性或严重不良反应。在三名患者中观察到轻度(1-2级)输注毒性。以0.3mg/kg剂量开始，所有8名患者表现出生物活性的证据，包括具有del(17p13.1)的患者。2名患者具有皮肤白血病的部分清除，并且外周淋巴细胞计数的中位减少为64％(参见图5)。1名患者具有外周淋巴细胞计数的99％的减少，未伴随严重不良反应，并且在3个月治疗后具有持续反应(参见图6)。1名患者具有血红蛋白的40％的增加和按CT扫描测定的***大小的36％的减小，并且在3个月治疗后持续反应(参见图7)。2名患者具有血小板计数的显著增加。
结论：迄今为止，该CD37SMIP分子是良好耐受的治疗，其具有最低限度的输注毒性和未观察到的限制剂量的毒性。似乎还存在任意补体参与，因为具有淋巴细胞计数严重降低的患者未表现出肿瘤溶解综合征的迹象。在低的、非饱和剂量的CD37SMIP分子，已观察到鼓舞人心的肿瘤淋巴细胞血液计数的减少、***/脾体积的减小、皮肤白血病的清除和/或骨髓疾病的部分清除和/或具有高风险基因组CLL的患者中正常造血功能的改善。
实施例11
CAS024联合苯达莫司汀的体外功效
该研究是为了确定CAS024、苯达莫司汀和CAS024与苯达莫司汀的组合对Rec-1(套细胞淋巴瘤细胞系)和SU-DHL-6(弥散大细胞淋巴瘤系)细胞的效应。
使用以下表达CD37的人细胞系：Rec-1和SU-DHL-6(都来自DSMZ，Braunschweig，Germany)。苯达莫司汀()购自华盛顿药科大学(UniversityofWashingtonPharmacy)(Seattle,WA)并且溶解于PBS并保存在-20℃直至使用。
将Rec-1和SU-DHL-6细胞以1×104细胞/孔接种在黑色侧面、黑色底面的96孔板中的100μL培养基中。用不同浓度的CAS024处理已与抗人IgGF(ab)'2预先孵育的细胞并且在连续稀释的苯达莫司汀的存在下，在37℃，5％CO2将板孵育96小时。每孔中的终体积为150μL。孵育后，将板冷却至室温并用100μL/孔的ATPlite检测试剂(PerkinElmer,Boston,MA)进行标记。该检测测量作为活性细胞标志物的细胞ATP。通过使用TopcountNXT(PerkinElmer,Waltham,MA)平板读数器检测发光来分析样品。使用Prism(版本4.0,GraphpadSoftware,SanDiego,CA)中的4参数曲线拟合简化数据并且IC50定义为与未处理的培养物相比导致50％抑制的浓度。
对于协同作用测定，使用中位效应/联合指数(CI)方法用于数据分析(Chou和Talalay)。以预先定义的剂量水平分配给每种药物组合的数值使能够进行不同药物组合之间的定量性药物/药物相互作用比较。CI值将相互作用分为三类：协同作用、相加作用和拮抗作用(分别为CI<1.0、CI＝1或CI>1.0)。标记和数据简化后，使用Calcusyn软件包(Biosoft,Cambridge,UK)测定联合指数(CI)值。两个单独实验的结果表明CAS024与苯达莫司汀的联合导致对于靶细胞生长的协同抑制作用(参见图11)。获得表明CAS024与苯达莫司汀的联合还协同地抑制SU-DHL-6细胞生长的相似的结果。
如图12中所示，还使用上文所述的方法和浓度测定了CAS-024与另一烷化剂苯丁酸氮芥的联合效应。不同于苯达莫司汀，苯丁酸氮芥与CAS-024的联合未导致对于SU-DHL-6细胞生长的协同抑制作用(参见图13)。
实施例12
人肿瘤异种移植物模型中CAS024联合苯达莫司汀的功效
该研究是为了比较对于SCID小鼠中皮下DOHH2人肿瘤异种移植物CAS024联合苯达莫司汀与每种试剂单独给药的功效。
肿瘤异种移植物的建立和治疗组分组。如上文所述，DOHH2是源自患有滤泡性淋巴瘤的患者的CD20+CD37+人B成淋巴细胞样细胞系。将5百万个DOHH2细胞皮下注射入雌性CB-17SCID小鼠的侧腹。肿瘤接种后第8天，大部分小鼠中明显出现可触及的肿瘤。将荷瘤小鼠分为具有同等平均肿瘤体积的5个组(每组n＝15；对于每组，每笼5只小鼠，共3笼)。分组当天被定义为第0天。用一对测径器测定肿瘤直径并使用以下公式计算肿瘤体积：V＝1/2[长度×(宽度)2]。基线平均肿瘤体积为231mm3，中位基线肿瘤大小为229mm3，并且范围为201至261mm3。
体内治疗。用0.2ml含有以下的PBS的注射剂治疗小鼠组：10μghuIgG(第0天、第4天、第8天，IV)、10μgCAS024(第0天、第4天、第8天，IV)、10mg/kg苯达莫司汀(第0天、第2天、第4天、第7天、第9天，IP)或10μgCAS024(第0天、第4天、第8天，IV)和10mg/kg苯达莫司汀(第0天、第2天、第4天、第7天、第9天，IP)。
监测和终点。每天通过视觉检查监测小鼠。每周测定重量，并且每周至少3次(M、W、F)由对于治疗组不知情的观察者(参见上文)测定肿瘤直径。如上文所述计算肿瘤体积。
如果小鼠的肿瘤体积达到大于1500mm3(或星期五时大于1200mm3)，则对小鼠施以安乐死。在该研究中死亡不是终点，并且除非另外说明，由小鼠因为肿瘤体积达到预定限度而被施以安乐死的时间来确定小鼠的“存活”。如果小鼠的肿瘤体积超出上文所述的参数、发生肿瘤的溃疡、肿瘤抑制小鼠的活动度或体重降低超过20％，则对小鼠施以安乐死。
统计分析。使用GraphPadPrism软件进行所有统计分析。使用采用Dunn's验后多重比较的用于非参数数据的单向方差分析(Kruskal-Wallis检验)来确定平均肿瘤体积和平均相对肿瘤体积的显著差异。使用Kaplan-Meier存活分析确定随时间小鼠存活的显著差异，所述Kaplan-Meier存活分析利用用于比较存活曲线的对数秩检验。使用Fisher's精确检验确定无肿瘤小鼠的发生率的显著差异。p值<0.05被视为具有显著性。
在苯达莫司汀治疗组中，在第6天左右开始观察到皮毛不整和腹泻。在第10天，CAS024+苯达莫司汀治疗组中的1只小鼠由于≥20％的体重降低而被施以安乐死。该小鼠对于存活曲线分析作为检剔数据对待。在CAS024单独治疗组中未见毒性的临床迹象。
与huIgG相比，所有治疗表现出对于DOHH2生长的抑制作用。在第13天(所有小鼠都存活的最后一天)，所有治疗组的平均肿瘤体积和平均相对肿瘤体积显著不同于huIgG对照小鼠组(图14A和4B)。苯达莫司汀和CAS024+苯达莫司汀联合治疗组之间也观察到平均肿瘤体积和平均相对肿瘤体积的显著差异。任何2个其他治疗组之间不存在平均肿瘤体积或平均相对肿瘤体积的显著差异。随时间变化的4个组的平均肿瘤体积显示在图15中。
用huIgG治疗的小鼠中的肿瘤快速生长，并且该组中所有小鼠到第17天都被施以安乐死。如图16中所示以及表12和13中所总结，与huIgG治疗组相比，以任何治疗组给药的小鼠的存活延长(对于所有组p<0.0001)。所有三个治疗组之间以及互相之间的存活曲线也存在显著差异，CAS024/苯达莫司汀联合优于单一试剂。
研究结束(第34天)时，huIgG治疗的小鼠都没有存活(因此没有小鼠是无肿瘤的)(图17和表12)。其他组中无肿瘤小鼠的发生率为：CAS024和苯达莫司汀治疗组中为0/15(0％)，以及CAS024+苯达莫司汀联合治疗组中为2/14(14％)。任何治疗组之间的无肿瘤小鼠发生率不存在显著差异。
表12.观察期结束时中位存活时间和无肿瘤小鼠的发生率
a通过小鼠因为肿瘤生长而被施以安乐死的那天来确定小鼠的“存活”。在第10天，CAS024+苯达莫司汀联合组中的1只小鼠由于体重降低≥20％而被施以安乐死。当计算存活曲线时，该小鼠作为检剔数据对待。无其它小鼠因为除了其肿瘤体积未达到预定限度之外的原因而被施以安乐死。
b粗体的值表示所示组的存活曲线显著不同于HuIgG对照的存活曲线(对于所有治疗组p<0.0001；对数秩检验)。
c“无肿瘤”小鼠没有可触及的SC肿瘤。未通过组织学确认肿瘤细胞不存在。该研究至第34天时结束。
d在CAS024+苯达莫司汀联合组中，1只小鼠由于体重降低≥20％而被施以安乐死。无其它小鼠由于毒性原因而被施以安乐死。
表13.治疗组之间存活曲线比较的p值
该研究表明CAS024联合苯达莫司汀表现出大于任一试剂单独观察到的对于SCID小鼠中DOHH2肿瘤生长的抑制作用。
可以组合上文所述的各种实施方案以提供其他实施方案。本说明书中引用的和/或申请数据表中列出的所有的美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公布通过引用的方式以其整体并入本文。如果需要利用不同专利、申请和出版物的构想以提供其他实施方案，可以改动实施方案的各方面。
根据上文详细的描述，可以对实施方案进行这些改变和其他改变。总的来说，在以下权利要求中，使用的术语不应解释为将本权利要求书限定为本说明书和本权利要求书所公开的具体实施方案，而应当解释为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求所要求保护的等同物的全部范围。因此，本公开内容不限制权利要求书。

Claims (15)

1.CD37特异性结合分子，其包含：
(a)CD37特异性单链Fv(scFv)，其从氨基末端至羧基末端包含：
(i)人源化重链可变区，所述人源化重链可变区包含由SEQIDNO:63所示的氨基酸序列组成的重链CDR1、由SEQIDNO:65所示的氨基酸序列组成的重链CDR2以及由SEQIDNO:68所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；和
(ii)人源化轻链可变区，所述人源化轻链可变区包含由SEQIDNO:61所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、由SEQIDNO:64所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2、由SEQIDNO:66所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；
(b)铰链区，以及
(c)免疫球蛋白CH2区和CH3区。
2.如权利要求1所述的CD37特异性结合分子，其中所述CD37特异性scFv包含连接所述人源化重链可变区和所述人源化轻链可变区的连接子。
3.如权利要求2所述的CD37特异性结合分子，其中所述连接子具有5-30个氨基酸。
4.如权利要求3所述的CD37特异性结合分子，其中所述连接子包含如SEQIDNO:229所示的序列。
5.如权利要求1所述的CD37特异性结合分子，其中所述免疫球蛋白CH2区和CH3区为人IgG1CH2区和CH3区。
6.如权利要求1所述的CD37特异性结合分子，其由SEQIDNO:253所示的氨基酸序列组成。
7.分离的核酸分子，其编码权利要求1所述的CD37特异性结合分子。
8.包含如权利要求7所述的核酸分子的载体。
9.包含如权利要求8所述的载体的宿主细胞。
10.组合物，其包含权利要求1所述的CD37特异性结合分子和药学上可接受的载体。
11.权利要求1所述的CD37特异性结合分子在制备用于减少B细胞或治疗与异常的B细胞活性相关的疾病的药物中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述与异常的B细胞活性相关的疾病是B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、B细胞骨髓瘤、特征为自身抗体产生的疾病或特征为与B细胞途径相关的不适当T细胞激活的疾病。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述特征为自身抗体产生的疾病是自身免疫性疾病。
14.如权利要求12所述的用途，其中所述特征为自身抗体产生的疾病是特发性炎症性肌病、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、重症肌无力、格雷夫斯氏病、I型糖尿病、抗肾小球基底膜病、急进性肾小球性肾炎、伯格氏病(IgA肾病)、***性红斑狼疮(SLE)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、抗磷脂抗体综合征、视神经脊髓炎、多发性硬化、皮肌炎、多肌炎或Waldenstrom巨球蛋白血症。
15.如权利要求11所述的用途，其中所述与异常的B细胞活性相关的疾病是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多毛细胞性白血病、小淋巴细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、粘膜相关(MALT)淋巴样组织的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或者伯基特(Burkitt)淋巴瘤/白血病。
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