CN104364651A - 用于增加基于cd37的疗法的功效的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于改良靶向CD37的癌症疗法的成果的方法。进一步提供包含适用于所述方法的试剂的试剂盒。

Description

用于增加基于CD37的疗法的功效的方法
技术领域
本发明的领域大致是关于增加特征为人类CD37过表达的B细胞疾病的治疗功效。更具体地说，本发明关于用CD37拮抗剂(例如CD37免疫缀合物)对易患或诊断患有B细胞疾病(例如癌症或自体免疫疾病)的患者的更有效治疗，其中如通过基因表达分析所确定，所述细胞表达CD37。
发明背景
在发达国家，癌症是主要死亡原因之一，其中超过一百万人诊断患有癌症并且仅仅在美国每年就有500,000人死亡。总的说来，估计超过1/3的人将在其一生中发展某种形式的癌症。
白细胞抗原CD37(“CD37”)，也称为GP52-40、四跨膜蛋白-26(tetraspanin-26)或TSPAN26，是一种四跨膜蛋白超家族的跨膜蛋白(Maecker等人,1997 FASEB J.11:428-442)。其为一种具有四个跨膜域的高度糖基化蛋白质，其在前B到周围成熟B细胞阶段期间在B细胞上表达，但在最终分化为浆细胞后不存在。(Link等人,1987,J Pathol.152:12-21)。CD37抗原仅在T细胞、骨髓细胞和粒细胞上弱表达(Schwartz-Albiez等人1988,J.Immunol.,140(3)905-914)。然而，CD37也在例如那些造成非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma；NHL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的细胞的恶性B细胞上表达(Moore等人1986,J Immunol.137(9):3013-8)。这种表达谱表明CD37表示一种用于B细胞恶性病的有前途的治疗靶，并且目前，对于用于B细胞恶性病的更有效治疗存在明显未满足的医学需要。
发明概要
本发明是基于癌症中的CD37表达的动态范围的发现和具有增加的CD37表达水平的癌症对用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物治疗反应更大的发现。本发明有利地允许治疗对通过向发现具有增加的CD37表达水平的患者施用治疗剂(即抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物)进行的治疗具有更大反应可能性的患者。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于增加使用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物的癌症疗法的功效的方法，其中该方法包括向患有癌症的受试者施用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物，其中来自该受试者的癌性样品中的增加的CD37基因或蛋白质表达已经使用区分CD37表达癌性样品中的染色强度或染色均一性与一种或多种参考样品中的染色强度或染色均一性的检测方法检测到。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种将癌症鉴别为可能对用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物治疗敏感的方法，该方法包括(a)测量获自受试者癌症的癌性样品中的CD37表达水平，其中该测量包含使用区分CD37表达癌性样品中的染色强度或染色均一性与参考样品中的染色强度或染色均一性的检测方法；(b)测定该癌性样品的CD37染色强度或染色均一性评分；和(c)将步骤(b)中所测定的该CD37染色强度或染色均一性评分与通过测量至少一种参考样品中的CD37蛋白质表达所测定的相对值进行比较，其中该至少一种参考样品是对用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物治疗不敏感的组织、细胞或细胞颗粒样品，并且其中高于该相对值的步骤(b)中所测定的样品的CD37染色强度评分将该癌症鉴别为对用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物治疗敏感。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于将癌症鉴别为可能对抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物有反应的方法，该方法包括(a)使包含来自该癌症的细胞的生物样品与结合细胞表面上的CD37蛋白质的药剂接触；(b)检测该药剂与结合(a)的该生物样品的细胞表面上的CD37蛋白质的结合；(c)为步骤(b)的该结合指定评分，其中该评分是基于相较于参考样品来指定的；和(d)将步骤(c)中的该评分与参考组织或细胞的评分进行比较，其中大于阴性或低CD37表达参考样品的评分的癌症CD37水平的评分或等于或大于高CD37表达参考样品的评分的癌症CD37水平的评分将癌症鉴别为可能对抗CD37抗体或抗CD免疫缀合物有反应。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种将患有癌症的受试者鉴别为可能对低剂量抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物治疗方案有反应的方法，该方法包括：(a)使包含来自该癌症的细胞的生物样品与结合细胞表面CD37蛋白质的药剂接触；(b)检测该药剂与(a)的该生物样品的结合；(c)为步骤(b)的该结合指定评分，其中该评分是基于相较于一种或多种参考样品来指定的；和(d)将步骤(c)中的该评分与参考组织或细胞的评分进行比较，其中大于阴性或低CD37表达参考样品的评分的癌症CD37水平的评分或等于或大于高CD37表达参考样品的评分的癌症CD37水平的评分将癌症鉴别为可能对低剂量抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物有反应。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种优化用于患有癌症的受试者的使用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物的治疗方案的方法，该方法包括：(a)检测获自该受试者的癌性样品中的CD37表达水平；(b)将该癌性样品中的该CD37表达水平与参考样品中的CD37表达进行比较；(c)测定癌性样品的CD37染色强度评分；和(d)如果该评分低，那么向受试者施用增加剂量的抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物，或如果该评分高，那么向受试者施用减少剂量的抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测来自受试者的癌性样品中的癌细胞上的细胞表面CD37表达的方法，该方法包括：(a)获得癌性样品，其中该样品经过***固定、石蜡包埋；(b)使该癌性样品与特异性结合细胞表面CD37的抗体接触；(c)使用可以区分CD37表达样品中的染色强度或染色均一性与一种或多种参考样品中的染色强度或染色均一性的检测方法测量(b)中的该抗体与癌性样品中的细胞表面CD37的结合；和(d)在将癌性样品与一种或多种参考样品的细胞表面CD37染色强度或染色均一性的水平进行比较后为CD37指定CD37表达评分。
在一些实施方案中，检测是通过免疫组织化学(IHC)进行的。该IHC可以是可以区分不同CD37表达水平的校准IHC。
在一些实施方案中，检测方法产生具有低细胞表面CD37表达、中等CD37细胞表面表达或高CD37细胞表面表达的样品的染色强度范围。
在一些实施方案中，检测方法区分CD37表达癌性样品与参考样品中的染色强度和染色均一性。
在一些实施方案中，通过免疫组织化学，癌性样品或生物样品的CD37表达的染色强度评分大于1。在一些实施方案中，通过免疫组织化学，癌性样品或生物样品的CD37表达的染色强度评分为2、3或3+。在一些实施方案中，通过对***固定的石蜡包埋样品进行的免疫组织化学，癌性样品或生物样品的CD37表达的染色强度评分为2、3或3+。在一些实施方案中，癌性样品或生物样品的CD37表达的染色均一性是均质的。在一些实施方案中，癌性样品或生物样品的CD37染色强度评分为2、3或3+且染色均一性是非均质或均质的。
在一些实施方案中，免疫组织化学是手动进行的。在一些实施方案中，免疫组织化学是使用自动***进行的。
在一些实施方案中，参考样品是阳性参考样品或阴性参考样品。在一些实施方案中，参考样品包含细胞、细胞颗粒或组织。
在一些实施方案中，检测包含用特异性结合细胞表面CD37的抗体检测CD37表达。在一些实施方案中，抗体进一步包含选自以下的检测试剂：酶、荧光团、放射性标记和发光体。在一些实施方案中，该检测试剂是选自以下：生物素、地高辛(digoxigenin)、荧光素、氚和若丹明(rhodamine)。在一些实施方案中，该抗体是克隆CT1。
在一些实施方案中，抗体的浓度为约1到约10μg/mL或约2.1到约8.4μg/mL、约4到约5μg/mL、或2.1、4.2或8.4μg/mL。在一个实施方案中，抗体(例如克隆CT1)的浓度是4.2μg/mL。
在一些实施方案中，癌症是选自以下：B细胞淋巴瘤、NHL、前体B细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞赘生物、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、低级、中级和高级(FL)、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT型边缘区B细胞淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤、脾型边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma；BL)、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴组织增生性病症、瓦登史东巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)和退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
本发明还提供了制品，其包含抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物、容器和指示该抗体或免疫缀合物可用于治疗特征为通过IHC测量的CD37的表达水平为2、3或3+的癌症的包装说明书或标签。
本发明还提供了组合诊断和药物试剂盒，其包含用于诊断的鼠科抗CD37抗体和用于治疗的抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物。在一些实施方案中，诊断抗体是能够通过IHC检测CD37表达的检测抗体。
本发明还提供了诊断试剂盒，其包含可以特异性结合于细胞表面CD37的检测抗体、用于免疫组织化学(IHC)的试剂和一种或多种标准化参考样品，其中该等标准化参考样品包含***固定的石蜡包埋细胞、细胞颗粒或组织样品，并且其中该一种或多种标准化参考样品是来自非CD37表达、低CD37表达、中等CD37表达或高CD37表达细胞、细胞颗粒或组织。所述参考样品的实例在本文中描述于实施例中。
在一些实施方案中，物品或试剂盒是其中IHC是可以区分不同CD37表达水平的校准IHC的物品或试剂盒。在一些实施方案中，校准IHC产生具有低细胞表面CD37表达、中等CD37细胞表面表达或高CD37细胞表面表达的样品的染色强度范围。在一些实施方案中，IHC区分CD37表达癌性样品与参考样品中的染色强度和染色均一性。在一些实施方案中，对***固定的石蜡包埋样品进行IHC。IHC可以手动进行或使用自动***进行。
在一些实施方案中，物品或试剂盒包含CD37免疫缀合物，该CD37免疫缀合物包含抗CD37抗体、连接子和细胞毒素。在一些实施方案中，该抗CD37抗体是嵌合或人源化CD37-3、CD37-38或CD37-50。在一些实施方案中，抗CD37抗体是选自以下的抗体：包含SEQ ID NO:56的多肽和SEQ ID NO:73的多肽的抗体、包含SEQ IDNO:57的多肽和SEQ ID NO:74的多肽的抗体、包含SEQ ID NO:58的多肽和SEQ ID NO:74的多肽的抗体、包含SEQ ID NO:62的多肽和SEQ ID NO:78的多肽的抗体、包含SEQ ID NO:63的多肽和SEQ IDNO:79的多肽的抗体以及包含SEQ ID NO:65的多肽和SEQ ID NO:81的多肽的抗体。
在一些实施方案中，该连接子是选自以下：可裂解连接子、不可裂解连接子、亲水性连接子和基于二羧酸的连接子。在一些实施方案中，连接子是选自以下：4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)或4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基戊酸N-琥珀酰亚胺酯(sulfo-SPP)；4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)或4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(sulfo-SPDB)；4-(顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)；4-(顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-磺基琥珀酰亚胺酯(sulfoSMCC)；N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)；和N-琥珀酰亚胺基-[(N-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-顺丁烯二酰亚胺)。在一些实施方案中，连接子是4-(顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)。在一些实施方案中，该细胞毒素是选自以下：类美登素(maytansinoid)、类美登素类似物、苯二氮、紫杉烷类(taxoid)、CC-1065、CC-1065类似物、度卡霉素(duocarmycin)、度卡霉素类似物、卡奇霉素(calicheamicin)、海兔毒素(dolastatin)、海兔毒素类似物、奥里斯他汀(auristatin)、富山霉素(tomaymycin)衍生物和来普霉素(leptomycin)衍生物或细胞毒素的前药。在一些实施方案中，细胞毒素是类美登素。在一些实施方案中，类美登素是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素或N(2')-脱乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。在一些实施方案中，类美登素是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)。在一些实施方案中，免疫缀合物包含抗体huCD37-3、SMCC和DM1。
在一些实施方案中，组合诊断和药物试剂盒进一步包含一种或多种参考样品。在一些实施方案中，该参考样品是阳性参考样品或阴性参考样品。在一些实施方案中，参考样品包含细胞、细胞颗粒或组织。
在一些实施方案中，用于如本文所提供的试剂盒中的检测抗体进一步包含选自以下的检测试剂：酶、荧光团、放射性标记和发光体。在一些实施方案中，检测试剂是选自以下：生物素、地高辛、荧光素、氚和若丹明。抗体的浓度可为约1到约10μg/mL或约2.1到约8.4μg/mL、约4到约5μg/mL、或2.1、4.2或8.4μg/mL或4.2μg/mL。
在一些实施方案中，试剂盒包含低CD37表达对照组，并且该低CD37表达对照组是Namalwa或RL肿瘤细胞。在一些实施方案中，试剂盒包含高CD37表达对照组，并且该高CD37表达对照组是选自以下：Daudi和Ramos细胞系以及经CD37稳定或瞬时转染的细胞系。在一些实施方案中，经CD37稳定或瞬时转染的细胞系是300-19/CD37。
在一些实施方案中，抗CD37抗体或免疫缀合物是如国际公开申请No.WO 2011/112978或WO 2012/135740中所述的抗体或免疫缀合物，其中每一者以引用的方式整体并入本文中。
附图简述
图1.非转染300-19细胞(左)和经人类CD37转染的300-19细胞(huCD37)上的CD37的免疫组织化学(IHC)染色。
图2.在10×(左)和40×(右)放大倍数下人类脾组织的白髓中的CD37的IHC染色。
图3.由用于Daudi、Ramos和RL细胞的优化手动方法得到的CD37的IHC染色结果。在每一图像下方给出通过定量流式细胞术获得的CD37表达水平。
图4.使用Daudi、Ramos和RL细胞在用PE标记的抗CD37抗体(粗线)染色后相较于未染色样品(细线)所获得的流式细胞术直方图。
图5.由优化手动方法得到的Daudi细胞上的CD37和RL细胞上的CD20的IHC染色结果。表达类似CD37和CD20抗原水平的细胞展示类似染色图案。
图6.由优化手动方法得到的淋巴瘤样品的CD37的染色评分相较于CD20的染色评分的总结。
图7.使用优化手动方法对CD37进行染色的NHL患者样品的代表性照片。
图8.在带有SU-DHL-4异种移植物的雌性CB.17 SCID小鼠中huCD37-3-SMCC-DM1的抗肿瘤活性(中值肿瘤体积，mm3)。
图9.在带有DoHH2人类肿瘤异种移植物的SCID小鼠中huCD37-3抗体、huCD37-3-SMCC-DM1和标准化学治疗剂的抗肿瘤活性(中值肿瘤体积，mm3)。
图10.在带有DoHH2人类肿瘤异种移植物的SCID小鼠中huCD37-3-SMCC-DM1的抗肿瘤活性(中值肿瘤体积，mm3)。
图11.在带有JVM-3人类肿瘤异种移植物的SCID小鼠中huCD37-3抗体、huCD37-3-SMCC-DM1、奥法木单抗(Ofatumumab)和苯达莫司汀(Bendamustine)的抗肿瘤活性(中值肿瘤体积，mm3)。
图12.在带有JVM-3人类肿瘤异种移植物的SCID小鼠中huCD37-3-SMCC-DM1的抗肿瘤活性(中值肿瘤体积，mm3)。
图13.使用自动染色法的大细胞淋巴瘤(DLBCL)中的评分分布。
图14.包括滤泡性淋巴瘤(FL)的小细胞淋巴瘤中的评分分布。使用自动染色法的套细胞淋巴瘤(MCL)、MALT型边缘区B细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、未分类小细胞淋巴瘤和未分类非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)样品。
发明详述
本发明提供用于治疗B细胞疾病(例如癌症和自体免疫疾病)和用于增加对特征为CD37过表达的治疗疾病有反应的功效或可能性的方法。本发明是基于检测癌症和自体免疫疾病相较于阴性正常组织中的CD37表达的动态范围的方法的发现和具有高CD37表达水平的B细胞对用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物治疗反应更大的发现。进一步提供包含一种或多种适用于实践本发明的方法的试剂的试剂盒。
I.定义
为了有助于对本发明的理解，许多术语和短语定义如下。
除非另有指示，否则如本文中所使用，术语CD37是指任何天然CD37。CD37也被称为GP52-40、白细胞抗原CD37和四跨膜蛋白-26。术语“CD37”涵盖“全长”、未加工的CD37以及由细胞中的加工所得的任何形式的CD37。术语也涵盖CD37的天然存在的变异体，例如剪接变异体、等位变异体和同种型。本文中所述的CD37多肽可以从各种来源分离，例如从人类生物样品或从另一来源分离，或通过重组或合成方法制备。
术语CD37的“增加的表达”或“高表达”是指含有相较于阴性或低参考对照组或相较于相同组织或细胞类型的健康或非患病样品升高的CD37表达水平的样品。在一个实例中，CD37表达是通过IHC测量的且相较于展现确定评分的校准对照组给出染色强度评分或染色均一性评分(例如，如果强度类似于3级校准对照组，那么给予测试样品强度评分3，或如果强度类似于2级校准对照组，那么给予测试样品强度2)。举例来说，通过免疫组织化学，评分1、2、3或3+或更大、优选地评分2、3、3+或更大指示增加的CD37表达。非均质或均质染色均一性也指示增加的CD37表达。染色强度和染色均一性评分可以单独或组合(例如，2homo、2hetero、3homo、3hetero等)使用。在另一个实例中，CD37表达的增加可以通过检测相对于对照值(例如，不具有升高的CD37值的来自未患癌症或患有癌症的受试者的生物样品、组织或细胞中的表达水平)至少2倍、至少3倍或至少5倍的增加来测定。
术语特定肿瘤、组织或细胞样品中的CD37“过表达”是指CD37(CD37多肽或编码所述多肽的核酸)以高于相同类型或起源的非患病组织或细胞或在肿瘤或癌症附近的其它细胞中存在的水平的水平存在。所述过表达可以是例如通过突变、基因扩增、增加的转录或增加的翻译所引起的。
“参考样品”可用于关联并比较在本发明的方法中从测试样品获得的结果。参考样品可以是细胞(例如细胞系、细胞颗粒)或组织。“参考样品”中的CD37水平可以是CD37的绝对或相对量、量范围、最小及/或最大量、平均量和/或中值量。本发明的诊断方法涉及测试样品中的CD37表达水平与“参考值”之间的比较。在一些实施方案中，该参考值是参考样品中的CD37表达水平。参考值可以是预定值并且也可以从与测试样品平行测试的参考样品(例如对照生物样品)来测定。参考值可以是单一截断值，例如中值或平均值或值范围，例如置信区间。可以为个体的多种亚组建立参考值，例如易患癌症的个体、患有早期或晚期癌症的个体、雄性和/或雌性个体或经历癌症疗法的个体。阴性参考样品或值和阳性参考样品或值的实例描述于本文中。
在一些实施方案中，参考样品是来自健康组织、尤其是不受癌症影响的相应组织的样品。这些类型的参考样品被称为阴性对照样品或参考样品。在其它实施方案中，参考样品是来自表达CD37的肿瘤的样品。这些类型的参考样品被称为阳性对照样品。阳性对照样品也可以用作用于与CD37表达水平有关的染色强度的类型(hetero对homo)和/或程度(0、1、2、3、3+)的比较指示剂。阳性对照组比较样品也被称为校准参考样品。如实施例中所示，低或非CD37参考包括脾的红髓(例如单核细胞和红细胞)和T细胞并且高CD37表达参考包括脾的白髓(例如B淋巴细胞)。对于细胞系，示范性非表达子包括300-19细胞，并且高表达子包括Daudi、Ramos和RL细胞。另一阳性高CD37参考是经CD37稳定或瞬时转染的细胞系(例如300-19/CD37)。特定癌症的CD37的适当阳性和阴性参考水平可以通过测量一个或多个适当受试者的CD37的水平来测定，并且所述参考水平可以对特定受试者群体进行定制(例如参考水平可以与年龄匹配以便可在来自特定年龄的受试者的样品中的CD37水平与特定年龄组中的特定疾病状态、表型或缺乏时的参考水平之间进行比较)。所述参考水平也可以对用于测量生物样品中的CD37水平的特定技术(例如免疫分析等)进行定制，其中CD37水平可能基于所使用的特定技术而不同。
术语“一级抗体”在本文中是指特异性结合于样品中的靶蛋白质抗原的抗体。一级抗体一般是免疫组织化学(IHC)程序中所用的第一抗体。在一个实施方案中，一级抗体是IHC程序中所用的唯一抗体。术语“二级抗体”在本文中是指结合特异性于一级抗体、从而在一级抗体与随后的试剂(如果有的话)之间形成桥的抗体。二级抗体一般是免疫组织化学程序中所用的第二抗体。术语“三级抗体”在本文中是指结合特异性于二级抗体、从而在二级抗体与随后的试剂(如果有的话)之间形成桥的抗体。
本发明的“样品”来源于生物，在特定实施方案中，例如来源于真核生物。在优选实施方案中，该样品是人类样品，但动物样品也可以用于实践本发明。用于本发明中的样品的非限制性来源包括例如实体组织，活检抽出物，流体提取物，血液，血浆，血清，脊髓液，淋巴流体，皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部切片、眼泪、唾液、乳汁、肿瘤、器官、细胞培养物和/或细胞培养物成分。“癌性样品”是含有癌细胞的样品。本发明适用于可用材料的量较小的实体组织样品。该方法可用于检查CD37的表达方面或样品的状态，包括(但不限于)比较不同类型的细胞或组织、比较不同发育阶段和检测或测定疾病或异常的存在和/或类型。
出于本文目的，组织样品的“切片”是指组织样品的单一部分或单片，例如从组织样品切下的组织或细胞薄片。应理解可取得组织样品的多个切片并使其经受根据本发明的分析。在一些情况下，组织的所选部分或切片包含同源细胞群体。在其它情况下，所选部分包含组织区域，例如作为非限制性实例的内腔。举例来说，所选部分可以像一个细胞或两个细胞一样小，或可以表示成千上万个细胞。在大多数情况下，细胞的收集很重要，并且虽然已经描述本发明用于检测细胞组分，但该方法也可以用于检测生物体的非细胞组分(例如作为非限制性实例的血液中的可溶组分)。
“关联(correlate)”或“关联(correlating)”意指以任何方式将第一种分析的性能和/或结果与第二种分析的性能和/或结果进行比较。举例来说，可在进行第二种分析时使用第一种分析的结果和/或可使用第一种分析的结果以确定是否应进行第二种分析和/或可将第一种分析的结果与第二种分析的结果进行比较。在一个实施方案中，增加的CD37表达与增加的靶向CD37的抗癌症疗法的有效性可能性有关。
术语“抗体”意指通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合于靶(例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或上述组合)的免疫球蛋白分子。如本文中所使用，术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体(例如由至少两个完整抗体产生的双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体展现所需生物活性即可。抗体可以分别基于称为α、δ、ε、γ和μ的其重链恒定域的一致性而具有任何五种主要免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同种类的免疫球蛋白具有不同和众所周知的亚单元结构和三维构形。抗体可以是裸抗体或缀合于例如毒素、放射性同位素等其它分子。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其所结合的抗原(例如CD37)的生物活性的抗体。在某一个实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。合乎需要的是，生物活性降低了10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
术语“抗CD37抗体”或“结合于CD37的抗体”是指能够以足够亲和性结合CD37以使得抗体适用作靶向CD37的诊断剂和/或治疗剂的抗体。如通过放射免疫分析(RIA)所测量，抗CD37抗体与无关、非CD37蛋白质的结合程度小于该抗体与CD37的结合的约10％。在某些实施方案中，结合于CD37的抗体的解离常数(Kd)是≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM。抗CD37抗体的实例在本领域中是已知的并且在美国公开申请No.2011/0256153中公开，该案以引用的方式并入本文中。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原确定可变区。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单克隆抗体”是指单一抗原决定子或表位的高特异性识别和结合所涉及的同源抗体群体。这和典型地包括针对不同抗原决定子的不同抗体的多克隆抗体大不相同。术语“单克隆抗体”涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以包括(但不限于)通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物的许多方式制备的所述抗体。
术语“表位”或“抗原决定子”在本文中可互换使用并且是指能够通过特定抗体识别并特异性结合的抗原的那部分。当抗原是多肽时，表位可以由邻接氨基酸和通过蛋白质的三级折叠并置的非邻接氨基酸形成。由邻接氨基酸形成的表位典型地在蛋白质变性后得以保留，而通过三级折叠形成的表位典型地在蛋白质变性后丢失。表位典型地包括呈独特空间构象的至少3个并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。
“结合亲和性”大致是指分子的单一结合位点(例如抗体)与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总强度。除非另有指示，否则如本文中所使用，“结合亲和性”是指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和性。分子X对于其伴侣Y的亲和性一般可以由解离常数(Kd)来表示。亲和性可以通过本领域中已知的常见方法(包括本文所述的那些方法)测量。低亲和性抗体一般缓慢地结合抗原并且倾向于容易解散，而高亲和性抗体一般更快地结合抗原并且倾向于保持较长时间的结合。多种测量结合亲和性的方法在本领域中是已知的，其中任一者都可以用于本发明的目的。下文描述特定说明性的实施方案。
“或更好”在本文中用于提及结合亲和性时是指结合分子与其结合伴侣之间更强的结合。“或更好”在本文中使用时是指更强结合，由较小数值Kd值表示。举例来说，对抗原的亲和性是“0.6nM或更好”的抗体，抗体对于抗原的亲和性是<0.6nM，即0.59nM、0.58nM、0.57nM等或小于0.6nM的任何值。
如本文中所使用，短语“基本上类似”或“基本上相同”表示两个数值(一般一个与本发明的抗体相关且另一个与参考/比较抗体相关)之间足够高的相似性程度以使得本领域技术人员将认为在通过所述值(例如Kd值)所测量的生物学特征范围内两个值之间的差异具有极小或不具有生物学和/或统计显著性。所述两个值之间的差异小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％，这与参考/比较抗体的值有关。
“分离”的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈自然界中不存在的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经纯化到不再呈自然界中存在的形式的程度的那些多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。在一些实施方案中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
如本文中所使用，“基本上纯的”是指物质为至少50％纯的(即不含污染物)、至少90％纯的、至少95％纯的、至少98％纯的或至少99％纯的。
如本文中所使用，术语“免疫缀合物”或“缀合”是指连接于细胞结合剂(即抗CD37抗体或其片段)的化合物或其衍生物并且是由通式定义：C-L-A，其中C＝细胞毒素，L＝连接子，并且A＝细胞结合剂或抗CD37抗体或抗体片段。免疫缀合物也可以由相反顺序的通式定义：A-L-C。
“连接子”是能够以稳定、共价方式将化合物、通常是药物(例如类美登素)连接于细胞结合剂(例如抗CD37抗体或其片段)的任何化学部分。连接子可以在化合物或抗体保持活性的条件下对酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解敏感或对其有抗性。合适的连接子在本领域中众所周知并且包括例如二硫基、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。连接子也包括如本文所述和本领域中已知的带电连接子和其亲水性形式。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述细胞群体的特征为不受调控的细胞生长的哺乳动物的生理情况。癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。“癌症”或“致瘤”疾病的更特定实例包括B细胞淋巴瘤(包括NHL)、前体B细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞赘生物、例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)(包括低级、中级和高级FL)、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MALT型、结节和脾型)、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特氏淋巴瘤(BL)、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴组织增生性病症和退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
“肿瘤”和“赘生物”是指由良性(非癌性)或恶性(癌性)(包括癌前病变)的过度细胞生长或增殖引起的任何肿块。
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”和语法对等词是指来源于肿瘤或癌前病变的总细胞群体，包括非致瘤细胞(包含大部分肿瘤细胞群体)和致瘤干细胞(癌症干细胞)。如本文中所使用，术语“肿瘤细胞”当仅仅是指缺乏更新和分化的能力的肿瘤细胞以使那些肿瘤细胞与癌症干细胞区别开来时将由术语“非致瘤”修饰。
术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括(但不限于)人类、非人类灵长类动物、啮齿动物及其类似动物，其将是特定治疗的接受者。典型地，术语“受试者”和“患者”关于人类受试者在本文中可互换使用。
“与一种或多种其它治疗剂组合”施用包括同时(同步)和以任何顺序连续施用。
术语“药物制剂”是指呈使得允许活性成分的生物活性有效的形式并且不含对将施用制剂的受试者的毒性不能接受的额外组分的制剂。所述制剂可以是无菌的。
如本文所公开的抗体的“有效量”是足以实现特定规定目的的量。就指定目的而论，“有效量”可以用常规方式凭经验确定。
术语“治疗有效量”是指有效治疗受试者或哺乳动物的疾病或病症的抗体或其它药物的量。在癌症情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数目；减小肿瘤大小；抑制(即缓慢到一定程度或终止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即缓慢到一定程度或终止)瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与癌症相关的症状。参见本文中对“治疗”的定义。如果药物可以防止生长和/或杀死现有的癌细胞，那么其可以具有细胞抑制性和/或细胞毒性。“预防有效量”是指在必需的剂量下和时间段内有效实现成所需预防结果的量。典型地但非必要地，因为在疾病之前或早期，将预防剂量用于受试者，所以预防有效量将小于治疗有效量。
术语“有利的反应”大致是指在受试者中引起有益状态。就癌症治疗而言，该术语是指提供对受试者的治疗性作用。对癌症的积极治疗性作用可以以多种方式测量(参见W.A.Weber,J.Nucl.Med.50:1S-10S(2009))。举例来说，肿瘤生长抑制、分子标记物表达、血清标记物表达和分子成像技术全部都可能用于评估抗癌治疗剂的治疗功效。就肿瘤生长抑制而言，根据NCI标准，T/C≤42％是最小抗肿瘤活性水平。T/C<10％被视为高抗肿瘤活性水平，其中T/C(％)＝治疗组的中值肿瘤体积/对照组的中值肿瘤体积×100。无进展存活期(PFS)、无病存活期(DFS)或总存活期(OS)也可以用于评估抗癌治疗的治疗功效。
PFS、DFS和OS可以通过由国家癌症研究所(National CancerInstitute)和美国食品与药物管理局(Food and Drug Administration)用于批准新药所设置的标准来测量。参见Johnson等人,(2003)J.Clin.Oncol.21(7):1404-1411。“无进展存活期(PFS)”也被称为或“到肿瘤进展的时间(YIP)”指示在治疗期间和之后癌症未生长的持续时间长度。无进展存活期包括患者已经经历完全反应或部分反应的时间量，以及患者已经经历稳定疾病的时间量。“无病存活期(DFS)”是指在治疗期间和之后患者保持无病的持续时间长度。“总存活期(OS)”是指相较于天然或未治疗的个体或患者预期寿命的延长。
词语“标记”当在本文中使用时是指可检测到的化合物或成分，其直接或间接与抗体缀合以使得产生“经标记”的抗体。标记可以单独检测到(例如放射性同位素标记或荧光标记)或在酶标记情况下可以催化可检测到的底物化合物或成分的化学改变。
“化学治疗剂”是与作用机制无关而适用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的种类包括(但不限于)：烷基化剂、抗代谢物、纺锤体抑制剂植物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制剂。化学治疗剂包括用于“靶向疗法”和传统化学疗法的化合物。
例如“治疗(treating/treatment)”或“以治疗”或“减轻”或“以减轻”的术语是指治愈、减慢、减轻诊断出的病理情况或病症的症状和/或停止其进展的治疗措施。因此，需要治疗的那些人包括已经诊断患有或怀疑患有病症的那些人。预防或防治措施是指防止和/或减缓靶向病理情况或病症发展的治疗措施。因此，需要预防或防治措施的那些人包括倾向于患有病症的那些人和病症待防止的那些人。在某些实施方案中，根据本发明的方法，如果患者显示以下一种或多种，那么受试者成功地“治疗”了癌症：癌细胞数目减少或完全不存在；肿瘤大小减小；抑制或不存在癌细胞浸润到周围器官中，包括例如癌症扩散到软组织和骨中；抑制或不存在肿瘤转移；抑制或不存在肿瘤生长；一种或多种与特定癌症相关的症状缓减；降低发病率和死亡率；生活品质的改善；肿瘤的致瘤性、致瘤频率或致瘤能力降低；肿瘤中癌症干细胞的数目或出现率降低；致瘤细胞分化为非致瘤状态；或作用的一些组合。
除非上下文另外明显规定，否则如本公开和权利要求书中所使用，单数形式“一个(a/an)”和“该”包括复数形式。
应理解，无论实施方案在本文中以措辞“包含”描述，还提供用“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的类似实施方案。
如本文中例如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”打算包括“A和B”两者、“A或B”、“A”和“B”。同样，如例如“A、B和/或C”的短语中所使用的术语“和/或”打算涵盖以下实施方案的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
II.生物样品
生物样品经常用固定剂来固定。典型地使用例如***(甲醛)和戊二醛的醛固定剂。使用例如醇浸没(Battifora和Kopinski,J.Histochem.Cytochem.(1986)34:1095)的其它固定技术固定的样品也是合适的。所使用的样品也可以包埋在石蜡中。在一个实施方案中，样品既经过***固定又经过石蜡包埋(FFPE)。在另一个实施方案中，在选择一种或多种部分用于分析之前，FFPE块体经过苏木精和伊红染色以便为FFPE核心样品选择比表面积。由这些微粒样品制备组织块体的方法已经用于先前对多种预后因素的IHC研究中，和/或为本领域技术人员所熟知(参见例如，Abbondanzo等人,Am J ClinPathol.1990年5月；93(5):698-702；Allred等人,Arch Surg.1990年1月；125(1):107-13)。
简单来说，任何完整器官或组织都可以切成相当小的片状并且孵育在多种固定剂(例如***、醇等)中持续不同的时间段直到组织得到“固定”。样品可以是通过手术从身体上除下的几乎任何完整组织。样品可以切成适合于组织病理学实验室中通常所用的设备的相当小的片状。切片的大小典型地在几毫米到几厘米范围内。生物样品也可以是流体提取物、血液、血浆、血清、脊髓液、骨髓抽出物、骨髓活检、淋巴流体或脾制备物。
III.检测抗体缀合物
本发明进一步提供了针对CD37、一般是单克隆类型、连接于至少一种药剂以形成检测抗体缀合物的抗体。为了增加抗体分子作为诊断剂的功效，传统上是连接或共价结合或复合至少一种所需分子或部分。所述分子或部分可以是(但不限于)至少一种报导分子。报导分子定义为可以使用分析进行检测的任何部分。已经缀合于抗体的报导分子的非限制性实例包括酶、放射性同位素、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和性分子、有色粒子和/或配体(例如生物素)。
具有足够选择性、特异性或亲和性的任何抗体都可以用作检测抗体缀合物的基础。所述性质可以使用本领域技术人员已知的传统免疫学筛选方法来评估。除典型抗原结合位点之外，抗体分子中用于结合于生物活性分子的位点包括位于可以结合抗原的可变域中的位点。另外，可变域参与抗体自体结合(Kang等人,1988)并且含有由抗抗体识别的表位(独特位)(Kohler等人,1989)。
抗体缀合物的某些实例是其中抗体连接于可检测标记的那些缀合物。“可检测标记”是可以因其特定性质和/或化学特征而检测到的化合物和/或元素，使用所述可检测标记允许其所连接的抗体被检测到，和/或如果需要就进一步定量。
作为将其连接于抗体的方法，许多适当显影剂在本领域中是已知的(参见例如美国专利号5,021,236；4,938,948；和4,472,509，每一者以引用的方式并入本文中)。所使用的成像部分可以是例如顺磁离子；放射性同位素；荧光染料；NMR可检测的物质；和/或X射线成像。
预期用作缀合物的示范性荧光标记包括例如Alexa 350、Alexa430、Alexa 488、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、级联蓝(Cascade Blue)、Cy3、Cy5,6-FAM、Dylight 488、异硫氰酸荧光素(FITC)、绿色荧光蛋白质(GFP)、HEX、6-JOE、俄勒冈绿(OregonGreen)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、藻红蛋白、REG、若丹明绿、若丹明红、四甲基若丹明(TMR)、泛影葡胺(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明、得克萨斯红(Texas Red)和这些标记的衍生物(即经异硫氰酸酯或用于缀合的其它连接子修饰的卤化类似物等)。
本发明中涵盖的检测抗体缀合物包括用于体外使用的那些检测抗体缀合物，其中抗体连接于在与生色底物接触后将产生有色产物的二级结合配体和/或酶(酶标记)。合适的酶的实例包括尿素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶和/或葡萄糖氧化酶。优选二级结合配体是生物素和/或抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素化合物。所述标记的使用为本领域技术人员所熟知的并且描述于例如美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241中；每一者以引用的方式并入本文中。
含有叠氮基的分子也可以用于通过由低强度紫外光产生的反应性氮烯中间物与蛋白质形成共价键(Potter和Haley,1983)。具体来说，嘌呤核苷酸的2-和8-叠氮基类似物已经用作定点光探针以鉴别粗细胞提取物中的核苷酸结合蛋白质(Owens和Haley,1987；Atherton等人,1985)。2-和8-叠氮基核苷酸也已经用于定位经纯化蛋白质的核苷酸结合域(Khatoon等人,1989；King等人,1989；和Dholakia等人,1989)并且可以用作抗体结合剂。
用于将抗体连接或缀合于缀合部分的若干种方法在本领域中是已知的。一些连接方法涉及使用金属螯合物络合物，使用例如有机螯合剂，例如连接于抗体的二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；亚乙基三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(美国专利号4,472,509和4,938,948，每一者以引用的方式并入本文中)。单克隆抗体也可以在例如戊二醛或高碘酸的偶联剂的存在下与酶反应。具有荧光素标记物的缀合物是在这些偶联剂的存在下或通过与异硫氰酸酯反应来制备。在美国专利No.4,938,948中，例如胸部肿瘤的成像是使用单克隆抗体来实现的，并且使用例如甲基-对羟基苯甲亚胺酸酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟苯基)丙酸酯的连接子将可检测成像部分结合于抗体。
在其它实施方案中，预期通过使用不会改变抗体结合位点的反应条件将硫氢基选择性地引入免疫球蛋白的Fc区中使免疫球蛋白衍生。公开根据这种方法产生的抗体缀合物以展现改善的寿命、特异性和敏感性(美国专利No.5,196,066，其以引用的方式并入本文中)。效应或报导分子的位点特异性连接(其中报导或效应分子缀合于碳水化合物残基的Fc区中)也已经公开在文献中(O'Shannessy等人,1987)。
在本发明的其它实施方案中，免疫球蛋白经例如氚的核素放射性标记。在其它实施方案中，使用纳米金粒子(例如约0.5nm-40nm的尺寸)和/或量子点(Hayward,Calif.)。
IV.酶和底物(发色团)
举例来说，涵盖用于检测CD37的底物和指示剂的用途，例如下文所提供的示范性实施方案。
辣根过氧化酶(HRP)是一种酶，其首先与过氧化氢形成复合物且然后使其分解、产生水和原子氧。与许多其它酶类似，HRP和一些HRP样活性可以被过量底物抑制。HRP与过量过氧化氢之间形成的复合物无催化活性并且在电子供体(例如生色物质)不存在下受到可逆地抑制。导致内源性HRP活性猝灭的是过量过氧化氢和不存在电子供体。
当用于分析***中时，HRP也可以用于将所定义的底物转化成其活化发色团，由此引起变色。HRP酶可以通过许多方法缀合于抗体、蛋白质、肽、聚合物或其它分子。所述方法在本领域中是已知的。将戊二醛添加到含有HRP和抗体的混合物的溶液中将产生与酶相比更多彼此缀合的抗体分子。在两步骤程序中，HRP首先与双官能试剂反应。在第二阶段，仅将活化的HRP与抗体混合，导致更加有效的标记而无聚合。使用两步骤戊二醛程序也将HRP缀合于抗生物素蛋白(抗生蛋白链菌素)。举例来说，在LAB和LSAB是底物的程序中使用这种形式。与生物素缀合也涉及两个步骤，因为生物素必须首先衍化成生物素基-N-羟基琥珀酰亚胺酯或生物素酰肼，随后其可以与HRP酶的ε氨基反应。
3,3'-二氨基联苯胺(DAB)是例如产生高度不溶于醇和其它有机溶剂的棕色终产物HRP的酶的底物。DAB的氧化也会引起聚合，从而导致能够与四氧化锇起反应，并且由此增加其染色强度和电子密度。在用于增强聚合DAB的光学密度的若干种金属和方法中，氯化金与硫化银的组合似乎最成功。
3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)是例如HRP的酶的底物，并且在氧化时形成可溶于醇的玫瑰红色终产物。因此，用AEC加工的样品不可浸于醇或醇溶液(例如哈里斯苏木精(Harris'hematoxylin))中。反而应使用水性复染和封固剂。AEC不幸地容易受到进一步氧化并且当暴露于过量光照时将减弱强度。因此推荐在黑暗中贮存。
4-氯-1-萘酚(CN)是例如HRP的酶的底物，其以蓝色终产物形式沉淀。因为CN可溶于醇和其它有机溶剂中，所以样品不可脱水，暴露于醇性复染，或用含有有机溶剂的封固剂盖上盖玻片。不同于DAB，CN倾向于从沉淀位置扩散开。
对苯二胺二盐酸盐/焦儿茶酚(汉克耶茨试剂(Hanker-Yatesreagent))是例如HRP的酶的底物，其产生不溶于醇和其它有机溶剂的深蓝色反应产物。与聚合DAB类似，这种反应产物可以用锇酸着色。不同结果已经在免疫过氧化酶技术中用汉克耶茨试剂实现。
小牛肠碱性磷酸酶(AP)(分子量100kD)通过断开P-0键从有机酯上除去(通过水解)并转移磷酸基；暂时形成中间物酶-底物键。AP的主要金属活化剂是Mg++、Mn++和Ca++。
AP尚未广泛用于免疫组织化学中直到公布未标记的碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)程序。这一程序中所利用的可溶性免疫复合物的分子量为约560kD。APAAP程序相较于PAP技术的主要优点是没有由内源性过氧化酶活动带来的干预。因为内源性过氧化酶活性对PAP染色可能的分散，APAAP技术被推荐用于血液和骨髓涂片。骨、肾、肝和一些白细胞的内源性碱性磷酸酶活性可以通过将1mM左旋咪唑添加到底物溶液中来抑制，但已经发现5mM更有效。肠碱性磷酸酶未受到左旋咪唑充分抑制。
在免疫碱性磷酸酶染色法中，酶将萘酚磷酸酯(底物)水解成酚类化合物和磷酸酯。酚与无色重氮盐(色原)偶联，产生不溶性有色偶氮染料。已经成功地使用底物和色原的若干种不同组合。
萘酚AS-MX磷酸酯AP底物可以其酸形式或以钠盐形式使用。色原底物固红TR和固蓝BB分别产生亮红色或蓝色终产物。因为两者都可溶于醇和其它有机溶剂，所以必须使用水性封固剂。当对细胞涂片染色时，固红TR是优选的。
其它示范性底物包括萘酚AS-BI磷酸酯、萘酚AS-TR磷酸酯和5-溴-4-氯-3-吲哚氧基磷酸酯(BCIP)。其它可能的色原包括例如固红LB、固深红GBC、硝基蓝四唑(NBT)和碘硝基四唑紫罗兰(INT)。
V.免疫检测方法
在其它实施方案中，本发明关于如本发明所涵盖的用于结合、纯化、除去、定量和/或另外一般检测生物组分(例如CD37)的免疫检测方法。根据本发明制备的抗体可用于检测CD37。一些免疫检测方法包括(且举几例)免疫组织化学、流式细胞术、酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫放射测定分析、荧光免疫分析、化学发光分析、生物发光分析和西方印迹(Western blot)。多种适用的免疫检测方法的步骤已经描述于科学文献中，例如Doolittle M H和Ben-Zeev O,Methods Mol Biol.1999；109:215-37；Gulbis B和Galand P,Hum Pathol.1993年12月；24(12):1271-85；和De Jager R等人,SeminNucl Med.1993年4月；23(2):165-79，每一者以引用的方式并入本文中。
一般来说，免疫结合方法包括获得怀疑包含配体蛋白质、多肽和/或肽的样品，并且根据本发明，视情况而定，在有效允许形成免疫复合物的条件下，使该样品与第一抗配体抗体接触。
就抗原检测而言，所分析的生物样品可以是需要检测CD37的任何样品，例如流体提取物、血液、血浆、血清、脊髓液、淋巴流体、组织切片或试样、均质化组织提取物、活检抽出物、细胞、含有CD37的成分的分离和纯化形式或任何生物流体。在一些实施方案中，使用血液、血浆、组织或淋巴样品或提取物。
在足以允许形成免疫复合物(初级免疫复合物)的有效条件和一段时间下使所选生物样品与抗体接触一般是将抗体组合物简单地添加到样品种并且孵育混合物足够长以使抗体与(即结合于)存在的任何配体蛋白质抗原形成免疫复合物的一段时间。此后，一般将洗涤样品-抗体组合物(例如组织切片)、ELISA培养板、斑点印迹或西方印迹以除去任何非特异性结合抗体物质，从而仅允许那些特异性结合于初级免疫复合物内的抗体被检测到。
一般来说，免疫复合物形成的检测在本领域中是众所周知的并且可以通过应用许多方法来实现。这些方法一般是基于标记或标记物的检测，例如那些放射性、荧光、生物和酶标签中的任一种。关于所述标记的使用的美国专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，每一者以引用的方式并入本文中。当然，如本领域中所已知，通过使用二级结合配体(例如第二抗体)和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合配置可能会发现额外优点。
检测中所用的抗配体抗体自身可连接于可检测标记，其中随后将简单地检测这标记，从而允许组合物中初级免疫复合物的量被测定出。可选地，变得结合于初级免疫复合物内的第一抗体可以借助于对于该抗体具有结合亲和性的第二结合剂来检测。在这些情况下，第二结合剂可以连接于可检测标记。第二结合剂本身经常是抗体，其因此可被称为“二级抗体”。在足以允许形成二级免疫复合物的有效条件和一段时间下使初级免疫复合物与经标记的二级结合剂或抗体接触。随后一般洗涤二级免疫复合物以除去任何非特异性结合的经标记的二级抗体或配体，并且随后检测二级免疫复合物中的残余标记。
其它方法包括通过两步骤方法检测初级免疫复合物。如上文所述，使用对于抗体具有结合亲和性的第二结合剂(例如抗体)形成二级免疫复合物。洗涤后，再次在足以允许形成免疫复合物(三级免疫复合物)的有效条件和一段时间下，二级免疫复合物与对于第二抗体具有结合亲和性的第三结合剂或抗体接触。该第三配体或抗体连接于可检测标记，从而允许检测由此形成的三级免疫复合物。如果需要的话，这种***可提供信号扩增。
在另一个实施方案中，使用生物素化单克隆或多克隆抗体检测靶抗原，并且然后使用第二步骤抗体检测连接于复合生物素的生物素。在那种方法中，首先将待测试的样品孵育于包含第一步骤抗体的溶液中。如果靶抗原存在，那么一些抗体结合于该抗原以形成生物素化抗体/抗原复合物。随后抗体/抗原复合物是通过孵育于抗生蛋白链菌素(或抗生物素蛋白)、生物素化DNA和/或补充生物素化DNA的连续溶液中来扩增的，其中每一步骤将额外生物素位点添加到抗体/抗原复合物中。重复扩增步骤直到实现合适的扩增水平，此时将样品孵育于包含针对生物素的第二步骤抗体的溶液中。这种第二步骤抗体是经标记的，例如可用于通过组织酶学使用色原底物检测抗体/抗原复合物的存在的酶。在合适的扩增下，可以产生肉眼可见的缀合物。
在一个实施方案中，免疫组织化学(IHC)用于免疫学检测。使用IHC，样品中CD37的检测可以通过用例如抗CD37抗体的探针靶向样品来实现。该探针可以直接或间接连接于可检测标记或可以通过直接或间接连接于可检测标记的另一探针来检测。
在一些实施方案中，IHC可以区分不同水平的蛋白质表达，例如校准IHC。在一些实施方案中，IHC可以区分具有低细胞表面CD37表达、中等CD37细胞表面表达或高CD37细胞表面表达的样品的染色强度。
在一些实施方案中，IHC可以区分染色强度与染色均一性。在一个实施方案中，针对强度和均一性对CD37的免疫学检测(通过免疫组织化学)进行评分(染色细胞的百分比-仅膜)。用于CD37表达的强度比较量表关联为0-阴性、0-1-很弱、1-弱、1-2-弱到中等、2-中等、2-3-中等到强、3-强、3+-很强。定量地，评分0表示未观察到染色或在小于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色。评分1表示在大于10％的肿瘤细胞中检测到微弱/勉强可觉察的膜染色。细胞仅在其一部分膜中被染色。对于评分2，在大于10％的肿瘤细胞中观察到中等完全膜染色。最后，评分3表示在大于10％的肿瘤细胞中观察到强的完全膜染色。CD37表达为0或1评分的那些样品可以视为不过表达CD37，而2或3评分的那些样品可以视为过表达CD37。过表达CD37的样品也可以通过对应于每个细胞所表达的CD37分子或每个细胞所结合的抗体(ABC)的拷贝数目的免疫组织化学评分来评估，并且可以用生物化学方法测定。用于CD37细胞膜染色均一性百分比的比较量表关联如下：0-阴性、集中-<25％、非均质(hetero)-25-75％和均质(homo)->75％。
IHC可以手动或使用自动***(例如使用自动染色器)进行。因此，可以对来自血液、血浆、血清或淋巴流体等的细胞、细胞颗粒、组织、制备物进行IHC。在一些实施方案中，样品是固定样品。在一些实施方案中，样品是石蜡包埋的样品。在一些实施方案中，样品是***固定和石蜡包埋的样品。
另一已知的免疫检测方法利用immuno-PCR(聚合酶链反应)方法。该PCR方法使用用低pH值或高盐缓冲液的洗涤的释放抗体的DNA/生物素/抗生蛋白链菌素/抗体复合物。然后使用所得洗液用合适的引物和适当对照物进行PCR反应。在特定实施方案中，可以利用PCR的巨大扩增能力和特异性检测单一抗原分子。可以实时进行所述检测。举例来说，预期使用定量实时PCR。
在一个实施方案中，使用流式细胞术进行免疫学检测。因此，举例来说，每个细胞所结合的抗体(ABC)数目可以利用流式细胞术来评估。每个细胞所结合的抗CD37抗体的高数目可以指示高CD37表达水平和易用抗CD37抗体或其免疫缀合物治疗的高可能性。
VI.核酸杂交
原位杂交一般是对固定于载玻片的细胞或组织切片进行的。原位杂交可以通过若干种传统方法进行(参见例如Leitch等人In situHybridization:a practical guide,Oxford BIOS Scientific Publishers,Microscopy handbooks v.27(1994))。在一个原位程序中，使用荧光染料(例如当用氩离子激光激发时发出绿色荧光的异硫氰酸荧光素(FITC))标记与细胞中的靶核苷酸序列互补的核酸序列探针。包含靶核苷酸序列的每一细胞将结合经标记的探针，从而在使细胞暴露于适合于激发所用特定荧光染料的光源的波长时产生荧光信号传导。
可以使用多种程度的杂交严格度。因为杂交条件变得更严格，所以在探针和靶之间需要更大程度的互补性以形成并维持稳定的双链体。通过升高温度、降低盐浓度或升高甲酰胺浓度来增加严格度。添加硫酸葡聚糖或升高其浓度也可以将经标记探针的有效浓度以增加杂交率和最终信号强度。杂交后，用一般包含类似于杂交溶液中存在的那些试剂的试剂的溶液洗涤载玻片，其中洗涤时间视所需严格度而由数分钟到数小时不等。较长时间或更严格的洗涤典型地降低非特异性背景，但冒着降低总敏感性的危险。
用于核酸杂交分析的探针可以是RNA或DNA寡核苷酸或多核苷酸并且可能不仅含有天然存在的核苷酸而且含有其类似物，例如地高辛dCTP、生物素dcTP 7-氮杂鸟嘌呤、叠氮胸苷、次黄嘌呤核苷或尿苷。其它适用的探针包括例如肽探针和其类似物、分支基因DNA、类肽(peptidometics)、肽核酸(PNA)和/或抗体。
探针将具有对所关注的靶核酸序列足够的互补性以使得在靶核酸序列和探针之间发生稳定且特异性的结合。稳定杂交所需的同源性程度随杂交培养基和/或洗涤培养基的严格度而变。优选地，本发明中使用完全同源性探针，但本领域技术人员将容易了解，展现较小但足够同源性的探针可用于本发明中(参见例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold SpringHarbor Press,(1989))。
探针也可以通过若干种方法来产生和选择，这些方法包括(但不限于)通过原位杂交、体细胞杂交板或分选染色体的斑点印迹定位；染色体连锁分析；或从来自人类细胞系或具有人类染色体、放射体细胞杂交体、染色体区域显微解剖的体细胞杂交体的分选染色体文库，或从通过对于独特染色体基因座具有特异性的PCR引物或其它合适的方法(如相邻YAC克隆)鉴别的酵母人工染色体(YAC)克隆和分离。探针可以是在质粒、噬菌体、柯斯质粒(cosmid)、YAC、细菌人工染色体(BAC)、病毒载体或任何其它合适的载体中克隆的基因组DNA、cDNA或RNA。探针可以通过传统方法用化学方法克隆或合成。当克隆时，将分离的探针核酸片段典型地***载体(例如λ噬菌体、pBR322、M13或含有SP6或T7启动子的载体)中并且在细菌宿主中克隆成文库。[参见例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,(1989)]。
举例来说，探针优选地经标记，例如经荧光团标记。荧光团的实例包括(但不限于)稀土螯合物(铕螯合物)、得克萨斯红、若丹明、荧光素、丹酰、丽丝胶(Lissamine)、伞形酮、藻红蛋白、藻青蛋白或市售的荧光团，例如SPECTRUM ORANGETM和SPECTRUM GREENTM和/或上述任何一种或多种的衍生物。分析中所用的多种探针可以经超过一种可辨别的荧光或颜料颜色标记。这些色差提供一种鉴别特定探针的杂交位置的方法。此外，空间上间隔的探针可以通过由混合两种其它颜色所产生的不同颜色的光或颜料(例如红色+绿色光＝黄色)颜料(例如蓝色+黄色＝绿色)或通过利用每次仅通过一种颜色的滤光器设置来鉴别。
探针可以利用本领域技术人员所已知的传统方法直接或间接地经荧光团标记。
VII.检测试剂盒和组合物
本发明还提供了如本文所公开的用于本发明的实践的试剂盒。所述试剂盒可包含容器，其中各自含有方法中所用的多种试剂中的一种或多种(典型地呈浓缩形式)，包括例如已经连接于标记物的一种或多种结合剂(抗体)，或任选地含有用于将结合剂偶联于抗体或核酸分子(以及标记物自身)的试剂；缓冲液、适当的三磷酸核苷酸(例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、ATP、CTP、GTP和UTP)、反转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和一种或多种用于通过扩增检测核酸分子的序列特异性或变形引物；和/或用于分离(任选地通过显微解剖)以支持本发明的实践的试剂和装备仪器。也将典型地包括描述本发明的配体检测方法中的试剂盒组分的标签或指示物或一组使用说明书，其中该等说明书可以与包装说明书和/或试剂盒或组分其的包装关联在一起。
在其它实施方案中，本发明关于用于如上文所述的免疫检测方法的免疫检测试剂盒。因为抗体一般用于检测CD37，所以抗体将优选地包括在试剂盒中。免疫检测试剂盒将因此在合适的容器构件中包含结合于CD37的第一抗体，和/或任选地免疫检测试剂和/或进一步任选地CD37蛋白质或含有CD37蛋白质的细胞或样品。
试剂盒的免疫检测试剂可采取多种形式中的任何一种，包括与既定抗体缔合和/或连接于既定抗体的那些可检测标记。也涵盖与二级结合配体缔合和/或连接于二级结合配体的可检测标记。示范性二级配体是对于第一抗体具有结合亲和性的那些二级抗体。
用于本发明试剂盒的其它合适的免疫检测试剂包括包含对于第一抗体具有结合亲和性的二级抗体的双组分试剂，以及对于第二抗体具有结合亲和性的第三抗体，该第三抗体连接于可检测标记。如上文所述，许多示范性标记在本领域中是已知的和/或所有所述标记可以适当地与本发明结合使用。
试剂盒可进一步包含一种或多种用于治疗癌症的治疗剂，例如抗CD37免疫缀合物和/或化学治疗剂。
试剂盒可进一步包含用于测量受试者的CD37表达的CD37检测试剂，包含CD37检测试剂，和使用说明书。在一个实施方案中，该CD37检测试剂包含CD37结合肽、蛋白质或分子探针(即核酸)。在另一个实施方案中，CD37检测试剂是抗CD37抗体。在另一个实施方案中，试剂盒进一步包含结合抗CD37抗体的二级抗体。在一个实施方案中，CD37特异抗体是以2.1、4.2和8.4μg/mL的浓度包括。在另一个实施方案中，抗体以浓溶液形式与稀释说明书一起包括在内以实现2.1、4.2和8.4μg/mL的最终浓度。在另一个实施方案中，试剂盒进一步包含选自以下的检测试剂：酶、荧光团、放射性标记和发光体。在另一个实施方案中，检测试剂是选自以下：生物素、地高辛、荧光素、氚和若丹明。
试剂盒也可以包括用于CD37表达的检测和评分的说明书。试剂盒也可以包括对照或参考样品。对照或参考样品的非限制性实例包括来源于阴性正常组织(阴性对照组)或肿瘤(阳性对照组)样品的细胞颗粒或组织培养细胞系。示范性阳性对照细胞系包括Daudi、Ramos、Namalva且阴性对照组包括Colo205和经表达CD37的表达载体稳定或瞬时转染的细胞系。
VIII.CD37结合剂
结合CD37的任何抗体可用于本发明的的检测方法中。可用于本发明方法中的治疗有效抗CD37抗体的实例可在美国公开申请No.2011/0256153中找到，该案以引用的方式并入本文中。举例来说，抗CD37抗体可以是小鼠、嵌合或人源化CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56或CD37-57。CD37的全长氨基酸序列在本领域中是已知的并且还如由SEQ ID NO:1表示提供于本文中。用于检测CD37的特异性适用抗体是小鼠单克隆抗huCD37克隆CT1(Leica#NCL-CD37)。治疗有效抗CD37抗体的实例是huCD37-3-SMCC-DM1。多肽SEQ ID NO:57对应于huCD37-3的可变域重链型式1.0。分别，多肽SEQ ID NO:58对应于huCD37-3的可变域重链型式1.1，并且多肽SEQ ID NO:74对应于huCD37-3的可变域轻链。在某些实施方案中，CD37抗体可以包含由重组质粒DNAphuCD37-3LC(ATCC保藏名称PTA-10722，2010年3月18日保藏于ATCC(10801 University Boulevard,Manassas,Virginia 20110))编码的轻链。在某些实施方案中，CD37抗体可以包含由重组质粒DNAphuCD37-3HCv.1.0(ATCC保藏名称PTA-10723，2010年3月18日保藏于ATCC)编码的重链。在某些实施方案中，CD37抗体可以包含由重组质粒DNA phuCD37-3LC(PTA-10722)编码的轻链和由重组质粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(PTA-10723)编码的重链。在某些实施方案中，CD37抗体可以包含由重组质粒DNA phuCD37-3LC(PTA-10722)编码的VL-CDR和由重组质粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(PTA-10723)编码的VH-CDR。
下文提供适用于本发明的治疗方法中的CD37免疫缀合物的实例。
IX.CD37免疫缀合物
本发明还增加缀合物(本文中也称为免疫缀合物)的功效，该等缀合物包含连接或缀合于细胞毒素(药物)或前药的如本文所公开的抗CD37抗体、抗体片段、功能等效物、改良抗体和其方面。示范性CD37抗体和免疫缀合物可见于美国公开申请No.2011/0256153中，该案以引用的方式并入本文中。本发明的尤其有效的治疗性免疫缀合物包含如上文所述的huCD37-3抗体。
合适的药物或前药在本领域中是已知的。在某些实施方案中，药物或前药是细胞毒性剂。用于本发明的细胞毒性缀合物的细胞毒性剂可以是导致细胞死亡或诱导细胞死亡或以一些方式降低细胞存活力的任何化合物，并且包括例如类美登素和类美登素类似物、苯二氮紫杉烷类、CC-1065和CC-1065类似物、度卡霉素和度卡霉素类似物、烯二炔(例如卡奇霉素、海兔毒素和海兔毒素类似物，包括奥里斯他汀)、富山霉素衍生物、来普霉素衍生物、甲氨喋呤(methotrexate)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、长春新碱、长春花碱、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥和吗啉代阿霉素。在某些实施方案中，细胞毒性剂是类美登素和类美登素类似物。
药物或前药可以例如通过二硫键连接于抗CD37抗体，例如huCD37-3或其片段。连接子分子或交联剂包含可以与抗CD37抗体或其片段反应的反应性化学基团。在某些实施方案中，用于与细胞结合剂反应的反应性化学基团是N-琥珀酰亚胺酯和N-磺基琥珀酰亚胺酯。另外地，连接子分子包含反应性化学基团，在某些实施方案中，可以与药物反应形成二硫键的二硫代吡啶基。在某些实施方案中，连接子分子包括例如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(参见例如Carlsson等人,Biochem.J,173:723-737(1978))、4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)(参见例如美国专利No.4,563,304)、4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(sulfo-SPDB)(参见美国公布No.20090274713)、4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)(参见例如CAS注册号341498-08-6)、2-亚氨基硫杂环戊烷或乙酰丁二酸酐。
也可以制备具有不可裂解连接的抗体-类美登素缀合物。本领域中描述所述交联剂(参见ThermoScientific Pierce CrosslinkingTechnical Handbook和美国专利申请公布No.2005/0169933)并且包括但不限于4-(顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(其为SMCC的“长链”类似物)(LC-SMCC)、κ-顺丁烯二酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、β-顺丁烯二酰亚胺基丙酸N-琥珀酰亚胺酯(BMPS)、γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、ε-顺丁烯二酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-顺丁烯二酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SMPB)和N-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)、N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)、溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBA)和3-(溴乙酰胺基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBAP)。在某些实施方案中，如文献中所述，抗体经交联剂修饰，例如4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、sulfo-SMCC、顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、sulfo-MBS或琥珀酰亚胺基-碘乙酸酯，以引入1-10个反应性基团(Yoshitake等人,Eur.J.Biochem.,101:395-399(1979)；Hashida等人,J.Applied Biochem.,56-63(1984)；和Liu等人,Biochem.,18:690-697(1979))。
本发明包括其中细胞结合剂细胞毒性剂缀合物中的细胞毒性剂(例如类美登素)与细胞结合剂的平均摩尔比为约1到约10的方面。术语“MAR”、“类美登素-Ab比率”、“药物负荷”、“DAR”和“药物-Ab比率”可以在本文中用于表征包含类美登素化合物作为细胞毒性剂和抗体或其片段作为细胞结合剂的缀合物中细胞毒性剂与细胞结合剂的比率。因此，在一些实施方案中，MAR为约1到约10、约2到约7、约3到约5、约2.5到约4.5(例如、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5)、约3.0到约4.0、约3.2到约4.2、约4.5到5.5(例如、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5)。在一个方面，可以连接于细胞结合剂的药物分子的数目可以平均为约2到约8(例如，1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1)。在某些实施方案中，药物是N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N2'-脱乙酰基-N2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。因此，在某一实施方案中，抗体huCD37-3缀合于DM1或DM4。
X.CD37表达和治疗功效的相关性
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于鉴别具有增加的用于对CD37靶向抗癌疗法有反应的可能性的受试者的方法。本发明是部分基于升高的CD37表达水平与CD37靶向抗癌治疗剂的功效有关的发现和检测B细胞样品中的CD37表达的动态范围的方法的发现。
使用异种移植物模型的患者样品的评估和与体内功效的相关性说明用于选择对治疗更可能有反应的受试者的表达分析的能力。IHC提供对肿瘤细胞上的CD37表达的评分：0(无表达)到3+(极高表达水平)。CD37表达评分为1、2、3或3+(或2、3或3+)的样品具有增加的在临床相关剂量的CD37免疫缀合物下对CD37靶向抗癌疗法有反应的可能性(例如CD37免疫缀合物的0.1到10或10以上mg/kg异种移植物剂量在患者中可以接近3.0到400mg/m2)。因此，对具有升高的CD37评分的个体的鉴别将有助于鉴别可能对临床相关剂量有反应的那些个体。如下文更详细地描述，对CD37治疗剂的敏感性可能与CD37评分2或更高有关，尤其是与水平3评分有关。此外，CD37更均一水平的表达也可以用作CD37表达与治疗益处的相关性的指示剂。因此，均质染色均一性或增加的强度与非均质染色均一性的组合可以指示增加的CD37表达。举例来说，大于2hetero的评分可以用作用CD37治疗剂治疗的患者选择准则。
CD37表达分析也鉴别CD37靶向抗癌疗法(“低剂量疗法”)的水平降低可以有效引起抗肿瘤反应的患者。如本领域中所了解，化合物一般是以实现所需治疗反应的最小剂量施用。这对于引起临床并且经常不合乎需要的副作用的治疗剂特别重要。识别具有升高的CD37表达水平的那些受试者的能力允许CD37靶向治疗剂的剂量的最小化，由此减少可能的副作用，同时维持治疗功效。
XI.药物组合物和治疗方法
CD37结合剂(包括抗体、免疫缀合物和多肽)适用于多种应用，包括(但不限于)治疗性治疗方法，例如癌症治疗。在某些实施方案中，药剂适用于抑制肿瘤生长、诱导分化、减小肿瘤体积和/或降低肿瘤的致瘤性。有用的方法可以是体内、离体或体内方法。在某些实施方案中，CD37结合剂或抗体或免疫缀合物或多肽是与人类CD37结合的拮抗剂。
在某些实施方案中，用CD37结合剂或拮抗剂(例如huCD37-3抗体或免疫缀合物)治疗的疾病是癌症。在某些实施方案中，癌症的特征为表达CD37结合剂(例如抗体)结合的CD37的肿瘤。
本发明提供了用于治疗癌症的方法，其包括向受试者(例如需要治疗的受试者)施用治疗有效量的CD37结合剂。在某些实施方案中，该癌症是选自以下：B细胞淋巴瘤、NHL、前体B细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞赘生物、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、低级、中级和高级(FL)、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT型边缘区B细胞淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤、脾型边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特氏淋巴瘤(BL)、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴组织增生性病症、瓦登史东巨球蛋白血症和退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)。在某些实施方案中，该受试者是人类。
本发明进一步提供了用于使用本文所述的抗体或其它药剂抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括使细胞与CD37结合剂(例如抗体)体外接触。举例来说，将表达CD37的永生化细胞系或癌细胞系培养在添加抗体或其它药剂以抑制肿瘤生长的培养基中。在一些实施方案中，从例如组织活检、胸膜积液或血样的患者样品分离肿瘤细胞并且培养在添加CD37结合剂以抑制肿瘤生长的培养基中。
在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括使肿瘤或肿瘤细胞与CD37结合剂(例如抗体)体内接触。在某些实施方案中，使肿瘤或肿瘤细胞与CD37结合剂接触是在动物模型中进行。举例来说，CD37结合剂可以施用于已经在免疫受损小鼠(例如NOD/SCID小鼠)中生长的表达一种或多种CD37的异种移植物以抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，CD37结合剂是在将致瘤细胞引入动物中的同时或之后不久施用以防止肿瘤生长。在一些实施方案中，CD37结合剂是在致瘤细胞已生长到指定大小后作为治疗剂施用。
在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括向受试者施用治疗有效量的CD37结合剂。在某些实施方案中，该受试者是人类。在某些实施方案中，受试者具有肿瘤或已除去肿瘤。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了利用CD37-3抗体(例如嵌合、人源化或完全人类)或其免疫缀合物治疗癌症的方法，其中该癌症因为具有增加的CD37表达而使用本文所述的方法来鉴别。在某一实施方案中，CD37-3免疫缀合物是huCD37-3-SMCC-DM1。
在某些实施方案中，通过将本发明的经纯化的抗体或药剂与药学上可接受的媒介物(例如载剂、赋形剂)组合来制备制剂用于贮存和使用(Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition MackPublishing,2000)。合适的药学上可接受的媒介物包括(但不限于)无毒缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵；氯化苯甲乙氧铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，例如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽(例如小于约10个氨基酸残基)；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，例如单糖、双糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和非离子型表面活性剂，例如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。
本发明的药物组合物可以许多方式施用以用于局部或全身治疗。施用可以是局部施用(例如施用于粘膜，包括***和直肠传递)，例如经皮贴片、软膏、洗液、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液体和粉末；肺部施用(例如通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过雾化器；气管内、鼻内、经表皮和经皮)；经口施用；或肠胃外施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉注射或输注；或颅内施用(例如鞘内或心室内)。
本发明的抗体或免疫缀合物可以与具有抗癌性质的第二化合物组合于药物组合制剂中或给药方案作为组合疗法。药物组合制剂或定量方案的第二化合物优选地具有与组合的ADC互补的活性，以使得其不会不利地影响彼此。还提供了包含CD37结合剂和第二抗癌剂的药物组合物。
为了治疗疾病，将适当剂量的本发明的抗体或药剂视待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和过程、疾病的反应、无论施用抗体或药剂是出于治疗抑或预防目的、先前疗法、患者的临床病史等而定，这全部都由治疗医生决定。抗体或药剂可以施用一次或在从数天持续到数月的一系列治疗中施用，或直到实现治愈或实现疾病状态减弱(例如肿瘤尺寸减小)。最佳给药方案可以由测量患者体内的药物积累来计算并且将视相对个别抗体或药剂的功效而变化。施用医生可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。在某些实施方案中，剂量是每千克体重0.01微克到100毫克，并且可以每日、每周、每月或每年给予一次或一次以上。在某些实施方案中，抗体或其它CD37结合剂是每周给予一次、每两周给予一次或每三周给予一次。在某些实施方案中，抗体或其它CD37结合剂的剂量为每千克体重约0.1微克到约20毫克。治疗医生可以基于所测量的药物在身体流体或组织中的滞留时间和浓度来估计给药重复率。
组合疗法可以提供“协同作用”并且证明“具有协同作用”，即当活性成分一起使用时所实现的作用大于由化合物分开使用所产生的作用之和。当活性成分如下时可以获得协同作用：(1)共配制并且以组合单位剂量制剂形式同时施用或传递；(2)以独立制剂形式交替或并行传递；或(3)通过一些其它方案。当以交替疗法传递时，当例如通过以独立注射器分别注射而依序施用或传递化合物时可以获得协同作用。一般来说，在交替疗法期间，依序(即连续)施用有效剂量的每一活性成分，而在组合疗法中，共同施用有效剂量的两种或两种以上活性成分。
本公开的实施方案可以进一步通过参考以下非限制性实例来定义，其详细描述本公开的某些抗体的制备和本公开的抗体使用方法。本领域技术人员将显而易见，可以对材料和方法作出许多修改，而不脱离本公开的范围。
实施例
应了解，本文所述的实例和实施方案仅出于说明性目的，并且根据其将向本领域技术人员提出多种修改或变化并将包括在本申请的精神和范围内。
实施例1
细胞样品中的CD37的免疫组织化学染色-手动方法
在以下染色剂和条件下使用***固定的石蜡包埋细胞颗粒和组织作为测试样品。
用鼠科抗CD37抗体克隆CT1(muIgG1，Leica，目录号NCL-CD37)、鼠科抗CD20抗体克隆L26(muIgG2a，Dako Cytomation，目录号M 07 55)和如下来自Coulter的各自同种型对照物muIgG1和muIgG2a抗体对***固定的石蜡包埋(FFPE)患者淋巴瘤活检进行染色。在干燥箱中在60℃下将含有样品的载玻片烘烤30分钟并且进行脱蜡和通过连续浸没于以下溶剂中来复水：二甲苯、无水ETOH、95％ETOH和水。在decloaker中的pH 9.5 Borg缓冲液(BiocareMedical)中进行抗原修复后，用PBS(Gibco)洗涤载玻片，并且用含有2％正常马血清(Vector Labs)和抗生物素蛋白-生物素阻断剂(每毫升4滴，Vector Labs)的PBS阻断切片30分钟。为了制备一级抗体的工作溶液，用稀释剂[含有2％正常马血清和生物素(每毫升4滴)的PBS]将CD37-测试和CD37-同种型对照物品各自稀释到4.0μg/mL。用稀释剂将CD20-测试和CD20-同种型对照物品各自稀释到0.5μg/mL。用PBS洗涤载玻片，并且在室温下与测试物品(抗CD37或抗CD20)或对照物品(muIgG1或muIgG2a)一起孵育60分钟，随后与10μg/mL生物素化马抗小鼠IgG(H+L)二级抗体(Vector Labs)一起孵育30分钟。再次用PBS洗涤载玻片并且与抗生物素蛋白-生物素-过氧化酶复合物(Vector Labs)一起孵育40分钟以检测所结合的二级抗体。与DAB(3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐，Dako Cytomation)一起孵育5分钟，产生颜色信号。通过浸没于充满苏木精(Biocare Medical)的容器中对含有显影的组织切片的载玻片进行复染4分钟。对载玻片清除过量染色，随后迅速浸没于增强蓝色核染色的碳酸锂溶液(0.135 M Li2CO3水溶液，Sigma Aldrich)中。通过用95％和100％ETOH冲洗两次，随后用二甲苯洗涤四次，每次1分钟来使载玻片脱水。使用封固剂(Richard Allan Scientific)将盖玻片安装到载玻片上。
如表1中所概述，FFPE样品来源于肿瘤微阵列以及来自三个不同CLL肿瘤的人类组织块体。
表1：FFPE测试样品
测试CD37测试物品鼠科抗CD37抗体克隆CT1以测定与huCD37抗原的结合特异性。使用所报道的IHC染色法，对300-19和经huCD37转染的300-19(300-19/huCD37)细胞颗粒的FFPE切片进行染色并评估CD37。CD37测试物品将300-19/huCD37细胞特异性染色且在300-19细胞中恢复未染色(分别为3homo和阴性；参见图1)。这些结果证明克隆CT1特异性靶向huCD37抗原。(图1)。也对人类正常脾的FFPE切片进行染色并评估CD37。如图2中所示，脾的白髓(含有富含B淋巴细胞的淋巴滤泡)显示强CD37染色，而脾的红髓(含有单核细胞和红细胞)显示极少到无CD37染色。
每一测试和对照物品与组织和细胞颗粒的免疫反应性由顾问病理学家Dr.David Dorfman测定。首先将样品分类为大细胞，由弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)组成；或小细胞，由套细胞淋巴瘤(MCL)、粘膜相关淋巴组织(MALT)、滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)组成。将小细胞组进一步分类为各自小细胞亚型。
对于评估的每一个组织，报告对染色强度和染色均一性的描述。染色强度评分和均一性量表描述于表2中。评估的每一组织样品的最终报告评分是测试物品的评分减去各自对照物品的评分。通过将染色评分与校准细胞颗粒对照组进行比较来估计每一样品的ABC(每个细胞结合的抗体)水平。
表2.用于评估CD37抗体克隆CT1与FFPE组织样品的免疫反应性的强度评分和均一性量表。
使用抗CD37抗体-PE缀合物和QuantiBRITE***(BD Biosciences)测定肿瘤细胞系的CD37表达水平。研究中包括若干种B细胞恶性病细胞系。为了获得可靠的ABC值，使用抗体-PE缀合物的结合实验应在饱和浓度(浓度，在该浓度下所有可用的结合位点都被缀合物占据的)下进行。为了测定抗CD37抗体-PE缀合物的所述浓度，对具有多种CD37表达水平的一组CD37阳性细胞系进行结合实验。将细胞与广泛浓度范围的PE缀合物一起在冰上孵育两小时，用FACS缓冲液(含1％BSA的PBS)洗涤，用含1％甲醛的PBS固定并且在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。测定缀合物使所有测试细胞系上的细胞表面结合位点饱和的浓度。在随后结合ABC-实验中，使用那一浓度的PE缀合物。每一样品分析一式两份或一式三份；对每一细胞系进行若干个独立实验。
使用流式细胞术方法，通过用饱和浓度的藻红蛋白(PE)标记的抗CD37抗体(huCD37-PE)对细胞染色来针对阳性对照细胞系、Daudi、Ramos和RL中的每一个的CD37测定每个细胞所结合的抗体(ABC)值。然后为CD37优化免疫组织化学染色条件，以使得Daudi、Ramos和RL阳性对照细胞(通过流式细胞术每一个表达均一水平的CD37和不同ABC值)通过IHC也显示出不同水平的染色强度(参见图3和图4)。Daudi和Ramos展现均质染色和高强度，而RL的染色具有较低强度和非均质图案。从细胞颗粒观察到的CD37染色强度趋势对应于所报告的ABC值，其中较高ABC值360,000和120,000ABC导致比ABC值55,000更强的染色。染色结果和各自的ABC值列于表3中。优化CD20染色以使得在分别表达类似水平的CD20和CD37的细胞颗粒中CD20和CD37的染色评分类似(参见图5)。
表3：细胞系上的CD37的ABC值和各自的染色结果。
在所评估的赘生性细胞类型中，CD37在B-NHL中显著表达(表4)。通过免疫组织化学在包括例如FL、MALT淋巴瘤、DLBCL、BL和MCL的亚型的B细胞NHL中证明不同水平的均一CD37表达(参见图6)。如图6中所示，大多数NHL样品显示IHC评分≥2的CD37表达。这对应于ABC值≥55,000的对照细胞系颗粒(例如Daudi、Ramos和RL)的染色水平。展示针对CD37染色的淋巴瘤样品的代表性照片展示于图7中。T细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤(MM)样品并不显示CD37或CD20染色。
表4.赘生性细胞类型中CD37和CD20的染色结果的总结。
实施例2
在带有SU-DHL-4(人类DLBCL)异种移植物的雌性CB.17 SCID小鼠中huCD37-3抗体和huCD37-3-SMCC-DM1的抗肿瘤活性
在这一研究中，评估在带有皮下SU-DHL-4肿瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤模型)的雌性SCID小鼠中CD37-3抗体和huCD37-3-SMCC-DM1的抗肿瘤活性(中值肿瘤体积，mm3)。根据体重将小鼠随机化到各组(每组n＝10)中。在随机化第二天进行处理，并且各组包括给予PBS(每次注射200μL)的对照组、huCD37-3抗体和不可裂解huCD37-3-SMCC-DM1缀合物。以对于抗体和huCD37-3-SMCC-DM1来说每次注射10mg蛋白质/kg的单次静脉内推注形式施用处理。如同PBS对照组动物一样，所有处理都耐受性良好并且没有体重减轻。十只PBS对照组动物全部形成肿瘤(100％成瘤率)，在细胞接种后37天中值肿瘤体积达到1000mm3。计算每一处理组的平均和中值肿瘤体积。另外，对于每一处理，计算％T/C值，其对应于每一处理组的中值肿瘤体积基团除以媒介物处理组的中值肿瘤体积。％T/C值等于或低于42％的处理被视为具有活性，而％T/C值等于或低于12％的处理被视为具有高活性。
在这一研究中，huCD37-3抗体的单次静脉内处理(每次注射10mg/kg)具有活性且为32％T/C；然而，没有无肿瘤存活者(tumor-freesurvivor；TFS)。huCD37-3-SMCC-DM1(每次注射10mg/kg)具有高活性且％T/C为1％。仅作为单次静脉内处理(每次注射10mg/kg)的huCD37-3-SMCC-DM1的抗肿瘤活性(中值肿瘤体积，mm3)展示于图8中。
如(以引用的方式并入本文中的美国公开申请No.2011/0256153)的实施例17中所概述，进行另一研究以评估在带有皮下SU-DHL-4肿瘤的雌性SCID小鼠中的CD37-3抗体和huCD37-3-SMCC-DM1。根据体重将动物随机化到各处理组中并且在细胞接种10mg/kg的huCD37-3 Ab或huCD37-3-SMCC-DM1后第15天处理一次。细胞接种后第38天时的％T/C值对应于huCD37-3或huCD37-3-SMCC-DM1分别为34％或4％。在细胞接种后第74天时，huCD37-3-SMCC-DM1处理导致8/10的无肿瘤存活者。在huCD37-3抗体或PBS媒介物对照组中未观察到TFS。在这一模型中，huCD37-3-SMCC-DM1缀合物在2.5或5mg/kg的单次剂量下也显示强功效，在细胞接种后第37天时％T/C值分别为18％和6％。因此，在SU-DHL-4模型中，huCD37-3-SMCC-DM1在10mg/kg的单次剂量下具有高活性并且在2.5mg/kg的单次剂量下具有活性。
实施例3
在带有DoHH2异种移植物的SCID小鼠(人类滤泡性淋巴瘤模型)中huCD37抗体huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1和护理标准化学治疗剂的抗肿瘤功效
在这一研究中，在带有皮下DoHH2肿瘤的雌性SCID小鼠(人类滤泡性淋巴瘤模型)中研究huCD37-3抗体、huCD37-3-SMCC-DM1、抗体和CVP(环磷酰胺(cyclophosphamide)、长春新碱和***(prednisone))的抗肿瘤活性。在肿瘤细胞接种后十一天，通过肿瘤体积将八十一只小鼠随机化到9个组(每组n＝9)中。在随机化第二天(第12天)开始处理，并且各组包括给予PBS(每次注射200μL)对照组，施用单次静脉内剂量10、5或2.5mg/kg的huCD37-3抗体或huCD37-3-SMCC-DM1缀合物的六个组，施用六次静脉内利妥昔单抗抗体剂量2mg/kg(每周两次乘以三)的一个组，和施用单次静脉内剂量40mg/kg的环磷酰胺和0.5mg/kg的长春新碱，以及五次日口服剂量0.2mg/kg的***的一个组。
如同PBS对照组动物一样，10、5和2.5mg/kg的huCD37-3抗体和huCD37-3-SMCC-DM1缀合物以及每次注射2mg/kg的利妥昔单抗(rituximab)抗体(2qw×3)的单一处理耐受性良好且无体重减轻。用CVP处理是有毒的，其中一例动物药物相关死亡和12％平均体重减轻(第18天是最低点)。这只动物从数据分析中排除。
九只PBS对照组动物全部形成肿瘤(100％成瘤率)，在细胞接种后19天中值肿瘤体积达到800mm3。计算每一处理组的中值和平均肿瘤体积。在这一研究中，用2.5和5mg/kg的huCD37-3抗体和huCD37-3-SMCC-DM1缀合物以及抗体(2mg/kg，每周两次乘以三)单次静脉内处理无活性且>42％T/C。用10mg/kg的huCD37-3抗体和huCD37-3-SMCC-DM1缀合物单次静脉内处理具有活性且分别为37％和16％T/C。对于这一方案，用所施用的一定剂量和时间表的CVP处理虽然具有高活性且2％T/C，但却高于耐受剂量。在带有DoHH2人类肿瘤异种移植物的SCID小鼠中huCD37-3抗体、huCD37-3-SMCC-DM1和标准化学治疗剂的抗肿瘤活性(中值肿瘤体积，mm3)展示于图9中。在这一模型中仅作为单次静脉内处理(每次注射10mg/kg)的huCD37-3-SMCC-DM1的抗肿瘤活性(中值肿瘤体积，mm3)展示于图10中。
实施例4
在带有JVM-3异种移植物(人类B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)模型)的SCID小鼠中抗体huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1和护理标准药剂的抗肿瘤功效
在这一研究中，在皮下植入雌性SCID小鼠中的人类B细胞慢性淋巴细胞性白血病模型中使用JVM-3(CD37+/CD20+)细胞中评估huCD37-3抗体、不可裂解缀合物huCD37-3-SMCC-DM1和以下两种护理标准药剂的抗肿瘤活性：奥法木单抗，一种靶向CD20的抗体；和苯达莫司汀，一种化学治疗剂。在肿瘤细胞接种后六天，通过肿瘤体积将九十只小鼠随机化到九个组(每组n＝10)中。在随机化第二天开始处理，并且各组包括给予PBS(每次注射200μL)的对照组、huCD37-3抗体、不可裂解huCD37-3-SMCC-DM1缀合物、奥法木单抗抗体和苯达莫司汀。以单次静脉内剂量10、5和2.5mg/kg的huCD37-3抗体和huCD37-3-SMCC-DM1、5mg/kg的奥法木单抗(每周两次乘以三)和以单次剂量50mg/kg的苯达莫司汀施用处理。
如同PBS对照组动物一样，10、5和2.5mg/kg的huCD37-3抗体和huCD37-3-SMCC-DM1缀合物以及每次注射5mg/kg的奥法木单抗抗体(2qw×3)的单次处理耐受性良好且无体重减轻。用苯达莫司汀处理具有耐受性和8％平均体重减轻(第9天是最低点)。十只PBS对照组动物全部形成肿瘤(100％成瘤率)，在细胞接种后16天中值肿瘤体积达到500mm3。计算每一处理组的中值和平均肿瘤体积。对于平均肿瘤体积和对于中值肿瘤体积，作出结果与接种后天数的曲线图。在这一研究中，用护理标准药剂奥法木单抗(5mg/kg，每周两次乘以三)和苯达莫司汀(单次静脉内剂量50mg/kg)处理具有活性且分别为39％和31％T/C。用2.5mg/kg的huCD37-3抗体和huCD37-3-SMCC-DM1缀合物单次静脉内处理无活性且为＞42％T/C。用10mg/kg的huCD37-3抗体和huCD37-3-SMCC-DM1缀合物单次静脉内处理具有活性且分别为29％和26％T/C，并且用中等剂量(5mg/kg单次注射)的huCD37-3抗体和huCD37-3-SMCC-DM1缀合物处理具有活性且分别为31和16％T/C。在带有JVM-3人类肿瘤异种移植物的SCID小鼠中huCD37-3抗体、huCD37-3-SMCC-DM1、奥法木单抗和苯达莫司汀的抗肿瘤活性(中值肿瘤体积，mm3)展示于图11中。在这一模型中仅作为单次静脉内处理(每次注射10mg/kg)的huCD37-3-SMCC-DM1的抗肿瘤活性(中值肿瘤体积，mm3)展示于图12中。
实施例5
在异种移植物模型中作为单次静脉内处理(每次注射10mg/kg)的huCD37-3-SMCC-DM1的抗肿瘤活性(中值肿瘤体积，mm3)与IHC染色评分的相关性。
在如实施例2、3和4中所述的三个淋巴瘤异种移植物模型中评估huCD37-3-SMCC-DM1的抗肿瘤作用并且与如实施例1中所述通过IHC所测定的各自的CD37表达有关。使用实施例1中所述的手动分析法评估由小鼠异种移植物肿瘤模型制备的FFPE样品的CD37阳性。来源于以下细胞系的FFPE小鼠异种移植物组织显示以下染色图案：SU-DHL-4显示均质染色图案和3级强度；DOHH-2显示均质染色和2和3级强度；JVM-3显示非均质图案和2和3级强度。来自huCD37-3-SMCC-DM1的单次静脉内处理(每次注射10mg/kg)的肿瘤异种移植物的代表性照片和各自的体内活性展示于图8、10和12中。每一异种移植物的体内活性和各自的CD37染色评分的总结列于表5中。在所评估的三种异种移植物中，具有最高表达的肿瘤(3homo)也显示出用huCD37-3-SMCC-DM1处理时的最高活性。其它2个模型显示较低表达和较低活性。
表5.在异种移植物模型中huCD37-3-SMCC-DM1的体内活性和各自的CD37染色评分。
实施例6
***固定的石蜡包埋(FFPE)样品中的CD37的免疫组织化学染色-自动方法。
IHC染色分析使用鼠科抗CD37抗体克隆CT1(Leica目录号NCL-CD37)作为测试物品和鼠科IgG1同种型对照组(Leica，目录号MOPC21 AB)并且在Leica Bond RX自动染色器上进行。当在60℃下烘烤含有样品的载玻片时除去石蜡。然后用Dewax溶液(Leica)除去过量石蜡。在pH 6.0 Bond表位修复液1(ER1，Leica)中进行抗原修复后，在3-4％过氧化物中阻断切片。为了制备一级抗体的工作溶液，用抗体稀释剂将CD37-测试和同种型对照物品各自稀释到4.2μg/mL。将载玻片与测试物品(抗CD37)或对照物品(muIgG1)一起孵育，随后与后初级试剂(兔抗小鼠IgG，Leica)一起孵育，然后与聚合物(山羊抗兔-HRP-IgG，Leica)一起孵育。通过与DAB(3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐，Leica)一起孵育使载玻片显影，产生颜色信号。用苏木精(Leica)对含有显影的组织切片的载玻片进行复染，然后清除过量染色并且通过一系列95％和100％ETOH浸没，随后浸没于二甲苯中来脱水。使用封固剂(Richard Allan Scientific)将盖玻片安装到载玻片上。
对所有染色样品进行评估和评分。首先评估对照样品，随后评估测试样品(来自组织微阵列的完整切片和个别核心)。对于所评估的每一肿瘤组织或细胞颗粒，报告对染色强度的描述和各自的染色肿瘤细胞的比例。记录每个样品的膜相关染色。当从一个患者评估重复评分时，仅较高评分包括在分析中。如果评分仅描述细胞质染色，那么报告最后评分为零(0)。如表6中所述给出每一样品的强度和均一性评分。相对于对照组IgG染色(非特异性)对染色强度和分布图案进行评分。按0到3(0＝未染色，1＝弱，2＝中等和3＝强)的量表对进行强度评分，并且将分布评为集中(染色细胞的<25％)、非均质(染色细胞的25-75％)和均质(染色细胞的>75％)。在正常组织中，当计算强度和比例时仅评估所定义的亚结构。
表6.由强度和均一性量表组成的IHC评分***
FFPE肿瘤样品源自于肿瘤微阵列，以及人类组织块体。
细胞(肿瘤细胞或转染细胞)经过***固定和石蜡包埋(FFPE)。使用显示出通过流式细胞术展现不同范围的CD37表达的FFPE细胞颗粒样品(Daudi、Ramos、Namalwa和Colo205)、正常人类组织(脾和扁桃体)和非霍奇金氏淋巴瘤组织样品表征阳性和阴性对照组并分析特异性。
为了测定分析条件，测试一系列测试和对照物品稀释液以选择展现适当敏感性水平的条件。对包括CD37阳性细胞颗粒、正常人类组织和由CD37阳性非霍奇金氏淋巴瘤样品组成的组织微阵列的一组FFPE样品进行实验。用测试物品浓度(2.1、4.2和8.4μg/mL)的连续稀释液或对照物品对每一样品进行染色。由专科认证的病理学家对所有样品进行评估和评分并且分类为小细胞(滤泡性淋巴瘤[FL]、套细胞淋巴瘤[MCL]、MALT型边缘区B细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、未分类小细胞淋巴瘤、未分类非霍奇金氏淋巴瘤[NHL]或大细胞(DLBCL)。针对每一样品比较每一稀释液的相对染色强度以鉴别最佳稀释度。用于最佳稀释度的准则是如下稀释液：1)在经同种型对照组2染色的样品中不引起背景染色；2)在经测试物品染色的阴性组织对照组中不引起染色；和3)在代表所关注病症(例如DLBCL、FL、CLL)的测试样品中区分不同水平的膜相关CD37表达。4.2μg/mL的测试物品浓度经过实验方法鉴别为最佳稀释度且因此是特别有用的浓度。大细胞淋巴瘤样品的染色结果的总结展示于表7中，并且每一浓度的评分分布曲线图展示于图13中。小细胞淋巴瘤样品的染色结果的总结列于表8中，并且每一浓度的评分分布曲线图描绘于图14中。
表7.大细胞淋巴瘤样品中的染色分布
表8.小细胞淋巴瘤样品在3种浓度下的染色分布
实施例7
表征分析的动态范围的对照组的鉴别和表征-自动染色法
质量对照组：在每一分析中使用正常人类脾的套区和边缘区以及扁桃体的区和套区作为阳性对照组以检验染色程序按预期进行。使用正常人类扁桃体的滤泡间区域和人类正常脾的红髓作为阴性对照组。在优化和验证阶段期间使用这些对照组作为分析检验对照组。复查这些结果以证实所选对照组给出一致的结果并且证实其跨越分析的动态范围。质量对照组在四种染色浓度(2.1、4.2、8.4和16.7μg/mL)下的示范性染色评分列于表9中，并且指示一级抗体的浓度确实影响测试样品的染色结果。
表9.
实施例8
自动染色法的性能分析
这种分析所打算的用途是再现性且以适当敏感性特异性检测CD37以区分B细胞恶性病中不同水平和均一性的膜相关CD37表达(最佳动态范围)。因此，特异性、再现性和敏感性被视为性能标准。
通过对一组组织微阵列进行染色和评估来表征研究分析的特异性和敏感性。观察染色以证实阳性染色一贯地定位于肿瘤组织，其中包括基质、血管和正常器官组织的正常相邻组织组分的染色按预期呈阴性或阳性。对于B细胞恶性病的每一亚型，观察在组织微阵列中染色评分的分布。评分的类似分布表明该方法进行良好并且不会过度地对多种固定和加工条件的较小变化敏感。还通过评估分析的操作内和操作间再现性使用由细胞颗粒组成的FFPE样品来调查研究分析的精确性，所述细胞颗粒表达不同水平的CD37:Daudi(高CD37表达)、Ramos(中等CD37表达)、Namalwa(低CD37表达)和Colo205(阴性)。另外包括正常人类脾(两种样品)、正常人类扁桃体和边缘区淋巴瘤样品。对于操作内再现性，将各含有每一对照组的切片的九个载玻片放在Leica Bond RX的随机位置上。对于操作间再现性，在不同的三天对含有来自相同样品的切片的三个载玻片进行染色。评估来自操作内和操作间再现性实验的所有载玻片并且发现是可再现的。
实施例9
通过IHC进行的CD37染色评分与huCD37-3-SMCC-DM1的活性有关
针对具有广泛CD37表达的CD37阳性细胞系分析huCD37-3-SMCC-DM1的效力和特异性。如实施例1中所述通过流式细胞术来测定CD37表达水平。可选地，通过IHC使用如实施例1中所述的手动染色法或通过IHC使用如实施例6-8中所述的自动染色法来测定CD37表达水平。使用如实施例2-4中所述的合适的体内异种移植物模型来评估效力。在例如10mg/kg、5mg/kg和/或2.5mg/kg的剂量下静脉内给予huCD37-3-SMCC-DM1。另外，可以使用具有低CD37表达水平的合适的CD37阳性细胞，例如Namalwa。为了检验活性的特异性，实验可以包括CD37阴性细胞系，例如Colo205。
本文中所引用的所有公布、专利、专利申请、因特网站点和登记号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列)都以引用的方式整体并入本文中用于所有目的，其引用程度就如同指示每个公布、专利、专利申请、因特网站点或登记号/数据库序列特定地且个别地以引用的方式并入一般。
序列
SEQ ID NO：1-人类CD37
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLAYR
可变重链CDR氨基酸序列：
可变轻链CDR氨基酸序列
可变重链氨基酸序列
可变轻链氨基酸序列
全长重链氨基酸序列
全长轻链氨基酸序列
可变重链多核苷酸序列
可变轻链多核苷酸序列
全长重链多核苷酸序列
全长轻链多核苷酸序列

Claims (58)

1.一种用于增加使用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物的癌症疗法的功效的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物，其中来自所述受试者的癌性样品中的增加的CD37基因或蛋白质表达已经使用区分CD37表达癌性样品中的染色强度或染色均一性与一种或多种参考样品中的染色强度或染色均一性的检测方法检测到。
2.一种将癌症鉴别为对用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物治疗敏感的方法，所述方法包括：
(a)测量在获自所述癌症的癌性样品中的CD37表达水平，其中所述测量包含使用区分CD37表达癌性样品中的染色强度或染色均一性与一种或多种参考样品中的染色强度或染色均一性的检测方法；
(b)测定所述癌性样品的CD37染色强度或染色均一性评分；和
(c)将步骤(b)中所测定的所述CD37染色强度或染色均一性评分与通过测量至少一种参考样品中的CD37蛋白质表达所测定的相对值进行比较，其中所述至少一种参考样品是对用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物治疗不敏感的组织、细胞或细胞颗粒样品，并且其中高于所述相对值的步骤(b)中所测定的所述样品的CD37染色强度评分将所述癌症鉴别为对用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物治疗敏感。
3.一种用于将癌症鉴别为可能对抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物有反应的方法，所述方法包括：
(a)使包含来自所述癌症的细胞的生物样品与结合细胞表面上的CD37蛋白质的药剂接触；
(b)检测结合(a)的所述生物样品的所述细胞表面上的CD37蛋白质的所述药剂的结合；
(c)为步骤(b)的所述结合指定评分，其中所述评分是基于与一种或多种参考样品比较来指定的；和
(d)将步骤(c)的所述评分与参考组织或细胞的评分进行比较，其中大于阴性或低CD37表达参考样品的评分的所述癌症CD37水平的评分或等于或大于高CD37表达参考样品的评分的所述癌症CD37水平的评分将所述癌症鉴别为可能对抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物有反应。
4.一种将患有癌症的受试者鉴别为可能对低剂量抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物治疗方案有反应的方法，所述方法包括：
(a)使包含来自所述癌症的细胞的生物样品与结合细胞表面CD37蛋白质的药剂接触；
(b)检测所述药剂与(a)的所述生物样品的结合；
(c)为步骤(b)的所述结合指定评分，其中所述评分是基于与一种或多种参考样品比较来指定的；和
(d)将步骤(c)的所述评分与参考组织或细胞的评分比较，其中大于阴性或低CD37表达参考样品的评分的所述癌症CD37水平的评分或等于或大于高CD37表达参考样品的评分的所述癌症CD37水平的评分将所述癌症鉴别为可能对低剂量抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物有反应。
5.一种优化用于患有癌症的受试者的使用抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物的治疗方案的方法，所述方法包括：
(a)检测获自所述受试者的癌性样品中的CD37表达水平；
(b)将所述癌性样品中的CD37表达水平与参考样品中的CD37表达进行比较；
(c)测定所述癌性样品的CD37染色强度评分；和
(d)如果所述评分低，那么向所述受试者施用增加剂量的抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物，或如果所述评分高，那么向所述受试者施用减少剂量的抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物。
6.一种检测来自受试者的癌性样品中的癌细胞上的细胞表面CD37表达的方法，所述方法包括：
(a)获得癌性样品，其中所述样品经过***(formalin)固定、石蜡包埋；
(b)使所述样品与特异性结合细胞表面CD37的抗体接触；
(c)使用可区分CD37表达样品中的染色强度或染色均一性与一种或多种参考样品中的染色强度或染色均一性的检测方法测量(b)中的所述抗体与所述癌性样品中的所述细胞表面CD37的结合；和
(d)在将所述肿瘤癌性样品与一种或多种参考样品中的细胞表面CD37染色强度或染色均一性水平进行比较后为所述CD37指定CD37表达评分。
7.如权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述检测是通过免疫组织化学(IHC)来进行的。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述IHC是可以区分不同CD37表达水平的校准IHC。
9.如权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述检测方法产生具有低细胞表面CD37表达、中等CD37细胞表面表达或高CD37细胞表面表达的样品的染色强度范围。
10.如权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述检测方法区分CD37表达癌性样品与参考样品中的染色强度和染色均一性。
11.如权利要求1到10中任一项所述的方法，其中通过免疫组织化学，所述癌性样品或生物样品的CD37表达的染色强度评分为2、3或3+。
12.如权利要求11所述的方法，其中通过对***固定的石蜡包埋样品进行的免疫组织化学，所述癌性样品或生物样品的CD37表达的染色强度评分为2、3或3+。
13.如权利要求10到12中任一项所述的方法，其中所述癌性样品或生物样品的CD37表达的染色均一性是均质的。
14.如权利要求7到12中任一项所述的方法，其中所述癌性样品或生物样品的CD37染色强度评分为2、3或3+且染色均一性是非均质或均质的。
15.如权利要求7到14中任一项所述的方法，其中所述免疫组织化学是手动进行的。
16.如权利要求7到14中任一项所述的方法，其中所述免疫组织化学是使用自动***进行的。
17.如权利要求1到16中任一项所述的方法，其中所述参考样品是阳性参考样品或阴性参考样品。
18.如权利要求1到17中任一项所述的方法，其中所述参考样品包含细胞、细胞颗粒或组织。
19.如权利要求1到18中任一项所述的方法，其中所述检测包含用特异性结合细胞表面CD37的抗体检测CD37表达。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述抗体是CT1。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述抗体进一步包含选自以下的检测试剂：酶、荧光团、放射性标记和发光体。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述检测试剂是选自以下：生物素、地高辛(digoxigenin)、荧光素、氚、若丹明(rhodamine)和辣根过氧化酶。
23.如权利要求19到22中任一项所述的方法，其中所述抗体的浓度为约1-10μg/mL。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述抗体的浓度为约4-5μg/mL。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述抗体的浓度为约4.2μg/mL。
26.如权利要求1到25中任一项所述的方法，其中所述癌症是选自以下：B细胞淋巴瘤、NHL、前体B细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞赘生物、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、低级、中级和高级(FL)、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT型边缘区B细胞淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤、脾型边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma；BL)、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴组织增生性病症、瓦登史东巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)和退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
27.如权利要求1到26中任一项所述的方法，其中所述癌性样品或所述生物样品是组织、血液、血浆、骨髓或淋巴。
28.一种制品，其包含抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物、容器和指示所述抗体或免疫缀合物可用于治疗特征为通过IHC测量的CD37的表达水平为2、3或3+的癌症的包装说明书或标签。
29.一种组合诊断和药物试剂盒，其包含用于诊断的鼠科抗CD37抗体和用于治疗的抗CD37抗体或抗CD37免疫缀合物。
30.如权利要求29所述的组合诊断和药物试剂盒，其中所述诊断抗体是能够通过IHC检测CD37表达的检测抗体。
31.一种诊断试剂盒，其包含特异性结合于细胞表面CD37的检测抗体、用于免疫组织化学(IHC)的试剂和一种或多种标准化参考样品，其中所述标准化参考样品包含细胞、细胞颗粒或***固定的石蜡包埋组织样品，并且其中所述一种或多种标准化参考样品是来自非CD37表达、低CD37表达或高CD37表达细胞、细胞颗粒或组织。
32.如权利要求28所述的制品或如权利要求30或31所述的试剂盒，其中所述IHC是可以区分不同CD37表达水平的校准IHC。
33.如权利要求32所述的制品或试剂盒，其中所述校准IHC产生具有低细胞表面CD37表达、中等细胞表面CD37表达或高细胞表面CD37表达的样品的染色强度范围。
34.如权利要求28或30到33中任一项所述的制品或试剂盒，其中所述IHC区分CD37表达样品与参考样品中的染色强度和染色均一性。
35.如权利要求28或30到33中任一项所述的制品或试剂盒，其中对***固定的石蜡包埋样品进行所述IHC。
36.如权利要求28或30到33中任一项所述的制品或试剂盒，其中所述IHC是手动进行的。
37.如权利要求28或30到33中任一项所述的制品或试剂盒，其中所述IHC是使用自动***进行的。
38.如权利要求28到30或32到37中任一项所述的制品或试剂盒，其中所述CD37免疫缀合物包含抗CD37抗体、连接子和细胞毒素。
39.如权利要求38所述的制品或试剂盒，其中所述抗CD37抗体是嵌合或人源化CD37-3、CD37-38或CD37-50。
40.如权利要求38或39所述的制品或试剂盒，其中所述连接子是选自以下：可裂解连接子、不可裂解连接子、亲水性连接子和基于二羧酸的连接子。
41.如权利要求40所述的制品或试剂盒，其中所述连接子是选自以下：4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)或4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基戊酸N-琥珀酰亚胺酯(sulfo-SPP)；4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)或4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(sulfo-SPDB)；4-(顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)；4-(顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-磺基琥珀酰亚胺酯(sulfoSMCC)；N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)；和N-琥珀酰亚胺基-[(N-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-顺丁烯二酰亚胺)。
42.如权利要求41所述的制品或试剂盒，其中所述连接子是4-(顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)。
43.如权利要求38到42中任一项所述的制品或试剂盒，其中所述细胞毒素是选自以下：类美登素、类美登素类似物、苯二氮、紫杉烷类、CC-1065、CC-1065类似物、度卡霉素、度卡霉素类似物、卡奇霉素、海兔毒素、海兔毒素类似物、奥里斯他汀、富山霉素衍生物和来普霉素衍生物或所述细胞毒素的前药。
44.如权利要求43所述的制品或试剂盒，其中所述细胞毒素是类美登素。
45.如权利要求44所述的制品或试剂盒，其中所述类美登素是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素或N(2')-脱乙酰基]-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
46.如权利要求45所述的制品或试剂盒，其中所述类美登素是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)。
47.如权利要求38到46中任一项所述的制品或试剂盒，其中所述免疫缀合物包含所述抗体huCD37-3、所述连接子SMCC和所述类美登素DM1。
48.如权利要求29到30和32到47中任一项所述的组合诊断和药物试剂盒，其进一步包含一种或多种参考样品。
49.如权利要求48所述的组合诊断和药物试剂盒，其中所述参考样品是阳性参考样品或阴性参考样品。
50.如权利要求48或49所述的组合诊断和药物试剂盒，其中所述参考样品包含细胞、细胞颗粒或组织。
51.如权利要求30到37中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体进一步包含选自以下的检测试剂：酶、荧光团、放射性标记和发光体。
52.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述检测试剂是选自以下：生物素、地高辛、荧光素、氚、若丹明和辣根过氧化酶。
53.如权利要求30到37或51到52中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体的浓度为约1-10μg/mL。
54.如权利要求53所述的试剂盒，其中所述检测抗体的浓度为约4-5μg/mL。
55.如权利要求54所述的试剂盒，其中所述检测抗体的浓度为约4.2μg/mL。
56.如权利要求31所述的试剂盒，其中低CD37表达对照组是Namalwa或RL肿瘤细胞。
57.如权利要求31所述的试剂盒，其中高CD37表达对照组是选自以下：Daudi和Ramos细胞系以及经CD37稳定或瞬时转染的细胞系。
58.如权利要求57所述的试剂盒，其中经CD37稳定或瞬时转染的所述细胞系是300-19/CD37。
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