PL201086B1 - Zastosowanie przeciwciał wiążących się z antygenem CD20 - Google Patents

Abstract

Niniejszy wynalazek opisuje zastosowanie przeciwcia la, które wiaze si e z antygenem CD20 na ludzkich limfocytach B do wytwarzania leku do blokowania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na obce antygeny. PL PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA

POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201086 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 352758 ⁽¹³⁾ (22) Data zgłoszenia: 10.07.2000 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

10.07.2000, PCT/US00/18776 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

18.01.2001, WO01/03734 PCT Gazette nr 03/01 (51) Int.Cl.

A61K 39/395 (2006.01) A61K 47/48 (2006.01) A61K 51/10 (2006.01) A61P 37/00 (2006.01) (54)

Zastosowanie przeciwciał wiążących się z antygenem CD20

(30) Pierwszeństwo: 16.07.1999,US,60/144,405	(73) Uprawniony z patentu: GENENTECH, INC.,South San Francisco,US IDEC PHARMACEUTICALS INC.,San Diego,US
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 08.09.2003 BUP 18/03	(72) Twórca(y) wynalazku: Antonio J. Grillo-Lopez,Santa Fe,US Lori A. Kunkel,Oakland,US Timothy A. Stewart,San Francisco,US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.03.2009 WUP 03/09	(74) Pełnomocnik: Urszula Bartnik, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o.

⁽⁵⁷⁾ Niniejszy wynalazek opisuje zastosowanie przeciwciała, które wiąże się z antygenem CD20 na ludzkich limfocytach B do wytwarzania leku do blokowania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na obce antygeny.

PL 201 086 B1

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciał wiążących się z antygenem CD20 i przez to blokowania u ssaków odpowiedzi immunologicznej na obce antygeny z użyciem antagonistów wiążących się z CD20.

Tło wynalazku

Limfocyty są jednym z wielu typów białych komórek krwi wytwarzanych w szpiku kostnym w procesie hematopoezy. Istnieją dwie główne populacje limfocytów: limfocyty B (komórki B) i limfocyty T (komórki T). W niniejszym wynalazku przedmiotem szczególnego zainteresowania są komórki B.

Komórki B dojrzewają w szpiku kostnym i opuszczają szpik wytwarzając na swej powierzchni przeciwciało wiążące antygen. W przypadku, gdy dziewicza komórka B po raz pierwszy zetknie się z antygenem, dla którego posiada swoiste przeciwciało błonowe, komórka ta zaczyna się szybko dzielić a jej komórki potomne różnicują się na pamięciowe komórki B i komórki efektorowe, zwane „komórkami osocza”. Pamięciowe komórki B mają dłuższy okres życia i w dalszym ciągu przebiega w nich ekspresja przeciwciała błonowego o tej samej swoistości, jak w pierwotnej komórce rodzicielskiej. Komórki osocza nie wytwarzają przeciwciała błonowego, produkują natomiast to przeciwciało w formie, która umożliwia jego wydzielanie. Wydzielane przeciwciała są głównymi cząsteczkami efektorowymi w odporności humoralnej.

Antygen CD20 (zwany również ludzkim antygenem różnicowania limfocytów B, Bp35) jest hydrofobowym białkiem transbłonowym o masie cząsteczkowej około 35 kilodaltonów, zlokalizowanym na limfocytach pre-B i dojrzałych limfocytach B [Valentine i wsp., J. Biol. Chem. 264 (19): 11282-11287 (1989) i Einfeld i wsp., EMBO J. 7(3): 711-717 )1988)]. Ekspresja tego antygenu ma również miejsce na ponad 90% komórek B w chłoniaku nieziarniczym (NHL) [Andersen i wsp., Bood 63(6): 1424-1433 (1984)] ale nie występuje on w hematopoetycznych komórkach pnia, komórkach pro-B, normalnych komórkach osocza ani w innych normalnych tkankach [Tedder i wsp., J. Immunol. 135(2): 973-979 (1985)]. CD20 reguluje wczesne etapy w procesie aktywacji cyklu inicjowania i różnicowania komórki (Tedder i wsp., jak wyżej) i prawdopodobnie pełni również rolę kanału wapniowego [Tedder i wsp., J. Cell. Biochem. 14D: 195 (1990)].

W odniesieniu do ekspresji CD20 na komórkach B w chłoniaku, antygen ten może służyć jako kandydat do „celowanego” leczenia chłoniaków. Pokrótce, takie celowanie może w zarysie przedstawiać się następująco: pacjentowi podaje się przeciwciała swoiste przeciw antygenowi powierzchniowemu CD20 na komórkach B. Te przeciwciała anty-CD20 swoiście wiążą się z antygenem CD20 zarówno na (pozornie) normalnych jak i na złośliwych komórkach B. Przeciwciało związane z powierzchniowym antygenem CD20 może powodować destrukcję i wypadanie nowotworowych komórek B. Dodatkowo, z przeciwciałem anty-CD20 można koniugować środki chemiczne lub znaczniki radioaktywne posiadające zdolność niszczenia nowotworu, dzięki czemu, taki środek jest swoiście „dostarczany” do nowotworowych komórek B. Niezależnie od podejścia, celem pierwszoplanowym jest destrukcja nowotworu; podejście specyficzne będzie zależało od konkretnego przeciwciała anty-CD20, jakie będzie stosowane, a więc, dostępne podejścia „celowania” na antygen CD20 mogą się znacznie różnić.

Przeciwciało rituximab (RITUXAN®) jest wytworzonym techniką inżynierii genetycznej, chimerycznym mysio/ludzkim przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw antygenowi CD20. Rituximab jest przeciwciałem nazwanym symbolem „C2B8” w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.736.137 udzielonym 7 kwietnia 1998 r (Andersen i wsp.). RITUXAN® jest wskazany do leczenia pacjentów z nawracającym lub opornym na leczenie, CD20-dodatnim chłoniakiem nieziarniczym komórek B niskiego stopnia lub grudkowym. Badania in vitro mechanizmu działania wykazały, że RITUXAN® wiąże komplement ludzki i wywołuje lizę linii komórek limfoidalnych na drodze mechanizmu cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) [Reff i wsp., Blood 83(2): 435-445 (1994)]. Poza tym, wykazuje on silną aktywność w próbach na zależną od przeciwciała cytotoksyczność komórkową (ADCC). Ostatnio wykazano, że RITUXAN® ma działanie anty-proliferacyjne w próbach wbudowania wyznakowanej trytem tymidyny i bezpośrednio indukuje apoptozę, podczas, gdy inne przeciwciała anty-CD20 nie mają takich właściwości [Maloney i wsp., Blood 88(10): 637a (1996)]. W badaniach eksperymentalnych obserwowano również synergię pomiędzy RITUXAN'em® i chemioterapią oraz toksynami. RITUXAN® uczula zwłaszcza lekooporne ludzkie linie chłoniaka komórek na cytotoksyczne działanie doksorubicyny, CDDP, VP-16, toksyny błonicy i rycyny [Demidem i wsp., Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3): 177-186 (1997)]. Badania przedkliniczne in vivo wykazały, że RITUXAN® usuwa komórki B z krwi obwodowej, węzłów chłonnych i szpiku kostnego małp cynomolgus, prawdopodobnie

PL 201 086 B1 w procesach zależnych od dopełniacza i komórkowych [Reff i wsp., Blood 83(2): 435-445 (1994)]. Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała wiążącego się z antygenem CD20 na ludzkich limfocytach B do wytwarzania leku do podawania dożylnego w ilości skutecznej terapeutycznie do blokowania odpowiedzi immunologicznej na przeszczep u człowieka który nie cierpi z powodu złośliwości choroby, przy czym przeciwciało to zmniejsza poziomy krążących komórek B wyrażających antygen CD20 u człowieka dla blokowania wspomnianej odpowiedzi immunologicznej. Przeciwciało to w wynalazku korzystnie nie jest skoniugowane ze ś rodkiem cytotoksycznym, i zawiera rituksimab. Także korzystnie, przeciwciało może być skoniugowane ze środkiem cytotoksycznym. Środek cytotoksyczny jest związkiem radioaktywnym. W zastosowaniu według wynalazku lek jest podawany w dawce przeciwciała mniejszej niż 375 mg/m², lub korzystnie w następujących dawkach 20 mg/m² do 1000 mg/m², 20 mg/m² do 250 mg/m², lub 50 mg/m² do 200 mg/m².

W zastosowaniu wedł ug wynalazku lek jest podawany co najmniej w dwóch dawkach, przy czym dawka przeciwciała w mg/m² w następnej dawki przekracza dawkę w mg/m² przeciwciała dawki początkowej.

Lek jest stosowany do podawania człowiekowi przed poddaniem człowieka przeszczepowi. Korzystnie przeciwciało jest ludzkim przeciwciałem. Także korzystnie przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym. Również korzystnie przeciwciało jest humanizowanym przeciwciałem. Przeszczep w zastosowaniu według wynalazku jest przeszczepem allogenicznym.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała wiążącego się z antygenem CD20 na ludzkich limfocytach B do wytwarzania leku do podawania dożylnego w ilości skutecznej terapeutycznie do leczenia choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi lub gospodarz przeciwko przeszczepowi u człowieka nie cierpiącego na złośliwą chorobę, przy czym przeciwciało zmniejsza poziomy krążących komórek B wyrażających antygen C20 u człowieka do leczenia wspomnianych chorób.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku przeciwciało może być ludzkim przeciwciałem, ewentualnie przeciwciałem chimerycznym, ewentualnie humanizowanym przeciwciałem. W kolejnym korzystnym rozwiązaniu przeciwciało to może zawierać rituksimab. W zastosowaniu według wynalazku lek jest podawany w dawce przeciwciała mniejszej niż 375 mg/m². Korzystnie lek jest do podawania z kortykosteroidem, lub ewentualnie lek i kortykosteroid są do podawania z jednym lub więcej dodatkowych czynników immunosupresyjnych. Bardziej korzystnie, przeciwciało zawiera rituksimab, a wspomniany dodatkowy czynnik immunosupresyjny, zawiera mykofenolan mofetilu. Dodatkowe czynniki immunosupresyjne korzystnie zawierają mykofenolan mofetilu i inhibitor kalcyneryny, a bardziej korzystnie inhibitor kalcyneuryny zawiera takrolimus.

Jeden lub więcej dodatkowy (ch) czynnik(ów) immunosupresyjny (ch) korzystnie można wybrać z grupy obejmują cej cyklosporynę, kortykosteroid, mykofenolan mofetilu, przeciwciało przeciwko receptorowi IL-2, przeciwciało przeciwko limfocytom, przeciwciało przeciwko CD3, inhibitor kalcyneuryny, i/lub czynnik antyproliferacyjny. Najkorzystniej czynnik inhibitora kalcyneuryny zawiera takrolimus, a czynnik antyproliferacyjny zawiera sirolimus.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała wiążącego się z antygenem CD20 na ludzkich limfocytach B do wytwarzania leku do podawania dożylnego w ilości terapeutycznie skutecznej do odczulania ssaka oczekującego na przeszczep.

Szczegółowy opis korzystnych rozwiązań

I. Definicje

Antygen „CD20” jest nie zglikozylowaną fosfoproteiną o wielkości około 35 kilodaltonów, występującą na powierzchni ponad 90% komórek B krwi obwodowej lub narządów limfoidalnych. Ekspresja CD20 przebiega już podczas wczesnej fazy rozwoju komórek pre-B i pozostaje do czasu różnicowania się komórek osocza. CD20 występuje zarówno na normalnych jak i na złośliwych komórkach B. W piśmiennictwie stosuje się również inne nazwy dla CD20, np. „antygen ograniczony do limfocytów B” i „Bp35”. Antygen CD20 jest opisany np. przez Clarka i wsp. [PNAS (USA) 82: 1766 (1985)].

Termin „obcy antygen” oznacza cząsteczkę lub cząsteczki, które nie są endogenne ani natywne dla ssaka wystawionego na ich działanie. Obcy antygen może wywołać u ssaka odpowiedź immunologiczną, np. humoralną i/lub z udziałem komórek T. W zasadzie, obcy antygen będzie prowokował produkcję przeciwciał przeciw niemu skierowanych. Przykłady obcych antygenów rozważanych w niniejszym opisie obejmują immunogenne środki lecznicze, np. białka takie jak przeciwciała, zwłaszcza przeciwciała zawierające nie-ludzkie reszty aminokwasowe (np. gryzoni, chimeryczne/humanizowane i prymatyzowane przeciwciał a), toksyny (ewentualnie skoniugowane z czą steczką kierują c ą , taką jak

PL 201 086 B1 przeciwciało, przy czym cząsteczka kierująca również może być immunogenna), wektory wirusowe stosowane w terapii genowej, takie jak retrowirusy i adenowirusy, przeszczepy, środki infekcyjne (np. bakterie i wirusy), alloantygeny (np. antygen występujący u niektórych ale nie występujący u innych członków tego samego gatunku), takie jak różnice w typach krwi, ludzkich antygenach limfocytarnych (HLA), antygenach płytkowych, antygenach wytwarzanych na narządach transplantowanych, w składnikach krwi, w czynniku ciążowym (Rh) i czynnikach krzepnięcia (np. w czynniku VIII i czynniku IX).

„Blokowanie odpowiedzi immunologicznej” na obcy antygen oznacza osłabienie lub zapobieżenie co najmniej jednej odpowiedzi o podłożu immunologicznym, spowodowanej ekspozycją na obcy antygen. Przykładowo, można tłumić odpowiedź humoralną na obcy antygen u ssaków, np. przez zapobieżenie lub zahamowanie produkcji przeciwciał skierowanych przeciw temu antygenowi. Alternatywnie lub dodatkowo można stłumić idiotyp, można zahamować („spacyfikować”) usuwanie komórek powleczonych alloprzeciwciałem i/lub wpływać na prezentację alloantygenu poprzez spowodowanie niedoboru komórek prezentujących antygen. Ssak leczony w niniejszym wynalazku jest w zasadzie ssakiem nie cierpiącym na złośliwą postać choroby, co oznacza, że nie zdiagnozowano u niego choroby nowotworowej lub raka, takiej jak chłoniak komórek B, ostra białaczka limfoblastyczna (ALL), przewlekła białaczka limfocytowa (CLL), białaczka kosmatokomórkowa, przewlekła białaczka mieloblastyczna lub poprzeszczepowa choroba limfoproliferacyjna (PTLD).

Termin „środek leczniczy” odnosi się do związku lub kompozycji stosowanej do leczenia choroby lub zaburzenia u pacjenta. Środek leczniczy może przykładowo zawierać polipeptyd taki jak przeciwciało, toksynę (ewentualnie skoniugowaną z cząsteczka kierującą do celu, taką jak przeciwciało), wektor wirusowy stosowany w terapii genowej i/lub czynnik krzepnięcia (np. czynnik VIII lub czynnik IX). Środek leczniczy podaje się ssakowi w zasadzie w ilości skutecznej w leczeniu danej choroby lub zaburzenia, przy czym ilość ta wywołuje odpowiedź immunologiczną na ten środek leczniczy u leczonego ssaka.

Stosowany w opisie termin „polipeptyd” oznacza ogólnie peptydy i białka złożone z ponad około 10 aminokwasów. Przykłady polipeptydów ssaczych obejmują takie cząsteczki jak np. reninę, hormon wzrostu, w tym ludzki hormon wzrostu, bydlęcy hormon wzrostu, czynnik uwalniający hormon wzrostu, hormon przytarczyczny, tyreotropinę, lipoproteiny, 1-antytrypsynę, łańcuch A insuliny, łańcuch B insuliny, proinsulinę, trombopoetynę, hormon folikulotropowy, kalcytoninę, hormon luteinizujący, glukagon, czynniki krzepnięcia, takie jak czynnik VIIIC, czynnik IX, czynnik tkankowy i czynnik von Willebranda, czynniki przeciw krzepnięciu, takie jak białko C, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, surfaktant płucny, aktywator plazminogenu, taki jak urokinazę lub moczowy lub tkankowy ludzki aktywator plazminogenu (t-PA), bombezynę, trombinę, homopoetyczny czynnik wzrostu, czynnik martwicy nowotworu alfa i beta, enkefalinazę, albuminę surowicy, taką jak ludzką albumina surowicy, inhibitor Μϋΐΐeriana, łańcuch A relaksyny, łańcuch B relaksyny, prorelaksynę, mysi peptyd związany z gonadotropiną, białko bakteryjne, takie jak beta-laktamaza, DNA-zę, inhibinę, aktywinę, czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), receptory dla hormonów lub czynników wzrostu, integrynę, białko A lub D, czynniki reumatoidalne, czynnik neurotroficzny, taki jak czynnik neurotroficzny mózgowy (BDNF), neurotrofinę-3, -4, -5 lub -6 (NT-3, NT-4, NT-5 lub NT-6) lub czynnik wzrostu nerwów, taki jak NGF, kardiotrofiny (czynniki przerostu mięśnia sercowego), takie jak kardiotrofina-1 (CT-1), płytkowy czynnik wzrostu (PDGF), czynnik wzrostu fibroblastów, taki jak aFGF i bFGF, naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), transfomujący czynnik wzrostu (TGF), taki jak TGF-alfa i TGF-beta, w tym TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 lub TGF-5, insulinopodobne czynniki wzrostu I i II (IGF-I i IGF-II), des(1-3)-IGF-I (mózgowy IGF-I), białka wiążące insulino-podobny czynnik wzrostu, białka CD, takie jak CD3, CD4, CD8 i CD20, erytropoetynę, czynniki wzrostu kości, immunotoksyny, morfogenetyczne białko kości (BMP), interferon, taki jak interferon-alfa, -beta i -gamma, albuminę surowicy, taką jak ludzka albumina surowicy (HSA) albo bydlęca albumina surowicy (BSA), czynniki stymulujące kolonie (CSF), np. M-CSF, GM-CSF i G-CSF, interleukiny (IL), np. IL-1 do IL-10, cytokiny (patrz niżej), dysmutazę supertlenkową, receptory komórek T, powierzchniowe białka błonowe, czynnik przyspieszający rozkład, antygen wirusowy, np. część otoczki wirusa AIDS, białka transportujące, receptory zasiedlania, adresyny, regulatory białek, przeciwciała oraz fragmenty lub warianty wyżej wymienionych polipeptydów.

Termin „przeszczep” oznacza w niniejszym opisie materiał biologiczny pochodzący od dawcy, przeznaczony do transplantacji do organizmu biorcy. Przeszczepy obejmują tak bardzo zróżnicowane materiały, jak np. izolowane komórki, takie jak komórki wysepek, tkanki, takie jak błona owodniowa noworodka, szpik kostny, komórki prekursorowe hematopoezy i tkanka oczna, taka jak tkanka rogówki oraz narządy, takie jak skóra, serce, wątroba, śledziona, trzustka, płat tarczycy, płuca, nerka, narządy przewodowe (np. jelito, naczynia krwionośne lub przełyk) i podobne. Narządy przewodowe mogą być

PL 201 086 B1 stosowane do zastąpienia zniszczonych części przełyku, naczyń krwionośnych lub przewodów żółciowych. Przeszczepy skóry stosuje się nie tylko w oparzeniach lecz również jako opatrunek dla zniszczonego jelita albo w celu uzupełnienia pewnych braków, takich jak przepuklina przeponowa. Przeszczep może pochodzić z dowolnego źródła ssaczego, w tym o człowieka, od nieboszczyka lub od dawcy żyjącego. Korzystnie, przeszczepem jest szpik kostny albo narząd, taki jak serce a dawca przeszczepu i gospodarz są dobrani pod względem antygenów klasy II głównego układu zgodności tkankowej (HLA).

Termin „gospodarz ssaczy” oznacza w niniejszym opisie dowolnego, zgodnego biorcę przeszczepu. Termin „zgodny” oznacza gospodarza - ssaka, który przyjmie przeszczep dawcy. Korzystnie, gospodarzem jest człowiek. Jeśli zarówno dawca przeszczepu jak i gospodarz są ludźmi, są oni korzystnie dobrani pod względem antygenów klasy II HLA, aby zwiększyć zgodność histologiczną.

Termin „dawca” odnosi się w niniejszym opisie do gatunków ssaków, martwych lub żyjących, od których pochodzi przeszczep. Korzystnie, dawcą jest człowiek. Człowiek będący dawcą jest korzystnie ochotnikiem, krewnym, zdrowym w badaniu lekarskim i o tej samej głównej grupie krwi AB0, ponieważ przejście przez bariery głównych grup krwi prawdopodobnie przesądza o przeżyciu przeszczepu allogenicznego. Możliwa jest jednak transplantacja np. nerki, dawcy o grupie 0 do organizmu biorcy o grupie krwi A, B lub AB.

Termin „transplant” i jego odmiany odnosi się do wbudowania przeszczepu do organizmu gospodarza, niezależnie od tego, czy transplantacja jest syngeniczna (dawca i biorca są identyczni pod względem genetycznym), allogeniczna (dawca i biorca mają różne źródła genetyczne ale należą do tego samego gatunku) czy ksenogeniczna (obcopochodna) (dawca i biorca należą do różnych gatunków). Tak więc, w typowym scenariuszu, gospodarzem jest człowiek a przeszczep jest izoprzeszczepem, pochodzącym od człowieka o tym samym lub innym źródle genetycznym. W innym scenariuszu, przeszczep pochodzi z gatunku różniącego się od gatunku biorcy, do którego jest transplantowany, np. jest to serce pawiana przeszczepiane w miejsce serca człowieka, przeszczep może również pochodzić od zwierząt z gatunków bardzo odległych filogenetycznie, np. jest to zastawka serca świni albo zwierzęce komórki wysepek trzustkowych beta bądź komórki neuronalne transplantowane do organizmu człowieka.

Termin „terapia genowa” oznacza ogólne podejście polegające na wprowadzeniu kwasu nukleinowego do organizmu leczonego ssaka. Ten kwas nukleinowy może kodować żądany polipeptyd albo być kwasem nukleinowym antysensownym. Jeden lub kilka składników wektora terapii genowej lub kompozycji może być immunogennych dla leczonego nimi ssaka. Przykładowo, wektory wirusowe (takie jak adenowirusy, wirus opryszczki I lub retrowirus), lipidy i/lub cząsteczki kierujące w tej kompozycji mogą indukować odpowiedź immunologiczną u leczonego ssaka.

Wyrażenie „desensytyzacja (odczulanie) ssaka oczekującego na przeszczep” odnosi się do zmniejszenia lub zniesienia wrażliwości alergicznej bądź reakcji na przeszczep przed wprowadzeniem przeszczepu do organizmu tego ssaka. Można to osiągnąć według dowolnego mechanizmu, takiego jak zmniejszenie u odczulanego ssaka ilości przeciwciał przeciw dawcy, np. jeśli przeciwciała przeciw dawcy są skierowane przeciw antygenowi ludzkich limfocytów (HLA).

„Chorobą autoimmunologiczną” jest w niniejszym opisie choroba lub zaburzenie niezłośliwe pochodzące od i skierowane przeciw własnym tkankom. Choroby autoimmunologiczne nie obejmują zwłaszcza chorób lub stanów złośliwych lub nowotworowych, zwłaszcza chłoniaka komórek B, ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL), przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL), białaczki kosmatokomórkowej i przewlekłej białaczki mieloblastycznej. Przykłady chorób lub zaburzeń autoimmunologicznych obejmują bez ograniczeń odpowiedzi immunologiczne takie jak zapalne choroby skóry, w tym łuszczyce i zapalenie skóry (np. atopowe zapalenie skóry), twardzinę skóry uogólnioną i stwardnienie, odpowiedzi związane z zapalną chorobą jelit (takie jak choroba Crohna i wrzodziejące zapalenie okrężnicy), zespół zaburzeń oddechowych (w tym zespół zaburzeń oddychania u dorosłych; ARDS), zapalenie skóry, zapalenie opon mózgowych, zapalenie mózgu, zapalenie błony naczyniowej oka, zapalenie okrężnicy, zapalenie kłębuszków nerkowych, stany alergiczne takie jak egzemę i astmę i inne stany związane z naciekaniem komórek T i z przewlekłymi odpowiedziami zapalnymi, miażdżycę tętnic, niedobór cząstek adhezyjnych na leukocytach, reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń rumieniowaty układowy (SLE), cukrzycę (np. cukrzycę typu I lub cukrzycę isulino-zależną), stwardnienie rozsiane, chorobę Reynauda, zapalenie tarczycy na tle autoimmunologicznym, alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zespół Sjorgena, cukrzycę mł odzień czą i odpowiedzi immunologiczne zwią zane z fazą ostrą lub opóźnioną nadwrażliwości wywołanej przez cytokiny i limfocyty T, występujące typowo w gruźlicy,

PL 201 086 B1 sarkoidozie, w zapaleniu wielomięśniowym, ziarnicy i w zapaleniu naczyń, anemii złośliwej (chorobę Addisona), choroby związane z diapedezą leukocytów, choroby zapalne ośrodkowego układu nerwowego (CNS), zespół uszkodzenia wielu narządów, niedokrwistość hemolityczną (obejmującą niewyłącznie krioglobulinemię i niedokrwistość pozytywną Coombsa), miastenię gravis, choroby na tle kompleksu antygen-przeciwciało, chorobę błony podstawnej przeciw kłębuszkom nerkowym, zespół antyfosfolipidowy, alergiczne zapalenie nerwów, chorobę Gravesa, zespół miastenii Lamberta-Eatona, pęcherzycę pęcherzową, pęcherzycę, poliendokrynopatie autoimmunologiczne, chorobę Reitera, zespół ze-sztywnienia, chorobę Behceta, zapalenie tętnicy skroniowej olbrzymiokomórkowe, immunologiczne uogólnione zapalenie nerek, nefropatię IgA, polineuropatie IgM, plamicę małopłytkową na tle immunologicznym (ITP) lub trombocytopenię autoimmunologiczną i podobne.

Termin „antagonista” oznacza cząsteczkę, która w wyniku związania z CD20 powoduje rozkład lub usuwa komórki B u ssaka i/lub zaburza jedną lub wiele funkcji komórek B, np. przez hamowanie lub zapobieganie odpowiedzi humoralnej wywoływanej przez komórki B. Antagonista ma korzystnie zdolność usuwania u traktowanego nim ssaka komórek B (to znaczy obniżania poziomu komórek B w krwiobiegu). To usuwanie może przebiegać drogą różnych mechanizmów, np. według mechanizmu cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciała (ADCC) i/lub cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC), hamowania proliferacji komórek B i/lub indukowania śmierci komórek B (np. przez apoptozę). Do antagonistów objętych zakresem niniejszego wynalazku należą przeciwciała, syntetyczne lub natywne sekwencje peptydów i antagoniści o małych cząsteczkach, które wiążą się z CD20, ewentualnie skoniugowane lub skondensowane z czynnikiem cytotoksycznym. Korzystny antagonista stanowi przeciwciało.

Termin „cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciała” i „ADCC” odnosi się do reakcji komórkowej, w której nieswoiste komórki cytotoksyczne, na których ma miejsce ekspresja receptorów Fc (RcR) (np. naturalne komórki bójcze (NK), leukocyty obojętnochłonne i makrofagi) rozpoznają przeciwciało związane na komórce docelowej i następnie powodują lizę tej komórki docelowej. Na komórkach, które jako pierwsze inicjują ADCC, komórkach NK, zachodzi ekspresja jedynie receptora FcyRIII, podczas gdy na monocytach zachodzi ekspresja FcyRI, FcyRII i FcyRIII. Ekspresja FcR na komórkach szlaku hematopoezy jest sumarycznie przedstawiona w tabeli 3 na stronie 464 w artykule Ravetch'a i Kinefa w Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). W celu oceny aktywności ADCC danej cząsteczki można przeprowadzić próbę ADCC in vitro, taką jak opisana w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.500.362 albo US 5.821.337. Cząsteczkami efektorowymi użytecznymi w tej próbie są komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i naturalne komórki bójcze (NK). Alternatywnie lub dodatkowo, aktywność ADCC danej cząsteczki można oznaczyć w próbie in vivo na modelu zwierzęcym, takim jak ujawniony przez Clynes'a i wsp., w PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).

„Ludzkimi komórkami efektorowymi” są leukocyty, na których ma miejsce ekspresja jednego lub większej ilości FcR i które mają funkcje efektorowe. Korzystnie, komórki te produkują przynajmniej FcyRIII i pełnią funkcję komórek efektorowych w ADCC. Przykłady ludzkich leukocytów, które uczestniczą w ADCC obejmują komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i naturalne komórki bójcze (NK), monocyty, cytotoksyczne komórki T i neutrofile, przy czym PBMC i NK są komórkami korzystnymi.

Terminy „receptor Fc” lub „FcR” oznaczają receptor wiążący się z regionem Fc przeciwciała. Korzystnym FcR jest natywna sekwencja ludzkiego FcR. Ponadto, korzystnym FcR jest receptor, który wiąże się z przeciwciałem IgG (receptor gamma). Obejmuje on podklasy receptorów FcyRI, FcyRII i FcyRIII, łącznie z wariantami allelowymi i ewentualnie formami połączonymi tych receptorów. Receptory FcyRII obejmują FcyRIIA (receptor aktywujący) i FcyRIIB (receptor hamujący), które mają podobne sekwencje aminokwasowe a różnią się głównie domenami cytoplazmatycznymi. Aktywujący receptor FcyRIIA zawiera w domenie cytoplazmatycznej motyw aktywacji immunoreceptora oparty na tyrozynie (ITAM). Hamujący receptor FcyRIIB zawiera w domenie cytoplazmatycznej motyw immunoreceptorowy hamujący oparty na tyrozynie (ITIM). [Patrz Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)]. Receptory FCR są opisane przez Ravetch'a i Kinet'a w Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991), przez Capel'a i wsp. w Immunomethods 4: 25-34 (1994) oraz przez de Haas'a i wsp. w J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Inne FcR, w tym te, które będą zidentyfikowane w przyszłości, objęte są ogólnym terminem „FcR”. Termin ten odnosi się również do receptora noworodkowego, FcRn, odpowiedzialnego za przenoszenie IgG matki do płodu [Guyer i wsp., J. Immunol. 117: 587 (1976) i Kim i wsp., J. Immunol. 24: 249 (1994)].

Termin „cytotoksyczność zależna od dopełniacza” albo „CDC” odnosi się do zdolności cząsteczki do lizy celu w obecności dopełniacza. Szlak aktywacji dopełniacza rozpoczyna się wiązaniem

PL 201 086 B1 pierwszego składnika układu dopełniacza (C1q) do cząsteczki (np. przeciwciała) skompleksowanej z rozpoznanym antygenem. W celu oznaczenia aktywacji dopełniacza można przeprowadzić próbę CDC, np. opisaną przez Gazzano-Santoro w J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

Antagonistami „hamowania wzrostu” są środki zapobiegające lub hamujące proliferację komórki wytwarzającej antygen, z którym łączy się dany antagonista. Przykładowo, antagonista może zapobiegać lub zmniejszać proliferację komórek B w próbach in vitro i/lub in vivo.

Antagonistami „indukującymi apoptozę” są antagoniści indukujący programowaną śmierć komórki, np. komórki B, co oznacza się w standardowych próbach na apoptozę, takich jak próba wiązania anneksyny V, próba fragmentacji DNA, próba kurczenia się komórki, rozszerzania retikulum endoplazmatycznego, fragmentacj i komórki i/lub tworzenia się pęcherzyków błonowych (zwanych ciałkami apoptotycznymi).

Termin „przeciwciało” jest w niniejszym opisie stosowany w najszerszym sensie a konkretnie obejmuje intaktne przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała wielo-swoiste (np. przeciwciała o podwójnej swoistości) utworzone z co najmniej dwóch intaktnych przeciwciał i fragmenty przeciwciał, tak długo, jak długo wykazuje żądaną aktywność biologiczną.

Termin „fragmenty przeciwciał” oznacza część intaktnego przeciwciała, korzystnie jego region wiążący antygen lub region zmienny. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 i Fv, „diabodies”, przeciwciała liniowe, jedno-łańcuchowe cząsteczki przeciwciał i przeciwciała wieloswoiste utworzone z fragmentów przeciwciał.

„Przeciwciała natywne” są zazwyczaj heterotetramerycznymi glikoproteinami o masie cząsteczkowej około 150.000 daltonów, złożonymi z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki jest związany z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym wiązaniem dwusiarczkowym a ilość wiązań dwusiarczkowych jest różna w łańcuchach ciężkich różnych izotypów immunoglobulin. Każdy łańcuch ciężki i lekki posiada również regularne wewnątrzłańcuchowe mostki dwusiarczkowe. Każdy łańcuch ciężki posiada na jednym końcu domenę zmienną (VH), po której występuje szereg domen stałych. Każdy łańcuch lekki posiada na jednym końcu domenę zmienną (VL) a na drugim końcu domenę stałą. Domena stała łańcucha lekkiego znajduje się w jednym szeregu w pierwsza domeną stała łańcucha ciężkiego a domena zmienna łańcucha lekkiego jest wyrównana z domeną zmienną łańcucha ciężkiego. Przypuszcza się, że reszty szczególnych aminokwasów tworzą powierzchnię rozdzielającą pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego.

Termin „zmienna” odnosi się do faktu, że w niektórych o częściach domen zmiennych występują duże różnice w sekwencji poszczególnych przeciwciał i różnice te są wykorzystywane do wiązania i do określania swoistości danego przeciwciała względem odpowiadającego mu antygenu. Jednakże, zmienność ta nie występuje równomiernie w domenach zmiennych przeciwciał. Koncentruje się ona w trzech segmentach zwanych regionami hiperzmiennymi, zarówno w domenach zmiennych ł a ń cucha lekkiego jak i ciężkiego. Bardziej konserwatywne części domen zmiennych zwane są regionami zrębowymi (FR). Domeny zmienne natywnych łańcuchów ciężkich i lekkich zawierają po cztery regiony zrębowe, przyjmują w większości konfigurację harmonijki β (β-sheet), i są połączone z trzema regionami hiperzmiennymi, które tworzą pętle łączące a w niektórych przypadkach, tworzą część struktury harmonijki β. W każdym łańcuchu, regiony hiperzmienne są utrzymywane w ścisłej bliskości przez regiony zrębowe i razem z regionami hiperzmiennymi z drugiego łańcucha uczestniczą w tworzeniu miejsca wiązania antygenu przez przeciwciało [patrz: Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. V, Public Health Service, Narodowy Instytut Zdrowia, Bethesda, MD (1991). Domeny stałe nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu się przeciwciała z antygenem ale mają różne funkcje efektorowe, takie jak uczestniczenie przeciwciała w zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej (ADCC).

W wyniku trawienia przeciwciała papainą powstają dwa identyczne fragmenty wiążące antygen, zwane fragmentami „Fab”. Każdy z nich posiada pojedyncze miejsce wiążące antygen i pozostały fragment „Fc”, którego nazwa odzwierciedla jego zdolność do łatwej krystalizacji. Po trawieniu pepsyną powstaje fragment F(ab')2 posiadający dwa miejsca wiązania z antygenem i w dalszym ciągu zdolność sieciowania antygenu.

„Fv” jest minimalnym fragmentem przeciwciała, posiadającym całkowite miejsce rozpoznawania i wiązania antygenu. Ten region składa się z dimeru jednego łańcucha ciężkiego i jednego łańcucha lekkiego domeny zmiennej, w ścisłym połączeniu nie-kowalencyjnym. Znajduje się on w takiej konfiguracji, że trzy regiony hiperzmienne każdej domeny zmiennej współdziałali ją dla określenia miejsca

PL 201 086 B1 wiążącego antygen na powierzchni dimeru VH-VL. Wspólnie, sześć hiperzmiennych regionów nadaje przeciwciału swoistość wiązania antygenu. Jednakże, nawet pojedyncza domena zmienna (albo połowa Fv zawierająca tylko trzy regiony hiperzmienne swoiste dla antygenu) ma zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, aczkolwiek ze słabszym powinowactwem niż całkowite miejsce wiązania.

Fragment Fab również zawiera domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą domenę stałą (CH1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab dodatkiem kilku reszt przy końcu karboksylowym łańcucha ciężkiego domeny CH1, w tym jednej lub większej ilości reszt cysteinowych z regionu zawiasowego tego przeciwciał a. Fab'-SH oznacza w niniejszym opisie Fab', w którym reszta (reszty) cysteinowe domen stałych zawierają co najmniej jedną wolną grupę tiolową. Fragmenty przeciwciała F(ab')2 początkowo wytwarzano jako pary fragmentów Fab' zawierających między nimi zawiasowe reszty cysteinowe. Znane są również inne sprzężenia chemiczne fragmentów przeciwciał.

We wszystkich gatunkach kręgowców, „łańcuchy lekkie” przeciwciał (immunoglobulin) można przydzielić do jednego z dwóch wyraźnie różniących się typów, zwanych kappa (κ) i lambda (λ) w oparciu o sekwencje aminokwasowe ich domen stałych.

W zależności od sekwencji aminokwasowych domen stałych w łańcuchach ciężkich, przeciwciała można przydzielić do różnych klas. Istnieje pięć głównych klas naturalnych przeciwciał: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM a ponadto, kilka z tych klas można dalej podzielić na podklasy (izotypy), np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Domeny stałe łańcuchów ciężkich odpowiadające różnym klasom przeciwciał oznacza się odpowiednio jako α, δ, ε, γ i μ. Struktury podjednostek i konfiguracje przestrzenne różnych klas immunoglobulin są dobrze poznane.

„Jednołańcuchowe fragmenty przeciwciał Fv” lub „scFv” zawierają domeny VH i VL, przy czym te domeny występują w jednym łańcuchu polipeptydowym. Korzystnie, polipeptyd Fv zawiera ponadto łącznik polipeptydowy pomiędzy domenami VH i VL, umożliwiający tworzenie przez scFv struktury potrzebnej do związania antygenu. Przeglądu scFv dokonał Ptockthun w The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, wyd. Rosenburg i Moore, Springer-Velag, Nowy Jork, str. 269-315 (1994).

Termin „diabodies” odnosi się do małych fragmentów przeciwciała z dwoma miejscami wiążącymi antygen, przy czym fragmenty te posiadają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) w tym samym łańcuchu polipeptydowym (VH - VL). Przez użycie łącznika, który jest za krótki aby umożliwić parowanie tych dwu domen na tym samym łańcuchu, zmusza się te domeny do tworzenia par z domenami komplementarnymi innego łańcucha i tworzenia dwóch miejsc wiążących antygen. „Diabodies” są pełniej opisane np. w publikacjach patentowych EP 404.097 i WO 93/11161 oraz przez Hollinger'a i wsp., w Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Termin „monoklonalne przeciwciało” oznacza w niniejszym opisie przeciwciało uzyskane z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, co oznacza, że poszczególne przeciwciała wchodzące w skład populacji są identyczne za wyjątkiem możliwych, zachodzących w sposób naturalny mutacji, które mogą być obecne w małych ilościach. Monoklonalne przeciwciała są wysoce swoiste, są skierowane przeciw pojedynczemu miejscu antygenicznemu. Poza tym, w odróżnieniu do konwencjonalnych (poliklonalnych) preparatów przeciwciał, które w zasadzie zawierają różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciw jednej determinancie na antygenie. Poza zaletą swoistości, monoklonalne przeciwciała są korzystne dlatego, że są syntetyzowane w kulturach hybrydoma, nie zanieczyszczonych innymi immunoglobulinami. Przymiotnik „monoklonalne” wskazuje na charakter przeciwciała, jako uzyskanego z zasadniczo homogenicznej populacji przeciwciał i nie obejmuje warunku produkcji tego przeciwciała jakimkolwiek konkretnym sposobem. Przykładowo, monoklonalne przeciwciała do stosowania w niniejszym wynalazku mogą być otrzymane sposobem z użyciem hybrydoma opisanym po raz pierwszy przez Kohlera i wsp. w Nature, 256: 495 (1975) albo technikami rekombinacji DNA (patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 4.816.567). Monoklonalne przeciwciała mogą być również wyizolowane z fagowej biblioteki przeciwciał z użyciem technik opisanych np. przez Clackson'a i wsp. w Nature, 352: 624-628 (1991) i Marksa i wsp. w J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991).

W niniejszym opisie, monoklonalne przeciwciała obejmują szczególnie „chimeryczne” przeciwciała (immunoglobuliny), w których część łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego jest identyczna lub homologiczna z odpowiednimi sekwencjami w przeciwciałach pochodzących od konkretnych gatunków lub należących do określonej klasy lub podklasy przeciwciał, podczas gdy pozostała część łańcucha (łańcuchów) jest identyczna lub homologiczna z odpowiednimi sekwencjami w przeciwciałach pochodzących z innego gatunku lub należących do innej klasy lub podklasy, a także fragmenty takich przeciwciał, w zakresie, w jakim wykazują one żądaną aktywność biologiczną (opis patentowy Stanów

PL 201 086 B1

Zjednoczonych Ameryki, US 4.816.567 i Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984). Do chimerycznych przeciwciał należą w niniejszym wynalazku „przeciwciała „prymatyzowane”, zawierające sekwencje wiążące antygen domeny zmiennej pochodzące od naczelnych nie będących ludźmi (np. małp Starego Świata, takich jak pawiany, małpy rezus lub cynomolgus) i ludzkie sekwencje regionu stałego (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.693.780).

„Humanizowanymi” formami nie-ludzkich (np. mysich) przeciwciał są przeciwciała chimeryczne, zawierające minimalną sekwencję pochodzącą z nie-ludzkiej immunoglobuliny. W większości, humanizowanymi przeciwciałami są ludzkie immunoglobuliny (przeciwciało przyjmujące), w których reszty z regionu hiperzmiennego biorcy został y zastą pione resztami z regionu hiperzmiennego gatunku nieczłowieka (przeciwciało dawcy), takiego jak mysz, szczur, królik lub osobnik z rodzaju naczelnych nie będący człowiekiem, posiadającymi żądaną swoistość, powinowactwo i zdolność reagowania. W niektórych przypadkach, reszty regionu zrębowego (FR) immunoglobuliny ludzkiej zastąpione są odpowiednimi resztami nie pochodzącymi od człowieka. Poza tym, przeciwciała humanizowane mogą zawierać reszty, których nie ma ani w przeciwciele biorcy ani w przeciwciele dawcy. Modyfikacji takich dokonuje się w celu dalszego udoskonalenia właściwości przeciwciała. Na ogół, przeciwciało humanizowane będzie zawierało zasadniczo wszystkie z co najmniej jednej a typowo dwu domen zmiennych, w których wszystkie bądź zasadniczo wszystkie hiperzmienne pętle odpowiadają tym, które pochodzą z immunoglobuliny nie człowieka a wszystkie lub zasadniczo wszystkie FR są sekwencjami immunoglobuliny ludzkiej. Przeciwciało humanizowane będzie ewentualnie zawierało również co najmniej jedną część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), typowo, immunoglobuliny ludzkiej. Dalsze szczegóły są podane w artykułach Jones'a i wsp., Nature 321: 522-525 (1986), Riechmann'a i wsp., Nature 332: 323-329 (1988) i Presta'y w Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

Termin „region hiperzmienny” odnosi się w niniejszym opisie do tych reszt aminokwasowych przeciwciała, które są odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny zawiera reszty aminokwasowe z „regionu determinującego dopasowanie” albo „CDR” (np. reszty 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego [Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. V, Public Health Service, Narodowy Instytut Zdrowia, Bethesda, MD (1991)] i/lub i odpowiednie reszty z „hiperzmiennej pętli” (np. reszty 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego [Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)]. Resztami „regionu zrębowego” lub „FR” są reszty domeny zmiennej inne niż zdefiniowane w opisie reszty regionu hiperzmiennego.

Antagonistą, który „wiąże” żądany antygen, np. CD20, jest antagonista o zdolności wiązania tego antygenu z powinowactwem i/lub zachłannością wystarczającą do tego, aby ten antagonista był użyteczny jako środek leczniczy do celowania na komórkę wytwarzającą antygen.

Przykłady przeciwciał, które wiążą antygen CD20 obejmują: „C2B8”, obecnie znane jako „rituximab” („RITUXAN®”) (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.736.137, formalnie wprowadzony do niniejszego opisu jako odnośnik), znaczone itrem⁹⁰ mysie przeciwciało 2B8, oznaczone symbolem „Y2B8” (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.736.137, formalnie wprowadzony do niniejszego opisu jako odnośnik), mysie przeciwciało IgG2a „B1”, ewentualnie znaczone ¹³¹J dla generowania przeciwciała „¹³¹J-B1” (BEXXAR™) (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.595.721, formalnie wprowadzony do niniejszego opisu jako odnośnik), mysie monoklonalne przeciwciało „1F5” [Press i wsp., Blood i wsp. 69(2): 584-591 (1987)], przeciwciało „chimeryczne 2H7” (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.677.180, formalnie wprowadzony do niniejszego opisu jako odnośnik) i monoklonalne przeciwciała L27, G28-2, 93-1B3, BCl lub NU-B2 dostępne z Międzynarodowych Warsztatów Typowania Leukocytów [Valentine i wsp., Leukocyte Typing III (McMichael, str. 440, Oxford University Press (1987)].

Terminy „rituximab” albo „RITUXAN®” odnoszą się w niniejszym opisie do wytworzonego techniką inżynierii genetycznej, chimerycznego, mysio/ludzkiego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw antygenowi CD20 i nazwanego symbolem „C2B8” w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.736.137, formalnie włączonego do niniejszego opisu jako odnośnik. Przeciwciało to jest immunoglobuliną IgG1 kappa zawierającą mysie sekwencje regionów zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego oraz ludzkie sekwencje regionu stałego. Powinowactwo wiązania rituximabu do antygenu CD20 wynosi około 8,0 nM.

Antagonistą „izolowanym” jest antagonista, który został zidentyfikowany i wyodrębniony i/lub odzyskany ze składnika jego naturalnego środowiska. Składnikami zanieczyszczającymi tego naturalnego

PL 201 086 B1 środowiska są materiały, które mogłyby przeszkadzać w diagnostycznych lub leczniczych zastosowaniach antagonisty i mogą one obejmować enzymy, hormony i inne rozpuszczone w nim substancje białkowe i niebiałkowe. W korzystnych rozwiązaniach, antagonista będzie oczyszczony (1) do czystości ponad 95% wagowych tego antagonisty według oznaczenia metodą Lowry'ego a najkorzystniej do czystości ponad 99% wagowych, (2) do stopnia czystości wystarczającego do uzyskania co najmniej 15 reszt N-końcowych albo wewnętrznej sekwencji aminokwasowej przy użyciu aparatu do sekwencjonowania z naczyńkiem obrotowym (spinning cup sequenator) albo (3) do homogeniczności oznaczonej metodą SDS-PAGE w warunkach redukujących bądź nie-redukujących, z użyciem błękitu Coomassie albo korzystnie barwnika srebrowego. Pojęcie izolowanego antagonisty obejmuje również antagonistę in situ, w komórkach rekombinowanych, gdyż nie występuje przynajmniej jeden składnik naturalnego środowiska tego antagonisty. Zazwyczaj jednak, izolowany antagonista będzie przygotowany w przynajmniej jednym etapie oczyszczania.

„Ssak” do celów leczenia odnosi się do zwierzęcia sklasyfikowanego jako ssak i obejmuje ludzi, zwierzęta domowe i hodowlane oraz zwierzęta w ogrodach zoologicznych, sportowe albo pieszczone, takie jak psy, konie, koty, krowy i podobne. Korzystnie, ssakiem jest człowiek.

Termin „leczenie” odnosi się zarówno do traktowania leczniczego jak i profilaktycznego albo zapobiegawczego. Do osobników wymagających leczenia należą ci, u których wystąpiła już choroba lub zaburzenie oraz ci, u których należy zapobiec wystąpieniu choroby lub zaburzenia. Tak więc, ssak może być zdiagnozowany jako obarczony chorobą lub zaburzeniem albo jako usposobiony lub skłonny do zachorowania.

Wyrażenie „ilość skuteczna leczniczo” oznacza taką ilość antagonisty, która jest skuteczna w zapobieganiu, łagodzeniu lub leczeniu choroby lub danego stanu patologicznego.

Termin „środek immunosupresyjny” stosowany w opisie do terapii wspomagającej odnosi się do substancji, które tłumią lub maskują układ immunologiczny leczonego nim ssaka. Powinien on obejmować substancje, które hamują produkcje cytokin, regulują negatywnie lub hamują ekspresję autoantygenu bądź maskują antygeny głównego układu zgodności tkankowej (MHC). Przykłady takich środków obejmują 2-amino-6-arylo-5-podstawione pirymidyny (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 4.665.077, którego ujawnienie jest włączone do niniejszego opisu jako odnośnik), środki antyproliferacyjne, takie jak azatioprin, leflunomid lub sirolimus, cyklofosfamid, bromokryptynę, danazol, dapson, aldehyd glutarowy (maskujący antygeny MHC, co jest podane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 4.120.649), przeciwciała anty-idiotypowe dla antygenów MHC i fragmentów MHC, cyklosporynę A, steroidy, takie jak kortykosteroidy, np. prednizon, metyloprednizolon i deksametazon, mykofenolat mofetilu, inhibitory kalcyneryny (np. tacrolimus), antagoniści cytokin lub receptora cytokinowego, w tym przeciwciała przeciw interferonowi -γ, -β lub -α, przeciwciała przeciw czynnikowi martwicy nowotworu-α, przeciwciała przeciw czynnikowi martwicy nowotworu-β, przeciwciała przeciw interleukinie-2 i przeciwciała przeciw receptorowi dla IL-2, przeciwciała przeciw białku powierzchniowemu LFA-1, w tym przeciwciała anty-CD11a i anty-CD18, przeciwciała anty-L3T4, przeciwciała anty-limfocytowe, np. poliklonalne przeciwciała anty-lifocytowe, przeciwciała pan-T, korzystnie przeciwciała anty-CD3 albo an-ty-CD4/CD4a, rozpuszczalny peptyd zawierający domenę wiążącą LFA-3 (opis patentowy międzynarodowy, WO 90/08187, opublikowany 26 lipca 1990 r), streptokonazę, transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β), streptodornazę, RNA lub DNA gospodarza, FK506, RS-61443, dezoksyspergualinę, rapamycynę receptor komórek T (Cohen i wsp., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.114.721), fragmenty receptora komórek T [Offner i wsp., Science, 251: 430-432 (1991), opis patentowy międzynarodowy, WO 90/11294, laneway, Nature, 341: 482 (1989) i WO 91/01133] oraz przeciwciała receptora komórek T (opis patentowy europejski, EP 340.109], takie jak T10B9.

Termin „środek cytotoksyczny” oznacza w niniejszym opisie substancję, która hamuje lub zapobiega funkcjonowaniu komórek i/lub powoduje destrukcję komórek. Termin ten obejmuje izotopy radioaktywne (np. At²¹¹, J¹³¹, J¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² i radioaktywne izotopy Lu), środki chemioterapeutyczne i toksyny, takie jak toksyny o małych cząsteczkach lub toksyny aktywne enzymatycznie pochodzenia bakteryjnego, grzybiczego, roślinnego lub zwierzęcego bądź fragmenty tych toksyn.

Termin „środek chemioterapeutyczny” oznacza związek chemiczny użyteczny w leczeniu raka. Przykładami środków chemioterapeutycznych są środki alkilujące, takie jak tiotepa i cyklofosfamid (Cytoxan™), alkilosulfoniany, takie jak busulfan, improsulfan i piposulfan, azyrydyny, takie jak benzodopa, karbokwon, meturedopa i uredopa, etylenoiminy i metyloitielaminy, takie jak altretamina, trietylenomelamina, trietylenofosforamid, trietylenotiofosforamid i trimetylolomelamina, pochodne iperytu,

PL 201 086 B1 takie jak chlorambucil, chlornafazyna, cholofosfamid, estramustyna, ifosfamid, mechloretamina, chlorowodorek tlenku mechloretaminy, melfalan, nowembichina, fenesteryna, prednimustyna, trofosfamid,

5-[di(e-chloroetylo)amino]uracyl, nitrozomoczniki, takie jak karmustyna, chlorozotocyna, fotemustyna, lomustyna, nimustyna, ranimustyna, antybiotyki, takie jak aklacynomycyny, aktynomycyna, autramycyna, azaseryna, bleomycyny, kaktynomycyna, kalichemicyna, karabicyna, karminomycyna, karzynofilina, chromomycyny, daktynomycyna, daunorubicyna, detorubicyna, 6-diazo-5-okso-L-norleucyna, doksorubicyna, epirubicyna, esorubicyna, idarubicyna, marcellomycyna, mitomycyny, kwas mykofenolowy, nogalamycyna, oliwomycyny, peplomycyna, potfiromycyna, puromycyna, kwelamycyna, rodorubicyna, streptonigryna, strep-tozocyna, tubercydyna, ubenimex, zinostatyna, zorubicyna, antymetabolity, takie jak metotreksat i 5-fluorouracyl (5-FU), analogi kwasu foliowego, takie jak denopteryna, metotreksat, pteropteryna, trimetreksat, analogi purynowe, takie jak fludarabina, 6-merkaptopuryna, tiamipryna, tioguanina, analogi pirymidyny, takie jak ancytabina, azacytydyna, 6-azaurydyna, carmofur, cytarabina, dideoksyurydyna, doksyf lurydyna, enocytabina, loksurydyna, 5-FU, androgeny, takie jak kalusteron, propionian dromostanolonu, epitiostanol, mepitiostan, testolakton, środki hamujące biosyntezę hormonów kory nadnercza, takie jak aminoglutetimid, mitotan, trilostan, środki uzupełniające niedobory kwasu foliowego, takie jak kwas frolinowy, aceglaton, glukozyd aldofosfamidu, kwas aminolewulinowy, amsakryna, bestrabucil, bisantren, edatraksat, defofamina, demekolcyna, diazikwon, elfornityna, octan elliptinium, etoglucyd, azotan galu, hydroksymocznik, lentinan, lonidamina, mitoguazon, mitoksantron, mopidamol, nitracrine, pentostatyna, fenamet, pirarubicyna, kwas podofilinowy, 2-etylohydrazyd, prokarbazyna, PSK®, razoksan, sizofiran, spirogermanium, kwas tenuazonowy, triazikwon, 2, 2', 2'' -trichlorotrietyloamina, uretan, windezyna, dakarbazyna, mannomustyna, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman, gacytozyna, arabinozyd (Ara-C), cyklofosfamid, tiotepa, taksoidy, np. paclitaxel (Taxol® firmy Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) i doxetaxel (Taxotere®, firmy Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francja), chlorambucil, gemcytabina, 6-tioguanina, merkaptopuryna, metotreksat, analogi platyny, takie jak cisplatyna i karboplatyna, winblastyna, platyna, etopozyd (VP-16), ifosfamid, mitomycyna C, mitoksantron, winkrystyna, winorelbina, nawelbina, nowantron, tenipozyd, daunomycyna, aminopteryna, xeloda, ibandronian, CPT-11, inhibitor topoizomerazy RFS 2000, difluorometyloornityna (DMFO), kwas retynowy, esperamicyny, kapecytabina oraz dopuszczalne farmaceutycznie sole, kwasy lub pochodne powyższych związków. Niniejszą definicją objęte są również środki anty-hormonalne, regulujące lub hamujące działanie hormonu na rozwój nowotworu, takie jak antyestrogeny, np. tamoksifen, raloksifen, inhibitory aromatazy z grupy 4 (5)-imidazoli, 4-hydroksytamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i toremifen (Fareston) oraz anty-androgeny, takie jak flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid, i goserelina oraz dopuszczalne farmaceutycznie sole, kwasy lub pochodne powyższych związków.

Termin „cytokina” jest nazwą rodzajową dla białek uwalnianych przez jedną populację komórek i działających na inną komórkę jako mediatory międzykomórke. Przykładami takich cytokin są limfokiny, monokiny i tradycyjne hormony polipeptydowe. Pojęcie cytokin obejmuje hormon wzrostu, taki jak ludzki hormon wzrostu, N-metionylo-ludzki hormon wzrostu i bydlęcy hormon wzrostu, hormon przytarczyc, tyroksyna, insulina, proinsulina, relaksyna, prorelaksyna, hormony glikoproteinowe, takie jak hormon folikulotropowy (FSH), tyreotropina (TSH) i hormon luteinizujący (LH), wątrobowy czynnik wzrostu, czynnik wzrostu fibroblastów, prolaktyna, laktogen łożyskowy, czynnik martwicy nowotworu-α i -β, inhibitor Mϋlleriana, mysi peptyd związany z gonadotropiną, inhibina, aktywina, czynnik wzrostu śródbłonka naczyń, integryna, trombopoetyna (TPO), czynniki wzrostu nerwów, takie jak NGF-β, płytkowy czynnik wzrostu, transformujące czynniki wzrostu (TGF), takie jak TGF-α i TGF-β, insulino-podobny czynnik wzrostu -I i -II, erytropoetyna (EPO), czynniki pobudzające wzrost kości, interferony, takie jak interferon-α, -β i -γ; czynniki stymulujące tworzenie kolonii (CSF), takie jak czynnik stymulujący i tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) i czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), in-terleukiny (IL), takie jak II-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, czynnik martwicy nowotworu, taki jak TNF-α i TNF-β oraz inne czynniki polipeptydowe, włącznie z LIF i ligandem kit (KL). W niniejszym opisie, termin cytokina obejmuje białka zarówno ze źródeł naturalnych jak i z hodowlikomórek rekombinowanych i biologicznie aktywne równoważniki natywnych sekwencji cytokin.

Termin „prolek” odnosi się w niniejszym zgłoszeniu do formy prekursorowej albo pochodnej substancji aktywnej farmaceutycznie, która jest mniej cytotoksyczna w stosunku do komórek nowotworowych w porównaniu z lekiem macierzystym. Prolek może być aktywowany na drodze enzymatycznej albo przekształcony w bardziej aktywną formę związku macierzystego [patrz: Wilman, „Prodrugs in

PL 201 086 B1

Cancer Chemotherapy”, Biochemical Society Transactions, 14, str. 375-382, 615 Spotkanie w Belfaście (1986) i Stella i wsp., „Prodrugs”: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, Directed Drug Delivery, wyd. Borchardt i wsp., str. 247-267, Humana Press (1985). Do proleków według wynalazku należą bez ograniczeń proleki zawierające fosforan, proleki zawierające tiofosforan, proleki zawierające siarczan, proleki zawierające peptyd, proleki modyfikowane D-aminokwasem, proleki glikozylowane, proleki zawierające β-laktam, proleki zawierające ewentualnie podstawiony fenoksyacetamid, proleki zawierające ewentualnie podstawiony fenyloacetamid, 5-fluorocytozyna i inne proleki 5-fluorourydyny, które mogą być przekształcone do bardziej aktywnego wolnego leku cytotoksycznego. Przykłady leków cytotoksycznych, które można derywatyzować do formy proleku do celów użycia w wynalazku obejmują środki chemioterapeutyczne opisane powyżej, nie ograniczając się do tych środków.

„Liposom” jest małym pęcherzykiem, złożonym z różnych typów lipidów, fosfolipidów i/lub surfaktantu. Stosuje się go do dostarczania ssakowi leku (takiego jak antagonisty ujawnionego w opisie i ewentualnie środka chemioterapeutycznego). Składniki liposomu mają zazwyczaj budowę dwuwarstwową, podobną do rozmieszczenia lipidów w błonach biologicznych.

Termin „wkładka do opakowania” oznacza instrukcje załączane rutynowo do opakowań handlowych produktów leczniczych, zawierające informację o wskazaniach, użyciu, dawkowaniu, sposobie stosowania, przeciwskazaniach i/lub ostrzeżenia odnoszące się do użycia tych produktów leczniczych.

II. Produkcja antagonistów

W sposobach i wyrobach przemysłowych według wynalazku stosuje się lub umieszcza antagonistę wiążącego się z CD20. Dlatego też, poniżej są opisane sposoby generowania takich antagonistów.

Antygenem CD20 użytym do wytworzenia antagonisty lub jego skriningu może być między innymi rozpuszczalna forma tego antygenu lub jego część, zawierająca żądany epitop. Alternatywnie lub dodatkowo, do generowania lub skiningu na obecność tego antagonisty (antagonistów) można użyć komórki, na powierzchni których przebiega ekspresja CD20. Inne formy CD20 użyteczne do generowania antagonistów okażą się oczywiste dla specjalistów.

Chociaż korzystnym antagonistą jest przeciwciało, w wynalazku rozważa się antagonistów innych niż przeciwciała. Przykładowo, antagonistą może być mała cząsteczka antagonisty ewentualnie skondensowana lub skoniugowana ze związkiem cytotoksycznym (takim jak opisany w opisie). Można przeprowadzić skrining bibliotek małych cząsteczek na aktywność przeciw CD20 dla zidentyfikowania małej cząsteczki, która wiąże się z tym antygenem. Taka mała cząsteczka może być następnie poddana skriningowi na właściwości antagonisty i/lub skoniugowana ze środkiem cytotoksycznym.

Antagonistą może być również peptyd generowany drogą racjonalnego projektowania lub z użyciem faga (patrz, publikacja zgłoszenia patentowego międzynarodowego, WO 98/35036 z 13 sierpnia 1998 r.). W jednym z rozwiązań, wybraną cząsteczką może być cząsteczka naśladująca region determinujący dopasowanie („naśladująca CDR) albo analog przeciwciała zaprojektowany w oparciu o regiony CDR przeciwciała. Chociaż takie peptydy mogą mieć właściwości antagonistów same z siebie, peptydy te można ewentualnie kondensować ze środkiem cytotoksycznym, w tym celu, aby dodać lub wzmocnić właściwości tego peptydu jako antagonisty.

Poniższy opis dotyczy przykładowych technik wytwarzania antagonistów będących przeciwciałami, stosowanych w wynalazku.

(i) Poliklonalne przeciwciała

Poliklonalne przeciwciała korzystnie generuje się u zwierząt przez wielokrotne, podskórne (sc) albo dootrzewnowe (ip) iniekcje odpowiedniego antygenu i adiuwanta. Może się okazać użyteczne skoniugowanie tego odpowiedniego antygenu z białkiem, które jest immunogenne dla immunizowanego gatunku, np. z hemocyjaniną pijawki, z albuminą surowicy, z tyreoglobuliną bydlęcą albo z inhibitorem trypsyny z soi, wykorzystując związek dwufunkcyjny lub derywatyzujący, np. ester sulfosukcynimidowy maleimidobenzoilu (koniugacja poprzez reszty cysteinowe), N-hydroksysukcynimid (przez reszty lizynowe), aldehyd glutarowy, bezwodnik kwasu bursztynowego, SOCl2 lub związek o wzorze R¹N=C=NR, w którym R i R¹ oznaczają różne grupy alkilowe.

Zwierzęta immunizuje się przeciw antygenowi immunogennym koniugatom albo pochodnym przez połączenie np. 100 μg albo 5 μg białka lub koniugatu (dawki odpowiednio dla królików i myszy) z trzema objętościami kompletnego adiuwantu Freunda i wstrzyknięcie tego roztworu śródskórnie w wielu miejscach. Po miesiącu, zwierzętom podaje się dawkę przypominającą, wynoszącą 1/5 do 1/10 wyjściowej ilości peptydu albo koniugatu w kompletnym adiuwancie Freunda przez podskórną iniekcję w wielu miejscach. Po upływie 14 dni zwierzęta wykrwawia się i w surowicach oznacza się miano przeciwciała. Zwierzętom podaje się dawki przypominające do uzyskania wysycenia miana (plateaus). Korzystnie, zwierzętom

PL 201 086 B1 podaje się iniekcje przypominające koniugatu tego samego antygenu ale skoniugowanego z innym białkiem i/lub z użyciem innego odczynnika sieciującego. Koniugaty można również przygotować w hodowli komórek rekombinantowych jako białka fuzyjne. Dodaje się również z powodzeniem środki agregujące, takie jak ałun, w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej.

(ii) Przeciwciała monoklonalne

Przeciwciała monoklonalne uzyskuje się z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, co oznacza, że poszczególne przeciwciała wchodzące w skład populacji są identyczne za wyjątkiem możliwych, zachodzących w sposób naturalny mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. Przymiotnik „monoklinalne” wskazuje na charakter przeciwciała, jako nie będącego mieszaniną odrębnych przeciwciał.

Przykładowo, przeciwciała monoklonalne można uzyskać metodą z użyciem hybrydoma, opisaną po raz pierwszy przez Kohlera i wsp. [Nature 256: 495 (1975)] albo można je otrzymać metodami rekombinacji DNA (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 4.816.567).

W metodzie poprzez hybrydoma, immunizuje się mysz lub innego odpowiedniego gospodarza zwierzęcego, takiego jak chomika, w sposób opisany powyżej dla pobudzenia produkcji limfocytów do wytwarzania lub ich zdolności do wytwarzania przeciwciał, które będą się swoiście wiązać z białkiem użytym do immunizacji. Alternatywnie, limfocyty można immunizować in vitro. Następnie, limfocyty te poddaje się fuzji z komórkami szpiczaka, stosując odpowiedni środek sprzęgający, taki jak glikol polietylenowy, uzyskując komórki hybrydoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986)].

Tak otrzymane komórki hybrydoma posiewa się i prowadzi się ich wzrost w odpowiedniej pożywce hodowlanej, zawierającej korzystnie jedną lub większą ilość substancji hamujących wzrost lub przeżycie macierzystych komórek szpiczaka, które nie uległy fuzji. Przykładowo, jeśli macierzyste komórki szpiczaka nie wytwarzają enzymu, fosforybosylo-transferazy hipoksantyno-guaniny (HGPRT albo HPRT), wówczas pożywka hodowlana dla hybrydoma będzie na ogół zawierać hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę (pożywka HAT), które to substancje zapobiegają wzrostowi komórek z deficytem HGPRT.

Korzystnymi komórkami szpiczaka są te, które dają dużą wydajność fuzji, stabilny, wysoki poziom produkcji przeciwciała przez wyselekcjonowane komórki wytwarzające te przeciwciała i są wrażliwe na pożywkę, taka jak pożywka HAT. Wśród tych korzystnych linii komórek szpiczaka są mysie linie szpiczaka, takie jak te, które pochodzą z raków mysich MOPC-21 i MPC-11, dostępne z Salk Institute Celi Distribution Center, San Diego, Kalifornia, USA i komórki SP-2 albo X63-Ag8-653 dostępne z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Do celów produkcji ludzkich przeciwciał monoklonalnych zostały również opisane ludzkie linie komórek szpiczaka i mysio-ludzkie linie komórek heteromyeloma (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984), Brodeur i wsp., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc. Nowy Jork, 1987).

W pożywce hodowli, w której rosną komórki hybrydoma oznacza się produkcję przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko danemu antygenowi. Korzystnie, swoistość wiązania przeciwciał monoklonalnych wytworzonych w komórkach hybrydoma oznacza się metodą immunoprecypitacji albo w próbach wiązania in vitro, takich jak test radioimmunologiczny (RIA) albo enzymoimmunologiczny (ELISA).

Powinowactwo wiązania przeciwciała monoklonalnego można np. oznaczyć techniką Scatcharda Munsona i wsp. [Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]. Po zanalizowaniu, że komórki hybrydoma produkują przeciwciała o żądanej swoistości, powinowactwie i/lub aktywności, można subklonować klony w procedurach ograniczonych rozcień czeń i prowadzić ich wzrost standardowymi technikami [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986)]. Do pożywek hodowlanych odpowiednich do tego celu należą np. pożywki D-MEM albo RPMI-1640. Poza tym, można prowadzić wzrost komórek hybrydoma in vivo, w postaci puchliny nowotworowej u zwierząt.

Przeciwciała monoklonalne wydzielane przez te subklony, dogodnie wydziela się z pożywki hodowli, płynu puchlinowego albo z surowicy w znanych procedurach oczyszczania immunoglobulin, takich jak np. technika z użyciem białka A-Sepharozy, chromatografii na hydroksyapatycie, elektroforezy żelowej, dializy lub chromatografii powinowactwa.

DNA kodujące te przeciwciała monoklonalne łatwo się izoluje i sekwencjonuje wykorzystując znane procedury (np. z użyciem sond oligonukleotydowych o zdolności swoistego wiązania z genami kodującymi łańcuchy ciężki i lekki przeciwciał mysich). Komórki hybrydoma służą jako korzystne źródło takiego DNA. Po izolacji, DNA można umieszczać w wektorach ekspresyjnych, które z kolei poddaje się transfekcji do komórek gospodarza, takich jak komórki E. coli, komórki Simian COS, komórki

PL 201 086 B1 jajnika chomika chińskiego (CH) lub komórki szpiczaka, które z drugiej strony nie wytwarzają białka immunoglobuliny, uzyskując syntezę przeciwciał monoklonalnych w rekombinantowych komórkach gospodarza. Do artykułów przeglądowych na temat rekombinacyjnej ekspresji w bakteriach DNA kodującego przeciwciało należą: Skerra i wsp., Curr. Opinion in Immunol. 5: 256-262 (1993) i Ptockthun,

Immunol. Revs. 130: 151-188 (1992).

W następnym rozwiązaniu, można izolować przeciwciała lub fragmenty przeciwciał z fagowych bibliotek przeciwciał generowanych z użyciem technik opisanych przez McCafferty'ego i wsp. [Nature, 348: 552-554 (1990)]. Izolacja mysich i ludzkich przeciwciał z użyciem bibliotek fagowych opisana jest odpowiednio przez Clackson'a i wsp. (Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks'a i wsp. (J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991). W następnych publikacjach opisana jest produkcja ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (rzędu nM) metodą „przeciągania łańcucha” (chain shuffling) (Marks i wsp., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992) oraz przez kombinatoryjne zakażenie i rekombinację in vivo jako strategię konstruowania bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse i wsp., Nuc. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993). Tak więc, techniki te są żywymi alternatywami do tradycyjnych technik produkcji przeciwciał monoklonalnych z użyciem hybrydoma do izolowania przeciwciał monoklonalnych.

DNA można również modyfikować np. przez podstawienie sekwencji kodującej ludzkie domeny stałe łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego w miejsce homologicznych sekwencji mysich [opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 4.816.567; Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851- (1984)] albo przez kowalencyjne przyłączenie do sekwencji kodującej immunoglobulinę całości lub części sekwencji kodującej dla polipeptydu nie będącego immunoglobuliną.

Na ogół, takimi polipeptydami nie będącymi immunoglobuliną zastępuje się domeny stałe przeciwciała albo domeny zmienne jednego wiążącego antygen miejsca przeciwciała, generując chimeryczne przeciwciało dwuwartościowe (biwalencyjne), posiadające jedno miejsce wiążące antygen o swoistości dla antygenu i drugie miejsce wiążące antygen, o swoistości dla innego antygenu.

(iii) Przeciwciała humanizowane

W literaturze opisane są metody humanizowania przeciwciał nie-ludzkich. Korzystnie, przeciwciało humanizowane posiada jedną lub większą ilość reszt aminokwasowych do niego wprowadzonych ze źródła nie ludzkiego. Te nie-ludzkie reszty aminokwasowe są często nazywane resztami „importowymi”, na ogół pobieranymi z „importowej” domeny zmiennej. Zasadniczo, humanizację można przeprowadzić metodą Wintera i wsp. [Johnes i wsp., Nature, 321: 522-535 (1986)], Riechmann'a i wsp. [Nature, 332:323-327 (1988)] i Verhoeyen'a i wsp. [Science 239: 1534-1536 (1988)], przez podstawienie sekwencji regionu hiperzmiennego w miejsce odpowiednich sekwencji przeciwciała ludzkiego. Tak więc, takie „humanizowane” przeciwciała są przeciwciałami chimerycznymi (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 4.816.567), w których znacząco mniej materiału niż w nienaruszonej ludzkiej domenie zmiennej zostało zastąpione przez odpowiednią sekwencję z gatunku nieczłowieka. W praktyce, humanizowane przeciwciała są na ogół przeciwciałami ludzkimi, w których niektóre reszty regionu hiperzmiennego i ewentualnie niektóre reszty FR zostały zamienione na reszty z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzoni.

Dla obniżenia antygeniczności, bardzo ważny jest wybór ludzkich domen zmiennych, zarówno ich łańcuchów ciężkich jak i lekkich, do użycia w przygotowaniu przeciwciał humanizowanych. Według tak zwanej metody najlepszego dopasowania („best fit”), prowadzi się przesiewanie sekwencji domeny zmiennej przeciwciała gryzonia względem całej biblioteki znanych ludzkich sekwencji domen zmiennych. Sekwencję ludzką, która najbardziej pasuje do sekwencji pochodzącej od gryzonia, akceptuje się jako ludzki region zrębowy (FR) dla tego humanizowanego przeciwciała [Sims i wsp., J. Immunol., 151: 2296 (1993), Chotia i wsp., J. Mol. Biol. 196: 901 (1987)]. W innej metodzie wykorzystuje się szczególny region zrębowy pochodzący z sekwencji consensus wszystkich przeciwciał ludzkich szczególnej podgrupy łańcuchów lekkich lub ciężkich. Ten sam region zrębowy można użyć do kilku różnych humanizowanych przeciwciał [Carter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Presta i wsp., J. Immunol., 151: 2623 (1993)].

Poza tym, jest ważne, aby przeciwciała były humanizowane z zachowaniem wysokiego powinowactwa względem antygenu i innych korzystnych właściwości biologicznych. Dla osiągnięcia tego celu, w korzystnym sposobie, humanizowane przeciwciała wytwarza się w procesie analizy sekwencji macierzystych i różnych pojęciowych produktów humanizowanych z użyciem modeli trójwymiarowych sekwencji macierzystych i humanizowanych. Trójwymiarowe modele immunoglobuliny są powszechnie dostępne i znane specjalistom. Dostępne są programy komputerowe ilustrujące i pokazujące na ekranie prawdopodobne trójwymiarowe struktury konformacyjne wybranych kandydatów sekwencji

PL 201 086 B1 immunoglobulinowych. Kontrola tych obrazów umożliwia analizę prawdopodobnej roli tych reszt w funkcjonowaniu danej immunoglobuliny - kandydata, np. analizę reszt, które wpływają na zdolność immunoglobuliny - kandydata do wiązania antygenu. W ten sposób można selekcjonować i łączyć od biorcy reszty FR i importować sekwencje tak, aby uzyskać przeciwciało o żądanych cechach charakterystycznych, takich jak zwiększone powinowactwo do docelowego antygenu. Na ogół, reszty regionu hiperzmiennego mają bezpośredni i największy wpływ na wiązanie z antygenem.

(iv) Przeciwciała ludzkie.

Alternatywnie do humanizowania, można generować przeciwciała ludzkie. Przykładowo, obecnie jest możliwe otrzymanie zwierząt transgenicznych (np. myszy) zdolnych w wyniku immunizacji do produkcji pełnego zestawu przeciwciał ludzkich przy braku produkcji immunoglobulin endogennych. Przykładowo, doniesiono, że homozygotyczna delecja genu dla regionu łączącego (JH) łańcucha ciężkiego przeciwciała u myszy chimerycznych i myszy mutantów linii zarodkowej, daje całkowite zahamowanie produkcji przeciwciał endogennych. Przeniesienie zestawu genów dla ludzkiej immunoglobuliny linii zarodkowej do takiej zmutowanej myszy w linii zarodkowej będzie powodowało produkcję przeciwciał ludzkich w wyniku prowokacji antygenem. [Patrz: np. Jakobovits i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993), Jakobovits i wsp., Nature 362: 255-258 (1993), Bruggermann i wsp., Year in Immunol. 7: 33 (1993) oraz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.591.669, US 5.589.369 i US 5.545.807.

Alternatywnie, do produkcji ludzkich przeciwciał i fragmentów przeciwciał metoda in vitro, wychodząc z repertuaru genów dla domeny zmiennej (V) immunoglobuliny od dawców nie immunizowanych, można wykorzystać technologię ujawniania fagów (phage display) [McCafferty i wsp., Nature 348: 552-553 (1990]. Zgodnie z tą techniką, geny dla domeny zmiennej V przeciwciała klonuje się w zgodnej ramce odczytu do genu dla większego lub mniejszego białka płaszczowego bakteriofaga nitkowego, takiego jak M13 albo fd i ujawnia się je jako funkcyjne fragmenty przeciwciała na powierzchni cząsteczki faga. Ze względu na to, że nitkowata cząstka zawiera kopię jednoniciowego DNA genomu faga, selekcje oparte na właściwościach funkcyjnych przeciwciała będą jednocześnie oznaczały selekcję genu kodującego przeciwciało wykazujące te właściwości. Tak więc, fag naśladuje pewne właściwości komórki B. Technologię ujawniania fagów można realizować w wielu różnych formatach [przegląd jest zawarty w artykule Johnson'a, P Kevin'a S. i Chiswell'a Davida J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)]. Do obrazowania faga można użyć kilka źródeł segmentów genu V. Clackson i wsp. [Nature 352: 624-628 (1991)] wyizolował odmienny zestaw przeciwciał anty-oksazolonowych z małej, losowej kombinatoryjnej biblioteki genów V pochodzącej ze śledzion immunizowanych myszy. Można skonstruować repertuar genów V od dawców - ludzi nie immunizowanych i izolować przeciwciała przeciw różnorodnym zestawom antygenów (w tym przeciw autoantygenom), postępując w zasadzie według techniki opisanej przez Marksa i wsp. [J. / Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) albo Griffith'a i wsp. [EMBO J. 12: 725-734 (1993)]. Patrz również opisy patentowe US 5.565.332 i US 5.573.905.

Ludzkie przeciwciała można również generować techniką in vitro, z aktywowanych komórek B (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.567.610 i US 5.229.275).

(v) Fragmenty przeciwciał

Do produkcji fragmentów przeciwciał opracowano różne techniki. Tradycyjnie, fragmenty te pochodzą z trawienia proteolitycznego całych przeciwciał [patrz: Morimoto i wsp., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) i Brennan i wsp., Science 229: 81 (1985)]. Obecnie jednak, fragmenty takie można wytwarzać bezpośrednio technologią z użyciem rekombinantowych komórek gospodarza. Przykładowo, takie fragmenty przeciwciał można izolować z opisanych powyżej fagowych bibliotek tych przeciwciał. Alternatywnie, fragmenty Fab'-SH można odzyskiwać bezpośrednio z E. coli i sprzęgać chemicznie z wytworzeniem fragmentów F(ab')2 [Carter i wsp., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]. W innym podejściu, fragmenty F(ab')2 można izolować bezpośrednio z hodowli rekombinantowych komórek gospodarza. Inne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał okażą się jasne dla specjalisty biegłego w praktyce laboratoryjnej. W innych rozwiązaniach, przeciwciałem z wyboru jest jednołańcuchowy fragment Fv (sc-Fv). Patrz: opis patentowy międzynarodowy, WO 93/16185, opisy patentowe US 5.571.894 i US 5.587.458. Fragmentem przeciwciała może być również „przeciwciało liniowe”, np. opisane w opisie patentowym US 5.641.870. Takie liniowe fragmenty przeciwciał mogą być monoswoiste lub o podwójnej swoistości.

PL 201 086 B1 (vi) Przeciwciała o podwójnej swoistości

Przeciwciałami o podwójnej swoistości są przeciwciała posiadające swoistości wiązania z co najmniej dwoma różnymi epitopami. Przykładowe przeciwciała o podwójnej swoistości mogą się wiązać z dwoma różnymi epitopami na CD20. Alternatywnie, ramię wiążące anty-CD20 można połączyć z ramieniem wiążącym cząsteczkę wyzwalającą na leukocycie, taką jak cząsteczka receptora na limfocycie T (np. CD2 albo CD3) albo receptory Fc dla IgG (FcyR), takie jak FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) i FcyRIII (CD16), skupiając w ten sposób mechanizmy obronne na komórkach B. Przeciwciała o podwójnej swoistości można również zastosować do doprowadzenia środków cytotoksycznych do komórki B. Takie przeciwciała posiadają ramię wiążące CD20 i ramię wiążące środek cytotoksyczny (np. saporynę, anty-interferon-α, alkaloid vinca, łańcuch A rycyny, metotreksat lub hapten izotopu radioaktywnego). Przeciwciała o podwójnej swoistości można wytwarzać jako przeciwciała o pełnej długości bądź jako fragmenty przeciwciał (np. przeciwciała F(ab')2 o podwójnej swoistości.

Sposoby uzyskiwania przeciwciał o podwójnej swoistości są znane. Tradycyjna produkcja pełnej długości przeciwciał o podwójnej swoistości opiera się na ko-ekspresji dwóch par: łańcuch ciężki-łańcuch lekki immunoglobuliny, przy czym te dwa łańcuchy charakteryzują się różną swoistością [Millstein i wsp., Nature 305: 537-539 (1983)]. Ze względu na losowe rozłożenie immunoglobulinowych łańcuchów ciężkich i lekkich, takie podwójne hybrydoma (kwadroma) produkują mieszaninę potencjalnie 10 różnych cząsteczek przeciwciała, z których tylko jedna ma prawidłowa strukturę podwójnej swoistości. Oczyszczenie tej prawidłowej cząsteczki, czego na ogół dokonuje się techniką chromatografii powinowactwa, jest uciążliwa a wydajności produktu są niskie. Podobne procedury są ujawnione w opisie zgłoszenia patentowego międzynarodowego, WO 93/08829 i przez Traunecker'a i wsp. w EMBO J. 10: 3655-3659 (1991).

W innym podejściu, sprzęga się domeny zmienne przeciwciała o żądanej swoistości wiązania (miejsca łączenia: antygen-przeciwciało) z sekwencjami domeny stałej immunoglobuliny. Miejsce fuzji znajduje się korzystnie w domenie stałej łańcucha ciężkiego immunoglobuliny i obejmuje przynajmniej część regionów zawiasowych CH2 i CH3. Zaleca się, aby w przynajmniej jednym miejscu fuzji znajdował się pierwszy stały region łańcucha ciężkiego (CH1) zawierający miejsce potrzebne do wiązania łańcucha lekkiego. DNA kodujące fuzje łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, i o ile to wskazane, łańcucha lekkiego immunoglobuliny, wbudowuje się do oddzielnych wektorów ekspresyjnych i dokonuje się ko-transfekcji do organizmu odpowiedniego gospodarza. Daje to ogromna elastyczność w dostosowywaniu wzajemnych proporcji tych trzech fragmentów polipeptydowych w takich rozwiązaniach, gdzie nierówne proporcje tych trzech łańcuchów polipeptydowych użytych do konstrukcji dają optymalne wydajności. Możliwa jest jednak insercja sekwencji kodujących dla dwóch albo dla wszystkich trzech łańcuchów polipetydowych w jednym wektorze ekspresyjnym, wówczas, kiedy ekspresja co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w jednakowych proporcjach daje wysokie wydajności albo jeśli proporcje te nie mają szczególnego znaczenia.

W korzystnym rozwiązaniu tego podejścia, przeciwciała o podwójnej swoistości są złożone z hybrydy łańcucha ciężkiego immunoglobuliny z pierwszą swoistością wiązania na jednym ramieniu i z hybrydy pary: łańcuch ciężki-łańcuch lekki (immunoglobuliny dostarczającej drugiej swoistości wiązania) w drugim ramieniu. Okazało się, że taka asymetryczna struktura ułatwia separację żądanego związku o podwójnej swoistości od niepożądanych połączeń łańcuchów immunoglobuliny, ponieważ obecność łańcucha lekkiego immunoglobuliny tylko na jednej połowie dwuswoistej cząsteczki dostarcza łatwej drogi rozdziału. To podejście jest ujawnione w opisie zgłoszeniowym WO 94/04690. Dalsze szczegółowe informacje na temat generowania przeciwciał o podwójnej swoistości są zawarte np. w publikacji Suresh i wsp., Methods in Enzymology 121: 210 (1986). Zgodnie z innym podejściem opisanym w opisie patentowym US 5.731.168, można modyfikować technikami inżynierii powierzchnię graniczną pary cząsteczek przeciwciała tak, aby zwiększyć do maksimum udział procentowy heterodimerów odzyskiwanych z hodowli komórek rekombinantowych. Korzystna powierzchnia graniczna zawiera co najmniej część domeny CH3 z domeny stałej przeciwciała. W tej metodzie, zastępuje się jeden lub większą ilość bocznych łańcuchów złożonych z małych aminokwasów z powierzchni granicznej na cząsteczce pierwszego przeciwciała łańcuchami bocznymi złożonymi z większych aminokwasów (np. tyrozynowymi lub tryptofanowymi). Na powierzchni granicznej cząsteczki drugiego przeciwciała tworzą się kompensujące „wgłębienia” o wielkości identycznej lub podobnej do wielkości dużych łańcuchów bocznych, przez zastąpienie łańcuchów bocznych złożonych z dużych aminokwasów łańcuchami mniejszymi (np. alaninowymi lub treoninowymi). Daje to drogę zwiększania wydajności heterodimeru w stosunku do innych niepożądanych produktów końcowych, takich jak homodimery.

PL 201 086 B1

Do przeciwciał o podwójnej swoistości należą przeciwciała sieciowane lub „heterokoniugaty”. Przykładowo, jedno z przeciwciał w takim heterokoniugacie może być sprzęgnięte z awidyną a drugie z biotyną. Takie przeciwciała proponowano do kierowania komórek układu immunologicznego przeciw komórkom niepożądanym (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 4.676.980) i do leczenia zakażenia wirusem HIV (opisy patentowe WO 91/00360, WO 92/200373 i EP 03089). Przeciwciała będące heterokoniugatami można otrzymać dowolną, dogodną metodą sieciowania. Odpowiednie środki sieciujące są powszechnie znane i są ujawnione w opisie patentowym US 4.676.980 łącznie z wieloma technikami sieciowania.

W piśmiennictwie są również opisane techniki generowania przeciwciał o podwójnej swoistości z fragmentów przeciwciał. Przeciwciała o podwójnej swoistości można np. wytwarzać metodą wiązania chemicznego. Brennan i wsp. [Science 229: 81 (1985) ] opisał procedurę, w której całe przeciwciała poddaje się rozszczepieniu proteolitycznemu, uzyskując fragmenty F(ab')2. Fragmenty te redukuje się wobec środka kompleksującego ditiol, arseninu sodu, stabilizując sąsiednie grupy ditiolowe i zapobiegając tworzeniu międzycząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych. Powstałe fragmenty Fab' przekształca się następnie w pochodne tionitrobenzoesanowe (TNB). Następnie, jedną z pochodnych Fab'-TNB przekształca się w Fab'-tiol przez redukcję merkaptoetyloaminą i miesza się z równomolową ilością innej pochodnej Fab'-TNB, uzyskując przeciwciało o podwójnej swoistości. Te przeciwciała o podwójnej swoistości mogą być stosowane jako środki do selektywnej immobilizacji enzymów.

Postęp, jaki się dokonał w ostatnich latach, ułatwił bezpośredni odzysk fragmentów Fab'-SH z E. coli, które to fragmenty moż na sprzę gać chemicznie, wytwarzają c przeciwciał a o podwójnej swoistości. Shalaby i wsp. [J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)] opisał wytwarzanie w pełni humanizowanej cząsteczki przeciwciała F(ab')2 o podwójnej swoistości. Każdy fragment Fab' był oddzielnie wydzielany z E. coli i poddany bezpoś redniemu sprzę gnię ciu chemicznemu in vitro, z wytworzeniem przeciwciał a o podwójnej swoistości. Powstałe w ten sposób przeciwciało o podwójnej swoistości miało zdolność wiązania się z komórkami, w których przebiegała nadekspresja receptora ErbB2 i z normalnymi ludzkimi komórkami T, a także uwalniania aktywności litycznej ludzkich limfocytów cytotoksycznych przeciw ludzkiemu rakowi sutka.

Opisano również różne techniki uzyskiwania i izolowania fragmentów przeciwciał o podwójnej swoistości bezpośrednio z hodowli komórek rekombinantowych. I tak, np. przeciwciała o podwójnej swoistości wytwarzano z użyciem „zamków leucynowych [Kostelny i wsp., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Peptydy zamka leucynowego z białek Fos i Jun przyłączano do części Fab' dwóch różnych przeciwciał metodą fuzji genów. Redukowano homodimery przeciwciał w regionie zawiasowym z utworzeniem monomerów i następnie utleniano je do heterodimerów przeciwciał. Ta metoda może być również użyta do produkcji homodimerów przeciwciała. Technologia „diabody” opisana przez Hollinger'a i wsp. [Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)] dostarczyła alternatywnego mechanizmu wytwarzania fragmentów przeciwciał o podwójnej swoistości. Fragmenty te zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) poprzez łącznik, który jest za krótki, aby było możliwe tworzenie się par pomiędzy dwiema domenami na tym samym łańcuchu. Tak więc, domeny VH i VL jednego fragmentu są zmuszane do tworzenia par z komplementarnymi domenami VH i VL innego fragmentu, z utworzeniem dwóch miejsc wiążących antygen. Inna strategia uzyskiwania fragmentów przeciwciał o podwójnej swoistości przez użycie dimerów jednołańcuchowego Fv (sFv) również została opisana [Gruber i wsp., J. Immunol., 152: 5368 (1994)].

Znane są również przeciwciała o więcej niż dwóch wartościowościach (miejscach wiązania). Możliwe jest np. otrzymanie przeciwciał o potrójnej swoistości [Tutt i wsp., J. Immunol. 147: 60 (1991)].

III. Koniugaty i inne modyfikacje antagonisty

Antagonista stosowany w sposobach albo zawarty w wyrobach przemysłowych według wynalazku jest ewentualnie skoniugowany ze środkiem cytotoksycznym.

Środki chemioterapeutyczne użyteczne do generowania takich koniugatów: antagonista - środek cytotoksyczny zostały opisane powyżej.

W wynalazku przewiduje się również koniugaty antagonisty i jednej lub wi ę kszej iloś ci toksyn o małych cząsteczkach, takich jak kalichemicyna, maytanzyna ((opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.208.020), trichoten i CC1065. W jednym z rozwiązań według wynalazku, antagonista jest skoniugowany z jedną lub większą ilością cząsteczek maytanzyny (np. od około 1 do około 10 cząsteczek maytanzyny na cząsteczkę antagonisty). Maytanzynę można np. przekształcić do związku May-SS-Me, który można zredukować do May-SH3 i poddać reakcji z modyfikowanym antagonistą (Chari i wsp., Cancer Research 52: 127-131 (1992) w celu uzyskania koniugatu: maytanzynoid-antagonista.

PL 201 086 B1

Alternatywnie, antagonistę koniuguje się z jedną lub z większą ilością cząsteczek kalichemicyny. Rodzina antybiotyków kalichemicynowych ma zdolność robienia przerw w dwuniciowym DNA w stężeniach sub-pikomolowych. Do strukturalnych analogów kalichemicyny, które mogą być użyte, należą (nie wyłącznie) γ₁', α₂', α₃ ^Ι, N-acetylo-γ-ι', PSAG i θ₁'. [Hinman i wsp., Cancer Research 53:

3336-3342 (1993) i Lode i wsp., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)].

Do toksyn aktywnych enzymatycznie i ich fragmentów, które mogą być użyte, należą: łańcuch A toksyny błonicy, nie wiążące, aktywne fragmenty toksyny błonicy, łańcuch A egzotoksyny (z Pseudomonas aeruginosa), łańcuch A rycyny, łańcuch A abryny, łańcuch A modeccyny, alfa-sarcyna, białka Aleurites fordii, białka diantyny, białka Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor z momordica charantia, kurcyna, krotyna, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonina, mito-gellina, restryktocyna, fenomycyna, enomycyna i tricoteceny (patrz np. opis patentowy WO 93/21232 opublikowany 28 października 1993).

Wynalazkiem objęty jest poza tym antagonista skoniugowany ze związkiem posiadającym aktywność nukleolityczną, np. z rybonukleazą lub z endonukleazą DNA, taka jak dezoksyrybonukleaza, DNaza.

Do produkcji antagonistów skoniugowanych z cząstką radioaktywną dostępnych jest wiele różnych izotopów radioaktywnych. Ich przykłady obejmują At²¹¹, J¹³¹, J¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁹⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² i izotopy radioaktywne Lu.

Koniugaty antagonisty i środka cytotoksycznego można wytwarzać z użyciem wielu różnych dwufunkcyjnych środków sprzęgających białka, takich jak N-sukcynimidylo-3-(2-pirydyloditiolo)propionian (SPDP), sukcynimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan, iminotiolan (IT), dwufunkcyjne pochodne imidoestrów (takie jak adypimian dimetylowy HCl), aktywne estry (takie jak suberan disukcynimidyIowy), aldehydy (takie jak aldehyd glutarowy), bis-azydozwiązki [takie jak bis(p-azydobenzoilo)heksanodiamina)], pochodne bis-diazoniowe (takie jak bis-(p-diazoniumbenzoilo)-etylenodiamina), diizocyjaniany (takie jak tolueno-2,6-diizocyjanian), bis-aktywne związki fluoru (takie jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Rycyno-immunotoksynę można np. otrzymać metodą opisaną przez Vitetta'ę i wsp. (Science 238: 1098 (1987). Przykładem środka chelatującego do koniugacji radionukleotydu z antagonistą jest znaczony C¹⁴ kwas 1-izotiocyjanianobenzylo-3-metylodietyleno-triaminopentaoctowy (MX-DTPA) (opis patentowy WO 94/11026). Łącznikiem (linkierem) może być „łącznik rozszczepialny” ułatwiający uwalnianie leku cytotoksycznego w komórce. Można np. użyć łącznik wrażliwy na kwas, łącznik wrażliwy na peptydazę, łącznik dimetylowy albo łącznik zawierający wiązanie dwusiarczkowe [Chari i wsp., Cancer Research 52: 127-131 (1992)].

Alternatywnie, można przygotować białko fuzyjne zawierające antagonistę i środek cytotoksyczny, np. technikami rekombinacji albo przez syntezę peptydów.

W jeszcze innym rozwiązaniu, antagonistę można koniugować z „receptorem” (takim jak streptawidyną) do celów kierowania do nowotworu, przy czym koniugat: antagonista-receptor podaje się pacjentowi, następnie usuwa się nie związany koniugat z krwiobiegu z użyciem środka oczyszczającego i podaje się „ligand” (np. awidynę), który jest skoniugowany ze środkiem cytotoksycznym (np. radionukleotydem).

Antagonistów według wynalazku można również koniugować z układem: prolek - enzym aktywujący, który przekształca prolek (np. peptydylowany środek chemioterapeutyczny, patrz opis patentowy WO 81/01145) do aktywnego leku przeciw-nowotworowego (patrz. np. opisy patentowe WO 88/07378 i US 4.975.278).

Składnikiem enzymatycznym w takich koniugatach jest enzym zdolny do działania na prolek w taki sposób, że przekształca go w bardziej aktywną formę cytotoksyczną.

Do enzymów, które są użyteczne w sposobie według wynalazku należą (nie wyłącznie): alkaliczna fosfataza, użyteczna do przekształcania proleków zawierających grupę fosforanową w wolne leki, arylosulfataza, użyteczna do przekształcania proleków zawierających grupę siarczanowa w wolne leki, deaminaza cytozynowa, użyteczna do przekształcania nietoksycznej 5-fluorocytozyny do leku przeciw-nowotworowego, 5-fluorouracylu, proteazy, takie jak proteaza z serratia, termolizyna, subtylizyna, karboksypeptydazy i katepsyny (takie jak katepsyna B i L), użyteczne do przekształcania proleków zawierających peptyd w wolne leki, D-alanylokarboksypeptydazy, użyteczne do przekształcania proleków zawierających podstawniki D-aminokwasowe, enzymy rozszczepiające węglowodany, takie jak β-galaktozydaza i neuraminidaza, użyteczne do przekształcania proleków glikozylowanych w wolne leki, β-laktamaza, użyteczna do przekształcania leków derywatyzowanych β-laktamami w wolne leki i amidazy penicylinowe, takie jak amidaza penicyliny V albo amidaza penicyliny G, użyteczne do przekształcania leków derywatyzowanych przy azocie aminowym grupami odpowiednio fenoksyacetylową

PL 201 086 B1 albo fenyloacetylową w wolne leki. Alternatywnie, do konwersji proleków według wynalazku w wolne, aktywne leki można użyć przeciwciała z aktywnością enzymatyczną, znane również w tej dziedzinie jako „abzymy” [patrz np. Massey, Nature 328: 457-458 (1987)]. Koniugaty: antagonista-abzym można wytwarzać w sposób opisany w niniejszym opisie i stosować do celów dostarczania abzymu do populacji komórek nowotworowych.

Enzymy według wynalazku można wiązać kowalencyjnie z antagonistą technikami znanymi w tej dziedzinie, takimi jak użycie opisanych powyżej hetero-dwufunkcyjnych reagentów sieciujących. Alternatywnie, białka fuzyjne zawierające co najmniej region wiążący antygen antagonisty według wynalazku połączony przynajmniej aktywną funkcyjnie częścią enzymu według wynalazku można konstruować z użyciem znanych technik rekombinacji DNA [patrz np. Neuberger i wsp., Nature 312: 604-608 (1984)].

W wynalazku przewiduje się również inne modyfikacje antagonisty. Przykładowo, antagonistę można związać z jednym z wielu różnych polimerów nie-białkowych, np. z glikolem polietylenowym, z glikolem polipropylenowym, z polioksyalkilenami albo z kopolimerami glikolu polietylenowego i glikolu propylenowego.

Preparaty antagonistów ujawnione w niniejszym opisie można również przygotowywać w formach liposomalnych. Liposomy zawierające antagonistę sporządza się metodami znanymi w stanie techniki, takimi jak np. opisana przez Epsteina i wsp. w Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985), Hwang'a i wsp. w Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980), w opisach patentowych US 4.485.045 i US 4.544.545 i WO 97/38731 opublikowanym 23 października 1997. Liposomy o wydłużonym czasie utrzymywania się w krwiobiegu są ujawnione w opisie patentowym US 5.013.556.

Szczególnie użyteczne liposomy otrzymuje się przez odparowanie w fazach odwróconych kompozycji lipidowej zawierającej fosfatydylocholinę, cholesterol i derywatyzowaną PEG fosfatydyloetanoloaminę (PEG-PE). Liposomy przetłacza się przez filtry o określonej wielkości porów, uzyskując liposomy o żądanej średnicy. Fragmenty Fab' przeciwciała według wynalazku można koniugować z liposomami w sposób opisany przez Martin'a i wsp. [J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)] w reakcji wymiany ugrupowania dwusiarczkowego. Wewnątrz liposomu znajduje się ewentualnie środek chemioterapeutyczny [patrz Gabizon i wsp., J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)].

Przewiduje się modyfikację (modyfikacje) sekwencji aminokwasowej (aminokwasowych) antagonistów białkowych lub peptydowych opisanych w niniejszym opisie. Przykładowo, może być pożądane zwiększenie powinowactwa wiązania i/lub innych właściwości biologicznych takiego antagonisty. Warianty sekwencji aminokwasowych antagonisty sporządza się przez wprowadzenie odpowiednich zmian nukleotydowych w kwasie nukleinowym dla tego antagonisty albo przez syntezę peptydu. Do takich modyfikacji należą przykładowo delecje z i/lub insercje do i/lub substytucje reszt w sekwencjach aminokwasowych antagonisty. W celu dojścia do finalnej konstrukcji dokonuje się dowolnych kombinacji delecji, insercji i substytucji, pod warunkiem, ze uzyska się końcowa konstrukcję o żądanych właściwościach. Zmiany w aminokwasach mogą również zmieniać procesy post-translacyjne antagonisty, takie jak zmiany ilości i pozycji miejsc glikozylacji.

Użyteczną metodą identyfikacji pewnych reszt lub regionów antagonisty będących korzystnymi miejscami dla mutagenezy jest metoda zwana „mutageneza skanowana alaniną” opisana przez Cunningham'a i Wells'a [Science 244: 1081-1085 (1989)]. W metodzie tej, identyfikuje się resztę lub grupę reszt docelowych (np. reszty z ładunkiem elektrycznym, takie jak arg, asp, his, lys i glu) i zastępuje się je aminokwasem obojętnym lub z ładunkiem ujemnym (najkorzystniej alanina lub polialaniną) w celu wpływania na interakcję aminokwasów z antygenem. Te lokacje aminokwasów, które ujawniają funkcjonalna wrażliwość na substytucje, analizuje się drobiazgowo przez wprowadzenie dalszych lub innych wariantów w tych miejscach lub zamiast tych miejsc. Tak więc, chociaż miejsce wprowadzenia zmiany w sekwencji aminokwasowej jest z góry określone, to rodzaj mutacji jako takiej, nie musi być z góry przewidziany. Przykładowo, w celu zanalizowania jakości mutacji w danym miejscu, prowadzi się skanowanie alaniną lub mutagenezę losową w docelowym kodonie lub regionie i przesiewa się warianty antagonistów wytworzone w wyniku ekspresji na żądaną aktywność.

Insercje sekwencji aminokwasowej obejmują fuzje na końcu aminowym i/lub karboksylowym o długości od jednej reszty aminokwasowej do polipeptydu zawierającego sto lub więcej reszt a także insercje jednej lub wielu reszt aminokwasowych wewnątrz sekwencji. Przykładem insercji terminalnych jest antagonista z N-terminalną resztą metioniny lub antagonista sprzęgnięty z cytotoksycznym polipeptydem. Do innych wariantów insercyjnych cząsteczki antagonisty należy fuzja końca aminowego

PL 201 086 B1 lub karboksylowego antagonisty z enzymem albo polipeptydem zwiększającym okres półtrwania w surowicy tego antagonisty.

Innym typem wariantu jest wariant z substytucją aminokwasu. Warianty te mają co najmniej jedną resztę aminokwasową w cząsteczce antagonisty zamienioną na inną resztę. Miejscami będącymi obiektem największego zainteresowania dla mutagenezy antagonistów przeciwciał przez substytucję są regiony hiperzmienne ale przewiduje się również zmiany w regionach zrębowych. Substytucje konserwatywne są podane w tabeli 1 w kolumnie „substytucje preferowane”. Jeśli w wyniku takich substytucji następuje zmiana w aktywności biologicznej, wówczas można wprowadzić więcej istotnych zmian, nazwanych w tabeli 1 „substytucjami przykładowymi” albo opisanych w dalszej części opisu w odniesieniu do klas aminokwasów i dokonać skriningu powstał ych produktów.

T a b e l a 1

Oryginalna reszta aminokwasowa	Substytucje przykładowe	Substytucje preferowane
Ala (A)	val, leu, ile	Val
Arg (R)	lys, gln, asn	Lys
Asn(N)	gin, his, asp, lys, arg	Gln
Asp(D)	glu, asn	Glu
Cys(C)	ser, ala	Ser
Gln (Q)	asn, glu	Asn
Glu (E)	asp, gln	Asp
Gly (G)	ala	Ala
His (H)	asn, gln, lys, arg	Arg
Ile (I)	leu, val, met, ala, phe, nerleucyna	Leu
Leu (L)	norleucyna, ile, val, met, ala, phe	ile
Lys (K)	arg, gln, asn	arg
Met (M)	leu, phe, ile	leu
Phe (F)	leu, val, ile, ala, tyr	tyr
Pro (P)	Ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr, phe	tyr
Tyr (Y)	trp, phe, thr, ser	phe
Val (V)	ile, leu, met, phe, ala, norleucyna	leu

Zasadniczych modyfikacji we właściwościach biologicznych antagonisty dokonuje się przez selekcję substytucji, które znacząco się różnią pod względem wpływu na utrzymanie (a) struktury szkieletu polipeptydowego w obszarze substytucji, np. jako konformacji harmonijkowej albo helikalnej, (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki w docelowym miejscu albo (c) całego łańcucha bocznego. Reszty występujące w stanie naturalnym dzieli się na grupy w oparciu o wspólne właściwości łańcucha bocznego:

(1) hydrofobowe: norleucyna, met, ala, val, leu, ile, (2) obojętne hydrofilowe: cys, ser, thr, (3) kwasowe: asp, glu (4) zasadowe: asn, gln, his, lys, arg, (5) reszty wpływające na orientację łańcucha: gly, pro, i (6) aromatyczne: trp, tyr, phe.

Substytucje nie-konserwatywne będą dotyczyć wymiany przedstawiciela jednej z tych klas na inną klasę.

PL 201 086 B1

Reszta cysteinowa nie zaangażowana w utrzymywanie prawidłowej konformacji antagonisty może być również zastąpiona, na ogół seryną, w celu polepszenia stabilności oksydacyjnej cząsteczki i zapobieżenia nieprawidłowemu sieciowaniu. Odwrotnie, do cząsteczki antagonisty można dodać wiązanie (wiązania) cysteinowe w celu poprawy jej stabilności (szczególnie wówczas, gdy antagonista jest fragmentem przeciwciała, takim jak fragment Fv).

W szczególnie korzystnym typie wariantu substytucyjnego dokonuje się substytucji jednej lub większej ilości reszt w regionie hiperzmiennym przeciwciała macierzystego. W zasadzie, uzyskany wariant (warianty) wyselekcjonowany do dalszego rozwoju będzie miał ulepszone właściwości biologiczne w stosunku do przeciwciała macierzystego, z którego został otrzymany. Dogodną drogą generowania takich wariantów substytucyjnych jest „dojrzewanie powinowactwa” (affinity maturation) z użyciem obrazowania fagowego. Pokrótce, kilka miejsc w regionie hiperzmiennym (np. 6-7 miejsc) poddaje się mutacji generując wszystkie możliwe substytucje aminokwasowe w każdym miejscu. Powstałe w ten sposób warianty przeciwciała obrazuje się w sposób monowalencyjny, z cząstek fagów nitkowatych, jako fuzje do produktu genu III w M13, upakowane w każdej cząstce. Obrazowane techniką fagową warianty przesiewa się na aktywność biologiczną (np. na powinowactwo wiązania) co jest ujawnione w niniejszym opisie. W celu identyfikacji miejsc w regionie hiperzmiennym przeznaczonych do modyfikacji, można przeprowadzić mutagenezę ze skanowaniem alaniną, dla zidentyfikowania reszt w regionie hiperzmiennym, w dużym stopniu odpowiedzialnych za wiązanie antygenu. Alternatywnie lub dodatkowo, może być korzystne zanalizowanie struktury krystalicznej kompleksu: antygen-przeciwciało w celu identyfikacji punktów kontaktu pomiędzy przeciwciałem a antygenem. Takie reszty kontaktowe i reszty z nimi sąsiadujące są kandydatami do substytucji, zgodnie z technikami opracowanymi w niniejszym wynalazku. Po uzyskaniu takich wariantów, panel wariantów poddaje się przesiewowi w sposób podany w niniejszym opisie i przeciwciała o właściwościach ulepszonych w jednej lub w kilku odpowiednich próbach selekcjonuje się do dalszych prac rozwojowych.

Inny typ wariantu aminokwasowego antagonisty posiada zmiany we wzorach glikozylacji w stosunku do oryginalnego antagonisty. Pod pojęciem „zmiany” rozumie się delecję jednej lub większej ilości reszt węglowodanowych w cząsteczce antagonisty i/lub dodanie jednego lub większej ilości miejsc glikozylacji nie występujących w tym antagoniście.

Glikozylacja w polipeptydach ma na ogół charakter N-wiązań lub O-wiązań. N-wiązanie odnosi się do przyłączenia reszty węglowodanowej do łańcucha bocznego w reszcie asparaginy. Sekwencje trójpeptydowe: asparagina-X-seryna i asparagina-X-treonina, w których X oznacza dowolny aminokwas za wyjątkiem proliny, są sekwencjami rozpoznania dla przyłączenia enzymatycznego reszty węglowodanowej do łańcucha bocznego asparaginy. Tak więc, obecność jednej z tych sekwencji trójpeptydowych w polipeptydzie tworzy potencjalne miejsce glikozylacji. O-Glikozylacja odnosi się do przyłączenia jednego z cukrów, N-acetylogalaktozaminy, galaktozy bądź ksylozy do hydroksy-aminokwasu, najczęściej seryny lub treoniny, aczkolwiek można również użyć 5-hydroksyprolinę albo 5-hydroksylizynę.

Dodanie do cząsteczki antagonisty miejsc glikozylacji prowadzi się dogodnie przez zmianę sekwencji aminokwasowej , tak, aby zawierała jedną lub większą ilość opisanych powyżej sekwencji trójpeptydowych (dla miejsc glikozylacji przez N-wiązanie). Można również dokonywać zmiany przez dodanie lub substytucję jednej lub większej ilości reszt seryny lub treoniny w sekwencji oryginalnej cząsteczki antagonisty (dla miejsc glikozylacji przez O-wiązanie).

Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące warianty sekwencji aminokwasowej antagonisty wytwarza się wieloma sposobami znanymi w stanie techniki. Do takich sposobów należą (nie wyłącznie), izolowanie ze źródła naturalnego (w przypadku wariantów z naturalną sekwencją aminokwasową) lub otrzymywanie metodą mutagenezy sterowanej oligonukleotydem (lub sterowanej miejscem), mutagenezy z użyciem reakcji PGR bądź mutagenezy kasetowej wcześniej uzyskanej wersji wariantu lub niewariantu antagonisty.

Może być korzystna modyfikacja antagonisty według wynalazku pod względem jego funkcji efektorowej, np. w celu poprawy cytotoksyczności komórkowej zależnej od antygenu (ADCC) i/lub cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) tego antagonisty. Można to osiągnąć przez wprowadzenie jednej lub kilku substytucji aminokwasowych w regionie Fc antagonisty będącego przeciwciałem. Alternatywnie lub dodatkowo, w regionie Fc można wprowadzić resztę (reszty) cysteiny, umożliwiając utworzenie w tym regionie mostka dwusiarczkowego miedzy łańcuchami. Tak utworzone przeciwciało homodimeryczne może mieć poprawioną zdolność internalizacji i/lub właściwość zwiększonego zabijania komórki zależną od dopełniacza i cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciała (ADCC). Patrz: Caron i wsp., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) i Shopes B, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Homodimeryczne

PL 201 086 B1 przeciwciała o zwiększonej aktywności przeciw-nowotworowej można również uzyskać przez wykorzystanie heterodwufunkcyjnych łączników sieciujących opisanych przez Wolffa i wsp. [Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)]. Alternatywnie, techniką inżynierii można przygotować przeciwciało, które będzie miało podwójne regiony Fc i będzie dzięki temu wykazywać nasilone właściwości lityczne dopełniacza i właściwości cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał [Stevenson i wsp., AntiCancer Drug Design 3: 219-230 (1989)].

Dla wydłużenia czasu półtrwania antagonisty w surowicy, można do cząsteczki tego antagonisty (zwłaszcza do fragmentu przeciwciała), wbudować ratunkowy epitop wiążący receptor, co jest opisane, np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.739.277. Użyty w opisie termin „epitop ratunkowy wiążący receptor” oznacza epitop regionu Fc na cząsteczce IgG (np. IgG1, IgG2, IgG3 albo IgG4), który jest odpowiedzialny za wydłużanie czasu półtrwania cząsteczki IgG w surowicy in vivo.

IV. Preparaty farmaceutyczne

Preparaty lecznicze antagonistów stosowanych zgodnie z wynalazkiem przygotowuje się do przechowywania przez zmieszanie antagonisty o żądanym stopniu czystości z dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami, substancjami pomocniczymi lub stabilizatorami [Remington's Pharmaceutical Sciences XVI wydanie, Osol A. (1980)], w postaci preparatów liofilizowanych lub roztworów wodnych. Dopuszczalne nośniki, substancje pomocnicze lub stabilizatory są nietoksyczne dla biorcy w stosowanych dawkach i stężeniach i zawierają bufory, takie jak fosforan, cytrynian i inne kwasy organiczne, antyutleniacze, w tym kwas askorbinowy i metioninę, środki konserwujące (takie jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamoniowy, chlorek heksametonium, chlorek benzalkonium, chlorek benzetonium, fenol, alkohol butylowy lub benzylowy, alkiloparabeny, takie jak metyloparaben i propyloparaben, katechol, rezorcynol, cykloheksanol, 3-pentanol i m-krezol), polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej (poniżej około 10 reszt), białka, takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny, polimery hydrofilowe, takie jak poliwinylopirolidon, aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, arginina lub lizyna, monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany, w tym glukozę, mannozę lub dekstryny, środki chelatujące, takie jak EDTA, cukry, takie jak sacharozę, mannitol, trehalozę lub sorbitol, tworzące sole przeciw-jony, takie jak jon sodowy, kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko) i/lub niejonowe środki powierzchniowo-czynne, takie jak produkty o nazwach handlowych TWEEN™, PLURONIC™ lub glikol polietylenowy (PEG).

Przykładowe kompozycje przeciwciała anty-CD20 są opisane w publikacji zgłoszenia patentowego międzynarodowego, WO 98/56418, formalnie włączonej do niniejszego opisu jako odnośnik. W publikacji tej jest opisany ciekły, wielodawkowy preparat zawierający 40 mg/ml rituximabu, 25 mM octanu, 150 mM trehalozy, 0,9% alkoholu benzylowego, 0,02% polisorbatu 20 przy pH 5,0, posiadający okres ważności minimum 2 lata przy przechowywaniu w temperaturze 2-8°C. Inny, będący przedmiotem zainteresowania preparat anty-CD20 zawiera 10 mg/ml rituximabu w roztworze 9,0 mg/ml chlorku sodu, 7,35 mg/ml dwuwodzianu cytrynianu sodu, 0,7 mg/ml polisorbatu 80 i wodę sterylną do iniekcji o wartości pH 6,5.

Preparaty liofilizowane dostosowane do podawania podskórnego są opisane w publikacji zgłoszenia patentowego międzynarodowego, WO 97/04801. Takie liofilizowane preparaty można rekonstytuować odpowiednim rozcieńczalnikiem uzyskując roztwory o wysokim stężeniu białka i taki rekonstytuowany preparat można podawać leczonemu nim ssakowi podskórnie.

Preparat według wynalazku może również zawierać więcej niż jeden związek aktywny, jeśli jest to potrzebne dla konkretnego leczonego wskazania, korzystnie, może on zawierać związki o aktywności komplementarnej, takie, które nie działają na siebie wzajemnie niekorzystnie. Przykładowo, może być celowe dostarczenie środka cytotoksycznego, chemioterapeutycznego, cytokiny lub środka immunosupresyjnego (np. działającego na komórki T, takiego jak cyklosporyna lub przeciwciała wiążącego komórki T, np. takiego, które wiąże FLA-1). Efektywna ilość takich innych środków zależy od ilości antagonisty obecnego w preparacie, typu choroby lub zaburzenia bądź sposobu leczenia i innych, opisanych powyżej czynników. Stosuje się je w zasadzie w tych samych dawkach i tymi samymi drogami podawania jakie są opisane powyżej albo od około 1 do 99% stosowanych dawek.

Składniki aktywne mogą być również zamknięte w mikrokapsułkach wytworzonych np. technikami koacerwacji albo przez polimeryzację na granicy faz, np. w mikrokapsułkach odpowiednio hydroksymetylocelulozowych lub żelatynowych i z poli(metakrylanu metylu), w koloidalnych układach dostarczania leków (np. w liposomach, mikrosferach albuminowych, mikroemulsjach, nanoczastkach i nanokapsułkach) albo w makroemulsjach. Takie techniki są opisane w encyklopedii Remington's Pharmaceutical Sciences XVI wydanie, Osol A. (1980).

PL 201 086 B1

Można sporządzać preparaty o spowolnionym uwalnianiu. Przykłady stosownych preparatów o spowolnionym uwalnianiu obejmują półprzepuszczalne matryce stałych hydrofobowych polimerów zawierające antagonistę przy czym matryce te mają formę ukształtowanych wyrobów, np. błon lub mikrokapsułek. Przykłady matryc o spowolnionym uwalnianiu obejmują poliestry, hydrożele [np. poli(metakrylan 2-hydroksyetylowy)] albo poli(alkohol winylowy), polilaktydy opisane w patencie US 3.773.919, kopolimery kwasu L-glutaminowego z L-glutaminianem γ-etylowym, nie-degradowalne kopolimery etylenu z octanem winylu, degradowalne kopolimery kwasu mlekowego z kwasem glikolowym i kopolimery takie jak LUPRON DEPOT™ (mikrosfery do iniekcji na podstawie kopolimeru kwasu mlekowego z kwasem glikolowym zawierające octan leuprolidu) i kwas poli-D-(-)-3-hydroksymasłowy.

Preparaty przeznaczone do stosowania in vivo muszą być sterylne. Sterylizuje się je przez filtracje przez membrany do filtracji sterylnej.

V. Leczenie antagonistą

Antagonista, który wiąże się z CD20, może być użyty do blokowania odpowiedzi immunologicznej na obcy antygen u ssaka (korzystnie człowieka), który nie cierpi na chorobę złośliwą. Korzystnie, antagonistą jest przeciwciało przeciw CD-20. W jednym rozwiązaniu, przeciwciało to nie jest skoniugowane ze środkiem cytotoksycznym, w innym rozwiązaniu, przeciwciało jest skoniugowane ze środkiem cytotoksycznym (np. z Y2B8 albo ¹³¹J-B1).

Ssak leczony zgodnie z wynalazkiem może być eksponowany zarówno na antagonistę, który wiąże się z CD20 jak i na następny, inny środek leczniczy, który to środek leczniczy jest immunogenny dla tego ssaka. W tym rozwiązaniu, antagonista może blokować odpowiedź immunologiczną na ten środek leczniczy u leczonego nim ssaka. Korzystne leczniczo może być również blokowanie usuwania komórek powleczonych przeciwciałem przez śledzionę. Środek leczniczy podaje się ssakowi w ilości skutecznej w leczeniu choroby lub zaburzenia, które może być z powodzeniem leczone tym środkiem. W tym rozwiązaniu, można podać ssakowi dany środek leczniczy i antagonistę w zasadzie jednocześnie albo oddzielnie w dowolnej kolejności. Tak więc, antagonistę można podać ssakowi przed podaniem środka leczniczego albo środek leczniczy można podać ssakowi przed podaniem antagonisty.

Antagonista, który wiąże się z CD20 może być zatem użyty do leczenia reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi albo reakcji gospodarza przeciw przeszczepowi u ssaka i/lub do odczulenia ssaka oczekującego na transplantacje.

Do celów różnych zastosowań ujawnionych w opisie, kompozycja zawierająca antagonistę, który wiąże się z CD20 będzie przygotowana w postaci preparatu, dawkowana i podawana w sposób zgodny z dobrą praktyką medyczną. Czynniki, które należy rozważyć w tym kontekście obejmują konkretną chorobę lub stan patologiczny, który ma być leczony, konkretnego ssaka, który ma być leczony, stan kliniczny danego pacjenta, przyczynę choroby lub stanu, miejsce dostarczenia środka, sposób stosowania, schemat stosowania i inne czynniki znane w praktyce leczniczej. Skuteczną leczniczo dawkę antagonisty, która ma być podana określa się w oparciu o rozpatrzenie powyższych czynników.

W ogólnym założeniu, skuteczną leczniczo ilością antagonisty podawanego parenteralnie na jedną dawkę będzie ilość w zakresie od około 0,1 do 20 mg/kg masy ciała pacjenta dziennie a typową dawką początkową antagonisty będzie ilość w zakresie od około 2 do 10 mg/kg.

Korzystnym antagonistą jest przeciwciało takie jak RITUXAN®, który nie jest skoniugowany ze środkiem cytotoksycznym. Dawkami odpowiednimi dla nieskoniugowanego przeciwciała są np. dawki w zakresie od około 20 mg/m² do około 1000 mg/m². W jednym z rozwiązań, dawkowanie przeciwciała różni się od obecnie zalecanego dla RITUXAN'u®. Przykładowo, można podać pacjentowi jedną lub większą ilość dawek znacznie niższych od 375 mg/m², np. dawkę zawierającą się w zakresie od około 20 mg/m² do około 250 mg/m², np. od około 50 mg/m² do około 200 mg/m².

Poza tym, można podać jedną lub większą ilość dawek początkowych przeciwciała i następnie jedną lub większą ilość następnych dawek, przy czym dawka w mg/m² przeciwciała zawartego w dawce następnej przewyższy dawkę w mg/m przeciwciała w dawce początkowej. Przykładowo, dawka początkową może się zawierać w zakresie od około 20 mg/m² do około 250 mg/m² (np. od około 50 mg/m² do około 200 mg/m²) a następna dawka będzie się mieścić w zakresie od około 250 mg/m² do około 1000 mg/m².

Jednakże, jak wspomniano powyżej, zalecane w opisie ilości antagonisty podlegają w znacznym stopniu osądowi lekarskiemu. Kluczowym czynnikiem w doborze odpowiedniej dawki i schematu stosowania jest uzyskany rezultat, co opisano powyżej. Przykładowo, mogą być potrzebne stosunkowo wysokie dawki początkowe do leczenia chorób nowo pojawiających się i ostrych. Dla uzyskania jak największej skuteczności, zależnie od rodzaju choroby lub stanu, antagonistę podaje się tak szybko

PL 201 086 B1 jak to tylko możliwe, po pierwszym sygnale choroby, zdiagnozowaniu, pojawieniu się lub wystąpieniu choroby lub stanu bądź podczas remisji choroby lub stanu.

Antagonistę podaje się w dowolny, dogodny sposób, obejmujący drogę parenteralną, podskórną, dootrzewnową, dopłucną i donosową i jeśli to jest zalecane, w miejscowym leczeniu immunosupresyjnym, stosuje się go bezpośrednio do miejsca uszkodzenia. Infuzje parenteralne obejmują stosowanie domięśniowe, dożylne, dotętnicze, dootrzewnowe lub podskórne. Poza tym, antagonistę można dogodnie podawać metodą infuzji pulsaflcyjnych, np., z malejącymi dawkami antagonisty. Korzystną drogą dawkowania jest podawanie iniekcji, najkorzystniej dożylnych lub podskórnych, po części zależnie od tego, czy kuracja jest krótka czy przewlekła.

Łącznie z antagonistą można stosować inne związki, takie jak środki cytotoksyczne, chemioterapeutyczne, immunosupresyjne i/lub cytokiny. To połączone stosowanie obejmuje stosowanie wspólne, użycie oddzielnych postaci farmaceutycznych lub jednej postaci farmaceutycznej i kolejne stosowanie, w dowolnym porządku, korzystnie w odstępie czasu, gdyż obydwa (lub wszystkie) składniki aktywne jednocześnie wywierają swe własne działanie biologiczne.

Oprócz stosowania u pacjenta antagonistów białkowych, niniejszy wynalazek obejmuje stosowanie antagonistów w ramach terapii genowej. Takie podawanie kwasu nukleinowego kodującego antagonistę jest objęte terminem: „stosowanie skutecznej leczniczo ilości antagonisty” (patrz. np. publikacja opisu patentowego WO 96/07321 z 14 marca 1996, dotyczącego zastosowania terapii genowej do generowania przeciwciał wewnątrzkomórkowych).

Istnieją dwa główne podejścia zmierzające do dostarczenia kwasu nukleinowego (ewentualnie zawartego w wektorze) do komórek pacjenta in vivo i ex vivo. W sposobie dostarczania in vivo, wstrzykuje się kwas nukleinowy bezpośrednio pacjentowi, zwykle w miejscu, gdzie jest potrzebny antagonista. W sposobie leczenia ex vivo, pobiera się komórki od pacjenta, do tych izolowanych komórek wprowadza się kwas nukleinowy i zmodyfikowane komórki podaje się pacjentowi, albo bezpośrednio albo np. zakapsułkowane w porowatych błonach, które implantuje się temu pacjentowi (patrz: opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 4.892.538 i US 5.283.187). Dostępnych jest wiele różnych technik wprowadzania kwasów nukleinowych do żywych komórek. Techniki te różnią się, zależnie od tego, czy kwas nukleinowy jest przenoszony do hodowli komórkowych in vitro, czy do komórek żądanego gospodarza, in vivo. Technikami użytecznymi do przenoszenia kwasu nukleinowego do komórek ssaków in vitro są techniki oparte na użyciu liposomów, elektroporacji, mikroiniekcji, fuzji komórek, DEAE-dekstranu, technika precypitacji fosforanem wapnia i podobne. Wektorem powszechnie stosowanym do dostarczenia genu ex vivo jest retrowirus.

Preferowane obecnie techniki przeniesienia kwasu nukleinowego in vivo polegają na transfekcji wektorami wirusowymi (takimi jak adenowirus, wirus Herpes simplex I albo wirus spokrewniony z adenowirusem oraz układy oparte na lipidach (lipidami użytecznymi do przeniesienia genu z udziałem lipidów są np. DOTMA, DOPE i DC-Chol). W niektórych sytuacjach pożądane jest dostarczenie źródła kwasu nukleinowego za pomocą czynnika, który dociera do komórek docelowych, takiego jak przeciwciało swoiste dla białka błonowego na powierzchni komórki albo komórki docelowej albo ligand dla receptora na komórce docelowej lub podobnego. Jeśli stosuje się liposomy, można użyć białka wiążące się z białkiem błonowym na powierzchni komórki biorącym udział w endocytozie, w celu osiągnięcia miejsca docelowego i/lub ułatwienia poboru, np. białek kapsydowych lub ich fragmentów dążących do danego typu komórek, przeciwciał przeciw białkom, które podlegają internalizacji w cyklu rozwojowym i białek, które docierają do swego miejsca wewnątrz komórki i zwiększają wewnątrzkomórkowy okres półtrwania. Technika endocytozy za pośrednictwem receptora jest opisana np. przez Wu i wsp. w J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) i Wagnera i wsp., w Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990). Przeglądu obecnie znanych protokółów znakowania genów i terapii genowej dokonał Anderson i wsp., Science 256:808-813 (1992). Patrz również publikacja opisu patentowego WO 93/25673 i cytowane tam odnośniki.

VI. Wyroby przemysłowe

W innym rozwiązaniu, przedmiotem wynalazku jest wyrób przemysł owy zawierają cy materiał y użyteczne do leczenia chorób lub stanów opisanych powyżej. W skład takiego wyrobu przemysłowego wchodzą: pojemnik i oznakowanie albo wkładka umieszczona na lub połączona z opakowaniem. Do odpowiednich opakowań należą np. butelki, fiolki, strzykawki i podobne. Pojemniki mogą być uformowane z wielu różnych materiałów, takich jak szkło lub plastik. Pojemnik utrzymuje lub zawiera kompozycję, która jest skuteczna w leczeniu wybranej choroby lub stanu i może być wyposażony w sterylny port dostępu (np. pojemnik może być workiem z roztworem dożylnym albo fiolką posiadającą korek

PL 201 086 B1 przebijany igłą do iniekcji podskórnych). Co najmniej jeden składnik aktywny w kompozycji jest antagonistą, który wiąże się z CD20. Oznakowanie albo wkładka do opakowania poucza, że kompozycję stosuje się do blokowania odpowiedzi immunologicznej na obcy antygen i/lub do leczenia różnych chorób lub stanów opisanych w niniejszym opisie. Wyrób przemysłowy może ponadto zawierać drugi pojemnik, w którym znajduje się dopuszczalny farmaceutycznie bufor rozcieńczający, taki jak bakteriostatyczna woda do iniekcji (BWFI), buforowana fosforanem sól fizjologiczna, roztwór Ringera i roztwór dekstrozy. W jednym z rozwiązań, ten drugi pojemnik utrzymuje lub zawiera kompozycję, przy czym składnikiem aktywnym w tej kompozycji jest środek leczniczy. W tym rozwiązaniu według wynalazku, wkładka do opakowania może pouczać, że pacjent ma być leczony obydwiema kompozycjami. Wyrób przemyślowy może poza tym zawierać inne materiały pożądane z punktu widzenia handlowego i wygody użytkownika, do których to materiałów należą inne bufory, rozcieńczalniki, filtry, igły i strzykawki.

Dalsze szczegóły wynalazku są opisane w poniższych nieograniczających przykładach. Ujawnienia zawarte we wszystkich cytowaniach do niniejszego opisu są formalnie włączone do opisu jako odnośniki.

P r z y k ł a d 1. Blokowanie odpowiedzi immunologicznej na białko lecznicze

W niniejszym przykładzie, przeciwciało anty-CD20 jest użyte do blokowania odpowiedzi immunologicznej na białko lecznicze: czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów (MGDF), zwany również trombopoetyną albo ligandem Mpl). Konkretnie, są doniesienia, że pegylowana forma rekombinacyjnego, ludzkiego MGDF (PEG-rHuMGDF) wywołuje produkcję neutralizujących przeciwciał u pacjentów z rakiem i u dawców płytek krwi. Podanie przeciwciała anty-CD20, jak ujawniono w niniejszym opisie, złagodzi odpowiedź immunologiczną, zwłaszcza odpowiedź humoralną, skierowaną przeciwko PEG-rHuMGDF.

PEG-rHuMGDF wytwarza się w sposób podany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.795.569 wydanym 18 sierpnia 1998 r, formalnie włączonym do niniejszego zgłoszenia jako odnośnik. PEG-rHuMGDF składa się z aminokwasów 1-163 (numeracja od początku dojrzałego białka) ludzkiego, uzyskanego w E. coli, MGDF i jednego łańcucha glikolu polietylenowego (PEG) przyłączonego do grupy α-aminowej przy N-końcu tego polipeptydu.

MGDF podaje się pacjentom cierpiącym na trombocytopenię, np. będącą następstwem chemioterapii albo radioterapii, w dawkach stosowanych do zwiększenia liczby płytek krwi u tych pacjentów, np. w zakresie od 0,1 do 1000 mikrogramów MGDF na kilogram masy ciała. Terapię za pomocą MGDF łączy się ewentualnie z podawaniem jednej lub większej ilości dodatkowych cytokin, takich jak erytropoetyna (EPO), interleukina-3 (IL-3) i czynnik stymulujący kolonie granulocytów i megakariocytów (GM-CSF).

Miana przeciwciał anty-MGDF u pacjenta tak leczonego monitoruje się wykonując stosowną próbę, taką jak test immunoenzymatyczny na miano przeciwciała (ELISA). Pacjenci, u których stwierdzono niskie miano odpowiedzi immunologicznej na MGDF są kandydatami do leczenia przeciwciałem anty-CD20, takim jak RITUXAN®. Przeciwciało anty-CD20 można podawać następnie po podaniu, jednocześnie lub po dalszym leczeniu za pomocą MGDF. Odpowiednią dawką przeciwciała antyCD20 jest dawka 375 mg/m² w postaci czterech cotygodniowych infuzji. Można jednak podać mniejsze dawki, np. w zakresie od około 50 do około 250 mg/m². Podanie pacjentowi przeciwciała antyCD20 zapobiegnie lub zmniejszy do akceptowanego poziomu powstawanie przeciwciał anty-MGDF u pacjentów leczonych zarówno MGDF jak i przeciwciałem anty-CD20, jak podano powyżej. Tak więc, w przypadku leku białkowego o wielkiej wartości leczniczej i znanej immunogeniczności, dodatkowe podanie przeciwciała anty-CD20 opisanego powyżej będzie leczyć immunogenne działania niepożądane związane z podaniem pacjentowi tego leku białkowego .

P r z y k ła d 2. Blokowanie odpowiedzi immunologicznej na terapię genową w wektorze wirusowym

Rekombinacyjne adenowirusy z delecją E1, E3 i z brakiem replikacji oceniano na zdolności przenoszenia leczniczych genów in vivo. Opracowano nowe wektory z dodatkowymi delecjami w regionach E2a albo E4 [Christ i wsp., Immunol. Let. 57: 19-25 (1997)]. Pomimo delecji tych regionów wirusowych, występuje ekspresja na niewielkim poziomie wczesnych i późnych genów wirusowych in vivo. Produkcja przeciwciał antyadenowirusowych, odpowiedź immunologiczna komórkowa a także wczesne, nieswoiste oczyszczanie z wektorów, stanowią bariery dla powodzenia terapii genowej. W celu zahamowania lub zmniejszenia do akceptowanego poziomu produkcji neutralizujących przeciwciał przeciw adenowirusom, pacjentowi poddawanemu terapii genowej podaje się przeciwciało anty-CD20 (np. RITUXAN®), jak to jest podane w niniejszym opisie.

PL 201 086 B1

Przykładowo, pacjentów z mukowiscydozą leczy się adenowirusem z brakiem replikacji, wytwarzającym regulator przewodzenia transbłonowego ludzkiej mukowiscydozy (CFTR) [Bellon i wsp., Human Gene Therapy 8: 15-25 (1997)]. Dla uzyskania ekspresji genu CFTR w płucach, pacjentom podaje się odpowiednie dawki wektora terapii genowej CFTR (wyrażane w jednostkach tworzących łysinki wirusowe, pfu) drogą aerozolową (np. od około 10⁷ do około 10⁹ pfu). Przeciwciała przeciw adenowirusowi u pacjenta można wykryć w próbie ELISA, w próbie immunofluorescencji i/lub w próbie wiązania dopełniacza. Tym pacjentom, u których wykrywa się przeciwciała przeciw adenowirusowi podaje się przeciwciało anty-CD20, np. chimerowe 2H7 ((opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.677.180), ewentualnie w połączeniu z innymi lekami immunosupresyjnymi (np. z cyklofosfamidem, związkiem FK506 albo z przeciwciałami monoklonalnymi, które blokują albo receptor na komórce T albo szlaki ko-stymulacji), przed terapią wektorem genu, jednocześnie albo po powtórnym podaniu wektora genu. Odpowiednią dawką przeciwciała anty-CD20 jest dawka 375 mg/m² w postaci czterech cotygodniowych infuzji. Podanie pacjentowi przeciwciała anty-CD20 zmniejszy lub wyeliminuje odpowiedź immunologiczną u pacjentów (np. przez zmniejszenie produkcji przeciwciał antyadenowirusowych) i dzięki temu zwiększy powodzenie powtórzeń terapii genowej.

P r z y k ł a d 3. Blokowanie odpowiedzi immunologicznej na prze-szczep

Przeciwciało anty-CD20 jest stosowane jako część złożonego schematu immunosupresyjnego w ramach profilaktyki ostrego odrzutu. W tym zestawie, przeciwciało anty-CD20 takie jak RITUXAN®, stosuje się w okresie okołoprzeszczepowym, jako część sekwencyjnego, złożonego reżimu, obejmującego środki ukierunkowane na komórki T, takie jak cyklosporynę, kortikosteroidy, mykofenolat mofetilu, z dodatkiem lub bez dodatku przeciwciała przeciw receptorowi IL-2. Tak więc, przeciwciało antyCD20 mogłoby być rozważane jako część reżimu indukcji, do stosowania w połączeniu z ciągłą terapią immunosupresyjną. Przeciwciało anty-CD20 może się przyczyniać do zapobiegania odpowiedzi w postaci odrzutu allogenicznego przez hamowanie wytwarzania alloprzeciwciała i/lub wpływanie na prezentację alloantygenu drogą usuwania komórek prezentujących antygen.

W schemacie leczenia można stosować cztery cotygodniowe infuzje (375 mg/m²) RITUXAN'u podawanego przed lub w okresie około transplantacyjnym. Odpowiednimi dawkami dalszych środków immunosupressyjnych są dawki następujące: cyklosporyna (5 mg/kg/dzień), kortikosteroidy (1 mg/kg, i stopniowe zmniejszanie), mykofenolat mofetilu (1 g 2 razy dziennie) i przeciwciało przeciw receptorowi IL-2 (1 mg/kg, pięć infuzji podanych co tydzień). Przeciwciało anty-CD20 można również łączyć z innymi lekami indukującymi immunosupresję, takimi jak poliklonalne przeciwciała anty-limfocytowe lub monoklonalne przeciwciała anty-CD3, z podtrzymującymi lekami immunosupresyjnymi, takimi jak inhibitory kalcyneuryny (np. tacrolimus) i środkami antyproliferacyjnymi (takimi jak azatiopryna, leflunomid lub sirolimus), można też stosować schematy leczenia złożonego obejmujące blokadę kostymulacji komórek T, blokadę cząsteczek adhezyjnych na komórkach T z blokady pomocniczych cząsteczek komórek T.

Oprócz profilaktyki ostrego odrzutu, przeciwciała anty-CD20 mogą być stosowane do leczenia ostrego odrzutu. Odpowiednie dawki anty-CD20 są podane powyżej. W leczeniu ostrego odrzutu, przeciwciało anty-CD20 łączy się ewentualnie z przeciwciałem monoklonalnym anty-CD3 i/lub kortikosteroidami.

Przeciwciała anty-CD20 można również stosować (a) po pewnym czasie w okresie post-transplantacyjnym, jako jedyne leki albo w połączeniu innymi środkami immunosupresyjnymi i/lub blokadą kostymulacji, do leczenia lub profilaktyki „uporczywego” odrzutu przeszczepu allogenicznego, (b) jako część składową schematu indukowania tolerancji albo (c) w przygotowaniu do heteroprzeszczepu.

P r z y k ł a d 4. Blokowanie odpowiedzi immunologicznej na czynnik krzepnięcia krwi

Pacjent z dziedzicznym niedoborem czynnika VIII otrzymuje wielokrotne transfuzje preparatu czynnika VIII i rozwinęły się u niego wysokie miana przeciwciał przeciw czynnikowi VIII. Przeciwciało anty-CD20, takie jak RITUXAN® podaje się takiemu pacjentowi z przeciwciałami przeciw czynnikowi VIII, np. w dawkach takich jak podano powyżej. Przeciwciało anty-CD20 może blokować odpowiedź immunologiczną na czynnik VIII przez wpływanie na produkcję przeciwciał przeciw niemu albo drogą innych mechanizmów, takich jak supresja idiotypowa.

P r z y k ł a d 5. Blokowanie odpowiedzi immunologicznej na płytki krwi

Pacjent otrzymuje wielokrotne transfuzje płytek krwi i wytwarza allo-przeciwciała przeciw płytkom. Terapia steroidowa u tego pacjenta nie powiodła się i może on być leczony w inny sposób (np. cyklosporyną, przez oczyszczanie krwi na kolumnie z białkiem A ze Staphyllococcus lub podobny). Przeciwciało anty-CD20 (np. RITUXAN®) podaje się temu pacjentowi w dawkach np. takich jak podano

PL 201 086 B1 powyżej. Przeciwciało anty-CD20 może blokować lub łagodzić odpowiedź immunologiczną przez wpływanie na produkcję przeciwciał lub z wykorzystaniem innych mechanizmów, takich jak supresja idiotypowa lub hamowanie usuwania powleczonych płytek przez śledzionę.

Claims (30)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie przeciwciała wiążącego się z antygenem CD20 na ludzkich limfocytach B do wytwarzania leku do podawania dożylnego w ilości skutecznej terapeutycznie do blokowania odpowiedzi immunologicznej na przeszczep u człowieka który nie cierpi z powodu złośliwości choroby, przy czym przeciwciało to zmniejsza poziomy krążących komórek B wyrażających antygen CD20 u człowieka dla blokowania wspomnianej odpowiedzi immunologicznej.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało nie jest skoniugowane ze środkiem cytotoksycznym.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało zawiera rituksimab.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest skoniugowane ze środkiem cytotoksycznym.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że środek cytotoksyczny jest związkiem radioaktywnym.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest podawany w dawce przeciwciała mniejszej niż 375 mg/m².
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest podawany w dawce przeciwciała 20 mg/m² do 1000 mg/m².
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest podawany w dawce przeciwciała 20 mg/m² do 250 mg/m².
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że lek jest podawany w dawce przeciwciała 50 mg/m² do 200 mg/m².
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest podawany co najmniej w dwóch dawkach przy czym dawka przeciwciała w mg/m² następnej dawki przekracza dawkę w mg/m² przeciwciała dawki początkowej.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest do podawania człowiekowi przed poddaniem człowieka przeszczepowi.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest ludzkim przeciwciałem.
13. 13. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym.
14. 14. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest humanizowanym przeciwciałem.
15. 15. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeszczep jest przeszczepem allogenicznym.
16. 16. Zastosowanie przeciwciała wiążącego się z antygenem CD20 na ludzkich limfocytach B do wytwarzania leku do podawania dożylnego w ilości skutecznej terapeutycznie do leczenia choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi lub gospodarz przeciwko przeszczepowi u człowieka nie cierpiącego na złośliwą chorobę, przy czym przeciwciało zmniejsza poziomy krążących komórek B wyrażających antygen C20 u człowieka do leczenia wspomnianych chorób.
17. 17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że przeciwciało jest ludzkim przeciwciałem.
18. 18. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym.
19. 19. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że przeciwciało jest humanizowanym przeciwciałem.
20. 20. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że przeciwciało zawiera rituksimab.
21. 21. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że lek jest podawany w dawce przeciwciała mniejszej niż 375 mg/m².
22. 22. Zastosowanie według zastrz. 1-21, znamienne tym, że lek jest do podawania z kortykosteroidem.
23. 23. Zastosowanie według zastrz. 1-21, znamienne tym, że lek i kortykosteroid są do podawania z jednym lub więcej dodatkowych czynników immunosupresyjnych.

    PL 201 086 B1
24. 24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że przeciwciało zawiera rituksimab i dodatkowy czynnik immunosupresyjny zawiera mykofenolan mofetilu.
25. 25. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że dodatkowe czynniki immunosupresyjne zawierają mykofenolan mofetilu i inhibitor kalcyneryny.
26. 26. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że inhibitor kalcyneuryny zawiera takrolimus.
27. 27. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że jeden lub więcej dodatkowy(ch) czynnik(ów) immunosupresyjny(ch) jest/są wybrane(ych) z grupy obejmującej cyklosporynę, kortykosteroid, mykofenolan mofetilu, przeciwciało przeciwko receptorowi IL-2, przeciwciało przeciwko limfocytom, przeciwciało przeciwko CD3, inhibitor kalcyneuryny, i/lub czynnik antyproliferacyjny.
28. 28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że czynnik inhibitora kalcyneuryny zawiera takrolimus.
29. 29. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że czynnik antyproliferacyjny zawiera sirolimus.
30. 30. Zastosowanie przeciwciała wiążącego się z antygenem CD20 na ludzkich limfocytach B do wytwarzania leku do podawania dożylnego w ilości terapeutycznie skutecznej do odczulania ssaka oczekującego na przeszczep.