CN104918634A - 用于组合疫苗的非交联无细胞百日咳抗原 - Google Patents

用于组合疫苗的非交联无细胞百日咳抗原 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含无细胞百日咳抗原的稳定组合物，所述无细胞百日咳抗原没有用交联试剂例如甲醛或戊二醛进行交联，以及它们在组合疫苗中作为无细胞百日咳组分的用途。还公开了用于制备这些抗原和组合物的方法。

Description

用于组合疫苗的非交联无细胞百日咳抗原
本申请要求2012年10月12日提交的美国临时专利申请61/713,356的利益，为所有目的将其全部内容通过引用的方式合并入本文。
发明领域
本发明涉及包含无细胞百日咳抗原的稳定组合物，所述无细胞百日咳抗原没有用交联试剂例如甲醛或戊二醛进行交联，以及它们在组合疫苗中作为无细胞百日咳组分的用途。
背景
百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)引起百日咳。疫苗中的百日咳抗原或者是细胞的(全细胞，以灭活的百日咳博德特氏菌细胞的形式；“wP”)，或者是无细胞的(“aP”)。细胞百日咳抗原的制备有详细记载(例如，参见参考文献1的第21章)，例如可以通过对百日咳博德特氏菌的I阶段培养物的加热灭活获得。无细胞百日咳抗原包含脱毒的百日咳毒素(百日咳类毒素，或“PT”)；(2)丝状血凝素(“FHA”)；和(3)百日咳杆菌粘附素(也被称为“69KD外膜蛋白”)。通常通过从在改良的Stainer-Scholte液体培养基中生长的百日咳博德特氏菌培养物中进行分离来制备这三种抗原。一些百日咳疫苗中另外包括百日咳博德特氏菌菌毛(例如凝集原2和3)。
PT和FHA可以从发酵液中分离 (例如通过羟基磷石灰凝胶吸附)，而百日咳杆菌粘附素可以通过加热处理和絮凝(例如使用氯化钡)从细胞中提取。然后在连续的层析和/或沉淀步骤中纯化抗原。可以通过疏水层析、亲和层析和尺寸排阻层析纯化PT和FHA。可以通过离子交换层析、疏水层析和尺寸排阻层析纯化百日咳杆菌粘附素。
在将FHA和百日咳杆菌粘附素加入到疫苗制剂之前通常用甲醛作为交联剂对其进行处理。通常通过用交联剂例如甲醛或戊二醛处理来对PT进行脱毒。作为这种化学脱毒程序的一种替代选择，可以通过酶活性所必需的并且由此负责抗原毒性的氨基酸的取代来对PT进行基因脱毒[2]。但是，基因脱毒的PT可能是不稳定的，且当以液体形式储存时易于降解[3]，因此用低浓度的甲醛处理来使蛋白质稳定，而不影响其物理化学和免疫学指标[4]。
抗原与交联剂例如甲醛或戊二醛的交联是附加的处理步骤，其增加了制备疫苗相关的成本，并在整个生产方法中引入了附加变量。但是，安全考虑，特别是当从同一个百日咳博德特氏菌培养物中分离FHA和百日咳杆菌粘附素作为酶活性PT时，导致采纳这样的制备方法：在加入疫苗之前将所有百日咳博德特氏菌抗原组分灭活，优选通过甲醛处理来灭活。此外，认为甲醛处理有益于增加液体疫苗制剂中各个单个百日咳博德特氏菌抗原的稳定性。
现已发现，从携带有基因脱毒PT的编码基因的百日咳博德特氏菌菌株充分纯化基因脱毒的PT和其它百日咳博德特氏菌抗原，使得不需要对PT和其它百日咳博德特氏菌抗原进行化学交联。单独纯化的组分甚至在升高的温度下进行长期储存后(在37℃至少一个月)还保持稳定性和免疫原性，而无需用甲醛或其它交联剂进行处理。
发明简述
本发明提供安全的和具有免疫原性的疫苗组合物，其不再需要用交联剂处理百日咳博德特氏菌抗原。本发明的疫苗制剂可与包含无细胞百日咳组分的标准组合疫苗以相同的方式储存，而不会由于储存期间的抗原降解而导致丧失效力。具体而言，本发明涉及疫苗组合物，其包含至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。
本发明还涉及组合疫苗，其包含基因脱毒的百日咳毒素和一种或多种选自IPV、HBsAg和Hib的其它抗原，其特征在于基因脱毒的百日咳毒素未用交联剂进行处理。
在另一个实施方案中，本发明涉及组合疫苗，其包含百日咳博德特氏菌抗原PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，其特征在于至少两种百日咳博德特氏菌抗原未用交联剂进行处理，条件是，如果PT未用交联剂处理，则PT是基因脱毒的百日咳毒素。
在另一个实施方案中，本发明涉及组合疫苗，其包含铝盐佐剂和至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。Al+++浓度优选低于1 mg/ml。本发明的组合疫苗可以进一步包括一种或两种Toll样受体(TLR)激动剂，其可以被吸附至铝盐佐剂。例如，本发明的组合疫苗可以包括TLR4激动剂(例如3d-MPL)或TLR7激动剂(例如化合物T，见下文)，其通常被吸附至铝盐佐剂。
在另一个方面，本发明涉及组合疫苗，其包含水包油乳液佐剂和至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。本发明的组合疫苗中使用的水包油乳液佐剂包括MF59和/或AS03。
在一个实施方案中，本发明涉及不含防腐剂的组合疫苗，其包含至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何未交联的PT均是基因脱毒的。
在另一个实施方案中，本发明涉及组合疫苗，其包含至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的，其中PT:FHA:百日咳杆菌粘附素的重量比为1:1:2或16:16:5或5:10:6或20:20:3或25:25:8或10:5:3。
在另一个实施方案中，本发明涉及组合疫苗，其包含D、T、aP，其中按Lf单位测量的D对T的比例在2:1和3:1之间，并且aP组分包含至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。
在另一个实施方案中，本发明涉及组合疫苗，其包含D、T、aP，其中按Lf单位测量的T对D的比例大于1.5，并且aP组分包含至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。
在优选的实施方案中，本发明的组合疫苗包括基因脱毒的百日咳杆菌粘附素例如PT-9K/129G。
本发明进一步涉及用于制备aP组分的方法，其包括培养表达基因脱毒PT的百日咳博德特氏菌菌株的培养物，从培养物纯化两种或更多种百日咳博德特氏菌抗原以获得两批次产物或更多批次产物，每一批次产物各含有不同的纯化百日咳博德特氏菌抗原，以及将两批次产物或更多批次产物混合以制备aP组分，其中所述方法的特征在于纯化的百日咳博德特氏菌未用交联剂进行处理。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于制备aP组分的方法，其包括培养已删除了PT编码基因的百日咳博德特氏菌菌株的培养物，从培养物纯化两种或更多种百日咳博德特氏菌抗原以获得两批次产物或更多批次产物，每一批次产物各含有不同的纯化的百日咳博德特氏菌抗原，以及将两批次产物或更多批次产物混合以制备aP组分，其中所述方法的特征在于纯化的百日咳博德特氏菌未用交联剂进行处理。
发明详述
百日咳毒素
百日咳毒素是由5个亚基构成的105 KD蛋白，命名为S1至S5。仅有S1亚基具有酶活性并对真核细胞具有毒性效果。亚基S2、S3、S4和S5以1:1:2:1的比例存在，并形成无毒的低聚物(B寡聚物)，其结合真核细胞表面上的受体，并将有毒性的亚基S1递送穿过真核细胞膜。通过替换百日咳博德特氏菌菌株中S1亚基的酶活性所必需的氨基酸的密码子，可以获得产生基因脱毒PT的百日咳博德特氏菌菌株。
通过取代突变鉴别了百日咳毒素的两个区域，这两个区域与霍乱毒素(CT)和大肠杆菌不耐热毒素(LT)的氨基酸序列共享序列同源性，并且对PT的ADP-核糖基转移酶活性有贡献。第一个区域位于残基8和13之间。特别地，发现Arg-9被Lys-9取代的突变体S1具有大大降低的毒性[5]。S1的第二个区域，位于残基51和59之间，也显示出参与百日咳毒素的酶活性，例如当Arg-58变为Glu-58时[6]。使用放射标记的NAD通过光交联实验发现S1亚基的位置129上的谷氨酸残基是酶催化位点的一部分[7]。残基129的取代产生的PT突变体酶活性大幅降低并由此具有非常低的毒性。还可以通过突变Trp-26、His-35和Cys-41对百日咳毒素进行脱毒[6]。
S1的单突变导致百日咳毒素的毒性和酶活性降低多达1000倍，而在S1亚基中具有多个取代的突变体(Lys-9 Gly-129, Glu-58 Gly-129，和Lys-9 Glu-58 Gly-129)是大约106-倍脱毒的[6]。
根据本发明，优选的百日咳毒素突变形式具有降低的或无法检测到的毒性，但是保留了诱导保护性免疫的能力。这些包括S1双突变体PT-9K/129G、PT-13L/129G、和PT-26I/129G。优选地，基因脱毒的PT是PT-9K/129G，即在残基9上是赖氨酸并且在残基129上是甘氨酸，如参考文献8所述。
疫苗组合物
本发明涉及疫苗组合物，其包含至少两种百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，所述抗原未用交联剂进行处理，条件是任何PT均是基因脱毒的。蛋白质抗原与交联剂例如甲醛或戊二醛的广泛交联可以干扰抗原呈递细胞对抗原的裂解，或者干扰通常与天然状态存在的抗原相关的结构柔性。例如，甲醛处理导致百日咳博德特氏菌抗原中氨基酸(主要是赖氨酸)的改变，并由此引起结构和功能上的改变。可以通过胰蛋白酶消化将未交联的百日咳博德特氏菌抗原与交联的百日咳博德特氏菌抗原区分开，因为交联的抗原与未交联的抗原显示出不同的蛋白酶敏感性。
本发明的未交联的百日咳博德特氏菌抗原可以表现出比传统的、交联的百日咳博德特氏菌抗原更高的效力。因此，与所有百日咳博德特氏菌抗原均被交联的传统疫苗相比，每一种未交联的百日咳博德特氏菌抗原可以仅需要较小的量，就能产生类似水平的保护性免疫。除此之外，或者可选择地，当未交联的百日咳博德特氏菌抗原与传统的、交联的百日咳博德特氏菌抗原以相同的剂量施用时，与传统的、交联的百日咳博德特氏菌抗原获得的免疫原性水平相比，可以增强免疫原性。
在本发明的优选实施方案中，百日咳博德特氏菌抗原之一是基因脱毒的百日咳毒素(例如PT-9K/129G)。包含基因脱毒的百日咳毒素的疫苗组合物通常需要较小量的PT，以获得与通过传统的甲醛或戊二醛交联脱毒的PT相当的或更高的免疫原性，因为已发现基因脱毒的PT比通过传统脱毒方法产生的PT更具有免疫原性[9, 10]。可以进一步提高免疫原性，因为未交联的、基因脱毒的PT能够更有效地被抗原呈递细胞加工，并因其更大的结构柔性而为更大范围的T细胞受体提供更好的底物[11]。因此，可以进一步减少本发明的疫苗组合物中的基因脱毒PT的量，其中已省略了交联步骤，而不影响疫苗组合物的免疫原性。或者，可以使用相同量的基因脱毒PT代替疫苗组合物中的传统的交联PT组分以获得相对于PT抗原的更高的免疫原性。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所有三种百日咳博德特氏菌抗原PT、FHA和百日咳杆菌粘附素在加入疫苗组合物之前都没有用交联剂进行处理。在这样的实施方案中，使用其中百日咳毒素S1亚基编码基因已被突变以使得突变体形式缺少全部的或基本上全部的酶活性的百日咳博德特氏菌菌株通过基因途径实现PT的脱毒。
但是，其中仅仅FHA和百日咳杆菌粘附素没有用交联剂进行处理的组合物也可以是有用的，因为交联剂使用的任何减少都会简化生产并减少化学废物的产生。此外，最终的疫苗制剂中存在的残余甲醛的总量可以充分降低至无法检测的水平，由此减少了患者对甲醛负面反应的可能性，特别是对于易于产生这种反应的患者。
本发明因此涉及无细胞百日咳(aP)组分，其包含至少两种未交联的的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。优选地，本发明的aP组分包含未交联的FHA、未交联的百日咳杆菌粘附素和未交联的、基因脱毒的PT，或者由它们组成。或者，只有FHA和百日咳杆菌粘附素未用交联剂例如甲醛或戊二醛进行交联。
aP组分中每一种抗原的量一般以μg表示。本发明的疫苗一般每单位剂量包括2-30 µg之间的PT。在第一种类型的疫苗中，PT可以以每单位剂量5-30µg 之间的量(例如5、7.5、20或25µg)存在，而在第二种类型的疫苗中，组合物通常包括每单位剂量2-10 µg之间的PT (例如2.5µg或8µg)。如果疫苗包括FHA，其通常以每单位剂量2-30 µg 之间的量存在。在第一种类型的疫苗中，FHA可以以每单位剂量2.5-25µg 之间的量(例如2.5、5、10、20或25µg)存在，而在第二种类型中，FHA可以以每单位剂量4-10µg 之间的量存在(例如5µg或8µg)。如果疫苗包括百日咳杆菌粘附素，它通常以每单位剂量2-10 µg之间的量存在。在第一种类型的疫苗中，百日咳杆菌粘附素可以以每单位剂量2.5-10µg之间的量存在(例如2.5、3、8或10µg)，而在第二种类型的疫苗中，百日咳杆菌粘附素可以以每单位剂量2-3µg之间的量存在(例如2.5µg或3µg)。
因此用于青少年和成人的增强疫苗通常每单位剂量含有2.5-8 μg的PT、4和8 μg之间的FHA和2.5和8 μg之间的百日咳杆菌粘附素。优选地，增强疫苗每单位剂量包含4 μg PT、4 μg FHA和8 μg百日咳杆菌粘附素，更优选5 μg PT、2.5 μg FHA和2.5 μg百日咳杆菌粘附素。儿科疫苗优选包含每单位剂量7 μg或7.5µg PT、10 μg FHA和10 μg百日咳杆菌粘附素。通常施用的单位剂量体积是0.5 ml。
疫苗通常含有每单位剂量<80µg的总无细胞百日咳抗原。每一个单独的抗原通常以每单位剂量<30µg的量存在。
通常本发明的疫苗中存在PT、FHA和百日咳杆菌粘附素的每一个。它们可以以不同的量存在，例如PT:FHA:百日咳杆菌粘附素的量(µg)为20:20:3、25:25:8、16:16:5、5:10:6、4:4:8、5:2.5:2.5、7.5:10:10、或10:5:3。还可以使用这些量的倍数，例如10:10:1.5、或30:30:4.5、或20:10:6等。一种有用的疫苗包括4µg PT、4µg FHA和8µg百日咳杆菌粘附素。通常FHA相对于百日咳杆菌粘附素是过量的，如果二者都存在的话。
如果疫苗包括铝盐佐剂，那么疫苗中的PT优选被吸附(有时完全吸附)至铝盐，优选被吸附至氢氧化铝佐剂。任何FHA也可以被吸附至铝盐。任何百日咳杆菌粘附素可以被吸附至铝盐佐剂，但是百日咳杆菌粘附素的存在通常意味着组合物需要存在氢氧化铝以确保稳定吸附[12]。
对于无细胞百日咳，使用改良的小鼠脑内保护测定(MICA)来确定效价。MICA是致死的小鼠攻毒模型，其检测由无细胞百日咳疫苗提供的小鼠保护活性。每一个半成品的效价表示为相对于参考疫苗的相对效价。用无细胞百日咳疫苗的国际标准(目前是JINH-3)对参考疫苗进行校准，并且保护活性以国际单位(International Units)表示。疫苗的效价应当为在单次人剂量推荐体积中至少4.0 IU，即至少8 IU/ml。
aP组分的制备
本发明进一步涉及用于制备可用于制备本发明疫苗组合物中存在的aP组分的未交联百日咳博德特氏菌抗原的制备方法。可以从百日咳博德特氏菌培养物纯化并被包括在根据本发明的aP组分中的百日咳博德特氏菌抗原是PT、FHA、百日咳杆菌粘附素、凝集原2和凝集原3。优选地，aP组分包括PT、FHA和(任选地)百日咳杆菌粘附素。形成aP组分的纯化抗原通常以特定比例混合，已发现所述特定比例特别适于增强针对aP组分中包括的所有百日咳博德特氏菌抗原的保护性抗体反应。例如，PT、FHA和百日咳杆菌粘附素可以按下述重量比混合：1:1:2或16:16:5或5:10:6或20:20:3或25:25:8或10:5:3。
在一个方面，本发明涉及用于制备aP组分的方法，其包括培养表达基因脱毒PT的百日咳博德特氏菌菌株的培养物，从培养物纯化两种或更多种百日咳博德特氏菌抗原以获得两批或更多批次产物，每一批次产物包含不同的纯化百日咳博德特氏菌抗原，以及将两批或更多批次产物以希望的比例(见上文)混合以制备aP组分，其中所述方法的特征在于纯化的百日咳博德特氏菌未用交联剂进行处理(即在最终的疫苗中抗原保持为其未交联的天然形式)。使用编码基因脱毒PT的百日咳博德特氏菌具有这样的优点：可以避免任何来自于发酵培养基的毒素活性遗留到包含另一种百日咳博德特氏菌抗原的组分中，并因此使得出于安全考虑对除PT以外的百日咳博德特氏菌抗原的预防性处理变得不必要。用于制备培养物的百日咳博德特氏菌菌株编码的基因脱毒百日咳毒素优选是PT-9K/129G。
在另一个方面，本发明涉及用于制备aP组分的方法，包括培养已删除了PT编码基因的百日咳博德特氏菌菌株的培养物，从培养物纯化两种或更多种百日咳博德特氏菌抗原以获得两批或更多批次产物，每一批次产物包含不同的纯化的百日咳博德特氏菌抗原，以及将两批或更多批次产物以希望的比例混合以制备aP组分，其中所述方法的特征在于纯化的百日咳博德特氏菌未用交联剂进行处理。使用缺少PT基因的突变百日咳博德特氏菌菌株与使用编码基因脱毒PT的百日咳博德特氏菌菌株具有相同的优点，即避免了其它具有毒素活性的百日咳博德特氏菌抗原的污染和由此导致的用交联剂对百日咳博德特氏菌抗原进行预防性处理的需要。
在第三个、次优选的方面，本发明涉及用于制备aP组分的方法，包括培养百日咳博德特氏菌菌株的培养物，从培养物纯化两种或更多种百日咳博德特氏菌抗原以获得两批或更多批次产物，每一批次产物包含不同的纯化的百日咳博德特氏菌抗原，以及将两批或更多批次产物以所期望的比例混合以获得aP组分，其中所述方法的特征在于仅有含有纯化的有酶活性的PT的批次产物用交联剂进行处理，而含有其他纯化的百日咳博德特氏菌抗原的批次产物不用交联剂进行处理。从百日咳博德特氏菌培养物中纯化除了具有酶活性的PT之外的其它百日咳博德特氏菌抗原的进行可以不需要交联这些百日咳博德特氏菌抗原。但是，需要进行另外的安全性测试以确保没有毒素活性从培养物遗留到含有除了具有酶活性的PT之外的其它百日咳博德特氏菌抗原的批次产物中。
通过在生产方法中去掉任何交联步骤，所述方法可以被大幅缩短，并且变得更节能。例如，用甲醛对百日咳毒素进行脱毒可能需要在37℃ 温育34-32天(参见参考文献13)。由于缩短了生产方法，可以通过首先生产需要脱毒的D和T组分，然后生产不需要脱毒的百日咳博德特氏菌抗原和其它组分，从而优化多价疫苗的生产。这使得可以优化利用发酵和纯化设备，并且使得即使是在小规模设备中，疫苗生产也是商业上可行的。例如，百日咳博德特氏菌抗原和交联剂温育所另外所需的空间量不再需要。此外，降低了生产方法对环境的影响，因为在aP组分的制备过程中产生更少的或者不产生含有残余交联剂的水溶液形式的化学废料，而且由于省略了百日咳博德特氏菌抗原在37℃的漫长的温育时间，降低了能源消耗。
总之，本发明省略了生产方法中的任何交联步骤，并且因此免疫原被称为“未用交联剂进行处理的”，如“未交联的”等。然而，在一些实施方案中，本发明可以使用交联剂，但是避免使用醛类交联剂。例如，本发明可以使用交联剂，但避免使用甲醛和戊二醛。虽然优选地，不使用交联剂处理百日咳博德特氏菌免疫原。
组合疫苗
本发明的疫苗组合物通常为组合疫苗，即包括来自至少一个不同于百日咳博德特氏菌的病原体的一种或多种保护性抗原。其它的一种或多种保护性抗原可以是病毒的和/或细菌的。典型的细菌病原体包括，但不限于白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；破伤风梭菌(Clostridium tetani)；B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b)；脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)，包括血清组A、B、C、W135和/或Y；和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)包括血清型6B、14、19F、和23F。典型的病毒病原体包括，但不限于：脊髓灰质炎病毒；甲型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；风疹病毒和水痘-带状疱疹病毒。
白喉
白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)引起白喉。可以对白喉毒素进行处理(例如使用甲醛或戊二醛)以除去毒性，同时保留在注射后诱导特异性抗毒素抗体的能力。这些白喉类毒素用于白喉疫苗中，更多细节在参考文献1的第13章中公开。优选的白喉类毒素是通过甲醛处理制备的那些。可以通过在生长培养基(例如Fenton培养基，或Linggoud & Fenton培养基)中培养白喉棒杆菌，然后进行甲醛处理，超滤和沉淀获得白喉类毒素，所述培养基中可加入牛提取物。优选用于培养白喉棒杆菌的生长培养基不含动物来源的成分。然后可以用包含无菌过滤和/或透析的方法处理类毒素材料。或者，可以使用基因脱毒的白喉毒素(例如CRM197)，其通常需要进行甲醛处理以在储存过程中保持长期稳定性。
白喉类毒素优选被吸附至氢氧化铝佐剂。
组合物中白喉毒素和/或类毒素的量通常以“Lf”单位(“絮凝单位”，或者“絮凝剂量限量”，或者“絮凝限度”)测量，其定义为当与一国际单位的抗毒素混合时，产生最佳絮凝混合物的毒素/类毒素的量[14, 15]。例如，NIBSC提供了“Diphtheria Toxoid, Plain”[16]，其中每安瓿瓶含有300 LF，还提供了“The 1st International Reference Reagent For Diphtheria Toxoid For Flocculation Test”[17]，其中每安瓿瓶含有900 Lf。组合物中白喉毒素或类毒素的浓度可以容易地使用絮凝测定通过与用这种参考试剂校准的参考材料进行比较来确定。
组合物中白喉类毒素的免疫效价通常表示为国际单位(IU)。可以将组合物对实验室动物(通常是豚鼠)提供的保护与按IU校准的参考疫苗进行比较，来评估效价。NIBSC提供了“Diphtheria Toxoid Adsorbed Third International Standard 1999”[18, 19]，其中每安瓿瓶含有160 IU，适合于对这些测定进行校准。
可以使用三稀释测定(three-dilution assay)确定本发明组合物的效价。免疫之后，通过皮下或皮内途径对豚鼠进行采血或攻毒。在替代的实施方案中，用小鼠代替豚鼠。当对豚鼠或小鼠进行采血的时候，通过使用体内或体外血清学方法进行的毒素中和试验，用滴定法测定个体动物的抗毒素水平，所述体内或体外血清学方法已在所检测的疫苗类型上进行过验证。在一个实施方案中，使用在包含动物来源成分的发酵培养基中生产的白喉类毒素进行验证。使用合适的统计学方法计算本发明组合物的效价。对于三稀释测定，估算效价的95%置信区间的限制为估算效价的50-200%内，除非估算效价的95%置信区间的下限高于每单次人剂量30 IU。当进行一次稀释时，测试疫苗的效价被证明显著高于每人剂量30 IU。
通过IU测量，组合物通常包括至少30 IU/剂量。组合物通常包括20和80 Lf/ml之间的白喉类毒素，通常为大约50 Lf/ml。青少年和成人的增强疫苗通常含有4 Lf/ml和8 Lf/ml之间的白喉类毒素，例如每0.5 ml剂量2.5 Lf，优选4 Lf。儿科疫苗通常含有20和50 Lf/ml之间的白喉类毒素，例如每0.5 ml剂量10 Lf或25 Lf。
蛋白质制备物的纯度可以用特定蛋白对总蛋白的比例来表示。组合物中白喉类毒素的纯度通常表示为每单位质量的蛋白(不可透析的)氮中白喉类毒素的Lf单位。例如，非常纯的毒素/类毒素可能具有超过1700 Lf/mg N的纯度，表示组合物中大部分或所有的蛋白质都是白喉毒素/类毒素[20]。
破伤风
破伤风梭菌(Clostridium tetani)引起破伤风。可以对破伤风毒素进行处理得到保护性类毒素。类毒素用于破伤风疫苗中，更多细节在参考文献1的第27章中公开。因此本发明的组合疫苗可以包括破伤风类毒素。优选的破伤风类毒素是通过甲醛处理制备的那些。可以通过在生长培养基(例如来源于牛酪蛋白的Latham培养基)中培养破伤风梭菌，然后进行甲醛处理，超滤和沉淀，获得破伤风类毒素。优选用于培养破伤风梭菌的生长培养基不含动物来源的成分。然后可以用包含无菌过滤和/或透析的方法处理所述材料。
破伤风类毒素优选被吸附至氢氧化铝佐剂。
破伤风类毒素的量可以以“Lf”单位表示(见下文)，其定义为，当与一国际单位的抗毒素混合时，产生最佳絮凝混合物的类毒素的量[14]。NIBSC提供了“The 1st International Reference Reagent for Tetanus Toxoid For Flocculation Test”[21]，其中每安瓿瓶含有1000 LF，可以用它对测量进行校准。
青少年和成人的增强疫苗通常每0.5 ml剂量含有5 Lf破伤风类毒素。儿科疫苗通常每0.5 ml剂量含有5和10 Lf之间的破伤风类毒素。
破伤风类毒素的免疫效价以国际单位(IU)测量，通过将组合物对实验室动物(通常是豚鼠)提供的保护与参考疫苗进行比较来评估，例如使用NIBSC的“Tetanus Toxoid Adsorbed Third International Standard 2000”[22, 23]，其中每安瓿瓶含有469 IU。本发明的组合物中破伤风类毒素的效价应当是每剂量至少35 IU，例如至少70 IU/ml。更优选地，本发明的组合物中破伤风类毒素的效价是每剂量至少40IU。而且，在成人和青少年的增强疫苗中，20 IU/剂量的降低的效价是可以接受的，因为相比儿科疫苗降低的抗原含量意在用于初次免疫。
可以使用多稀释测定(multiple dilution assay)确定本发明组合物的效价。免疫之后，通过皮下或皮内途径对豚鼠进行采血或攻毒。在替代的实施方案中，使用小鼠代替豚鼠。当对豚鼠或小鼠进行采血的时候，通过使用体内或体外血清学方法进行的毒素中和试验，用滴定法测定个体动物的抗毒素水平，所述体内或体外血清学方法已在所检测的疫苗类型上进行过验证。使用合适的统计学方法计算本发明组合物的效价。如果使用多稀释测定，95%置信区间的下限和上限应当分别在估算效价的50-200%之内。用于儿童初次免疫的破伤风疫苗的估算效价的95%置信下限应当不低于每单个人剂量40 IU。
组合物中破伤风类毒素的纯度通常表示为每单位质量蛋白(不可透析的)氮中破伤风类毒素的Lf单位。破伤风类毒素应当具有至少1000 Lf/mg N的纯度。
Hib
B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b，“Hib”)引起细菌性脑膜炎。Hib疫苗通常是基于荚膜多糖抗原(例如参考文献1的第14章)，其制备已有详细记载(例如参考文献24至33)。可以在缺乏动物来源成分的条件下培养流感嗜血杆菌细菌。Hib多糖与载体蛋白缀合以增强其免疫原性，特别是在儿童中。这些缀合物中的典型的载体蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的CRM197衍生物、或来自脑膜炎球菌血清组B的外膜蛋白复合物。因此，本发明的组合疫苗可以包括与载体蛋白缀合的Hib荚膜多糖。
任何合适的活化化学和/或接头化学可用于Hib多糖的缀合中。通常在缀合之前活化或功能化多糖。活化可以涉及，例如氰化试剂如CDAP(例如1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐[34, 35])。其它适合的技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；还可参见参考文献36的介绍)。
可以利用任何已知的程序通过接头基团进行连接，例如参考文献37和38中描述的程序。一种类型的连接涉及多糖的还原胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一个末端偶联，然后将蛋白质与己二酸接头基团的另一末端偶联[39, 40, 41]。其它接头包括B-丙酰胺基[42]、硝基苯基-乙胺[43]、卤代酰基卤化物[44]、糖苷键[45, 46, 47]、6-氨基己酸[48]、ADH [49]、C4至C12基团[50]等。作为使用接头的替代方式，可以进行直接连接。与蛋白质直接连接包括氧化多糖，然后蛋白质进行还原胺化，如例如参考文献46和51中所述。
破伤风类毒素是优选的载体，用在产品中通常被称为“PRP-T”。可以通过用溴化氰活化Hib荚膜多糖，将活化的多糖与己二酸接头(例如(1-乙基-3-(3-二乙基氨丙基) 碳化亚胺)，通常盐酸盐)偶联，然后使接头-多糖实体与破伤风类毒素载体蛋白反应制备PRP-T。
CRM197白喉类毒素是另一种优选的Hib载体蛋白[52,53,54]。优选的缀合包括Hib多糖与CRM1978通过己二酸琥珀酸二酯共价连接[55,56]。
缀合物的多糖部分可以包含如由Hib细菌制备的全长磷酸多聚核糖基核糖醇(PRP)，和/或全长PRP的片段。可以使用多糖：蛋白质比例(w/w)在1:5(即过量蛋白质)和5:1(即过量多糖)之间的缀合物，例如在1:2和5:1之间的比例以及在1:1.25和1:2.5之间的比例。然而，在优选的疫苗中，多糖对载体蛋白的重量比在1:2.5和1:3.5之间。在破伤风类毒素同时作为抗原和载体蛋白存在的疫苗中，则缀合物中多糖对载体蛋白的重量比可以在1:0.3和1:2之间[57]。
Hib抗原的量通常用μg多糖表示。疫苗中多糖的浓度通常在10和30μg/ml之间，例如20μg/ml。Hib缀合物的施用优选导致抗PRP抗体浓度为>0.15µg/ml，且更优选>1µg/ml，并且这些是标准反应阈值。
脑膜炎球菌
脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)引起细菌性脑膜炎。基于生物体的荚膜多糖，已鉴别了脑膜炎奈瑟菌的多种血清组，包括A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y & Z。与疾病最相关的血清组是A、B、C、W135和Y。目前针对血清组A、C、W135和Y的疫苗是基于荚膜多糖抗原的，但是这种方法不适合于血清组B，因此使用蛋白抗原和外膜囊泡代替[58]。荚膜多糖与载体蛋白缀合以增强免疫原性。典型的载体蛋白是破伤风类毒素(如在NIMENRIX™产品中)、白喉类毒素(如在MENACTRA™产品中)、和白喉毒素的CRM197衍生物(如在MENVEO™产品中)。因此本发明的组合疫苗可以包括一种或多种(例如2、3、或4中)荚膜多糖，其与载体蛋白缀合，其选自：(1) 脑膜炎奈瑟菌血清组A；(2) 脑膜炎奈瑟菌血清组C；(3) 脑膜炎奈瑟菌血清组W135；和/或(4) 脑膜炎奈瑟菌血清组Y。多糖各自与相同的或不同的载体蛋白缀合(例如所有多糖与CRM197或破伤风类毒素缀合)并随后混合，获得包括一种以上荚膜多糖的组合疫苗。
缀合物的多糖部分可以包含由脑膜炎球菌制备的全长多糖，和/或其片段。可以从OAc+或从OAc–菌株制备血清组C多糖。对于血清组A多糖，优选至少50%(例如至少60%、70%、80%、90%、95%或更多)的甘露糖胺残基在C-3位置是O-乙酰化的。可以使用多糖：蛋白比例(w/w)在1:10(即过量蛋白)和10:1(即过量多糖)之间的脑膜炎球菌，例如比例在1:5和5:1之间、在1:2.5和2.5:1之间、或在1:1.25和1.25:1之间。
可以在缺乏动物来源成分的条件下培养脑膜炎奈瑟菌细菌。
脑膜炎球菌抗原的量通常用μg多糖表示。疫苗中多糖的浓度通常为每个血清组5和30μg/ml之间，例如10μg/ml或20μg/ml。缀合物的施用优选导致相关血清组的血清杀菌力实验(SBA)滴度增加至少4倍，且优选至少8倍。可以用仔兔补体或人补体测量SBA滴度[59]。
肺炎球菌
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)引起细菌性脑膜炎。与Hib和脑膜炎球菌一样，现有的疫苗是基于荚膜多糖的。可以在缺乏动物来源成分的条件下培养肺炎链球菌细菌。因此本发明的组合疫苗可以包括与载体蛋白缀合的肺炎球菌荚膜多糖。
优选包括一种以上肺炎链球菌血清型的多糖，特别是至少血清型6B、14、19F和23F。其它的血清型优选选自：1、3、4、5、7F、9V和18C。例如，来自23个不同血清型的多糖的混合物，以及具有5-11种不同血清型的多糖的缀合疫苗得到广泛应用[60]。例如PREVNAR™ [61]含有来自七种血清型的缀合多糖(4、6B、9V、14、18C、19F、和23F)，SYNFLORIX™含有来自十种血清型的缀合多糖 (1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F)，以及PREVNAR 13™含有来自十三中血清型的缀合多糖(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、和23F)。多糖优选与载体蛋白缀合[例如参考文献62-64]。典型的载体蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的CRM197衍生物、和流感嗜血杆菌蛋白D。PREVNAR™产品中的多糖通过还原胺化各自与CRM197缀合，每0.5ml剂量含每种多糖2µg(血清型6B为4µg)。SYNFLORIX™使用三种不同的载体蛋白和对于不同血清组不同多糖量的混合物。
肺炎球菌抗原的量通常用μg多糖表示。肺炎球菌缀合物的浓度，按多糖测量，通常是每种血清型2和20µg/ml之间。
乙型肝炎病毒
乙型肝炎病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的原因。HBV病毒颗粒由外层蛋白外壳或衣壳包围的内核组成，且内核含有病毒DNA基因组。衣壳的主要组分是已知为HBV表面抗原的蛋白或者，更常见地，“HBsAg”，其通常是分子量为~24 kDa 的226个氨基酸的多肽。所有现有的乙型肝炎疫苗都含有HBsAg，当给正常的受接种者施用该抗原时，它刺激产生抗HBsAg抗体，保护免受HBV感染。因此本发明的组合疫苗可以包括HBsAg。
对于疫苗制备来说，可以用两种方式制备HBsAg。第一种方法是从慢性乙型肝炎携带者的血浆中纯化颗粒形式的抗原，因为由于在HBV感染的过程中肝脏中合成大量的HBsAg并释放到血流中。第二种方式涉及通过重组DNA方法表达蛋白。用于本发明方法的HBsAg应当是重组表达的，例如在酵母细胞中。合适的酵母包括酵母(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))、汉逊酵母(Hanensula)(例如H.polymorpha)或毕赤酵母(Pichia)宿主。可以在缺乏动物来源成分的条件下培养酵母。
与天然的HBsAg (即如在血浆纯化产物中)不同，酵母表达的HBsAg通常是非糖基化的，而这是用于本发明的最优选的形式。酵母表达的HBsAg是具有高度免疫原性的，其制备可以不存在血液制品污染的风险。本领域已知许多用于从重组酵母纯化HBsAg的方法。
HBsAg通常是基本上球状颗粒的形式(平均直径为大约20nm)，包括含有磷脂的脂质基质。酵母表达的HBsAg颗粒可以包括天然HBV病毒颗粒中未发现的磷脂酰肌醇。颗粒还可以包括无毒量的LPS，以刺激免疫***[65]。颗粒可以保留非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)，如果在酵母的裂解中使用了它的话[66]。
HBsAg优选来自于HBV亚型adw2。
HBsAg纯化的优选方法涉及，在细胞裂解之后：超滤；尺寸排阻层析；阴离子交换层析；超速离心；脱盐；无菌过滤。在细胞破坏后，可以对裂解物进行沉淀(例如使用聚乙二醇)，HBsAg留在溶液中，准备好进行超滤。
纯化后，可以对HBsAg进行透析(例如用半胱氨酸)，其可用于除去在HBsAg制备过程中可能用到的任何含汞防腐剂例如硫柳汞[67]。
HBsAg的量通常用毫克表示。含有HBsAg的组合疫苗通常包括5和60 µg/ml之间。本发明的组合物中HBsAg的浓度优选低于60 µg/ml，例如<55 µg/ml、<50 µg/ml、<45 µg/ml、<40 µg/ml等。大约20 µg/ml的浓度是典型的，例如每剂量10µg。在本发明的一些实施方案中，组合物包括“低剂量”的HBsAg。这意味着组合物中HBsAg的浓度为<5 μg/ml，例如<4、<3、<2.5、<2、<1等。在典型的0.5ml单位剂量体积中，因此，HBsAg的量为低于2.5μg，例如<2、<1.5、<1、<0.5等。
脊髓灰质炎病毒
脊髓灰质炎病毒引起脊髓灰质炎。人们知道灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)已有许多年，更多细节在参考文献1的第24章中公开。因此，本发明的组合疫苗可以包括灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。
脊髓灰质炎病毒可以在细胞培养物中生长，且优选的培养物使用Vero细胞系，其来自于猴肾。可以便利地将Vero细胞培养为微载体。生长之后，可以使用例如超滤、透析过滤、和层析的技术纯化病毒颗粒。如果在细胞培养中使用动物(特别是牛)材料，它们应当从无传染性海绵状脑病(TSE)，且特别是无牛海绵状脑病(BSE)的来源获得。优选地，脊髓灰质炎病毒在不含动物来源成分的培养基上培养的细胞中生长。
在给患者施用之前，必须灭活脊髓灰质炎病毒，并且这可以通过甲醛(或者优选地，非醛类试剂)处理实现。脊髓灰质炎可由三种类型的脊髓灰质炎病毒之一引起。这三种类型相似，并且引起相同的症状，但它们在抗原上是非常不同的，一种类型的感染不能保护免受其它类型的感染。因此发明优选使用三种脊髓灰质炎病毒抗原：脊髓灰质炎病毒类型1 (例如Mahoney毒株)、脊髓灰质炎病毒类型2(例如MEF-1毒株)、和脊髓灰质炎病毒类型3(例如Saukett毒株)。病毒优选分别生长、纯化和灭活，然后混合得到三价混合物原液（bulk trivalent mixture），用于本发明。
IPV的量通常以“DU”单位(“D-抗原单位”[68])表示。组合疫苗通常包含每剂量每脊髓灰质炎类型1-100 DU 之间，例如大约40 DU的1型脊髓灰质炎病毒，大约8 DU的2型脊髓灰质炎病毒，和大约32 DU的3型脊髓灰质炎病毒，但是可以使用比这更低的剂量[69, 70]，例如对于1型10-20 DU，对于2型2-4 DU，以及对于3型8-20 DU。本发明的组合疫苗可以包括“低剂量”的脊髓灰质炎病毒。对于1型脊髓灰质炎病毒，这意味着组合物中病毒的浓度为<20 DU/ml，例如<18、<16、<14、<12、<10等。对于2型脊髓灰质炎病毒，这意味着组合物中病毒的浓度为<4 DU/ml，例如<3、<2、<1、<0.5等。对于3型脊髓灰质炎病毒，这意味着组合物中病毒的浓度为<16 DU/ml，例如<14、<12、<10、<8、<6等。如果1、2、3型所有三种脊髓灰质炎病毒都存在，三种抗原可以分别以DU比例5:1:4的量存在，或者以任何其它合适的比例存在，例如当使用Sabin毒株时，比例为15:32:45[71]。来自Sabin的低剂量抗原是特别有用的，其中含有<10 DU的1型、<20 DU的2型、和<30 DU的3型(每单位剂量，通常为0.5 ml)。
如果使用IPV组分，且脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上生长，疫苗组合物优选含有少于10ng/ml、优选<1ng/ml，例如<500pg/ml或<50 pg/ml的Vero细胞DNA，例如>50碱基对长度的Vero细胞DNA少于10ng/ml。
制备组合疫苗
用于疫苗中的来自这些病原体的抗原组分通常通过缩写名称提及：“D”是白喉类毒素；“T”是破伤风类毒素；“P”是百日咳抗原，“aP”是无细胞的(例如包括至少PT和任选地FHA和/或百日咳杆菌粘附素)；“Hib”是B型流感嗜血杆菌荚膜多糖缀合物；“MenA”、“MenB”、“MenC”、“MenW”和“MenY”是相应的脑膜炎球菌血清组，分别与载体蛋白缀合；“IPV”是3价灭活脊髓灰质炎病毒；以及“Spn”是肺炎球菌。
本发明的实施方案包括，但不限于包含下述组分的组合疫苗：
- D, T, aP
- D, T, aP, IPV
- D, T, aP, HBsAg
- D, T, aP, Hib
- D, T, aP, Hib, IPV
- D, T, aP, HBsAg, Hib
- D, T, aP, HBsAg, IPV
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib, Spn
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib, MenC
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenA
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenY
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenW135
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenA, MenW135, MenY。
这些组合疫苗可以由所列出的抗原组成，或者可以进一步包括来自其它病原体的抗原。因此，它们可以单独使用，或者作为其它疫苗的组分。
对于儿科组合疫苗，D:T的比例通常大于1(即儿科疫苗按Lf单位通常具有过量的D)并且通常在2:1和3:1之间(用Lf单位测量)，例如2.5:1。相反，对于施用给青少年或成人(其通常已经接受过至少一种包含D和T的儿科组合疫苗)的增强疫苗，T:D的比例通常大于1(即增强疫苗按Lf单位通常具有过量的T) 并且通常在1.5:1和2.5:1之间，例如2:1。
一种有用的疫苗包括(每单位剂量)2Lf D、5Lf T、4µg PT-9K/129G、4µg FHA和8µg百日咳杆菌粘附素。另一种有用的疫苗包括(每单位剂量)25Lf D、10Lf T、25µg PT-9K/129G、25µg FHA和8µg百日咳杆菌粘附素。
当混合抗原组分以制备多价组合物时，可以单独加入抗原，或者可以将它们预混。如果组合疫苗包含D和T抗原和其它抗原，在组合疫苗的制备中可以使用预混的D-T组分。这种二价组分可以与其它抗原组合。如果使用D-T混合物制备组合疫苗，混合物中白喉类毒素对破伤风类毒素的比例可以在2:1和3:1之间(用Lf单位测量)，优选在2.4:1和2.6:1之间，例如优选2.5:1。
缀合物的载体蛋白
缀合多糖抗原包括载体蛋白，多糖直接或通过接头与其共价连接。关于缀合技术的一般信息可在参考文献33中找到。
已知多种蛋白可用作载体，优选的载体蛋白是细菌类毒素，例如白喉类毒素或破伤风类毒素。其它合适的载体蛋白包括，但不限于白喉毒素的CRM197突变体[52-54]、脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白[72]、合成多肽[73, 74]、热休克蛋白[75,76]、百日咳蛋白[77,78]、细胞因子[79]、淋巴因子[79]、激素[79]、生长因子[79]、包含多个来自不同病原体来源抗原的人CD4+ T 细胞表位的人造蛋白[80]例如N19 [81]，来自流感嗜血杆菌的蛋白D[82,83]、肺炎球菌表面蛋白PspA [84]、肺炎球菌溶血素 [85]、铁摄取蛋白[86]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[87]、无乳链球菌(S.agalactiae)蛋白[88]等。
多糖与载体优选通过-NH2基团连接，例如载体蛋白的赖氨酸残基侧链中的-NH2基团，或者精氨酸残基侧链的-NH2。还可以与-SH基团(例如半胱氨酸侧链中)连接。
优选多糖：蛋白比例(w/w)为1:5 (即过量蛋白)和5:1 (即过量多糖)之间的缀合物。
组合物可以包括少量的游离载体。不考虑作为单独抗原的任何载体，未缀合的载体优选总体上不超过组合物中载体蛋白总量的5%，并且更优选按重量计以少于2%的量存在。
如同在SYNFLORIX™产品中那样，组合物中可以包括超过一种类型的载体蛋白，例如，以降低载体抑制的风险。
缀合物的量通常按多糖的量给出(即，缀合物的总体剂量(即载体+多糖)高于所注明的剂量)，以避免由于载体的选择而造成的变化。
铝盐佐剂
本发明的疫苗通常包括佐剂。所包含的最常见的佐剂是铝盐，例如氢氧化铝和/或磷酸铝。组合疫苗中的抗原可以被吸附(部分地或全部地)至铝盐。
通常被称为“氢氧化铝”的佐剂典型地是羟基氧化铝盐，其通常是至少部分结晶的。铝的羟基氧化物，其可由式AlO(OH)表示，可以通过红外(IR)光谱与其它铝化合物，例如氢氧化铝Al(OH)3区分开，具体是其在1070cm-1处存在吸收带和在3090–3100cm-1处存在强肩峰 (参考文献89的第9章)。半峰高处衍射带的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示出更强的谱线增宽。表面积随WHH增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂的纤维形态学(例如在透射电镜中观察到的)是典型的，例如直径为大约2nm的针状颗粒。氢氧化铝佐剂的pI通常是大约11，即佐剂本身在生理pH下具有正的表面电荷。据报道，pH 7.4时氢氧化铝佐剂的吸附容量为1.8-2.6 mg蛋白/mg Al+++。
通常被称为“磷酸铝”的佐剂典型地是羟基磷酸铝，通常还含有少量的硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。可以通过沉淀获得它们，沉淀过程中的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。羟基磷酸盐通常具有0.3和1.2之间的PO4/Al摩尔比。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO­4。例如，3164cm-1的IR光谱带(例如，当加热至200℃时)表示存在结构性羟基(参考文献89的第9章)。磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比通常在0.3和1.2之间，优选在0.8和1.2之间，更优选为0.95+0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al 摩尔比在0.84和0.92之间的无定形的羟基磷酸铝，包括0.6mg Al3+/ml 。磷酸铝通常是颗粒(例如在透射电镜上观察到的板状形态，具有在50nm范围的基本颗粒)。在吸附任意抗原后典型的颗粒直径是在0.5-20μm的范围内 (例如大约5-10μm)。据报道，pH 7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5 mg蛋白/mg Al+++。
磷酸铝的PZC与磷酸根对羟基的取代程度负相关，这种取代程度可取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根=更多酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)也改变PZC。根据本发明使用的磷酸铝的PZC通常在4.0和7.0之间，更优选在5.0和6.5之间，例如大约5.7。
用于给患者施用的组合物中Al+++的浓度优选小于10mg/ml，例如<5 mg/ml、<4 mg/ml、<3 mg/ml、<2 mg/ml、<1 mg/ml等。本发明组合物中Al+++的优选范围是在0.3和1mg/ml之间或在0.3-0.5mg/ml之间。典型的是0.85mg/剂量的最大量。
在本发明的疫苗组合物中，百日咳博德特氏菌抗原可以被吸附至一种或多种铝盐佐剂，或者可以以未吸附状态加入。如果本发明的组合物中存在百日咳杆菌粘附素，那么它优选被吸附至氢氧化铝佐剂。在本发明的组合物中，PT和FHA可以被吸附至氢氧化铝佐剂或磷酸铝。在优选的实施方案中，PT、FHA和百日咳杆菌粘附素被吸附至氢氧化铝。
在含有白喉类毒素的组合疫苗中，白喉类毒素被吸附至铝盐佐剂，例如其被吸附至氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂。
在含有破伤风类毒素的组合疫苗中，破伤风类毒素可以被吸附至氢氧化铝佐剂，但这不是必须的(例如可以使用0-10%的总破伤风类毒素吸附)。或者，破伤风类毒素可以被吸附至磷酸铝佐剂。
在含有Hib抗原和铝盐的组合疫苗中，Hib缀合物可以是未吸附的或者可以被吸附(例如被吸附至磷酸铝佐剂[90])。在含有D-T-Pw-Hib-HBsAg抗原的疫苗中，这种方式的吸附特别有用。其它缀合抗原(例如脑膜炎球菌、肺炎球菌)可以类似地被吸附至铝盐(例如磷酸盐)或者可以是未吸附的 [91]。
IPV抗原在与组合疫苗的其它组分混合之前不需要被吸附至任何佐剂，但是它们可以被吸附至来自这些其它组分的一种或多种铝佐剂。
在含有HBsAg的组合疫苗中，可以用参考文献92所述的方法将HBsAg吸附至磷酸铝。磷酸铝的吸附与众所周知的ENGERIX-B™产品(其中HBsAg被吸附至氢氧化铝)相反。如参考文献93中所提及的，对于HBsAg来说，磷酸铝可能是比氢氧化铝更好的佐剂。
如果本发明的方法使用的组分中白喉和破伤风类毒素在它们与HBsAg 混合之前已经进行了混合，则这种D-T混合物优选含有D和T抗原均吸附到其上的氢氧化铝佐剂。
当本发明的疫苗中包括佐剂时，其可以在不同阶段加入。抗原可以在用于制备组合疫苗之前与佐剂组合(例如二价D-T混合物可以在用于本发明的方法之前被吸附至一种或多种铝盐佐剂)，但是还可以在混合抗原之后加入佐剂，或者将一系列抗原加入到佐剂中(例如由含水佐剂开始，然后加入抗原，单独加入或者先预混)。
水包油乳液佐剂
本发明的组合物可以包括水包油乳液佐剂。
已知多种这样的乳液，例如MF59和AS03在欧洲均已获得批准。
有用的乳液佐剂通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解的(可代谢的)和生物相容的。乳液中的油滴通常具有亚微米级的直径，并且这种小尺寸可以容易地通过微射流机获得以提供稳定的乳液，或者通过替代方法例如相转化。优选其中至少80%(按数量计)的液滴具有小于220nm的直径的乳液，因为它们可以进行过滤灭菌。
乳液可以包括来源于动物(例如鱼)和/或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种子和谷物。最常用的花生油、大豆油、椰子油、和橄榄油是坚果油的示例。可以使用例如从荷荷芭豆获得的荷荷巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物组中，玉米油是最易得到的，但是也可以使用其它谷物例如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等的油。甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，虽然不是天然存在于种子油中，但是可以从坚果和种子油开始，通过对合适材料的水解、分离和酯化来制备。来自于哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可用于本发明。获得动物来源的纯油所必需的分离、纯化、皂化和其他方法的程序在本领域是众所周知的。
大多数鱼类含有可易于回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油、和诸如鲸蜡的鲸油是本文可使用的几种鱼油的示例。用5-碳异戊二烯单位通过生化途径合成多种支链油，其通常被称为萜类。鲨鱼肝油含有被称为角鲨烯的支链不饱和萜类，2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，其特别优选用于本发明(见下文)。角鲨烷，角鲨烯的饱和类似物也是有用的油。鱼油，包括角鲨烯和角鲨烷，易于从商业来源获得，或者可以通过本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(见下文)。可以使用油的混合物。
优选佐剂乳液中总油量(体积%)在1和20%之间，例如在2-10%之间。按体积计5%的角鲨烯含量是特别有用的。
可以通过其“HLB”(亲水/亲脂平衡值)对表面活性剂进行分类。用于本发明的优选表面活性剂具有至少10，例如大约15的HLB。可与本发明一起使用的表面活性剂包括，但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常被称为Tween)，特别是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；以商品名DOWFAX™出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)、和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EO/PO嵌段共聚物；辛苯聚醇，其重复乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量可以不同，特别感兴趣的是辛苯聚醇-9(Triton X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，例如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，例如Tergitol™ NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三甘醇单月桂基醚(Brij 30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常被称为Spans)，例如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
用于本发明的乳液优选包括非离子表面活性剂。乳液中所包括的优选表面活性剂是聚山梨醇酯80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯；Tween 80)、Span 85 (脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂或Triton X-100。可使用表面活性剂的混合物，例如聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯例如聚山梨醇酯80(Tween 80)和辛苯聚醇例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)的组合也是有用的。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。如果使用表面活性剂的混合物，那么根据它们的相对权重(按体积计)计算混合物的HLB，例如优选的聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯按体积计1:1的混合物具有8.4的HLB。
佐剂乳液中总表面活性剂的优选量(体积%)在0.1和2%之间，例如在0.25-2%之间。按体积计总含量为1%是特别有用的，例如按体积计聚山梨醇酯80为0.5%以及按体积计脱水山梨糖醇三油酸酯为0.5%。
可以通过已知技术制备有用的乳液，例如参见参考文献94-101。
可用于本发明的特定的水包油乳液佐剂包括，但不限于：
• 角鲨烯、聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的亚微米乳液。该乳液的组成按体积计可以是约5%角鲨烯、约0.5%聚山梨醇酯80和约0.5%脱水山梨糖醇三油酸酯。按重量计，这些比例变为4.3%角鲨烯、0.5%聚山梨醇酯80和0.48%脱水山梨糖醇三油酸酯。这种佐剂被称为“MF59” [102-104]，更多细节在参考文献89的第10章和参考文献94的第12章中描述。MF59乳液有利地包括柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。
• 角鲨烯、生育酚和聚山梨醇酯80的乳液。该乳液可以包括磷酸盐缓冲液。这些乳液可以具有2-10%的角鲨烯、2-10%的生育酚和0.3-3%的聚山梨醇酯80，并且角鲨烯：生育酚的重量比优选<1 (例如0.90)，因为这可以提供更稳定的乳液。角鲨烯和聚山梨醇酯80可以以大约5:2的体积比存在，或者以大约11:5的重量比存在。因此这三种组分(角鲨烯、生育酚、聚山梨醇酯80)可以以1068:1186:485或者大约55:61:25的重量比存在。这种佐剂被称为“AS03”。这种类型的另一种有用的乳液可以包含，每人剂量，0.5-10 mg角鲨烯、0.5-11 mg生育酚、和0.1-4 mg聚山梨醇酯80 [105]，例如采用上述比例。
• 其中皂苷(例如QuilA或QS21)和固醇(例如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[106]。
• 具有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子表面活性剂的乳液。如参考文献107中所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。亚微米液滴尺寸是有利的。
• 包含角鲨烯、水溶液、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子表面活性剂(例如脱水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯或“Span 80”)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90%的油滴(按体积计)具有小于200 nm的尺寸[108]。该乳液还可以包括一种或多种下述物质：醛醇；低温保护剂(例如糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。还可以包括TLR4激动剂，例如化学结构不包括糖环的 TLR4激动剂[109]。这种乳液可以是冻干的。“AF03”产品是一种这种乳液。
用于本发明的优选的水包油乳液包含角鲨烯和聚山梨醇酯80。
可以在疫苗制备时将乳液和抗原混合，或者可以在递送时将它们即时混合。因此，在一些实施方案中，在包装或分配的疫苗中佐剂和抗原可以分开保存，为使用时配制成最终制剂做好准备。混合时(无论是否是在原液(bulk)制备过程中，或者在使用时)抗原通常为水溶液形式，以使得通过混合两种液体来制备最终疫苗。用于混合的两种液体的体积比是可变的(例如5:1-1:5)，但通常为大约1:1.如果在试剂盒中乳液和抗原分开保存，那么产品可以以一个含有乳液的小瓶和一个含有水性抗原的小瓶的形式存在，用于混合以得到佐剂化的液体疫苗(单剂量或多剂量)。
本发明的优选乳液包括角鲨烯油。其通常由鲨鱼油制备，但是已知有替代来源，例如参见参考文献110(酵母)和111(橄榄油)。优选用于本发明的是每克角鲨烯含有不超过661pg PCB(TEQ)的角鲨烯，如参考文献112所述。优选用高纯角鲨烯制备乳液，例如通过双蒸发制备，如参考文献113中所述。
如果组合物包括生育酚，可采用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚的任何一种，但优选α-生育酚。生育酚可以采用几种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可以同时施用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。生育酚具有可以帮助稳定乳液的抗氧化特性[114]。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，这种生育酚的优选盐是琥珀酸盐。
TLR 激动剂
本发明组合物可以包括TLR激动剂，即可以激动Toll-样受体的化合物。最优选地，TLR激动剂是人TLR的激动剂。TLR激动剂可以活化TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLR11中任一种；优选其能活化人TLR4或人TLR7。
可以通过标准试验来测定针对任何特定Toll-样受体的激动剂活性。公司例如Imgenex和Invivogen提供稳定共转染人TLR基因和NFκB加上合适的报告基因的细胞系，以测量TLR激活通路。其设计为灵敏的、宽工作范围动力学，并可以用于高通量筛选。这类细胞系中通常存在一种或两种特异性TLR的组成型表达。也可参见参考文献115。许多TLR激动剂是本领域已知的，例如参考文献116描述了特定的脂肽分子是TLR2激动剂，参考文献117-120每一篇都描述了TLR7的小分子激动剂种类，而参考文献121和122描述了用于治疗疾病的TLR7和TLR8激动剂。
TLR激动剂可以吸附至铝盐，由此提高佐剂的免疫增强效果[123]。这可能导致更好的(更强的，或更快起效的)免疫反应和/或允许减少组合物中铝的量，同时还保持等效的佐剂效果。本发明组合物因此可以包括吸附有TLR激动剂的铝盐。激动剂和盐可以形成稳定的佐剂复合物，其保留(至少部分)盐吸附抗原的能力。
含磷的吸附部分是特别有用的，因此吸附部分可以包含磷酸盐、膦酸盐、次磷酸盐、亚磷酸盐等。这些基团可以与铝盐上的表面基团进行配体交换，尤其是与具有表面羟基基团的盐。
在优选的实施方案中，本发明组合物包括含膦酸盐基团的TLR激动剂(更优选地TLR7激动剂)。该膦酸盐基团可使该激动剂吸附至不溶性铝盐[123]。
本发明可用的TLR激动剂可以包括单一吸附部分，或者可以包括一个以上的，例如2和15个之间的吸附部分。通常，化合物将会包含1、2或3个吸附部分。
本发明可用的含磷TLR激动剂可由式(A1)表示：
其中：
RX 和 RY 独立地选自H 和 C1-C6 烷基；
X选自共价键、O和NH；
Y选自共价键、O、C(O)、S 和 NH；
L是接头，例如，选自C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷基氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，其各自任选地被1-4个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和-P(O)(OH)2；
每一个 p独立地选自1、2、3、4、5和6；
q选自1、2、3和4；
n选自1、2和3；并且
A是 TLR激动剂部分。
在一个实施方案中，根据式(A1)的TLR激动剂如下所示：RX和RY是H；X是O；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，其各自任选地被1-2个卤素原子取代；p选自1、2和3；q选自1和2；且n是1。因此，在这些实施方案中，吸附部分包含磷酸盐基团。
在其它实施方案中，根据式(A1)的TLR激动剂如下所示：RX和RY是H；X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，其各自任选地被1-2个卤素原子取代；p选自1、2和3；q选自1和2；且n是1。因此，在这些实施方案中，吸附部分包含膦酸盐基团。
在一些实施方案中，TLR激动剂部分“A”具有小于1000 Da的分子量。在一些实施方案中，式(A1)的TLR激动剂具有小于1000 Da的分子量。
优选的 TLR激动剂是水溶的。因此，它们在pH 7、25℃和1个大气压强下与水在水性缓冲剂中混合时能形成均匀的溶液，以获得浓度为至少50μg/ml的溶液。因此，术语“水溶的”排除了在这些条件下仅微溶的物质。
可用的TLR激动剂包括具有式(B)、(C)、(D)、(E)、(F)、(G)、(H)、(I)、(II)、(IV)、或(J)的那些，如参考文献123中所述。其它有用的TLR激动剂是参考文献123中定义的化合物1-102。优选的TLR7激动剂具有参考文献123的式(IV)，例如下文鉴定的化合物K1或K2。这些可以作为盐，例如K2的精氨酸盐使用。
单位剂量中TLR激动剂的量会落入相对较宽的范围内，其可以通过常规试验确定。可以使用1-1000μg/剂量的量，例如每剂量5-100μg或者每剂量10-100μg，并且理想地是每剂量<300μg，例如每剂量大约5μg、10μg,、20μg、25μg、50μg或100μg。因此，本发明组合物中TLR激动剂的浓度可以是2-2000μg/ml，例如10-200μg/ml，或者大约5、10、20、40、50、100或200μg/ml，并且理想地是<600μg/ml。
通常，组合物中TLR激动剂对Al+++的重量比将会小于5:1，例如小于4:1、小于3:1、小于2:1、或小于1:1。因此，例如，对于0.5mg/ml 的Al+++浓度，TLR激动剂的最大浓度应当是2.5mg/ml。但是可以使用更高或更低的水平。TLR激动剂的质量小于Al+++可以是最典型的，例如，每剂量100μg的TLR激动剂和0.2mg的Al+++等。例如，Fendrix产品每剂量包括50µg的3d-MPL和0.5mg的Al+++。
优选组合物中至少50% (按质量计)TLR激动剂被吸附至铝盐，例如>60%、>70%、>80%、>85%、>90%、>92%、>94%、>95%、>96%、>97%、>98%、>99%、或者甚至100%。
如果本发明组合物包括吸附至金属盐的TLR激动剂，并且还包括缓冲剂，优选缓冲剂中的任何磷酸根离子的浓度应当小于50mM (例如在1-15mM之间)，因为高浓度的磷酸根离子可能引起解吸附。优选使用组氨酸缓冲剂。
Toll-样受体4激动剂
本发明组合物可以包括TLR4激动剂，优选人TLR4的激动剂。TLR4由先天免疫***的细胞表达，包括常规的树突细胞和巨噬细胞[124]。经由TLR4的触发诱导信号级联反应，所述反应使用MyD88-和TRIF-二者依赖的通路，分别导致NF-κB和IRF3/7激活。TLR4激活通常诱导大量IL-12p70产生并显著增强Th1-型细胞和体液免疫应答。
本领域已知多种有用的TLR4激动剂，其中许多是内毒素或脂多糖(LPS)的类似物，例如，TLR4激动剂可以是：
(i) 3d-MPL (即3-O-去酰化的单磷酰基脂质A；也被称为3-去氧-酰化单磷酰基脂质A或3-O-去酰化-4'-单磷酰基脂质A)。该内毒素的单磷酰基脂质A部分的衍生物具有葡糖胺还原性末端的3位脱酰化位点。其已由明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体制备，并在化学上类似于脂质A但缺少酸不稳定的磷酰基基团和碱不稳定的酰基基团。3d-MPL的制备最初在参考文献125中描述，并且该产品已由科雷莎公司(Corixa Corporation)生产并出售。其存在于GSK的“AS04”佐剂中，更多细节可以参见参考文献126-129。
(ii) 氨基烷基氨基葡糖苷磷酸盐，例如RC-529或CRX-524 [130-132]。RC-529和CRX-524具有下述结构，区别在于它们的R2基团：
(iii) 含有与含磷酸无环主链连接的脂质的化合物，例如TLR4拮抗剂E5564 [133,134]：
(iv) 吡喃葡糖基脂质A (GLA) [135]或其铵盐，例如
(v) 参考文献136中定义的式I、II或III的化合物，或其盐，例如化合物“ER 803058”、“ER 803732”、“ER 804053”、“ER 804058”、“ER 804059”、“ER 804442”、“ER 804680”、“ER 803022”、“ER 804764”或“ER 804057”。ER 804057也被称为E6020，其具有下述结构：
而ER 803022具有下述结构：
(vi) 参考文献137中公开的多肽配体中的一种。
本发明可采用这些TLR4的任一种。
用于本发明的优选的TLR4激动剂是3d-MPL。其可被吸附到磷酸铝佐剂、氢氧化铝佐剂、或两者的混合物[138]。
3d-MPL可以是采取酰化不同的相关分子(例如具有3、4、5或6个酰基链，其可以有不同的长度)的混合物的形式。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖在其2-位碳(即2位和2'位)上被N-酰化，而且3'位上也被O-酰化。与碳2连接的基团具有式-NH-CO-CH2-CR1R1'。与碳2'连接的基团具有式-NH-CO-CH2-CR2R2'。与碳3'连接的基团具有式-O-CO-CH2-CR3R3'。代表性结构是：
基团R1、R2和R3各自独立地是–(CH2)n–CH3。n值优选在8和16之间，更优选为在9和12之间，最优选为10。
基团R1'、R2'和R3'各自独立地是：(a) –H；(b) –OH；或(c) –O-CO-R4，其中R4是–H或–(CH2)m–CH3，其中m值优选为在8和16之间，更优选为10、12或14。在2位上，m优选为14。在2'位上，m优选为10。在3'位上，m优选为12。因此，基团R1'、R2'和R3'优选是来自十二烷酸、十四烷酸或十六烷酸的O-酰基。
当R1'、R2'和R3'均为–H时，则3d-MPL仅有3条酰基链(2、2'和3'位上各有一条)。当R1'、R2'和R3'中仅有两个是–H时，3d-MPL可以有4条酰基链。当R1'、R2'和R3'中仅有一个是–H时，3d-MPL可以有5条酰基链。当R1'、R2'和R3'中没有一个是–H时，3d-MPL可以有6条酰基链。根据本发明使用的3d-MPL可以是具有3-6条酰基链的这些形式的混合物，但混合物中优选包括具有6条酰基链的3d-MPL，特别是确保6条酰基链的形式占3d-MPL总重的至少10%，例如>20%、>30%、>40%、>50%或更多。已发现具有6条酰基链的3d-MPL是佐剂活性最高的形式。
因此，用于本发明的3d-MPL的最优选形式是：
当以混合物的形式使用3d-MPL时，在本发明的组合物中，当提及3d-MPL的量或浓度时，指混合物中的混合3d-MPL种类。
典型的组合物包括浓度在25µg/ml和200µg/ml之间的3d-MPL，例如在50-150µg/ml、75-125µg/ml、90-110µg/ml的范围内、或大约100µg/ml。通常以每剂量25-75µg 3d-MPL的量施用，例如每剂量45-55µg，或大约50µg 3d-MPL。
在水性条件下，3d-MPL可以形成不同尺寸的胶束聚集体或颗粒，例如直径<150nm或>500nm。本发明可以使用它们中的一种或两种，可以通过常规测定选择较好的颗粒。根据本发明优选使用较小颗粒(例如小到足以产生澄清的3d-MPL水性悬液)，因为它们具有优良的活性[139]。优选的颗粒平均直径小于150nm，更优选小于120nm，甚至平均直径可以小于100nm。然而，在大多数情况下，平均直径将小于50nm。当3d-MPL被吸附至铝盐时，可能无法直接测量3D-MPL的颗粒大小，但是可以在发生吸附之前测量颗粒大小。可以通过动态光散射的常规技术评估颗粒直径，其揭示了平均颗粒直径。当颗粒直径据称为x nm时，颗粒通常分布在此平均值附近，但至少50%数量(例如>60%、>70%、>80%、>90%或更多)的颗粒的直径在x +25%的范围内。
Toll-样受体7激动剂
本发明组合物可以包括TLR7激动剂，优选人TLR7的激动剂。TLR激动剂可以是根据式(K)的化合物：
(K)
其中：
R1 是 H、C1-C6alkyl、-C(R5)2OH、-L1R5、-L1R6、-L2R5、-L2R6、-OL2R5、或-OL2R6；
L1 是 –C(O)- 或 –O-；
L2 是 C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基或-((CR4R4)pO)q(CH2)p，其中L2 的C1-C6亚烷基和C2-C6亚烯基任选地被1-4个氟代基团取代；
每一个L3独立地选自C1-C6亚烷基和-((CR4R4)pO)q(CH2)p-，其中L3 的C1-C6亚烷基任选地被1-4个氟代基团取代；
L4 是亚芳基或杂亚芳基；
R2 是 H 或 C1-C6烷基；
R3 选自C1-C4烷基、–L3R5、-L1R5、-L3R7、-L3L4L3R7、-L3L4R5、-L3L4L3R5、-OL3R5、 -OL3R7、 -OL3L4R7、-OL3L4L3R7、-OR8、-OL3L4R5、-OL3L4L3R5和-C(R5)2OH ；
每一个R4独立地选自H和氟；
R5 是 -P(O)(OR9)2，
R6 是 –CF2P(O)(OR9)2 或 -C(O)OR10；
R7 是 –CF2P(O)(OR9)2 或 -C(O)OR10；
R8 是 H 或 C1-C4烷基；
每一个R9独立地选自H和C1-C6烷基；
R10 是 H或C1-C4烷基；
每一个p独立地选自1、2、3、4、5和6，以及
q是1、2、3或4。
式(K)化合物优选为式(K')：
其中：
P1选自H、C1-C6烷基，其任选地被COOH和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)取代；
P2 选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
条件是P1和P2至少之一是-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；
RB 选自H和C1-C6烷基；
RX和RY独立地选自H和C1-C6烷基；
X 选自共价键、O和NH；
Y 选自共价键、O、C(O)、S和NH；
L选自共价键C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷基氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，其各自任选地被1-4个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2；
每一个 p独立地选自1、2、3、4、5和6；以及
q选自1、2、3和4。
在式(K')的一些实施方案中：P1选自C1-C6烷基，其任选地被COOH和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)取代；P2选自C1-C6烷氧基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)；RB是C1-C6烷基；X是共价键；L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-，其各自任选地被1-4个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2；每一个p独立地选自1、2和3；q选自1和2。
一种有用的TLR7激动剂是“化合物K1”(参考文献140的80页的化合物6A)：
化合物 K1在水中的溶解度为大约4mg/ml，并且能良好地吸附至氢氧化铝。
另一种优选的TLR7激动剂是化合物“K2”(参考文献140第83页的化合物21A)：
这些TLR7激动剂可以作为盐使用，例如式(K2)的精氨酸盐，例如精氨酸盐一水合物。
其它的非抗原组分
本发明的组合物可以包含载体、赋形剂、缓冲剂等。
为控制张力，组合物可以包括生理盐，例如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以以1和20 mg/ml之间的量存在。在特定的实施方案中，氯化钠浓度在8-9 mg/ml 之间(例如大约8.5 mg/ml)。
组合物通常具有在200 mOsm/kg和400 mOsm/kg之间的克分子渗透压重量浓度；优选在240-360 mOsm/kg之间，更优选在280-320 mOsm/kg的范围内。以前曾报道克分子渗透压重量浓度对接种引起的疼痛没有影响[141]，但是仍然优选将克分子渗透压重量浓度保持在此范围内。
本发明的组合物可以包括一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。所含的缓冲剂通常在5-20mM的范围。
本发明的组合物可以包括一种或多种防腐剂，但是在一些实施方案中，组合物是不含防腐剂的。由于抗原的吸附性质，疫苗产品可能是具有混浊外观的混悬液。这种外观意味着不容易看到微生物污染，因此疫苗优选含有防腐剂。当将疫苗包装在多剂量容器中时，这尤其重要。优选包含的防腐剂是2-苯氧乙醇和硫柳汞。然而，优选在本发明的方法过程中不使用含汞防腐剂(例如硫柳汞)。因此，在所述方法中使用的一种或所有组分中可以基本上不含含汞防腐剂。但是，如果某种组分在用于本发明之前用这种防腐剂进行了处理，则难以避免存在痕量防腐剂。为安全起见，优选最终组合物含有的汞低于大约25 ng/ml。更优选地，最终的疫苗产品含有的硫柳汞无法检测到。通常通过先从抗原制备物中除去含汞防腐剂，再将其加入到本发明的方法中，或者避免在用于制造组合物的组分制备过程中使用硫柳汞来实现。不含汞的组合物是优选的。
本发明的组合物进一步可以包含表面活性剂。加入表面活性剂以减少抗原组分聚集。水溶液中的疫苗组分在长期储存过程中可能会发生一种或多种抗原的沉淀。加入表面活性剂例如聚山梨醇酯20 (聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇月桂酸酯；Tween 20)和聚山梨醇酯80 (聚氧乙烯(80) 脱水山梨糖醇月桂酸酯；Tween 80)可以减少或防止抗原的沉淀，例如液体组合疫苗中的抗原沉淀。优选地，表面活性剂的浓度按体积计不超过0.05%。如果组合物包括HBsAg，其通常包括聚山梨醇酯20，例如如果在酵母裂解过程中使用它的话 [66]。
本发明组合物的pH通常在5.0和7.5之间，更典型地在5.0和6.0之间，以达到最佳稳定性，或者，如果存在白喉类毒素和/或破伤风类毒素，在6.0和7.0之间。因此，本发明的方法可以包括在包装之前调节散装疫苗(bulk vaccine)pH的步骤。
本发明的组合物优选是无热原的(non-pyrogenic)，例如每剂量含有<1 EU (内毒素单位，标准测量；1 EU等于每剂量0.2 ng FDA参比标准内毒素EC-2 ‘RSE’)，优选每剂量<0.1 EU。
本发明的组合物优选不含谷蛋白。
本发明的组合物优选是无菌的。
本发明的组合物优选是水溶液的形式。在制备过程中，通常用WFI(注射用水)稀释抗原以得到所需的终浓度。
在本发明的最终疫苗组合物中，来源于单个抗原组分的残留材料也可以以痕量存在。例如，如果用甲醛制备白喉、破伤风和百日咳类毒素，那么最终疫苗可能含有痕量的甲醛(例如低于10µg/ml，优选<5µg/ml)。在脊髓灰质炎病毒制备过程中可能已使用培养基或稳定剂(例如培养基199)，这些可能继续存在在最终的疫苗中。类似地，游离氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和/或胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸和/或羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸)、维生素(例如胆碱、抗坏血酸盐等)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钙、葡萄糖、硫酸腺嘌呤、酚红、乙酸钠、氯化钾等，各自可在最终疫苗中保留<100µg/ml，优选<10µg/ml。来自抗原制备物的其它组分，如新霉素(例如新霉素硫酸盐，具体来自IPV组分)、多粘菌素B(例如硫酸多粘菌素B，具体来自IPV组分)等，也可以在每剂量中存在亚纳克的量。来自于抗原制备物的最终疫苗的其它可能组分产生于抗原的不完全纯化(less-than-total purification)。因此可能存在少量的百日咳博德特氏菌、白喉棒杆菌、破伤风梭菌和酿酒酵母蛋白和/或基因组DNA。为了使这些残留的组分的量最小化，优选在这些抗原用于本发明的方法之前对抗原制备物进行处理以除去它们。
包装本发明的组合物
本发明可以提供适合于包装为单个剂量的散装材料，其随后可被分配用于施用给患者。上述提及的浓度通常是最终包装剂量中的浓度，因此散装疫苗中的浓度可以更高(例如通过稀释降低至最终浓度)。
人肌内疫苗通常以单位剂量给药，其个别剂量体积为0.5ml。因此，本发明的方法可以包括取出0.5ml混合物样品并将其包装在容器中的步骤。应当理解，当提及0.5ml剂量时，其包括正常偏差，例如0.5ml+0.05ml。在多剂量的情况下，一起取出多剂量的量并包装在单个容器中，例如在10-剂量的多剂量容器装入5ml(或5.5ml，10%的溢装量)。
本发明的方法可以包括将疫苗包装在容器中以便使用的步骤。合适的容器包括小瓶和一次性注射器(优选为无菌的)。
将本发明的组合物装在小瓶中时，小瓶优选由玻璃或塑料材料制成。在将组合物加入小瓶之前优选对其进行灭菌。为了避免乳胶敏感型患者的问题，优选用无乳胶的塞子密封小瓶。小瓶可以包括单一剂量的疫苗，或者其可以包括一个以上的剂量(“多剂量”小瓶)，例如10剂量。当使用多剂量小瓶时，应当用无菌针头和注射器在严格无菌的条件下取出各剂量，注意避免污染小瓶内容物。优选地，小瓶由无色玻璃制成。
小瓶可以有帽，所述帽适合于使得预装填注射器可以***该帽(例如鲁尔(Luer)锁)，可以将注射器的内容物推入小瓶(例如在其中重构冻干物质)，并可以将小瓶的内容物移回注射器中。从小瓶中移出注射器后，可以连上针头，并组合物可以施用给患者。该帽优选位于封口或盖子内，以便在封口或盖子移除之后才能接触到该帽。
当组合物被包装到注射器中时，注射器通常不会连接有针头，但可以提供单独的针头与注射器组装和使用。优选安全针头。通常是1-英寸 23-号、1-英寸25-号和5/8-英寸25-号针头。注射器可具有剥离标签，该标签上可打印有批号和失效日期，以帮助保存记录。注射器的活塞优选带有防脱装置，以防止活塞在吸出过程中意外脱出。注射器可以具有乳胶橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头之前密封顶端。且顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选地装有丁基橡胶护罩。优选灰色丁基橡胶。有用的注射器是以商品名“Tip-Lok”™销售的注射器。
当使用玻璃容器(例如注射器或小瓶)时，优选使用由硼硅酸盐玻璃而不是钠钙玻璃制成的容器。
当将组合物包装在容器中之后，可将容器封装到用于分销的箱子中，例如纸箱中，该箱子标有该疫苗的详细情况，例如其商品名、疫苗中抗原列表(例如“乙型肝炎重组物”等)、提供的容器(例如“一次性预装填Tip-Lok注射器”或“10 x 0.5 ml单剂量小瓶”)、其剂量(例如“每个含有一0.5ml剂量”)、警示(例如“仅用于成人”或“仅用于儿童”)、失效日期、说明、专利号等。每箱可以含有一个以上的包装疫苗，例如5-10个包装疫苗(特别是对于小瓶)。如果疫苗装在注射器中，那么包装可以显示注射器的图片。
可将疫苗与说明书包装在一起(例如在同一个箱子中)，所述说明书包括疫苗的详细情况，例如施用说明、疫苗内所含抗原的详情等。说明还可以含有警示，例如如果接种后发生过敏反应，请准备好肾上腺素溶液等。
包装疫苗优选储存于2℃-8℃。不应将其冷冻。
在制备过程中疫苗可以全液体的形式提供(即所有抗原组分都在水溶液或悬液中)，或者它们可以这样的形式制备，其中一些组分为液体形式，而其它组分为冻干形式。因此，可以在使用时通过混合以下两种组分来即时制备最终疫苗：(a) 含有水性抗原的第一组分；和(b)含有冻干抗原的第二组分。这两种组分优选装在单独的容器(例如小瓶和/或注射器)中，本发明提供包含组分(a)和(b)的试剂盒。这种形式对于包括缀合组分，特别是Hib和/或脑膜炎球菌和/或肺炎球菌缀合物的疫苗来说是特别有用的，因为它们在冻干形式下可能是更稳定的(而D、T、P和HBsAg组分优选为液体形式)。因此在用于本发明之前，缀合物可以被冻干。在冻干之前可以加入其它组分，例如稳定剂。所包含的优选稳定剂是乳糖、蔗糖和甘露醇，及其混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。因此，最终的疫苗可能含有乳糖和/或蔗糖。使用蔗糖/甘露醇混合物可以加速干燥过程。
因此，本发明提供了制备两容器组合疫苗的方法，包括下述步骤：
- 如上所述制备水性组合疫苗，但其中所述一种或多种抗原不包括缀合的荚膜多糖抗原；
- 将所述水性组合疫苗包装在第一容器(例如注射器)中；
- 制备冻干形式的缀合荚膜多糖抗原；
- 将所述冻干抗原包装在第二容器(例如小瓶)中；以及
- 将第一容器和第二容器一起包装在试剂盒中。
然后可将试剂盒分配给医生。在接种前，在医生办公室，混合两个容器的内容物以得到准备好施用的单一液体疫苗。
疫苗的治疗和施用方法
本发明的组合物适合于给人类患者施用，并且本发明提供了在患者中产生免疫应答的方法，包括给患者施用本发明组合物的步骤。本发明的组合物优选以0.5ml的剂量给患者施用(如上所述)。
本发明还提供了本发明组合物在药物中的应用。本发明还提供了本发明组合物在预防至少百日咳中的应用。
本发明还提供了本文所述抗原组分(包括本发明的无细胞百日咳抗原)在制备疫苗中的应用。
为了充分发挥功效，对于儿童，典型的初次免疫方案可以包括施用一剂以上的剂量。例如，可在以下时间给药：在0 & 6个月(时间0是第一次给药)；在0、1、2 & 6个月；在0天、21天然后第三次给药在6 & 12个月之间；在2、4 & 6个月；在3、4 & 5个月；在6、10 & 14周；或者在0、1、2、6 & 12个月。儿科组合物还可以用作增强剂量，例如用于儿童，在其生命的第二年。
本发明的成人增强疫苗组合物可以单剂量施用给年龄10岁或以上的人。
本发明组合物可以通过肌内注射的方式给药，例如注射到手臂或腿中。
可以将本发明产生的疫苗在同一时间作为分开的疫苗施用给患者，例如在同一时间作为肺炎球菌缀合疫苗如PREVNAR™、在同一时间作为流感疫苗、在同一时间作为轮状病毒疫苗、在同一时间作为MMR疫苗等。
当本发明的组合物包括基于铝的佐剂时，在储存过程中组分可能发生沉淀。因此应当在给患者施用之前摇动组合物。被摇动的组合物将会是混浊的白色混悬液。
通用
术语“包含”涵盖了“包括”以及“由……组成”，例如组合物“包含”X可以是仅由X组成，或者可以是包括其它物质，例如X + Y。
术语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以是完全不含Y。必要时，可以从本发明的定义中省略“基本上”一词。
与数值x相关的术语“约”是可选的，且表示，例如x +10%。
除非明确说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求任何特定的混合顺序。因此组分可以任何顺序混合。当有三种组分时，那么可将两种组分彼此混合，然后将混合物与第三种组分混合等。
当抗原被描述为被“吸附”至佐剂时，优选该抗原的至少50% (按重量计)被吸附，例如50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或更多。优选白喉类毒素和HBsAg均有至少90%被吸附，并且理想地是全部被吸附，即离心后在上清中无法检测到。
附图描述
图1-3显示了用含有未甲酰化的或甲酰化的aP抗原的Tdap制剂免疫的小鼠的IgG滴度，如下述实施例6所述。通过Luminex 测定来确定IgG滴度。以相对光单位(RLU)/ml表示结果。定量下限 (LLOQ)用虚线显示。显示百日咳杆菌粘附素(图1)、FHA(图2)、和PT(图3)的滴度。数字1/5或1/50表示相对于人剂量的抗原剂量。数字14和42表示用于评估血清的第一次免疫后的天数。标识+表示甲酰化抗原，而–表示未甲酰化抗原。A * 表示 p = 0.02。
本发明的实施方式
实施例1：甲酰化和未甲酰化FHA批次产物的稳定性
从百日咳博德特氏菌培养物的上清纯化FHA，制备两批FHA产物。浓缩上清并渗滤。将过滤的浓缩物加到羟基磷石灰柱上。通过一系列层析步骤对含FHA的洗脱物进行进一步纯化，所述一系列层析步骤包括丁基650M Sepharose柱和Q Sepharose FF柱。浓缩得到的纯化的FHA批次产物并进行渗滤。在存在甲醛和赖氨酸的条件下将一批FHA产物额外进行温育，另一批次产物不进行处理。
每批的样品在室温(RT)下温育达一个月，或者在2-8℃下温育至多达三个月。通过测量在280 nm处的吸收确定每个样品的初始蛋白浓度。在温育两周和一个月后(在RT温育的样品)或者在温育两周、一个月和三个月后(在2-8℃温育的样品)重复测量。用3-8%梯度SDS-PAGE 确认结构稳定性。对于甲醛处理批次和未处理批次来说，稳定性在RT和2-8℃均相当。在RT温育一个月以及在2-8℃温育一或三个月后，两批都没有观察到蛋白浓度有统计学显著的降低。
还通过尺寸排阻高压液相色谱(SEC-HPLC)，使用Superdex 200® HPLC 柱确认样品的完整性。将样品在柱上运行之前先对其进行过滤。在每一批的样品在2-8℃温育一至三个月之后，在甲醛处理批次的和未处理批次之间也没有观察到明显差异。
实施例 2：甲酰化和未甲酰化FHA批次中聚集体的形成
通过动态光散射(DLS)检查温育过程中FHA聚集体/沉淀的形成。在测试之前对样品进行离心。鉴定出两个峰：峰1相应于单体形式，峰2相应于聚集体形式。用60℃角评价聚集体/沉淀形成。DLS分析显示无论是否用甲醛处理FHA，在2-8℃储存3个月的过程中都发生沉淀。还可以通过向甲醛处理的样品中加入0.05% Tween-80减少沉淀，但对于未处理的FHA样品则不行。聚集仅在甲醛处理之后发生，进一步的研究表明可以通过降低用于处理FHA的甲醛的浓度减少聚集。
实施例 3：含有甲酰化或未甲酰化FHA的疫苗组合物的稳定性
配制包含下述抗原的TdaP疫苗组合物：破伤风类毒素(T)、白喉类毒素(D)、和来自无细胞百日咳(aP)的三种纯化抗原(PT、FHA和百日咳杆菌粘附素)。在添加了NaCl (9 mg/ml)的组氨酸缓冲液(100 mM, pH 6.5)中配制疫苗，并加入氢氧化铝(2 mg/ml)作为佐剂。一种疫苗组合物中的FHA来自甲醛处理批，而另一种疫苗组合物中的FHA是来自未处理批的FHA。
通过将来自两种疫苗组合物每一种的样品在2-8℃，以及在36-38℃温育2或4周，进行短期稳定性研究，所述两种疫苗组合物分别含有甲酰化和未甲酰化FHA。
用夹心ELISA对aP抗原的吸附程度进行定量测定。结果总结于表1和2。在0时刻和在2-8℃ 或36-38℃温育达一个月之后，在用未甲酰化或甲酰化FHA原液配制的TdaP疫苗组合物之间没有观察到在吸附程度上有差异。
温育之后，使用PT-、FHA-、和百日咳杆菌粘附素特异性抗体通过Western印迹确认样品的完整性/身份。无论疫苗组合物是否含有甲酰化或未甲酰化FHA，在0时刻和在2-8℃和36-38℃分别温育两周或一个月之后，在样品之间没有观察到差异。
表1：含有未甲酰化FHA的Tdap疫苗的稳定性结果：
表2：含有甲酰化FHA的Tdap疫苗的稳定性
实施例4：aP抗原的体内免疫原性特性 (ELISA)
用包含未甲酰化或甲酰化FHA的TdaP疫苗组合物对八只CD1小鼠的组进行皮下免疫(剂量1)。此外，将所测试TdaP疫苗用盐水稀释4-倍(剂量2)和16-倍(剂量3)，制备之后立即使用稀释液对另外的小鼠进行皮下注射。使用同一批的甲酰化PT和甲酰化百日咳杆菌粘附素制备所有的测试疫苗。
注射后5周给小鼠采血。使用来自采血血样的血清进行ELISA测定。为了评估分别含有甲酰化和未甲酰化FHA的两种TdaP疫苗的功效，通过测量针对PT、FHA和百日咳杆菌粘附素的平均几何抗体滴度确定每一个aP抗原的免疫原性。ELISA测定的结果总结于表3-5。
表 3：PT抗原的免疫原性结果(GMT (UI/ml)：
FHA 处理 剂量 1 剂量 2 剂量 3
未甲酰化的 220 218 51
甲酰化的 194 120 36
表 4：FHA抗原的免疫原性结果(GMT (UI/ml)：
FHA 处理 剂量 1 剂量 2 剂量 3
未甲酰化的 124 53 5
甲酰化的 167 71 5
表 5：百日咳粘附素抗原的免疫原性结果(GMT (UI/ml)：
FHA 处理 剂量 1 剂量 2 剂量 3
未甲酰化的 52 91 5
甲酰化的 97 52 3
含有未甲酰化和甲酰化FHA的Tdap疫苗组合物的免疫原性结果非常相似，表明省略甲醛处理步骤对于FHA组分本身的免疫原性或者对于PT和百日咳杆菌粘附素组分没有影响。
实施例5：aP抗原的相对效价
使用欧洲药典(European Pharmacopoeia)中所述的方法，使用单个小鼠滴度(IU/ml)确定每一个疫苗制剂相对于参考Tdap疫苗的相对效价。结果总结于表6。
表6：相对效价结果 (效价 (95%CI))：
FHA 处理 PT FHA 百日咳杆菌粘附素
未甲酰化的 0.98 (0.51-1.88) 0.40 (0.21-0.69) 0.78 (0.38-1.55)
甲酰化的 0.55 (0.31-0.92) 0.49 (0.30-0.76) 0.74 (0.45-1.21)
省略甲醛处理步骤对于所测试Tdap疫苗中FHA和百日咳杆菌粘附素组分的相对效价没有影响。包含未甲酰化FHA的疫苗中的出乎意料的较高的PT效价将需要进一步研究。
实施例 6：未甲酰化和甲酰化aP抗原的体内免疫原性特性
为了确认由未甲酰化FHA获得的上述结果可类似地适用于Tdap疫苗中aP抗原组分中通常所包括的其它抗原，制备两批的实验用Tdap疫苗，其中三种aP抗原是甲酰化或未甲酰化的。
如下所述对五组，每组12只小鼠(雌性，Balb/C小鼠，6周龄)进行免疫：第1组和第2组接受的Tdap疫苗中三种aP抗原是未甲酰化的，而第3和第4组接受的Tdap疫苗中所有aP抗原均是甲酰化的。第1组和第3组小鼠接受Tdap疫苗人剂量的1/5，而第2组和第4组接受人剂量的1/50。小鼠用100µl肌内注射两次(第0天和第28天) (每次2 × 50µl)。第5组小鼠不进行免疫，并作为未经抗原免疫的对照组。
在免疫之前在第0天取血清样品。在免疫之后，在第14和42天取血清样品，测定所测试aP抗原的血清IgG滴度(参见图1-3)。通过t检验、Mann-Whitney 检验对滴度进行统计学评估。
除了第14天的PT之外，在仅含有甲酰化aP抗原的批次产物和含有一种未甲酰化aP抗原的批次产物之间没有观察到IgG滴度中统计学显著的差异。对于PT， 1/5人剂量的未甲酰化抗原免疫后第14天的IgG滴度在统计学上显著高于使用甲酰化抗原获得的IgG滴度(参见图3)。
正如所预期的，对于每一个研究的抗原，免疫后第42天的IgG滴度在统计学上都显著高于免疫后第14天的IgG滴度。类似地，在所有情况下，第42天的滴度都显著高于未经抗原免疫的小鼠，甚至是在1/50剂量的情况下(在所有情况下p < 0.003)，并且1/5剂量的滴度显著高于1/50剂量的滴度(在所有情况下p < 0.01)。
应当理解本发明的描述仅仅是举例说明，可以进行修改并仍然在本发明的范围和精神之内。
参考文献

Claims (25)

1.一种组合疫苗，包含基因脱毒的百日咳毒素和一种或多种选自IPV、HBsAg和Hib的其它抗原，其特征在于所述基因脱毒的百日咳毒素未用甲醛或戊二醛进行处理。
2.权利要求1的组合疫苗，其中所述百日咳毒素未用醛类交联剂进行处理。
3.权利要求1的组合疫苗，其中所述百日咳毒素未用交联剂进行处理。
4.一种组合疫苗，包含百日咳博德特氏菌（B. pertussis）抗原PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，其特征在于至少两种百日咳博德特氏菌抗原未用甲醛或戊二醛进行处理，条件是，如果PT未用交联剂处理，则PT是基因脱毒的百日咳毒素。
5.权利要求4的组合疫苗，其中至少两种百日咳博德特氏菌抗原未用醛类交联剂进行处理。
6.权利要求4的组合疫苗，其中至少两种百日咳博德特氏菌抗原未用交联剂进行处理。
7.一种组合疫苗，包含铝盐佐剂和至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。
8.权利要求7的组合疫苗，其中Al+++的浓度低于1 mg/ml。
9.权利要求7的组合疫苗，其中所述疫苗进一步包含TLR激动剂。
10.权利要求9的组合疫苗，其中所述疫苗包括AS04作为佐剂。
11.一种组合疫苗，包含至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原和水包油乳液佐剂，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。
12.权利要求11的组合疫苗，其中水包油乳液佐剂包括MF59和/或AS03。
13.一种不含防腐剂的组合疫苗，包含至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何未交联的PT均是基因脱毒的。
14.一种组合疫苗，包含至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的，其中PT:FHA:百日咳杆菌粘附素的重量比为1:1:2或16:16:5或5:10:6或20:20:3或25:25:8或10:5:3。
15.一种组合疫苗，包含下述组分：
- D, T, aP, IPV
- D, T, aP, HBsAg
- D, T, aP, Hib
- D, T, aP, Hib, IPV
- D, T, aP, HBsAg, Hib
- D, T, aP, HBsAg, IPV
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib, Spn
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib, MenC
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenA
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenY
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenW135
- D, T, aP, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenA, MenW135, MenY
其中aP组分包含至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。
16.一种组合疫苗，包含D、T、aP，其中以Lf单位测量的D对T的比例在2:1和3:1之间，并且aP组分包含至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。
17.一种组合疫苗，包含D、T、aP，其中以Lf单位测量的D对T的比例大于1.5，并且aP组分包含至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。
18.权利要求4-17任一项的组合疫苗，其中百日咳博德特氏菌抗原之一是基因脱毒的百日咳毒素。
19.权利要求1-18任一项的组合疫苗，其中基因脱毒的百日咳毒素是PT-9K/129G。
20.一种用于制备aP组分的方法，包括：
a. 培养表达基因脱毒PT的百日咳博德特氏菌菌株的培养物；
b. 从培养物纯化两种或更多种百日咳博德特氏菌抗原以获得两批次产物或更多批次产物，每一批次产物各含有不同的纯化的百日咳博德特氏菌抗原；以及
c. 将两批次产物或更多批次产物混合以制备aP组分；
其中所述方法的特征在于纯化的百日咳博德特氏菌未用交联剂进行处理。
21.权利要求20的方法，其中所述基因脱毒的百日咳毒素是PT-9K/129G。
22.一种用于制备aP组分的方法，包括：
a. 培养已缺失了编码百日咳毒素的基因的百日咳博德特氏菌菌株的培养物；
b. 从培养物纯化两种或更多种百日咳博德特氏菌抗原以获得两批次产物或更多批次产物，每一批次产物各含有不同的纯化的百日咳博德特氏菌抗原；以及
c. 将两批次产物或更多批次产物混合以制备aP组分；
其中所述方法的特征在于纯化的百日咳博德特氏菌未用交联剂进行处理。
23.一种用于制备aP组分的方法，包括：
a. 培养百日咳博德特氏菌菌株的培养物；
b. 从培养物纯化两种或更多种百日咳博德特氏菌抗原以获得两批次产物或更多批次产物，每一批次产物各含有不同的纯化的百日咳博德特氏菌抗原；以及
c. 将两批次产物或更多批次产物混合以制备aP组分；
其中所述方法的特征在于仅有含有纯化的有酶活性的PT的批次产物用交联剂进行处理，而含有其他纯化的百日咳博德特氏菌抗原的批次产物不用交联剂进行处理。
24.一种用于制备组合疫苗的方法，包括将权利要求19-23任一项获得的aP组分与一种或多种非百日咳抗原混合以制备组合疫苗。
25.可由权利要求24的方法获得的组合疫苗。
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