CN108025053A - 百日咳杆菌免疫原性的疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗和预防百日咳杆菌(Bordetella pertussis)的组合物、疫苗、工具和方法。特别地，本发明涉及一种三管齐下的方法，其包括除去非必需的疫苗组分，使用非变性的、遗传上去毒的突变体，和添加毒力因子。

Description

百日咳杆菌免疫原性的疫苗组合物
相关申请的引用
本申请要求2015年4月16日提交的美国临时申请号62/148,529的优先权，其通过引用明确和整体地并入本文。
1.发明领域
本发明涉及治疗和预防百日咳杆菌(Bordetella pertussis)的组合物、疫苗、工具和方法。特别地，本发明涉及一种三管齐下的方法，其包括除去非必需的疫苗组分，使用非变性的、遗传上去毒的突变体，和添加毒力因子。
2.发明背景
在20世纪40年代晚期引入全细胞百日咳(wP)疫苗导致快速减少百日咳的发病率和由该感染引起的死亡。然而，对安全性问题的忧虑损害了这些疫苗的成功。因此，在20世纪90年代晚期在许多发达国家中它们被替换为无细胞百日咳(aP)疫苗(1)。从那时起，百日咳病例一直增加，和已产生明显的流行性周期。在2012年，48,277例百日咳和18例死亡被报告至疾病控制和预防中心(CDC)，其代表了在60年中在美国的百日咳的最大载量，并且在其它国家出现类似的爆发(2-4)。然而，现代百日咳的流行病学不复制前-疫苗时代的流行病学。疾病现在更常见于婴儿和较大的儿童(9-19岁)，并且引人注意的是，这些较大的儿童通常根据当前建议充分接种，但仍发生百日咳(5,6)。不幸的是，分析在转换成aP疫苗期间出生和接种的儿童中的百日咳发病率的研究已经发现，与接种甚至单剂量的wP疫苗的儿童相比，在仅接种aP疫苗的那些儿童中感染率显著更高(7)。为了对抗在该群体中的感染上升，管理当局已要求较早给予加强免疫(8)。用aP疫苗加强免疫的益处充其量是不清楚的，因为并不知道百日咳的再次出现是仅归因于减弱的免疫还是归因于与wP疫苗或天然感染相比由aP疫苗诱导的免疫反应的性质的根本差异。
因为传染给未免疫的或不完全免疫的婴儿的相应风险，在较大儿童以及成人中增加的疾病发病率是特别令人担忧的(9)。使得该问题更复杂的是，在得出大多数诊断时抗生素治疗具有极小功效，并且严重的病例可能因为呼吸窘迫，例如机械通气而对标准疗法无反应(10)。作为全球公共卫生问题，百日咳的这种再次出现面临许多挑战。例如，需要具有可接受的安全性特征，提供长效免疫，减少感染载量和预防传染的疫苗。还需要在易感群体中减少发病率和死亡率的治疗剂和治疗策略(11)。明显的是，强烈需要改进的百日咳疫苗。
发明简述
本发明克服了与当前策略有关的问题和缺点，并且设计和提供了用于治疗和预防百日咳杆菌和相关生物的感染中的新的工具、组合物和方法。
本发明的一个实施方案涉及免疫原性的百日咳杆菌疫苗组合物，其包含遗传上去毒的百日咳毒素(PT)；遗传上去毒的百日咳腺苷酸环化酶毒素(ACT)；在载体蛋白或肽上的自百日咳杆菌的脂低聚糖衍生的具有一个或多个内毒素抗原决定簇的免疫原性低聚糖或其片段；针对百日咳杆菌诱导保护性细胞介导的反应的TLR激动剂，其中当向哺乳动物提供所述组合物时：产生针对百日咳杆菌的中和性抗毒素抗体；产生针对百日咳杆菌的直接杀菌性抗体；引起百日咳毒素-特异性的Th1/Th17细胞反应；产生IFN-δ和IL-17细胞因子，其中所述细胞因子允许募集嗜中性粒细胞；和减少在疫苗接受者中百日咳杆菌的鼻咽定殖和运送。优选地，遗传上去毒的百日咳毒素在大肠杆菌(E.coli)中产生。还优选地，遗传上去毒的百日咳毒素突变体在百日咳杆菌中产生。优选地，遗传上去毒的AC毒素具有一级氨基酸SEQ ID NO 1。优选地，本发明的疫苗诱导针对百日咳杆菌的抗-PT和抗-ACT中和性和杀菌性抗体的产生。
本发明的另一个实施方案涉及低聚糖缀合物，其包含遗传上去毒的百日咳毒素(PT)；遗传上去毒的百日咳腺苷酸环化酶毒素(ACT)；在载体蛋白或肽上的自百日咳杆菌的脂低聚糖衍生的具有一个或多个内毒素抗原决定簇的免疫原性低聚糖或其片段；针对百日咳杆菌诱导保护性细胞介导的反应的TLR激动剂。优选地，低聚糖包含图2的式1、式2或式3的一种或多种低聚糖。还优选地，式3的五糖是合成的，或者是百日咳杆菌LOS的脱氨基产物。优选地，低聚糖包含百日咳杆菌LOS-衍生的低聚糖(OS)或其片段和百日咳杆菌衍生的去毒毒素(dPT)，和低聚糖包含百日咳杆菌LOS-衍生的低聚糖(OS)或其片段和百日咳衍生的去毒毒素(dACT)。优选地，TLR激动剂是TLR-2、TLR-4或TLR-8。
本发明的另一个实施方案涉及用权利要求1的疫苗免疫哺乳动物以预防由百日咳杆菌引起的疾病的方法。
本发明的另一个实施方案涉及用权利要求1的疫苗免疫哺乳动物以减少百日咳杆菌的鼻咽定殖和运送的方法。
本发明的其它实施方案和优点在随后的描述中部分地阐明，并且部分地，根据该描述可以显而易见，或可根据本发明的实践而获悉。
附图描述
图1描述了百日咳杆菌去毒腺苷酸环化酶毒素的Sequence ID No 1氨基酸序列。
图2描述了支气管败血性博德特氏菌(B.bronseptica)LOS的十二糖核心的结构(式1)；通过百日咳杆菌菌株186的LOS的脱氨基作用获得的五糖半抗原的结构(式2)；和配备有间隔物和末端醛的合成的百日咳杆菌表位远端的LOS三糖的结构(式3)。
发明描述
在较大儿童以及成人中增加的疾病发病率是令人担忧的。使得该问题更复杂的是，在得出大多数诊断时抗生素治疗具有极小功效，并且严重的病例可能因为呼吸窘迫而对标准疗法无反应。作为全球公共卫生问题，百日咳的这种再次出现面临许多挑战。需要具有可接受的安全性特征，提供长效免疫，减少感染载量和预防传染的疫苗。
已令人惊讶地发现，百日咳疫苗治疗可用一种三管齐下的方法创建。步骤一包括除去非必需的疫苗组分。步骤二包括通过使用非变性的、遗传上去毒的突变体改进必需组分PTx，所述突变体之一已显示是在更小(1/5)剂量下，比化学修饰的PTx更好的免疫原(12,13)。步骤三包括添加毒力因子例如腺苷酸环化酶毒素和脂低聚糖缀合物以扩展免疫反应(21,22)。该第三步骤提供：(i)抗蛋白抗体，疫苗和疾病-诱导的IgG抗蛋白的持续时间减少，使得最大水平在2–5年内下降约10倍(14-17)；(ii)较大儿童和成人因为不良反应而未用细胞百日咳疫苗免疫，产生许多未免疫个体(18)；(iii)根据AlisonWeiss:“未发现用无细胞百日咳疫苗对成人加强免疫相对于免疫前水平增加杀菌活性。促进杀菌性免疫反应可改进百日咳疫苗的功效”(19)；和(iv)百日咳疫苗的主要作用是血清IgG抗-毒素免疫，其阻断PT对吞噬细胞的失活作用，从而允许它们使百日咳杆菌易受调理素作用，即由无细胞或全细胞疫苗引发的抗体不直接杀死病原体。百日咳疫苗还存在"群体(herd)"免疫作用，其减少咳嗽，从而导致在易感人群中百日咳杆菌的传染减少。类似于通过用白喉类毒素的广泛免疫产生的作用，抗毒素的这种间接作用解释了在个体基础上两种疫苗的不完全免疫(大约71％)。因为针对革兰氏阴性病原体的表面多糖的疫苗-诱导的IgG抗体诱导杀菌作用和免疫，百日咳杆菌的脂低聚糖(LOS)可能是一种潜在的疫苗组分(20)，其可能更有效地产生杀菌性免疫反应和减少细菌运送，并因此减少疾病发病率。百日咳杆菌内毒素缺少典型的O-抗原，因此构成脂低聚糖。百日咳杆菌LOS由脂质A、核心低聚糖和作为单一低聚糖单元的远端三糖构成(52,53)。在百日咳杆菌菌株中，还存在具有缺少末端三糖的LOS的菌株，其显示较低的毒力。
百日咳杆菌分泌数种毒素，其中之一的腺苷酸环化酶毒素(ACT)仅在感染发生后出现。一旦百日咳细菌连接至支气管中的细胞，细菌中的基因启动，结果产生ACT毒素，其像力场一样对抗免疫***起作用。ACT终止免疫***免于识别细菌，和给予细菌约2周的益处，直到免疫***认识到其已被欺骗的事实。在自然百日咳免疫的情况下，ACT或腺苷酸环化酶毒素形成初始免疫反应的基础。该第一线免疫反应不仅对消除第一轮百日咳细菌是关键的，而且对在随后再次感染时除去细菌也是重要的。无论是否被接种，当细菌散布时受感染的个体仍被定殖。差异在于接种的个体将保持定殖更久和更可能发生一定程度的咳嗽(其是百日咳传播的方式)。在天然免疫中，身体对ACT反应非常强烈，但因为初始抗原过失(33)和疫苗中缺少ACT，接种的身体根本没有被程序化以对其发生反应。疫苗未加强对该毒素的抗体，因为在那时疫苗中不存在该抗原。如在百日咳感染后所测量的，自然恢复的血清具有比DTaP接受者所具有的超过17倍的量的对ACT的抗体，和超过接种DTP接受者具有的量的9倍(23)。百日咳杆菌腺苷酸环化酶-溶血素(AC-Hly)，直接穿透靶细胞并通过提高细胞内cAMP损害它们的正常功能。用纯化的百日咳杆菌AC-Hly或AC(在体外仅携带腺苷酸环化酶活性但没有毒素活性的AC-Hly分子片段)主动免疫保护小鼠免于百日咳杆菌鼻内感染(50)。用AC-Hly或AC免疫显著缩短小鼠呼吸道的细菌定殖的时间。此外，副百日咳杆菌(B.parapertussis)AC-Hly或AC也是针对副百日咳杆菌定殖的保护性抗原；它们的保护性活性等同于全细胞疫苗(50)。在鼠模型中，AC-Hly可在博德特氏菌(Bordetella)发病机制中起重要作用。如果该因子在人类疾病中起类似作用，通过限制细菌运送，其作为保护性抗原的用途可不仅减少疾病发病率，而且减少无症状人类库。因此，本发明的目的是在更有效的百日咳杆菌疫苗制剂中加入ACT。
已经开发了疫苗佐剂，但关于安全性的潜在顾虑使它们引入至预定用于婴儿的第三代百日咳疫苗受到挑战。尽管如此，有必要对靶向青少年和成人的百日咳疫苗的佐剂、抗原递送***和给药途径进行研究。
本发明还包括用包含将免疫反应指向Th1/th17细胞反应的佐剂的疫苗免疫青少年和成人的方法。无细胞百日咳疫苗(aP)由吸收至明矾的单独百日咳杆菌抗原组成，和促进强的抗体，Th2和Th17反应，但对于诱导由Th1细胞介导的细胞免疫较少有效。相比之下，全细胞百日咳疫苗(wP)，其包括内源Toll样受体(TLR)激动剂，诱导Th1以及Th17反应。鉴定和表征来自百日咳杆菌的新的TLR2-活化脂蛋白(24)。这些蛋白包含特征性的N-端信号肽，其对革兰氏阴性细菌是独特的，和我们证实了这些脂蛋白之一，BP1569通过TLR2活化鼠树突细胞和巨噬细胞和人单核细胞。具有有效的免疫刺激性和佐剂性质的相应的合成脂肽LP1569能够提高在小鼠中用实验性Pa诱导的Th1、Th17和IgG2a抗体反应，和赋予比用明矾配制的等效疫苗优越的针对百日咳杆菌感染的保护作用(24)。
在儿童中分析T细胞反应证实，Pa促进Th2-型反应，而Pw优先诱导Th1细胞(25,26)。还已报道，在小鼠中由wP诱导的优越的长期保护作用，当抗体反应已显著减少时，与有效的Th1反应诱发有关(27)。最近已报道，Th17细胞也在由天然感染或wP免疫诱导的保护中起作用(28-31)。
可获得遗传上去毒的百日咳毒素(dPT)，和可获得适合于疫苗开发的百日咳毒素的突变体(43,44a,44b)。dPT-诱导的Th17扩增通过PI3K途径反调节。对于其性质和已在人类中用作百日咳的疫苗Ag，dPT可代表促进针对感染性疾病的疫苗的免疫保护性反应的有效候选佐剂，其中Th1/Th17介导宿主免疫(45)。作为实例，百日咳毒素突变体、能够产生这样的突变体的博德特氏菌菌株和它们在开发抗百日咳疫苗中的用途描述于美国专利号7,666,436。百日咳毒素(PT)突变体经描述具有免疫学活性，和具有减少的毒性或没有毒性，特征为亚基S1氨基酸序列的氨基酸残基Glu129、Asp11、Trp26、Arg9、Phe50、Asp1、Arg13、Tyr130、Gly86、Ile88、Tyr89、Tyr8、Gly44、Thr53和Gly80中的至少一个被缺失，和被选自天然氨基酸的不同氨基酸残基取代。
还描述了能够提供和分泌所述PT突变体的博德特氏菌菌株和获得它们的方式和方法。博德特氏菌菌株和由它们产生的PT突变体特别适合于制备有效的细胞和无细胞抗百日咳疫苗。
腺苷酸环化酶毒素是另一种由百日咳杆菌(并且也由其它紧密相关的博德特氏菌物种)分泌的重要的毒力因子。其是一种免疫原性蛋白，可引起保护性免疫反应，但其不作为无细胞百日咳疫苗的组分包括在内。ACT由大约400个氨基酸的氨基端的腺苷酸环化酶(AC)结构域和与大肠杆菌溶血素具有显著同源性的大约1300个氨基酸的形成孔的毒素重复序列(RTX)溶血素结构域组成。ACT通过由CyaBDE蛋白形成的I型分泌“经隧(channel-tunnel)”机制自百日咳杆菌分泌，然后通过由CyaC酰基转移酶介导的在溶血素结构域的两个特定的赖氨酸残基上脂肪酰化进行修饰(35)。在小鼠模型中的研究确立了ACT作为百日咳杆菌感染的重要毒力因子(36-38)。与野生型细菌相比，AC催化活性去除的百日咳杆菌的点突变体对新生小鼠的病原性低大于1000倍，直接证实了AC毒素在百日咳毒力中的重要性。类似地，缺少HLY的百日咳杆菌的框内缺失突变体同等无毒力，支持了HLY结构域在AC毒素进入细胞中起重要作用的观察结果。此外，由点突变体产生的遗传上失活的AC毒素在抗原性上类似于天然毒素。该菌株可用于开发百日咳组分疫苗(37)。使用PT和ACT缺陷的突变体，提议PT较早地起作用以抑制嗜中性粒细胞流入和ACT较晚起作用以使嗜中性粒细胞(和其它募集的细胞)一旦存在于感染部位时而中毒(39)。对腺苷酸环化酶毒素的中和性抗体促进人嗜中性粒细胞吞噬百日咳杆菌(40)。用AC-Hly或AC免疫可阻止不仅百日咳杆菌，而且对于人类的其它博德特氏菌病原体的肺的定殖，和减少其无症状运送。来自百日咳杆菌的腺苷酸环化酶(AC)毒素是177-kDa的毒素重复序列(RTX)家族蛋白，其由四个主要结构域组成；催化结构域、疏水结构域、富含甘氨酸/天冬氨酸的重复结构域和分泌信号结构域(41)。百日咳杆菌的AC毒素可作为遗传上去毒的重组形式在大肠杆菌中产生。这些重组毒素可特别在大肠杆菌菌株BL(Novagen,Madison,WI)中通过使用表达载体产生，所述表达载体为pTRACG质粒的衍生物(42)。
在优选的实施方案中，百日咳疫苗制剂包含遗传上去毒的重组百日咳毒素(rPT)。为启动PT，所有aP疫苗中存在的主要的毒力因子由于在生产期间使用的化学(特别是甲醛)去毒过程(其移除了高达80％的表面表位)而可能使用不当。化学去毒减少PT的免疫原性，并可导致初始抗原过失，即利用对PT疫苗表位的免疫记忆以在响应后续剂量/暴露时产生对野生型菌株无效的抗体(32-34)。
在另一个优选的实施方案中，涉及除了dPT外还包含去毒的腺苷酸环化酶毒素(dACT)的疫苗。PT通过在接种后首24-48h期间延迟嗜中性粒细胞流入感染部位对百日咳杆菌感染起重要的早期作用，然后在细菌与这些细胞相互作用后ACT在募集的嗜中性粒细胞的中毒中起重要作用。已知ACT在结合至嗜中性粒细胞上存在的CD11b/CD18整联蛋白受体后有效地进入细胞，和对嗜中性粒细胞活性具有不利影响，在对紧密相关的病原体支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)的研究后，嗜中性粒细胞被鉴定为在促进感染中ACT的主要靶细胞。因此，这些毒素可提供一种对嗜中性粒细胞募集和活性的二合一组合，其对于百日咳杆菌的呼吸道的最佳感染和定殖是必需的。
在另一个实施方案中，本发明包含脂低聚糖缀合物以产生杀菌性抗体，其有效产生杀菌性免疫反应和减少细菌运送并因此减少疾病的发病率。在另一个优选的实施方案中，疫苗包含自百日咳杆菌脂低聚糖内毒素衍生的具有一个或多个内毒素抗原决定簇的核心低聚糖，所述核心低聚糖缀合至载体蛋白或肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了百日咳疫苗制剂，其包含Toll-样受体(TLR)、优选地TLR4或TLR2激动剂作为佐剂以改变对Th1/Th17细胞反应的免疫反应，以介导针对百日咳杆菌的保护性细胞免疫。证据表明，遗传上去毒的百日咳毒素(dPT)-诱导的Th17扩增通过PI3K途径反调节。对于其性质和已在人类中用作百日咳的疫苗Ag，dPT可代表促进针对感染性疾病的疫苗的免疫保护性反应的有效候选佐剂，其中Th1/Th17介导宿主免疫(45)。
以下实施例说明了本发明的实施方案，但不应视为限制本发明的范围。
实施例1 cyaA突变体的构建
对在pUC19中亚克隆和在大肠杆菌中表达的cyaA的2.7-千碱基(kb)BamHI-EcoRI片段进行cyaA突变体的构建(47)。带有在待特定突变的cyaA的两个区域之间大致等距离的可选择标记的突变体cyaA片段通过将来自pUC4-KIXX(Pharmacia)的1.6-kb BamHI卡那霉素抗性盒***cyaA的Bcl I位点产生。按所述(47)进行寡核苷酸-定向诱变以在cyaA的位置58处用甲硫氨酸取代赖氨酸，以产生突变体cyaA片段，其用于产生AC-点突变体菌株A2-6。切除cyaA的1047-碱基对pflMI片段和再连接，产生突变体cyaA片段，其用于产生HLY-缺失突变体菌株32-5，其缺少cyaA毒素的氨基酸469-817。所有的突变体cyaA片段随后从pUC19切除和以合适的方向连接至重组pSS1129载体，所述载体带有来自紧接cyaA上游的另外2-kbBamHI片段。百日咳杆菌的突变体菌株根据Stibitz等的方法(48)，通过接合转移这些重组pSS1129载体和选择基因重组来产生。AC-或HLY-突变体cyaA基因的等位基因交换以两步方法实现，以确保基因重组在cyaA外不发生。染色体cyaA首先通过同源重组卡那霉素抗性***突变至百日咳杆菌用可选择表型标记，产生AC-和HLY-菌株(S7c2)。在第二轮中，标记的染色体基因用AC点突变或HLY-缺失突变置换；在合适位点处的重组通过表型分析和Southern(49)或免疫印迹分析来证实。百日咳杆菌的去毒的CyaA变体序列的氨基酸序列在图1中显示。
实施例2低聚糖缀合物的构建
百日咳杆菌内毒素和支气管败血性博德特氏菌(bronchiseptica)的低聚糖缀合物诱导杀菌性抗体，其是一种对百日咳疫苗的添加物，这样的缀合物容易制备和标准化；加入至重组百日咳类毒素，它们可诱导抗细菌和抗毒素免疫(20,46)。内毒素核心低聚糖可获自类似于百日咳杆菌Tohama I和Tax 113的支气管败血性博德特氏菌RB50LPS核心OS结构，以及另外的组分O-SP。不含其O-SP的支气管败血性博德特氏菌RB50(图2A)的十二糖核心(通常称为“条带A”)可容易地在Bio-Gel P-4柱上分离，活化和缀合至载体蛋白。支气管败血性博德特氏菌也是一种获得内毒素核心低聚糖的合理的生产菌株，因为它比百日咳杆菌更容易生长。
实施例3五糖的构建
缀合物的五糖部分是自百日咳杆菌186的LOS分离的片段，其包含远端三糖、庚糖和脱水甘露糖。五糖-TTd缀合物可诱导抗体，其在免疫荧光测定法(FACS)中能够结合百日咳杆菌。来自百日咳杆菌菌株186的脂低聚糖的末端五糖可在通过热酚水方法提取细菌细胞后产生，并通过超离心纯化(51)。五糖可通过用亚硝酸处理，从LOS选择性裂解。简言之，将脂低聚糖(50mg)悬浮于含有水、5％亚硝酸钠和30％乙酸(1:1:1,vol/vol/vol)的新鲜制备的溶液(180ml)中，和在25℃孵育4h，之后接着超离心(200,000g,2h)。将上清液冻干，并将产物在Bio-Gel P-2(Bio-Rad)柱上纯化，得到10mg的五糖，其结构示于图2(式2)，并通过MALDI-TOF MS和NMR光谱法分析。
实施例4形成免疫原性低聚糖-蛋白缀合物
图2所示的配备有间隔物接头和末端醛或其它合适的官能团的结构的合成三糖(远端三糖残基A,D,E)(式3)用缀合物免疫原制备，以产生针对这样的三糖的抗体，其与百日咳杆菌LOS在体内相互作用，和促进凝集、吞噬和杀死细菌，以及中和LOS的内毒素活性。
十二糖(图2)或五糖或末端三糖(图2)的任一或各自的免疫原性低聚糖-蛋白缀合物的形成通过直接偶联还原末端KDO残基或还原性氨基化(含或不含接头)五糖的2,5脱水甘露糖，和与载体蛋白的伯氨基缩合，而与蛋白载体偶联。或者，本发明的免疫原性的缀合物可通过用碳二亚胺处理形成容易与载体蛋白的伯氨基缩合的羧酸酯中间体，经直接偶联低聚糖来制备。优选的载体蛋白包括但不限于CRM、破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素亚基B、脑膜炎萘瑟氏菌外膜蛋白、pneumolysoid、来自B群链球菌的C-β蛋白、来自B群链球菌的非-IgA结合C-β蛋白、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)类毒素、百日咳类毒素、包含赖氨酸或半胱氨酸残基的合成蛋白等。载体蛋白可以是天然蛋白、化学修饰蛋白、去毒蛋白或重组蛋白。关于蛋白组分，根据本发明制备的缀合物分子可以是单体、二聚体、三聚体和更高级交联分子。
对于本领域技术人员而言，考虑到本文公开的发明的说明书和实践，本发明的其它实施方案和用途将显而易见。本文引用的所有参考资料，包括所有出版物和所有美国和外国专利和专利申请，通过引用明确和整体并入。术语包含，在任何时候使用时，意图包括术语由……组成和基本上由……组成。此外，术语包含、包括和含有不意图是限制性的。预期说明书和实施例仅视为示例性的，其中本发明的真实范围和精神由随附权利要求书指出。
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Claims (13)

1.一种免疫原性的百日咳杆菌(B pertussis)疫苗组合物，其包含遗传上去毒的百日咳毒素(PT)；遗传上去毒的百日咳腺苷酸环化酶毒素(ACT)；在载体蛋白或肽上的自百日咳杆菌的脂低聚糖衍生的具有一个或多个内毒素抗原决定簇的免疫原性低聚糖或其片段；针对百日咳杆菌诱导保护性细胞介导的反应的TLR激动剂，其中当向哺乳动物提供所述组合物时：
产生针对百日咳杆菌的中和性抗毒素抗体；
产生针对百日咳杆菌的直接杀菌性抗体；
引起百日咳毒素-特异性的Th1/Th17细胞反应；
产生IFN-δ和IL-17细胞因子，其中所述细胞因子允许募集嗜中性粒细胞；和
减少在疫苗接受者中百日咳杆菌的鼻咽定殖和运送。
2.权利要求1的疫苗，其中遗传上去毒的百日咳毒素在大肠杆菌中产生。
3.权利要求1的疫苗，其中遗传上去毒的百日咳毒素突变体在百日咳杆菌中产生。
4.权利要求1的疫苗，其中遗传上去毒的AC毒素具有一级氨基酸SEQ ID NO 1。
5.权利要求1的疫苗，其诱导针对百日咳杆菌的抗-PT和抗-ACT中和性和杀菌性抗体的产生。
6.一种低聚糖缀合物，其包含遗传上去毒的百日咳毒素(PT)；遗传上去毒的百日咳腺苷酸环化酶毒素(ACT)；在载体蛋白或肽上的自百日咳杆菌的脂低聚糖衍生的具有一个或多个内毒素抗原决定簇的免疫原性低聚糖或其片段；针对百日咳杆菌诱导保护性细胞介导的反应的TLR激动剂。
7.权利要求6的缀合物，其中低聚糖包含图2的式1、式2或式3的一种或多种低聚糖。
8.权利要求7的缀合物，其中式3的五糖是合成的，或者是百日咳杆菌LOS的脱氨基产物。
9.权利要求6的缀合物，其中低聚糖包含百日咳杆菌LOS-衍生的低聚糖(OS)或其片段和百日咳杆菌衍生的去毒毒素(dPT)。
10.权利要求6的缀合物，其中低聚糖包含百日咳杆菌LOS-衍生的低聚糖(OS)或其片段和百日咳衍生的去毒毒素(dACT)。
11.权利要求6的缀合物，其中TLR激动剂是TLR-2、TLR-4或TLR-8。
12.一种用权利要求1的疫苗免疫哺乳动物以预防由百日咳杆菌引起的疾病的方法。
13.一种用权利要求1的疫苗免疫哺乳动物以减少百日咳杆菌的鼻咽定殖和运送的方法。
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