ES2296390T3 - Composicion coadyuvante y procedimiento para su uso. - Google Patents

Abstract

Una composición coadyuvante constituida por 25 µg de 3D-MLA y una emulsión de aceite en agua que comprende aceite metabolizable, uno o más tensioactivos, un antioxidante y un componente para realizar la emulsión isotónica.

Description

Composición coadyuvante y procedimiento para su uso.

Antecedentes de la invención

Las vacunas comprenden antígenos o combinaciones de antígenos que cuando se administran a un animal de sangre caliente previenen, mejoran o tratan la enfermedad. Las vacunas para enfermedades infecciosas comprendían originariamente todos los microbios atenuados o muertos. Sin embargo, pronto se descubrió que solamente unas pocas proteínas o fragmentos de proteínas de un microbio o célula estimulaban una respuesta inmunitaria protectora y, de hecho, la inclusión de materiales extraños de toda la célula podrían dificultar la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, el desarrollo de vacunas se orientó hacia la identificación de la proteína, el fragmento de proteína, el epítope y el segmento de ADN particular que codifica este epítope que elicitaba la respuesta inmunitaria protectora. Sin embargo, como la identificación de antígenos se volvió más precisa, la eficiencia de las vacunas declinó. Los antígenos identificados eran a menudo pequeñas moléculas incapaces de ser reconocidas por las células que procesan los antígenos. Por lo tanto, se hizo necesario combinar estos antígenos con sustancias que potencian la antigenicidad del antígeno y proporcionan una mayor respuesta inmunitaria. Estas sustancias son los coadyuvantes.

Los coadyuvantes funcionan por diversos medios. Algunos ayudan en la presentación del antígeno a las células procesadoras de antígenos (APC). Las emulsiones aceite en agua, las emulsiones agua en aceite, los liposomas y las microperlas ayudan cada uno en la presentación del antígeno a las APC. Los pequeños antígenos o haptenos están a menudo unidos a mayores proteínas o polisacáridos inmunogénicos para facilitar el reconocimiento por las APC. Algunos coadyuvantes tienen un efecto de depósito que mantiene el antígeno en su sitio hasta que el cuerpo tiene una oportunidad de montar una respuesta inmunitaria. Otros coadyuvantes estimulan el sistema inmunitario aumentando generalmente la respuesta específica montada al antígeno.

Los derivados atenuados de lípido A (ALD), el lípido A de monofosforilo (MLA) y el de monofosforil lípido A 3-desaciloado (3D-MLA) son potentes coadyuvantes inmunológicos usados en vacunas profilácticas para enfermedades infecciosas y vacunas terapéuticas para el tratamiento de tumores cancerosos e infecciones crónicas. MLA y 3D-MLA son formas modificadas del lipopolisacárido bacteriano de endotoxinas, y se conocen y se describen en las patentes de los Estados Unidos Nº 4.436.727 y 4.912.094, respectivamente. MLA y 3D-MLD inducen tanto una respuesta de anticuerpo humoral de anticuerpos y una respuesta inmunitaria medida por células en pacientes a los que se les ha administrado los compuestos con un antígeno.

El documento WO 96/14871 describe una composición inmunogénica que comprende un aceite metabolizable, por ejemplo, escualeno, y un tensioactivo, por ejemplo fosfatidil colina o esfingomielina. El documento JP-A-57206625 describe una preparación de inmunoglobulina que contiene Pluronic® F68 (Paloxamer 188).

El documento WO 95/17210 describe una composición coadyuvante que comprende QS21, 3D-MPL y una emulsión de aceite en agua que comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, \alpha-tocoferol y tween 80 disueltos en PBS.

Una vacuna eficaz presenta antígenos a un animal de sangre caliente de manera que el animal puede montar una respuesta inmunitaria protectora a estos antígenos. A menudo, una composición de vacuna debe incluir un coadyuvante para conseguir este efecto. Los coadyuvantes que estimulan tanto una respuesta humoral como una respuesta celular y son seguros y no tóxicos promoverían la eficacia de cualquier vacuna.

Sumario de la invención

La presente invención es una nueva composición coadyuvante tal como se define en las reivindicaciones anexas. También se reivindican las composiciones de vacuna de la nueva emulsión estable.

Descripción detallada de la invención

La presente invención es una composición coadyuvante que es una emulsión estable de aceite en agua que comprende un aceite metabolizable, uno o más tensioactivos, un antioxidante y un componente para realizar la emulsión isotónica. La emulsión resultante puede estar tamponada y tener una dimensión de partículas inferior a 3 \mug. El equilibro hidrófilo-lipófilo de la emulsión es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 13,0, por ejemplo
10,5.

En un aspecto, el equilibrio hidrófilo-lipófilo es aproximadamente 8,0.

En otro aspecto, el equilibrio hidrófilo-lipófilo es aproximadamente 7,5 a aproximadamente 13,0, y la emulsión comprende el 10% en volumen a (de escualeno) volumen en, el 0,09% en peso a Poloxamer 188 en volumen, el 1,9% en peso a fosfatidil colina de huevo en volumen, el 1,75% en volumen a glicerol en volumen y el 0,05% en peso a \alpha-tocoferol en volumen.

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En una realización preferida la emulsión estable comprende de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 15%, y preferiblemente el 10% en volumen/volumen del escualeno de aceite metabolizable. Los tensioactivos están presentes en la misma emulsión en aproximadamente el 2%. Se puede añadir aproximadamente 50 \mug de un antioxidante a la emulsión estable de la presente invención y aproximadamente el 1,75% de un agente para realizar la emulsión isotónica.

Los aceites metabolizables útiles según la presente invención incluyen escualeno, aceite de soja, aceite de sésamo y aceite MIGLYOL®810. Se prefiere el escualeno.

Los tensioactivos útiles según la presente invención son monooleato de polioxietileno sorbitán.(Tween®80, tensioactivo CAPMUL®POE-O Low PV (ABITEC Corp, Janesville, WI), polietilenglicol 660 12-hidroxiestearato (tensioactivo SO-LUTOL® HS 15) (BASF Corp., Chicago, IL) y copolímero de bloques polioxietileno-polioxipropileno (copolímero de bloques PLURONIC®F68) (polaxamer 188 de BASF Corp., Chicago, IL), clorato de sodio, glicerodeoxi colato, fosfatidil colina, prefiriéndose el copolímero de bloques PLURONIC®F68. Se ha descubierto que Tween 80 y el tensioactivo CAPMUL POE-O® Low PV producía una respuesta de tipo de histamina cuando se administraba por vía intravenosa a los perros. Otros tensioactivos adecuados incluyen esfingolípidos tales como esfingomielina y esfingosina y fosfolípidos tales como fosfatidilcolina de huevo, 1.2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, L-\alpha-fosfatidiletanolamina, y 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) o mezclas de los mismos. El DPPC es aceptable para su uso en seres humanos.

Los antioxidantes útiles en la emulsión estable de la presente invención incluyen \alpha-tocoferol y ácido ascórbico, prefiriéndose un tocoferol.

Los agentes que se pueden añadir a la emulsión de la presente invención para realizar el coadyuvante isotónico incluyen dextrosa, glicerol, manitol, sorbitol PEG 300, PEG 400 y polietilenglicol, prefiriéndose el glicerol.

En una realización particularmente preferida, un derivado atenuado de lípido A (ALD) se incorpora a las composiciones de la presente invención. Los ADL son moléculas similares a lípido A que se han alterado o construido de manera que la molécula muestra menos o diferentes efectos adversos que el lípido A. Estos efectos adversos incluyen pirogenicidad, reactividad local de Shwarzman y toxicidad como se ha evaluado en el ensayo de dosis letal al 50% de embrión de pollo (CELD_{50}). Los ADL útiles según la presente invención incluyen lípido A de monofosforilo (MLA) y monofosforil lípido A de 3-desacilado (3D-MLA). MLA y 3D-MLA son conocidos y no necesitan ser descritos en detalle en el presente documento. Véase por ejemplo la patente de los Estados Unidos nº 4.436.727 concedida el 13 de marzo de 1984, transferida a Ribi ImmunoChem Research, Inc, que revela lípido A de monofosforilo y su fabricación. La patente de los Estados Unidos nº 4.912.094 y el certificado de reexaminación B14.912.094 concedido a Myers, y cols también transferida a RibiImmunolChem Research, Inc., incorpora el lípido A monofosforilo de 3-desacilado y un procedimiento para su fabricación.

Sin entrar en detalles en las anteriores patentes, el lípido A de monofosforilo (MLA) usado en la presente memoria descriptiva se deriva del lípido A, un componente de lipopolisacáridos enterobacterianos (LPS), un potente modulador del sistema inmunitario pero altamente tóxico. Edgar Ribi y asociados consiguieron la producción de lípido A de monofosforilo (MLA) denominado originariamente endotoxina detoxificada refinada (RDE). El MLA se produce llevando a reflujo un extracto de endotoxina (LPS o lípido A) obtenido a partir de mutantes sin heptosa de bacterias gram negativo en soluciones de ácido mineral de fuerza moderada (0,1 N HCI) durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Este tratamiento da como resultado la pérdida del residuo fosfato en la posición 1 de la glucosamina de extremo reductor.

De manera coincidente, el carbohidrato del núcleo se elimina de la posición 6 de la glucosamina no reductora durante este tratamiento. El producto resultante (MLA) muestra considerables niveles atenuados de las actividades endotóxicas normalmente asociadas al material de partida de endotoxinas, tal como la pirogenicidad, la reactividad local de Shwarzman, y la toxicidad evaluada en el ensayo de dosis letal al 50% de embrión de pollo (CELD_{50}). Sin embargo, se retuvo inesperadamente la funcionalidad del lípido A y LPS como inmunomodulador.

Otra endotoxina destoxificada que se puede utiliza en la práctica de la presente invención se denomina monofosforil lípido A 3-desacilado (3D-MLA). (3S-MLA) como se establece en la patente de los Estados Unidos nº 4.912.094, el certificado de reexaminación B1 4.192.094, y difiere de MLA en que hay selectividad eliminada de la molécula MLA, el residuo de acilo B-hidroximirístico que está unidos por ésteres a la glucosamina de extremo reductor en la posición 3 en condiciones que no afectan negativamente a los otros grupos. El monofosforil lípido A 3-desacilado está disponible en Ribi ImmunoChem Research, Inc. Hamilton, Montana 59840.

La moléculas MLA y el 3DMLA son un compuesto o una mezcla de una serie de patrones de sustitución de ácidos grasos, es decir, heptaacilo, hexaacilo, pentaacilo, etc., con longitudes de cadena variable de ácidos grasos. De este modo diversas formas de MLA y 3D-MLA incluyendo las mezclas de los mismos, son abarcados por esta invención. La estructura del lípido A que se muestra en la patente 094 corresponde al producto que se obtiene por 3-desacilación dehetaacil lípido A a partir de S. minnesota R595. Otros patrones de sustitución de ácidos grados son abarcados por está invención; la característica esencial es que el material esté 3-desacilado.

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El 3D-MLA modificado utilizado en la presente invención se prepara sometiendo MLA a hidrólisis alcalina en condiciones que dan como resultado la pérdida de un único ácido graso de la posición 3 de la estructura del lípido A. El ácido graso \beta-hidroximirístico en posición 3 es inusualmente lábil en medios alcalinos. Requiere solamente un tratamiento alcalino muy ligero para 3-desacilar completamente el lípido A. Los otros ligamientos de ésteres en lípido A requieren condiciones algo más fuertes antes de que se produzca la hidrólisis de manera que sea posible desacilar selectivamente estos materiales en posición 3 sin afectar considerablemente el resto de la molécula. La razón para la inusual sensibilidad a medios alcalinos del ácido grados \beta-hidroximirístico unido por ésteres en la posición 3 no se conoce por ahora.

Aunque los procedimientos de hidrólisis alcalina son conocidos, es importante elegir las condiciones que no causa una hidrólisis adicional más allá del ligamento por esteres al \beta-hidroximirístico en posición 3.

En general la hidrólisis se puede llevar a cabo en medios acuosos u orgánicos. En el último caso, los disolvente incluyen metanol (alcoholes), dimetilsufóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), cloroformo, diclorometano, así como las mezclas de los mismos. Las combinaciones de agua y uno o más de los disolventes mencionados también se pueden emplear.

La base alcalina se puede elegir entre diversos hidróxidos, carbonatos, fosfatos y amina. Las bases ilustrativas incluyen las bases inorgánicas tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato sódico, carbonato potásico, bicarbonato sódico, bicarbonato potásico, y las bases orgánicas tales como alquilaminas, e incluyen, pero no se limitan a, dietilamina, taretilamina.

En medios acuosos el pH se encuentra típicamente entre aproximadamente 10 y 14, prefiriéndose un pH en el intervalo de aproximadamente 12 a aproximadamente 13,5. La reacción de hidrólisis se lleva a cabo típicamente a una temperatura de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 80ºC, preferiblemente aproximadamente de 50ºC a 60ºC durante un periodo de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 minutos. Por ejemplo, la hidrólisis se puede llevar a cabo en trietilamina al 3% en agua a temperatura ambiente (22º-25ºC) durante un periodo de 48 horas. El único requisito en la elección de la temperatura y el tiempo de hidrólisis es que la desacilación se produzca para eliminar solamente le \beta-hidroximirístico en la posición 3.

En la práctica se ha descubierto que un procedimiento de hidrólisis particularmente deseable implica disolver lípido A o monofosforil lípido A en cloroformo:etanol 2:1) (v/v), saturar esta solución con un tampón acuoso de 0,5 M Na_{2}CO_{2} a pH 10,5 y a continuación evaporar de manera ultrarrápida el disolvente a 45ºC-50ºC en un vacío para un aspirador (aproximadamente 10 mm Hg). El material resultante se desacila selectivamente en posición 3. Este procedimiento se puede llevar a cabo con cualquiera de las bases inorgánicas listadas anteriormente. La adición de un catalizador de transferencia de fase, tal como bromuro de tetrabutilamonio, a la solución orgánica antes de la saturación con el tampón acuoso puede ser deseable en algunos casos. Además, del MLA y el 3D-MLA producidos como se ha descrito anteriormente, se puede usar el ADL producido por procedimientos sintéticos o semisintéticos. La composición de la presente invención es un coadyuvante. Cuando se administra una cantidad eficaz de la composición a un huésped con un antígeno proteico, la respuesta inmunitaria del huésped a ese antígeno se potencia. Una cantidad eficaz de la composición coadyuvante reivindicada es una cantidad que estimula o potencia una respuesta inmunitaria. Un experto en la técnica conoce la cantidad de antígeno que es necesaria para estimular una respuesta inmunitaria a ese antígeno. Por ejemplo, 2,5 \mug de antígeno de superficie de la hepatitis B (HbsAg) administrados con una realización preferida de la presente invención indujo una respuesta humoral en los ratones.

Se ha descubierto inesperadamente que la emulsión estable de la presente invención cuando se combina con un ALD reduce considerablemente la pirogenicidad del ADL. La pirogenicidad es la producción de un estado febril por un compuesto. El ALD, 3D-MLA produce una mayor respuesta febril cuando se formula en polietilenglicol al 40%, etanol al 10% que cuando se formula en la emulsión estable de la presente invención. La pirogenicidad de una composición se puede evaluar en un ensayo estándar de pirógenos en tres conejos de la USP. En resumen, se administraron a tres conejos los compuestos a dosis variables. Se controló la temperatura corporal de cada conejo durante un periodo de 4 horas. Se registró cualquier reducción de temperatura como una elevación de cero. Una subida individual de temperatura de menos de -17,5ºC se consideró no pirogénica. Si la composición causa una subida individual de temperatura de -17,5ºC o más, se vuelve a ensayar la composición usando cinco conejos diferentes. Si sin no muestran una subida de temperatura más de tres de los ocho conejos de -17,5ºC o más y si la suma de la subida de temperatura para cada uno de los ocho conejos no sobrepasa -16,01ºC, la composición se considera no
pirogénica.

A continuación se presentan algunos ejemplos que ilustran procedimientos para poner en práctica la invención. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezclas de disolventes son en volumen a menos que se indique otra cosa.

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Ejemplo 1

Preparación de 3D-MLA/SE

En una realización particular, la emulsión estable de la presente invención comprende lo siguiente:

Material

Cantidad

3D-MLA

1,200-0,005% p/v

escualeno

10,000% v/v

copolímero de bloques PLURONIC-F68®

0,091% p/v

fosfatidil colina de huevo

1,909% p/v

glicerol

1,800% v/v

\alpha-tocoferol

0,050% p/v

agua para inyección

78,200% v/v

tampón amonio fosfato

10,000% v/v.

Sería evidente para un experto en la técnica la manera de preparar l emulsión reivindicada. Sin embargo, se ha descubierto que la emulsión reivindicada se prepara más fácilmente fijando tres soluciones madre: Solución madre de MLA/PC de huevo, solución madre de aceite y solución madre acuosa.

Para preparar la solución madre de MLA/Pc de huevo, monofosforil lípido A 3-desacilado (3d-MLA) (Ribi ImmunoChem Research, Inc. Hamilton, MT) y fosfatidil colina de huevo (PC de huevo) se disuelven cada uno en 4:1 cloroformo: metanol (C:M). Las soluciones se combinan entonces y se deja que C:M se evapore. El resto de C:M se elimina colocando la mezcla en un liofilizador y manteniéndola aproximadamente 1-2 horas a una presión reducida.

Una solución madre de fase aceite se prepara combinando \alpha-tocoferol y escualeno y dándoles vueltas en un baño de agua calentada hasta que se disuelvan.

Una solución madre de fase acuosa se preparar pesando copolímero de bloque PLURONIC F-68 NF y glicerol en una botella de tapón de rosca. El agua para inyección se añade a la botella que se calienta y se mezcla suavemente hasta que los ingredientes se disuelven. Se añade 0,25 M de tampón amonio fosfato, pH 5,1 \pm 0,005 al copolímero de bloque PLURONIC® F-68 NF/glicerol/agua. Se añade agua adicional para alcanzar el volumen deseado.

Para preparar la emulsión estable se combina la solución madre de fase aceite con la mezcla MLA/PC de huevo. La mezcla se sonica hasta que se disuelve MLA. A continuación, se calienta fase aceite a 75ºC mientras la fase acuosa se calienta a 75ºC. La mezcla de fase aceite MLA/PC de huevo se emulsiona con un emulsionante Silverson mientras la fase acuosa se añade lentamente. La emulsión SE resultante tiene un HLB de 8,0 y se enfría a temperatura ambiente en un baño de hielo. La emulsión se puede homogeneizar además usando un homogeneizador Avestin C-50 a una presión de 1457,12-1758,09 kg/cm^{2} en la válvula hasta que la dimensión de partícula es \leq 0,2 \mum. El producto coadyuvante final se filtra usando un filtro de membrana hidrofílica de 0,2 \mum. Las etapas para una homogeneización adicional y una esterilización del filtro terminal no afecta a la cantidad de 3D-MLA presente en la composición o la coadyuvanticidad de la preparación.

Ejemplo 2

Generación de una respuesta de anticuerpo usando 3D-MLA/SE

A los ratones se le dio una inmunización primaria (1º) de 2,5 \mug de antígeno de superficie de la hepatitis B (HbsAg) formulada en el coadyuvante preparado en el Ejemplo 1 el día 0. Se les dio inyecciones subcutáneas (200 \mul por inyección). El día 21 se les dio a los ratones una inmunización secundaria (2º) administrada (200 \mul por inyección). Los ratones fueron sangrados el día 19 después de la inmunización primaria (día 19 post1º) y el día 27 después de la inmunización secundaria (día 27 post2º). Se recogió el suero y se ensayó por Elisa estándar para anticuerpo anti-HbsA, La tabla 1 muestra que la composición coadyuvante de la presente invención induce la producción de anticuerpos anti-HbsAg en un animal cuando se administra ese antígeno al animal.

TABLA 1 Valores de anticuerpos anti-HbsAg generando usando 3D-MLA-SE

1

Ejemplo 3

Estimulación de una respuesta linfocítos T citotóxicos

A) La inducción de una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) después de la administración de la composición coadyuvante de la presente invención y un antígeno proteico se detectó por un ensayo de citotoxicidad. A los grupos de ratones C57/BL/6 se les dio una inmunización primaria por vía subcutánea (región inguinal) con 1,0 \mug de antígeno de superficie de hepatitis B (HbsAg) formulado en el vehículo de emulsión estable de la presente invención (SE) y 3D-MLA/SE. Se preparo MLA/SE como en el ejemplo 1. Para ensayar la estabilidad de la emulsión estable reivindicada, la emulsión se diluyó 1/10 siete días antes de mezclarla con el antígeno o el día de inmunización. El volumen inyectado fue de 200 \mul. Catorce días más tarde tres ratones por grupo experimental fueron sacrificados y se les retiro el bazo y se mezclaron como suspensiones celulares únicas y se contaron. A los ratones que permanecieron en cada grupo se les dio una segunda inmunización por vía subcutánea(región inguinal) con 1,0 \mug de HbsAg formulada en el vehículo SE y el coadyuvante 3D-MLA/SE. Catorce día más tarde todos los ratones de cada grupo experimental fueron sacrificados y se les retiró el bazo se mezclaron como suspensiones celulares únicas y se contaron.

Las células de bazo (75 x 10^{6} células en 3-4 ml de medio) de los grupos experimentales se colocaron en un matraz en forma de T de 25 cm^{2}. A continuación se añadió al matraz 1,0 ml de células (E.G7 (OVA) irradiadas (20.000 rads) a 5 X 10^{6}/ml- el volumen se llevó a 10 ml. Los cultivos se mantuvieron colocando los matraces en forma de T en vertical en una incubadora a 37ºC, y 5% de CO_{2} durante cuatro días. El día 4 se recuperaron las células supervivientes de los matraces, se lavaron 1X, se volvieron a suspender en 5,0 ml y se contaron.

Las células efectoras recuperadas se ajustaron a 5 x 10^{6} células viables/ml y 100 \mul/pocillo de medio como un diluyente. A continuación, se añadieron volúmenes de 100 \mul de dianas ^{51}C-marcadas (véase más adelante) [E-G7 (OVA) un línea celular EL-4 transfectada de gen de ovalbumina] a 1 X 10^{5} células/ml a los pocillos. Los pocillos de liberación espontánea (SR) contenían 100 \mul de dianas y 100 \mul de medio. Los pocillos de liberación máxima (MR) contenían 100 \mul de dianas y 100 \mul de detergente (Tween 20 al 2%) Las relaciones Efector/diana (E/T) fueron de 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1. Las placas se centrifugaron a 400 Xg y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 4 horas. Después de la incubación se recogieron los sobrenadantes de los pocillos usando un sistema de recogida de sobrenadante Skatron

2

Las células diana, E.G7 (OVA) se marcaron con ^{51}C(Cromato de sodio) como sigue. En un volumen total de 1,0 ml se mezclaron 5 x 10^{6} células diana y 250 \muCi de ^{51}Cr en 15 ml de tubo cónico. Las suspensiones de células se incubaron en un baño de agua a 37ºC durante 90 minutos, con mezcla suave cada 15 minutos. Después de la incubación las células marcadas se lavaron 3X por centrifugación y se decantaron con volúmenes de medio de 15 ml. Después de la tercera centrifugación las células se volvieron a suspender en 10 ml de medio fresco y se las dejaron reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos y a continuación se centrifugaron. Las células se volvieron finalmente a suspender en el medio a 1 x 10^{5} células/ml. Los resultados del ensayo de citotoxicidad se presentan en las Tablas 2 y 3.

TABLA 2 Respuesta citotóxica 14 días después 1º

3

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TABLA 3 Respuesta citotóxica del día post 2º

4

B) La administración de 3D-MLA/SE y un antígeno proteico indujo tanto una respuesta de linfocitos T citotóxicos como la producción de antígeno en los ratones tratados. Los ratones BALB/c se inmunizaron por vía subcutánea con 2,0 \mu de HbsAg + 25 \mug de 3D-MLA/SE el día 0 (1º) y el día 21 (2º). Se llevaron a cabo ensayos de CTL como anteriormente. Se preparo el coadyuvante 3D-MLA/SE como en el ejemplo 1. La Tabla 4 ilustra que se indujo una respuesta de linfocitos T citotóxicos.

TABLA 4 Respuesta citotóxica

5

Los resultados del valor de anticuerpos a HbsAg se muestran en la Tabla 5. Los sueros de sangres tomados el día 28 post2º se valoraron sobre placas de ELISA revestidas bien con HbsAg o un péptido de 28 aminoácidos (p72) que contiene epítopes de células B encontrados en la región S, residuos 110-137,del HbsAg.

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TABLA 5 Valor anticuerpos antihepatitis en ratones tratados

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Los ratones tratados con 3-DMLA/SE mostraron tanto respuestas humorales como citotóxicas de linfocitos T al antígeno de superficie de hepatitis B.

Ejemplo 4

Evaluación de 3-DMLA/SE para pirogenicidad

Se evaluó el coadyuvante 3D-MLA/SE en el ensayo estándar de pirógenos en tres conejos la USP (NAMSA, Northwood, OH) se comparó el coadyuvante 3D-MLA/SE de la presente invención con 3D-MLA formulado en propilenglicol (PG) al 40% y etanol (EtOH) al 10%) que se evaluó a niveles de dosis de 5, 8, 11, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35 \mug/kg a lo largo de dos tandas experimentales- La formulación de 3D-MLA/SE se evaluó en el mismo ensayo de pirógeno en conejos a niveles de dosis de 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350 \mug/kg a lo largo de dos tandas experimentales. Las dosis pirogénicas y las dosis pirogénicas fronterizas se dieron por definiciones establecidas de la USP. Una dosis pirogénica fronteriza fue una dosis donde al menos uno de los tres conejos tuvo una subida de temperatura pico \geq 0,5ºC por encima de la línea basal durante tres horas después de la dosis.

TABLA 6 Pirogenicidad de 3D-MLA en PG al 40% EtOH al 10%

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TABLA 6B Pirogenicidad de 3D-MLA/SE

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El coadyuvante 3D-MLA/SE se evaluó otra vez para pirogenicidad y se comparó con 3D-MLA formulado en EtOH al 10%.

TABLA 7 Pirogenicidad de 3D-MLA/SE vs D-MLA en EtOH al 10%

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Hay un diferencial de diez veces en la pirogenicidad con una dosis de 20 \mug/kg de 3D-MLA en PG al 40%/EtOH al 10% que es pirogénica fronteriza, y una dosis de 200 \mug/kg para 3D-MLA/SE definida como dosis pirogénica umbral. El coadyuvante 3D-MLA/SE fue considerablemente menos pirogénico que otras formulaciones del compuesto (Tablas 6 y 7. Igualmente, la composición coadyuvante de la presente invención es segura en la producción de lesiones relacionadas con los fármacos que son mínimas o ninguna en los sitios de inyección, nódulos linfáticos que drenan los sitios de inyección y los bazos.

Se ha de entender que los ejemplos y realizaciones descritos en la presente memoria lo son a título ilustrativo únicamente y que diversas modificaciones o cambios a la vista de los mismos serán sugeridos a los expertos en la técnica y se habrán de incluir dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (6)

1. Una composición coadyuvante constituida por 25 \mug de 3D-MLA y una emulsión de aceite en agua que comprende aceite metabolizable, uno o más tensioactivos, un antioxidante y un componente para realizar la emulsión isotónica.

2. La composición coadyuvante de la reivindicación 1, en la que dicho aceite metabolizable es escualeno.

3. La composición coadyuvante de la reivindicación 1, en la cual uno o más tensioactivos se seleccionan a partir del grupo constituido por monooleato de polioxietileno sorbitán.(Tween®80, CAPMUL®POE-O), polietilenglicol 660 12-hidroxiestearato (tensioactivo SOLUTOL® HS 15), copolímero de bloques polioxietileno-polioxipropileno (copolímero de bloques PLURONIC®F68) clorato de sodio, glicerodeoxi colato, esfingomielina esfinosina, 1.2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, L-\alpha-fosfatidiletanolamina, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina y fosfatidil colina de huevo, o una mezcla de los mismos.

4. La composición coadyuvante de cualquier reivindicación anterior, en la cual dicho antioxidante se selecciona del grupo constituido por \alpha-tocoferol y ácido ascórbico.

5. La composición coadyuvante de la reivindicación 4, en la cual el antioxidante es \alpha-tocoferol.

6. Una composición de vacuna que comprende un antígeno proteico y una composición coadyuvante según las reivindicaciones 1-5.