CN1048731C

CN1048731C - 编码细胞因子抑制性抗炎药物结合蛋白质的多核苷酸

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Publication number: CN1048731C
Application number: CN94194056A
Authority: CN
Inventors: J·C·－L·李; J·L·阿当斯; T·F·加拉赫; D·W·格林; J·R·海斯; P·C·麦唐奈尔; D·E·麦努蒂; J·E·施蒂克勒; P·R·杨格
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1993-09-17
Filing date: 1994-09-16
Publication date: 2000-01-26
Anticipated expiration: 2014-09-16
Also published as: AU7798594A; CA2171982C; ES2140561T3; JP3377529B2; GR3032635T3; CN1134704A; DK0724588T3; EP0724588B1; CA2171982A1; AU686669B2; NZ274063A; EP0724588A4; HK1012399A1; JPH09502873A; US5777097A; US5955366A; EP0724588A1; US5871934A; PT724588E; DE69421624T2

Abstract

本发明涉及编码细胞因子抑制性抗炎药物(CSAID)结合蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸可以用于评价和鉴定这一药理学类别药物的筛选方法。

Description

编码细胞因子抑制性抗炎药物结合蛋白质的多核苷酸

发明领域

发明背景

细胞因子在调节炎症期间的细胞反应和其他免疫功能中起着重要作用。特别令人感兴趣的细胞因子是参子炎症级联反应之初始阶段的细胞间蛋白质白介素1(IL-1，α和β)及肿瘤坏死因子(TNF，α和β)(Arai，et al.，Ann.Rev.Biochem.，59，783-836(1990))。因此，近年已就在炎性刺激的反应中干扰IL-1和TNF产生问题进行了大量研究。

一种治疗方法包括在转录和/或翻译和/或分泌水平上抑制IL-1和TNF的产生。与某些吡啶基咪唑类相关联的活性导致一类称为“CSAID”或细胞因子抑制性抗炎药物之化合物的产生(图1)。这些化合物似乎之主要是在翻译水平上阻止IL-1和TNF的表达。虽然也已观察到对转录的较小影响，但不能排除对其他步骤的影响。

吡啶基咪唑，5-(4-吡啶基)-6(4-氟苯基)-2，3-二氢咪唑并(2，1-b)噻唑(SK & F 86002)被鉴定为原型CSAID。已确定并定性了其活性基础(Lee，et al.，Int′l.J.Immunopharm.，10(7)：835-843(1988)：Agents and Actions 27(3/4)，277-279(1989)和Int′l.J.Immunother.6(1)：1-12(1990))。SAR研究(本文中讨论的)提示吡啶基咪唑的细胞因子抑制作用代表了一种不依赖于其抑制类十二烷(eicosanoid)和白细胞三烯产生的独特活性。然而，没有一种最初系列的化合物是对细胞因子抑制活性有选择性的，或者是特别有效力的。

因为CSAID具有作为新的抗炎治疗剂的实质性潜力，所以对于定性其在分子水平上的作用机理以及得到有更高选择性和效力的化合物特别感兴趣。特别是，鉴定和定性CSAID分子靶有利于了解涉及炎症的生物化学过程并有助于设计和筛选更有效的抗炎药物。本发明还公开了纯化和定性这些CSAID结合蛋白质(CSBP)的方法。

本发明的DNA，例如本文公开的特异性序列适用于编码为表达新的CSBP所需的遗传信息。另外，可使用这些序列作为探针以分离和鉴定CSBP家族的其他成员，以及形成对以CSBP基因的不正常表达为特征的疾病状况进行反义治疗的基础。该新的蛋白质本身可直接用作治疗或诊断剂，以及用作筛选CSAID结合活性拮抗剂或激动剂化合物之***中的成分。该蛋白质还可用于在异源物种中引发抗体产生，所说的抗体则适用于前述诊断、治疗和筛选目的。在阅读本说明书后，本领域普通技术人员将会进一步了解本文所述之试剂的这些和其他应用。

发明概要

本发明提供经分离的编码CSAID结合蛋白质的核酸分子。包括mRNA、DNA、cDNA及其反义类似物和其有生物学活性的、治疗或诊断上有用的片段。

本发明还提供重组载体，如在重组生产CSAID结合蛋白质或肽中用作试剂的克隆和表达质粒，以及含有编码CSBP之核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。

本发明还提供通过检测待鉴定配体相对于已知配体的结合能力，以鉴定能够与CSBP结合之配体的方法。

本发明还提供用于筛选药物以鉴定与CSBP反应并结合之化合物的方法。该结合蛋白质可以是在溶液中的被分离形式的或固相化形式的，或者是经过遗传工程化改造而将在重组宿主细胞的表面上如在噬菌体显示***中或作为融合蛋白质表达的。或者，可以在筛选程序中利用含有CSBP的全细胞或胞质部分。不管结合蛋白质的形式如何，均使多数化合物在足以形成化合物/结合蛋白质复合物的条件下与结合蛋白质接触，并检测能够形成、增强或干扰所说复合物的化合物。

本发明还提供包含有足够长度以与CSAID结合蛋白质样序列特异性结合之核酸分子的核酸探针。

本发明还提供反义寡核苷酸，其具有能够与编码CSBP的mRNA结合，从而阻止所说mRNA翻译的序列。

本发明还提供包含或缺少编码CSBP之核酸分子的转基因非人类动物。另外也提供了使用所说的转基因动物作为模型，用于不同的结合蛋白质表达、突变和SAR评价及配体和药物筛选的方法。

本发明还提供融合蛋白质，其包括CSAID结合区域和能够提供分析上可检测之信号的结合蛋白质/配体结合指示区域。同时也提供了经形成、增强或干扰可检测信号以筛选药物的方法。

本发明还提供筛选化合物以鉴定那些与CSAID结合蛋白质结合之化合物的方法，该方法包括：提供在其表面上表达CSAID结合蛋白质的重组宿主细胞，所说的蛋白质与能够在对某种化合物与所说蛋白质结合的反应中提供可检测信号的第二种成分相联系；使许多候选化合物在足以允许化合物与结合蛋白质结合的条件下与所说的宿主细胞接触；并经检测由所说的第二种成分产生的信号来鉴定那些能够结合的化合物。

附图简要说明

图1显示吡啶基咪唑CSAID对THP.1细胞和人单核细胞中IL-1β生物合成之IC₅₀的相关性。制备50种化合物抑制IL-1或TNF的IC₅₀的双对数(Log-Log)散布图。进行回归分析并求得相关系数为0.881。

图2举例说明时间依赖性和³H-化合物I在完整THP.1细胞中的可逆摄入。在有(50μM)或没有(0-0)过量非放射活性配体化合物I(方块)和化合物VIII(三角)存在下，将2×10⁶个THP.1细胞单独(适当的溶剂对照)或与放射标记的化合物I(50nM)一起保温。在不同的间隔期，在8％蔗糖垫层上离心细胞并经闪烁计数估计细胞沉淀物的放射活性。在15分钟时达到饱和结合。

图3图解显示结合活性的亚细胞定位。10×10⁶个THP.1细胞在22℃下与50nM放射标记的化合物I共同保温30分钟。经dounce匀浆破碎细胞。经差速离心将细胞裂解物分级分离成核、颗粒和可溶性部分。大部分放射活性与胞质部分相联系。在结合试验中使用以前分级分离的样品获得了相同的结果。

图4显示THP.1胞质结合化合物I的结合等温线和Scatchard作图分析。在使用粗制THP.1胞质进行的结合试验中，在恒定过量冷配体(50μM)存在下滴定放射标记的化合物(0到1μM)。特异结合是可饱和的。Scatchard作图分析证明Kd值为3.6nM，Bmax为5pmol/mg蛋白质，并且证明了单一位点结合。

图5图解显示CSAID结合活性的特异性。在其中使用放射标记的化合物I的竞争结合试验中，试验大量以已知的细胞因子合成抑制作用的IC₅₀值跨三个不同结构类别的吡啶基咪唑化合物。两种活性间存在高度相关性(R＝0.889)，提示在抑制细胞因子产生中结合过程是必不可少的步骤。

图6图解显示CSAID的区域选择性。在生物检测和竞争性结合检测法中试验四对区域异构形式的CSAID。只有一个个别对的异构形式在两检测法中有相同IC₅₀的活性。

图7举例说明放射标记的SB 202190的结合是可饱和的、特异的和可逆的。将THP.1胞质与50nM放射标记的SB化合物I一起保温15分钟以使可饱和结合达到平衡，此时加入30μM冷配体并在不同的间隔期检测特异结合。与化合物VII的结合是可逆的，与化合物XI的结合程度较小并且完全不与化合物VIII结合，在生物检测法中这些化合物的IC50值分别为20nM、50nM和＞5μM。

图8说明CSAID结合活性是对蛋白酶和热敏感的。对THP.1胞质进行胰蛋白酶(100μg/ml)(A图)和热(56℃)(B图)处理。在用胰蛋白酶处理后的2分钟内达到结合活性的最大消除。于56℃保温后结合活性消除，显示了在37℃逐步丢失结合活性并在22℃和4℃分别保持相对稳定。

图9显示用SDS-PAGE和放射自显影术分析CSBP的光亲和标记。约40μg蛋白质加凝胶上方所列抑制物(10μM)预保温，然后用¹²⁵I-化合物IV(2.5nM)进行光亲和标记。用本文所述的SDS-PAGE和放射自显影方法分析反应情况。

图10显示对得自制备性等电聚焦的各分离物部分所作的分析果。将用¹²⁵I化合物IV标记的蛋白质加到Rainin RF3柱上并用本文所述方法进行分析。

图11用(A)SDS-PAGE和银染色，及(B)放射活性检测法分析各制备性SDS-PAGE部分的结果。按下文所述方法分析各分离部分内容物。

图12图解显示在分析CSBP和MAP激酶期间发现的独特氨基酸序列的同源性。线性图解下方列出MAP激酶之15个残基的肽序列(SEQID NO：1)；9个完全相同(60％)；13个完全相同或同源(87％)。

图13显示CSAID结合蛋白质之一部分的核酸序列(SEQ ID NO：6)和氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。

图14显示CSAID结合蛋白质之第二部分的核酸序列(SEQ ID NO：8)。

图15图解显示本文所述的各种CSBP cDNA。

图16显示本文所述的一种CSBPs的cDNA(SEQ ID NO：11的核苷酸356-1467)。

图17显示CSBP-1和CSBP-2之间的核苷酸(SEQ ID NOS：11和13的核苷酸1054至1128)和氨基酸(SEQ ID NOS：12和14的氨基酸230至255)序列差异。

图18显示各种蛋白质激酶的***树。

图19显示CSBP-1(SEQ ID NO：12)和CSBP-2(SEQ ID NO：14)与选择的蛋白质激酶家族的成员的一一对齐的氨基酸序列。

图20显示在大肠杆菌中表达CSBP(SEQ ID NOS：12或14)的结果。

图21显示CSBP-1 cDNA(SEQ ID NO：11)的全长度核酸序列。

图22显示CSBP-2 cDNA(SEQ ID NO：13)的全长度核酸序列。

发明的详细描述

在进一步描述发明时将使用有下文指出的定义的下列术语。

“抗原”是指含有一个或多个表位的分子，这些表位将刺激宿主的免疫***以产生体液和/或细胞的抗原特异性反应。在本文中该术语也与“免疫原”互换使用。

术语“表位”是指抗原或半抗原上与特异性抗体分子结合的位点。该术语在本文中也与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。

“融合蛋白质”是由于表达至少两种有效连接的异源编码序列所得到的蛋白质。融合蛋白质的一个例子是包含CSAID结合蛋白质或其片段和第二种无关肽序列的蛋白质。

当RNA聚合酶将两个编码序列转录成单一mRNA时，编码序列即“有效地连接到”另一个编码序列上，然后所说的单一mRNA被翻译成具有衍生于两编码序列之氨基酸的单一多肽。只要被表达的序列最终被加工以产生所需的蛋白质，编码序列即不必是彼此邻接的。

“重组”多肽是指以重组DNA技术产生的多肽；即从编码所需多肽之外源DNA构建体转化的细胞产生的多肽。“合成”多肽是以化学合成方法制备的多肽。

“复制子”是有DNA体内自身复制单位功能的，即能够在其自身控制下复制的遗传元件(如质粒、染色体、病毒)。

“载体”是一种复制子，如包括质粒、噬菌体或粘粒(cosmid)，在其上面可连接另一DNA片段以引起被连接片段的复制。

“双股DNA分子”是指包括松弛的或超螺旋的双股螺旋的多聚形式的脱氧核糖核苷酸(碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)。该术语仅指分子的一级和二级结构，并且不限于任何特殊三级结构形式。因此，该术语包括特别见于线性DNA分子(如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中的双股DNA。在讨论特定双股DNA分子的结构时，本文中按照只给出沿着非转录DNA链(即具有与mRNA同源之序列的链)之5′至3′方向的序列的正常惯例来描述序列。

某特定蛋白质的DNA“编码序列”或“编码核苷酸序列”是当置于适当的调节序列控制之下时，被转录和翻译成多肽的DNA序列。

“启动子序列”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并启动下游(3′方向)编码序列转录的DNA调节区。为了限定本发明之目的，启动子序列在3′末端被编码序列的翻译起始密码子(如ATG)结合，并向上游(5′方向)延伸以包括为在本底以上的可检测水平上起始转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列之内将会发现转录起始位点(用核酸酶S1经制作酶切图谱而易于限定)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合区域(共有序列)。真核启动子将常常但不总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子含有Shine-Dalgarno序列，还含有-10和-35位共有序列。

DNA“控制序列”总体上是指总地为在宿主细胞中表达(即转录和翻译)编码序列的启动子序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节区域、增强子等。

当RNA聚合酶结合启动子序列并将编码序列转录成mRNA，然后mRNA翻译成由编码序列编码的多肽时，控制序列即“指导”编码序列在细胞内的“表达”。

“宿主细胞”是已经被外源DNA序列转化或转染，或者能够被转化或转染的细胞。

当外源DNA已被导入细胞膜内时细胞即已被这样的外源DNA“转化”。外源DNA可以被或未被整合(共价连接)到构成细胞基因组的染色体DNA中。例如在原核细胞和酵母中，外源DNA可被保留在附加型元件如质粒上。就真核细胞来说，被稳定地转化或转染的细胞是其中外源DNA已被逐渐整合到染色体内，从而由子代细胞通过染色体复制而被遗传下来的细胞。可根据真核细胞确立包含携带外源DNA之子代细胞群体的细胞系或克隆的能力来证明这种稳定性。

“克隆”是通过有丝***而由单一细胞或共同祖先细胞衍生的细胞群体。“细胞系”是能够在体外稳定地生长许多代之原代细胞的克隆。

当两个DNA或多肽序列在限定的分子长度范围内至少约85％(较好至少约90％，最好至少约95％)的核苷酸或氨基酸相吻合时，则它们是”基本上同源”或“基本上相同”的。本文所说基本上同源还指显示与特定的DNA或多肽序列等同的序列。例如可在为特定***而限定的严格条件下，经Southern杂交实验鉴定基本上同源的DNA序列。限定适当的杂交条件是本领域技术人员已知的，例如可参见“Current Protocols in Mol.Biol.”，Vol.I & II，WileyInterscience，Ausbel，et al.(ed.)(1992)。可使用蛋白质消化、凝胶电泳及微量测序方法鉴定实质上相同的蛋白质序列。

术语“功能性等同物”，就CSBP来说是指主题蛋白质的氨基酸序列是表现有本文所述之CSAID结合活性的氨基酸序列。

DNA构建体的“异源”区是在另一个未发现与自然界的其他分子相联系的DNA分子内的或连接到该DNA分子上的可鉴别的DNA片段。因此，当异源区编码一受体基因时，该基因通常将侧接有并不侧接来源动物之基因组中基因的DNA。异源编码序列的另一个例子是其中编码序列本身并未见于自然界的构建体(例如，具有不同于天然基因之密码子的合成序列)。如本文所用的等位变异，或者切接或自然发生的突变过程并不产生DNA的异源区。分子试剂的研制放射配体合成

为了分离和纯化本发明的CSBP，首先必须提供几种标记的分子试剂。选用苯酚三芳基咪唑即化合物I作为一种可替代的放射配体，这是因为它具有毫微摩尔水平的活性，并且很容易在氘气体存在下通过相应芳基溴的催化还原来合成该放射标记的化合物。按下述反应程序制备化合物I：

4-(氟苯基)-2-(4-羟基苯基-3，5-t₂)-5-(4-吡啶基)咪唑(化合物I)的制备

将2.9mg(0.0059mmol)部分的2(3，5-二溴-4-羟基苯基)-4-(4-氟苯基)-5-(4-吡啶基)咪唑即化合物I(p)溶解于装在配有小磁力搅拌棒之2.4ml园底烧瓶内的0.95ml无水DMF和0.05ml三乙胺中。加入1.7mg部分的5％Pd/C(Engelhard lot28845)，并将烧瓶接到不锈钢氚歧管上。通过四次冷冻-泵-融化循环使混合物脱气，然后导入氘气体(5.3 Ci，0.091mmol)。使反应混合物升温至室温并强烈搅拌20小时。在液氮中冷冻混合物，除去剩余的氚气体(2.4Ci)，并从岐管上去掉烧瓶。使用3×1ml甲醇作为冲洗液将反应混合物转移到10ml园底烧瓶中，并经静态真空转移除去溶剂。向残留物中加入1.5ml甲醇，然后经静态真空转移除去。重复较后操作。最后，将残留物悬于1.5ml乙醇并通过注射器尖Millipore滤器(0.45微米)过滤，并进行3×约1ml乙醇冲洗。测得总滤液体积为3.9ml，总放射活性为94.2mCi。测得溶液为3.9ml，且总放射活性为94.2mCi。对滤液进行HPLC分析(Partisil 5ODS-3，4.6mm I.D.×25cm，流速1ml/分钟的70∶30∶0.1水/乙腈/三氟乙酸，Radiomatic Flo-One Beta放射检测器，通过0.75ml样品槽的3ml/分钟的Ecoscint-H混合物)显示存在化合物I(Rt＝60分钟，总放射性的大约37％)，和推测为单溴衍生物化合物Ia(R_t＝11.8分钟，约9％)的离散的中间体。

用氮气流蒸发滤过溶液至干，并将残留物溶解在大约1.2ml HPLC流动相中。

用如下所示的HPLC方法分离溶液，并分别收集相当于化合物I和Ia及SB的峰值部分。HPLC方法柱 Altex Ultrasphere，10mm I.D.×25cm流动相 70∶30∶0.1水/乙腈/三氟乙酸流速 5ml/分钟UV检测 210nm注射体积 0.05-0.4ml滞留时间 7.8分钟，化合物I；

24分钟，化合物Ia。

合并的化合物I级分总体积为32ml，且放射活性浓度为1.52mCi/ml(总计48.6mCi)。将合并的SB化合物Ia[³H]部分(总共10.1mCi)蒸发至干，并使用3.8ml无水乙醇将残留物定量转移到玻璃瓶中，以备进一步分析。

在真空中将8ml(12.2mCi)化合物I部分真空＜35℃蒸发至干，然后重新溶解在0.5ml流动相中。将整个体积的材料注射到上述的HPLC***中，并收集适当的峰值部分。在真空中于35℃以下蒸发收集的洗脱物并将黄色残留物转移到包含化合物I之无水乙醇溶液(3.8ml，2.44 mCi/ml)的小瓶中。首先使用氮气流将用于NMR分析的该溶液部分蒸发至干，然后重新溶解于CD₃ OD中。

分析4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基-3，5-t₂)-5-(4-吡啶基)咪唑，化合物I。用HPLC方法检测放射化学纯度方法柱 Ultrasphere Octyl，5μm，

4.6mm I.D.×25cm，Beckman流动相 350∶150∶0.5(v/v/v)

水/乙腈/三氟乙酸流速 1.0ml/分钟整体测定 UV，210nm(Mass detection)放射活性检测 Ramona-D放射活性流动检测器闪烁器 Tru-Count(Tru-Lab Supply Co.)流速 5.0ml/分钟细胞体积 0.75ml滞留时间 7.7分钟结果 98.7经闪烁计数检测放射活性浓度方法闪烁器 Ready Safe(Beckman Instruments，Inc.)装置 TM Analytic 6881型效率根据骤冷曲线进行自动DPM计数结果 2.44mCi/ml用质谱法检测比活性方法 CI-MS，NH₃试剂气体结果 20.0Ci/mmol

³H分配：未标记的 44％

单标记 43％

双标记 13％³H NMR⁹方法装置 Brunker AM 400实验质子去偶联的³H NMR

质子未去偶联的³H NMR

质子未去偶联的³H NMR峰值参比甲醇的溶剂峰3.3溶剂甲醇-d₄结果氘独特地掺入到芳香羟基基团邻位碳原子上分析总结

检测法结果

经HPLC确定的放射化学纯度 98.7％

闪烁计数确定的放射活性浓度 2.44mCi/ml

质谱确定的比活性 20.0Ci/mmol

³H NMR 与所提议的结构一致

光亲和放射标记的配体

此外，还合成光亲和放射标记物。理想的放射光亲和试剂应具有亚微摩尔的结合亲和力和便于连接放射标记物(较好是γ发射体)的位点并允许定位接近结合位点的光反应性基团(如叠氮化物)。下列表I中举例显示导致建议以化合物IV为光亲和试剂之候选物的SAR。

表I

化合物	X	生物检测法IC50，μM	化合物	Y-	生物检测法IC50，μM
化合物	X	生物检测法IC50，μM	化合物	Y-	生物检测法IC50，μM	IIa	4-F	＞0.1	IIIa	H	0.15
IIb	4-H	0.5	IIIb	4-N3	0.05	IIa	4-F	＞0.1	IIIa	H	0.15
IIb	4-H	0.5	IIIb	4-N3	0.05	IIc	4-Cl	0.05	IIIc	3-I-4-NH₂	0.48
IId	3-Cl	0.04	IIId	4-NH₂	0.28	IIc	4-Cl	0.05	IIIc	3-I-4-NH₂	0.48
IId	3-Cl	0.04	IIId	4-NH₂	0.28	IIe	2-Cl	0.25
IIf	4-I	0.58				IIe	2-Cl	0.25
IIf	4-I	0.58				IIg	3-I	0.05

另外，通常还利用特异性ELISA检测法确定IL-1β和TNFα水平(参见PCT申请US 93/00674和US 93/00675)

按照下述程序，利用钯介导的芳基碘的甲锡烷基化和继后的亲电子放射性碘标记合成放射性碘标记的光亲和标记物化合物IV。

方法描述

合成并纯化4-[2-(4-叠氮苯基)-5-(3-¹²⁵碘-苯基)-1H-咪唑-4-基]吡啶

将[3-[2-(4-叠氮苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]苯基]-三丁基甲锡烷，化合物IV(p)(250μg，0.398μmol)溶解在100μl加于乙醇中的3％乙酸中。向该溶液内加入溶于11.4μl水的2.85μg氯胺T水合物(0.013μmol)和溶于45μl 0.1N氢氧化钠的5.19mCi(¹²⁵I)碘化钠。加入另外50μl溶于乙醇的3％乙酸以使反应混合物均匀。室温下(在暗处)将反应混合物搅拌60分钟。然后在干燥氮气流下将反应混合物风干并使残留物分配于氯仿(1ml)和饱和碳酸氢钠水溶液(1ml)之间。用氯仿(2×1ml)提取水层，合并有机相并通过装有颗粒硫酸钠的吸移管干燥之。在干燥的氮气流下除去溶剂；发现残留物含有4.36mCi碘-125(在Capintec剂量校准器上检测)。发现水层含有310μCi碘-125。将有机相的残留物重新溶解在80μlHPLC流动相中并在BakerSiO₂柱(5μm，4.6mm I.D.×250mm)上纯化之，其中使用90∶10∶1(v/v/v)己烷/异丙醇/三乙胺以1.5ml/分钟的流速进行洗脱，并于260nm处进UV监测。合并产物部分并在干燥的氮气流下风干。将产物重新溶解在3.0ml无水乙醇中。该方法得到3.60mCi的化合物IV，其放射化学纯度为99.0％，放射活性浓度为1.20mCi/ml，且比活性为1736Ci/mmol。

分析4-[(2-叠氮苯基)-5-(3-碘-¹²⁵I-苯基)-1H-咪唑-4-基]吡啶，化合物IV。经HPLC分析放射化学纯度方法柱 Baker，Sio₂，5μm，120A，

4.6mm I.D.×25cm流动相 90∶10∶1(v/v/v)

己烷/异丙醇/三乙胺流速 1.3ml/分钟质量测定 UV.260nm 放射活性测定

检测器 β-RAM放射活性流动检测器

闪烁器 Tru-Count(Tru-Lab Supply Co.)

流速 5.0ml/分钟

细胞容积 0.8ml

滞留时间 17.0分钟

结果 99.0％经HPLC检测整体浓度

方法

柱 Baker，Sio₂，5μm，120A，

4.6mm I.D.×25cm

流动相 90∶10∶1(v/v/v)

己烷/异丙酵/三乙胺

流速 1.5ml/分钟

整体测定 UV，260nm

滞留时间 11.2分钟

结果 99.0％以闪烁计数法检测放射活性浓度-外标标准法

方法

溶剂 Ready Safe(Beckman)

装置 TM Analytic 6881型

效率根据骤冷曲线进行自动DPM计算

结果 1.2mCi/ml根据整体和放射活性浓度得出比活性

方法根据整体和放射活性浓度求得

结果 1736Ci/mmol

分析总结

检测法结果

经HPLC检测放射化学纯度 99.0％

经HPLC检测整体浓度 0.32μg/ml

放射活性浓度 1.2mCi/ml

根据整体和放射活性浓度

得出的比活性 1736Ci/mmol

在竞争结合试验中光亲和标记物具有0.5-0.8μM的IC₅₀，在CSAID生物检测法则IC₅₀值为3μM。

CSAID生物检测法

用于估计CSAID活性的生物学检测法是IL-1依赖性EL-4/IL-2诱导检测法(Simon，P.L.et al.，J.Immuno.Meth.84：85-94(1985))。简单地说，将悬浮于含1％入AB血清之无LPS的RPMI 1640培养基中的人单核细胞以每孔每毫升10⁶个细胞的浓度铺敷在24孔平板中并于37℃粘附1小时，经轻轻冲洗除去非粘附细胞。在加入细菌脂多糖(E.coli 001：B4；Difco，Detroit)(10ng/ml)之前0或1小时向细胞中加入试验化合物或培养基。然后以所指出的不同时间间隔在加湿的5％CO₂空气环境中于37℃保温培养物。保温时间结束时，收集培养物上清液。在含有0.15M辛基-吡喃葡糖苷、25mMHepes和溶于盐水中之0.5mM苯基甲基磺酰氟的缓冲液中裂解残留的粘附单核细胞。离心澄清上清液和细胞裂解液并检测IL-1活性。

根据其在A23187离子载体存在下刺激EL-4(ATCC TIB 181)细胞分泌IL-2的能力检测IL-1活性。在2×10^-7M钙离子载体A 23187存在下，将样品的系列稀释液与10⁵个EL-4细胞一起保温。过夜保温后，取各培养物的0.1ml无细胞上清液并与10⁴个IL-2依赖性CTLL-20(ATCC-TIB 214)细胞一起保温。继续保温20小时后，用1μCi氚标记的胸苷对培养物施加脉冲4小时。在玻璃纤维滤器上收获细胞并用液体闪烁计数法确定放射活性。与标准品相比较以确定所有的IL-1活性检测结果。

CSAID结合试验

分离和纯化CSBP的下一个阶段需要建立和证实以细胞为基础的CSAID结合检测法。如上文提到的，已在人单核细胞中进行了早期CSAID研究。选择更方便的细胞来源，即人单核细胞白血病细胞系THP.1(ATCC TIB 202)，鉴于其应答刺激以产生IL-1和TNF并对CSAID具有与人单核细胞差不多的敏感性(图1)，故其是可作为进行机理研究的恰当代用细胞来源。

完整的THP.1细胞以时间依赖性方式(图2)摄入放射标记的化合物I。在37℃下放射标记物的摄入迅速，而且在3-5分钟时达到最大值。此外，放射标记物的摄入是可饱和的并且是特异的。

在对负载放射标记之配体的THP.1细胞进行亚细胞分级分离后，发现胞质是放射活性积聚的优势亚细胞部位(图3)。

使用THP.1细胞的可溶性胞质部分和放射标记的化合物I建立特异的和可再现的CSAID结合检测法。简单地说，从经过氮气气蚀，然后进行10K×g低速离心和100K×g高速离心得到的细胞裂解物粗制THP.1胞质，其上清部分即称为胞质部份。将THP.1胞质在室温下与适当稀释的放射配体一起保温预定的时间，以使结合达到平衡。将样品加到G-10柱上并用20mM TRN，50μMβ-巯基乙醇、NaN₃洗脱。收集包括空隙体积的部分并用液体闪烁计数法估测放射活性。因为在保温混合物中加有过量冷配体情况下或不存在胞质部分时放射活性信号消失，所以这一检测反映结合的放射配体。

更具体地说，按下述方法进行CSAID结合试验：

材料

保温缓冲液：20mM Tris，1mM MgCl₂，20μM Hepes，0.02％NaN₃，储存于4℃下。洗脱缓冲液：20mM Tris，50μM 2-巯基乙醇，NaN₃，储存于4℃下。

G-10 Sephadex：将100g Sephadex G-10(Pharmacia，Uppsala，Sweden)加入400ml dd H₂O中并使之在室温下溶胀2小时。倾去细胞粒并洗3次。加入NaN₃和含dd H₂O的QS至500ml并储存于4℃下。

装柱：细管柱、过滤玻璃料和尖头(Konotes，SP 420160-000，420162-002)。结合反应中使用Lowsorb管(Nunc)。15000rpm将THP.1胞质离心5分钟以澄清之。对细胞进行低张处理并在氮气中减压裂解以制备THP.1胞质。经差速离心(10,000g，1小时和100,000g，1小时)除去核和膜部分。

化合物：有相应的EtOH对照的非放射活性化合物I(在保温缓冲液中制成稀释液)和³H-化合物I(在保温缓冲液中制成稀释液)。

方法：

A.柱制备

1.在预先洗脱反应混合物之前30分钟开始。

2.向1.5ml柱床体积的柱内加入3ml G-10浆。

3.用7ml洗脱缓冲液(加至柱项)冲洗。

4.切下适当大小的柱。B.样品保温

1.4℃保温15分钟。

2.结合反应混合物：100μl胞质，10μl冷化合物I或EtOH对照，10μl³H-化合物I(摩尔浓度取决于所作研究的性质)。

3.“空”对照＝100μl保温缓冲液代替胞质制备物。C.样品洗脱

1.于4℃下洗脱。

2.在G-10柱上加入总反应体积。

3.在柱上加入400μl洗脱缓冲液并排除洗脱液。

4 .在柱上加入500μl洗脱缓冲液，将洗脱的体积收集在20ml闪烁管中。

5.加入15ml Ready Safe闪烁液。

6.在液体闪烁计数器中涡旋并计数5分钟。包括“总输入计数对照”(10μl标记的配体)。D.数据分析

1.以图解形式绘制作为产生量的DPNS线图并以回归分析法和分另用于确定IC₅₀及Kd/Ki的“London配体结合”软件分析之。

2.按次序排列CSAID生物检测法中试验之化合物的IC₅₀，与以CSAID结合检测法产生者相比较并确定相关曲线。

进一步按下述标准验证结合检测法：

·证明THP.1胞质可饱和地并特异地结合放射标记的化合物I(图4)。

·以放射标记竞争结合检测法试验相当数目的吡啶基咪唑CSAID。按效力次序列排列，并显示化合物的IC₅₀与用人单核细胞生物检测法测得的效力等级高度相关(图5)。而且，竞争性结合活性有区域选择性(图6)。这些结果强调指出结合检测法特别适于检测这些化合物的细胞因子抑制作用，并认为对于SAR研究和为帮助阐明分子靶提供检测工具是特别有益的。

·结合对于吡啶基咪唑CSAID来说是高度特异的。以竞争结合法试验一系列有不同药理学活性之非结构相关的化合物。它们包括特异性环加氧酶抑制剂、5-脂氧合酶抑制剂、CO/LO双抑制剂、PDE IV抑制剂、免疫抑制性大环内酯、类固醇及其他(表II)。以100μM浓度试验所有化合物均未证明有竞争性结合作用。

表II中列示了以竞争性CSAID结合检测法试验的非吡啶基咪唑CSAID、相关抗炎或免疫抑制化合物。除非另外指明，在高达100μM量均未观察到竞争性结合。

表II

环加氧酶抑制剂·消炎痛·萘普生	类固醇·***
环加氧酶抑制剂·消炎痛·萘普生	类固醇·***	选择性5-脂氧合酶抑制剂·羟基脲类·氨基苯酚类	新的抗炎剂·IX 270·Tenidap(IC50＝139μM)·Romazarit
5-脂氧合酶转位抑制剂·MK 886	过氧化物酶体增殖剂·Wyeth 14643·Clofibrate	选择性5-脂氧合酶抑制剂·羟基脲类·氨基苯酚类	新的抗炎剂·IX 270·Tenidap(IC50＝139μM)·Romazarit
5-脂氧合酶转位抑制剂·MK 886	过氧化物酶体增殖剂·Wyeth 14643·Clofibrate	双抑制剂·Phenidone·NDGA(IC50＝154μM)	AH受体激动剂·3-甲基胆蒽·β-萘黄酮
免疫抑制剂·FK 506·Azaspirane·雷帕霉素及类似物	其他·Tibenelast·Tetrandrine	双抑制剂·Phenidone·NDGA(IC50＝154μM)	AH受体激动剂·3-甲基胆蒽·β-萘黄酮
免疫抑制剂·FK 506·Azaspirane·雷帕霉素及类似物	其他·Tibenelast·Tetrandrine	PDEIV抑制剂·咯利普兰

在已确定的细胞来源和结合检测法基础上，对CSBP特性的进一步鉴定表明，CSAID结合是可饱和的，特异的和可逆的(图7)(可迅速加快和减缓速率)，结合活性对蛋白酶及热处理敏感(图8)并且是蛋白质浓度依赖性的(数据未示出)。

人单核细胞中的CSAID结合活性可以区别于按照上面列出的结合活性标准在THP.1中测得的CSAID结合活性。

结合是pH依赖性的(其中最适pH范围为5至8)但其中不依赖于二价阳离子，并且是对高盐浓度敏感的(可逆的)。

CSBP的纯化

按照下述方法从THP.1细胞中纯化CSBP：

材料

按照PCT申请US 93/00674和US 93/00675(申请日均为1993年1月13日)中所述方法合成下列化合物。

按上述方法制备放射标记的化合物II和IV。抗肌动蛋白多克隆和单克隆抗体(分别是兔(cat.#65-096)和小鼠(cat.#69-100)抗体)购自ICN Biomedicals。按照标准固相FMOC化学合成法(例如参见Fields，G.B.et al.，Intl.Peptide Protein Res.35，161-214(1990))合成肽NH₂-Ile-Thr-Ala-Ala-Gln-Ala-Leu-Ala-His-Ala-Tyr-Phe-Ala-Gln-Tyr-Cys-COOH(Seq.I.D.No.1)，按照常规方法纯化并偶联到马来酰亚胺活化的匙孔蛾血蓝蛋白(KLH)(Pierce Chemical Co.，Cat #77105A)上，并用于接种兔。所有其它化学品都试剂级的，并且除特别指出者外均不是购自特定的卖主。

THP.1细胞的培养

按下述方法培养并处理THP.1细胞：

使THP.1细胞生长在加有25mM Hepes、10％FBS(在反应器中为8％)10mM谷氨酰胺和.05％ pluronic F-68的RPMI 1640培养基中。使细胞以2×10⁶的平均细胞计数(接种密度在2×10⁵和3×10⁵之间)通过3/4天周期传代。将摇瓶中的高密度细胞再循环转入大的反应器中放大增殖。在此过程中，离心摇瓶的总内容物并将细胞重新悬浮在同样体积的新鲜培养基中。因此，接种密度随每次传代而逐渐增加，每次都产生较高的每体积细胞密度。细胞密度范围为6×10⁶至12×10⁶。

两次放大过程从摇瓶中得到所需的体积。首先，使用两个80LArtisan反应器(60L工作体积)。每5天从两反应器中取50L并收获细胞。然后向细胞内给进另外50L直至达到所需的总体积。或者，可使细胞生长在30L Artisan反应器中并用于接种250L Abec反应器(总工作体积为150L)。每5天收获120L并留下30L作再进料。接种密度在3×10⁵和5×10⁵之间。两种类型反应器的pH均控制在7.0和7.2之间。使用CO₂作为控制酸，并使用碳酸氢钠作为缓冲剂。Artisan反应器的D.O.设为30％，Abec反应器的D.O.为20％。

THP.1胞质的制备

在20nM Tris-HCl pH7.4、1mM MgCl₂、1mM PMSF、1μM胃酶抑制剂A和1μM亮抑蛋白酶肽中经氮气气蚀作用裂解细胞。以10,000×g离心10分钟沉淀不溶性材料，并再次于4℃以100,000xg离心1小时进一步澄清上清液。收集末次离心的上清液，并将其称为THP.1胞质。

CSAID结合活性的检测

室温下，将THP.1胞质(典型地含200μg蛋白质)与适当稀释的³H-化合物I(50nM)一起保温60分钟以使结合达到平衡。在1.5ml Sephadex G-10柱(在20mM Tris-HCl，pH7.4中)上从结合的配体中分离出游离配体。收集包括空隙体积的部分并以液体闪烁计数法估测放射活性。用二辛可宁酸检测法(Pierce)检测蛋白质浓度。

Superose 12柱层析

将大约100至250ml THP.1胞质以14.5cm/小时的速度加到在10mM NaPO₄ pH7.0和150mM NaCl中于4℃平衡过的5L Superose12柱(Pharmacia；11.5×50cm)上。收集各级分(50ml)并检测其CSAID结合活性；合并相当于Mr约50,000之蛋白质的洗脱体积的单一活性峰(200至500ml)。

羟基磷灰石柱层析

将得自Superose 12柱的材料以30cm/小时速率加到在10mMNaPO₄ pH7.0中室温平衡过的160ml羟基磷灰石HA柱(Cal.Biochem.，5.0×8.0cm)上。用超过2.5倍柱体积的10至200mNNaPO₄梯度洗脱。收集各级分(30ml)并检测CSAID结合活性。合并含有上柱之约60％CSAID结合活性的蛋白峰(50至250ml)。

CSBP的放射光亲和标记

下述方法被用于大约30ml样品，但所述方法也适用于更大或更小的样品体积。使用Amicon搅拌池(YM30膜，70psi N₂)将羟基磷灰石集合物浓缩到大约30ml。离心(10,000×g，30分钟；SS34转子，4℃)除去浓缩物中的不溶性材料。将上清液(450mg蛋白质)用于在6孔微量滴定板(Nunc)上进行的标记反应中。使用下述试剂和方法完成6个反应。暗光下的将大约60mg蛋白质(4ml)加到0.25ml缓冲液(10mM NaPO₄ pH7.0，150mM NaCl)和0.25ml 50nM放射活性(即“热”)¹²⁵I-化合物IV(终浓度2.5nM，250μCi)，并在冰上放置10至15分钟。将微量滴定板在冰上暴露于距离5至10cm的＞300nm光2分钟。按下述步骤用化合物IV(化合物VI为“冷”(即非放射活性)形式的化合物IV)探查反应。向溶于10mMNaPO₄ pH7.0和150mN NaCl中之2.7ml 50％乙醇中加入0.3ml 10mM化合物VI以制备化合物VI的1mM储存液。向暗光下的各标记反应中加入化合物VI(0.5ml，1mM)并在冰上放置10至15分钟。使反应混合物曝光以进行放射活性标记。可利用制备性等电聚焦或电泳步骤从标记的蛋白质中除去未反应的化合物IV和VI；或者对于较小体积的样品，则可在Sephadex G25柱(1.6×12cm)(在20mN NaPO₄pH7.4和150mM NaCl中)上进行凝胶过滤层析以除去未反应的化合物IV和VI。

分析性电泳，放射自显影和免疫印迹分析

基本上按照Smith B.J.(Meth.in Mol.Biol.Vol.I，pp.44-57(1984))所述的方法，在还原条件下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。分别使用Hoefer SE 600或Mighty Small电泳***在0.75mm×16cm(4％积层胶，10或12％分离胶)或10cm(12％预浇注胶，Jule)上电泳分离样品。用考马斯亮兰R350(Pharmacia)或银(Silver Stain Plus，BioRad)染蛋白质。蛋白质分子量标准品购自Amersham或BioRad。为进行印迹分析，使用Genie电泳印迹装置(Idea Scientific)，以15V电压将蛋白质转移到在192mM甘氨酸/25mM Tris pH8.3和20％(v/v)甲醇中的聚偏二氟乙烯膜(Millipore)上。于-70℃过夜曝光后使用Hyperfilm-MP(Amersham)进行放射自显影以显现用¹²⁵I标记的蛋白质。在20mM Tris-HCl pH7.5和500mM NaCl中用5％明胶封闭膜，然后与在缓冲液中稀释到1,000至5,000倍的适当抗血清一起保温。用偶联到辣根过氧化物酶上的抗小鼠或抗兔免疫球蛋白G(Amersham)检测抗体复合物，并在Hyperfilm- ECL(Amersham)上用发光磷光显现之。

制备性等电聚焦

使用Rainin RF3再循环自由流式聚焦蛋白质分级分离器，经4℃过夜完成制备性等电聚焦，用Amicon搅拌池(YM30膜，70psiN₂)浓缩到3ml，并配制成含有10％甘油和1％两性电解质(Pharmacia Ampholine或Pharmalyte，pH4至6)溶液，并达到10ml终体积。在将样品加到RF₃上之前，将1％两性电解质/10％甘油溶液预聚焦1至1.5小时(直到电压、电流、功率和温度降至基线)。使用针头和注射器将样品注射到气泡口14内。使***达到平衡以进行预聚焦，然后以3ml收集各管。监测放射活性以鉴定标记的CSBP，并合并适当的部分。

制备性SDS-PAGE

使用BioRad 491型制备槽进行制备性SDS-PAGE。用Amicon搅拌池(YN30膜，70psi N₂)将合并的得自制备性等电聚焦电泳的各分离部分浓缩到2至3ml。使大约2至2.5ml浓缩物在100mM TrispH6.8、2％SDS、100mM 2-巯基乙醇、10％甘油和0.01％溴酚兰中达到约3ml，然后于100℃保温3至5分钟。将样品加到凝胶(2cm4％积层胶、6cm 11％分离胶)上并于室温下在192mM甘油/25mMTris pH8.3和0.1％SDS中以40mA进行电泳分离。收集各洗脱部分(2.5ml)并检测放射活性，以判定从凝胶中洗脱的被标记的CSBP。

结果

CSBP的部分纯化

表III中总结了对THP.1胞质中CSBP所作典型部分纯化的结果。如表中显示的，活性回收率为20％，并且纯化水平为3倍。这是在估价许多层析树脂(阴离子和阳离子交换、与(NH₄)₂SO₄的疏水相互作用、兰琼脂糖、肝素琼脂糖等)期间发现的CSBP回收和纯化的特征；表III中所示的纯化流程给出了最好的回收率和最具再现性的结果。因为试图进一步纯化CSBP而继后的CSAID结合活性出现活性回收率差的情况，所以须在光亲和标记之前进行这一纯化。

表III

从THP.1胞质中纯化CSBP

样品	活性，dpm^a	蛋白质，mg	比活性dpm mg^-1
样品	活性，dpm^a	蛋白质，mg	比活性dpm mg^-1	THP.1胞质^bSuperose 12羟基磷灰石	5.0×10⁸1.6×10⁸9.6×10⁷	68001200500	7.4×10⁴1.3×10⁵1.9×10⁵

^a以3H放射活性(每分蜕变，dpm)表示活性，所述数据是在按上述方法检测的CSAID结合中收集的并就总样品进行了校正。

^b从相当于大约10¹¹个细胞的起始材料制备的THP.1胞质。光亲和标记CSBP

用¹²⁵I，芳基叠氮CSAID衍生物化合物IV共价标记CSBP。如图9中图解显示的，该反应是很特异的，其显示Mr 43,000的单一蛋白质被标记(标记为“无”的泳道)。在上述部分纯化期间，CSAID结合活性作为有相当于Mr 45,000至50,000之蛋白质的单一峰从Superose 12凝胶过滤层析柱上被洗脱。这两种分析法从总体上表明CSBP是Mr 43,000的单链或“单体”蛋白质。

图9还显示标记的特异性。在凝胶的中间泳道中，在用¹²⁵I-化合物IV(2.5nM)进行光亲和标记之前将蛋白质与非放射活性CSAID(10μM)一起预保温。每种CSAID与光亲和标记物竞争的程度与其在细胞检测法中的效力密切相关。这就是说，化合物抑制入单核细胞中IL-1产生的能力越强，其阻止光亲和标记CSBP的效力越大。因此，CSBP是用化合物IV标记的蛋白质。

纯化被标记的CSBP

为了根据其氨基酸序列鉴定CSBP，进一步从用于光亲和标记的部分纯化的CSBP中纯化被标记的蛋白质。实现这一纯化目的的手段是制备性等电聚焦、制备性SDS-PAGE和反相HPLC。图10中显示了制备性等电聚焦的结果。被标记蛋白质的等电点相当于pH4.5左右。Western分析表明，在该过程中某些但不是所有的肌动蛋白己被除去。另外，差不多70％上样的蛋白质随被标记之蛋白质一起被洗脱(50％放射活性回收率)。这一点还经SDS-PAGE和银染色分析得以证明(数据未示出)。因此，对这一应用来说，制备性等电聚焦电泳并没有从实质上纯化所需的蛋白质。

制备性SDS-PAGE使标记的CSBP获得了最实质的纯化。将得自制备性等电聚焦的材料加样到使用BioRad 491型制备电泳槽的凝胶上。如图11中图解所示，用这种方法从相当于约43KDa蛋白质(第56级分)的放射活性部分中除去了至少90％的非放射活性蛋白质。另外，还除去了未被掺入的标记物。

CSBP的性质鉴定

完成制备性SDS-PAGE后，将标记的CSBP加样到反相HPLC上，收集其中与放射活性共洗脱的蛋白质峰。将蛋白质浓度(经氨基酸分析测得的)与样品的比放射活性相比较，证明该蛋白质只有10％是已被标记的(推测蛋白质Mr为43,000)。N末端序列分析鉴定了相当于预期之氨基末端下游30至40个氨基酸的肌动蛋白序列。在用胰蛋白酶或CNBr进行分级分离之后的内部序列分析产生出约90％肌动蛋白序列，但该肽的约10％则给出独特序列。胰蛋白酶消化所得序列中，有一个与见于所谓促***原活化(MAP)激酶之Ser/Thr蛋白激酶家族的C末端序列有强(85％)同源性，但又并不完全相同(图12，还参见Ray，L.B.&Sturgill，T.W.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，85：3753-3757(1988))。

合成基于MAP激酶之同源序列的肽，并用于接种兔以产生抗血清。对标记之THP.1胞质2-D凝胶所作Western分析和放射自显影证明，1)抗肌动蛋白或MAP激酶的抗体的确识别印迹上的蛋白质，但不识别放射标记的蛋白质；2)从胰化肽制备的抗体识别放射标记的蛋白质。可见，CSBP似乎与MAP激酶有同源性但又与之不同。还鉴于已知激酶在调节翻译中的作用(Pelech and Sanghera，Science 257：1355-66(1992))和CSAID对IL-1和TNF翻译的影响，所以激酶作为CSAID的分子靶是可以理解的。

CSBP基因的分离和性质鉴定

本发明提供分离的编码人CSBP的核酸分子。从与放射活性光亲和探针共迁移的蛋白质部分得到两个氨基末端肽序列。其中一个得自放射活性蛋白质部分的胰酶样产物，但其本身是无放射活性的，并且具有序列：ILE THR ALA ALA GLN ALA LEU ALA HIS ALA TYR PHE ALA GLN TYR(Seq.I.D.No.1)第二个得自与放射活性相联的8 KDa溴化氰片段并且具有序列：XXX (GLN) LEU LEU ASN ASN ILE (VAL/PHE) LYS (PHE) GLN LYSLEU THR (Seq.I.D.No.2)其中()代表不确定的指认和/代表两个氨基酸间的不确定性。XXX是未知氨基酸。检索Genbank表明肽序列I.D.No.1是与蛋白质激酶的MAP激酶家族同源的，而肽序列I.D.No.2是独特的。基于这两个序列，使用反向翻译蛋白质序列的遗传密码和哺乳动物细胞偏爱密码子表(Grantham，R.et al.，Nucl.Acid Res.，9：(1981))合成两个简并寡核苷酸DNA探针。1. GCYCAYGCTAYTTYGCYCARTA(Seq.ID.No.3)和2. AAYAAYATYKTBAARTTYCAAA(Seq.ID.No.4)

其中Y＝C或r

R＝A或G

K＝G或T

B＝G，C或T因此两个混合的寡核苷酸分别由128和384个独特序列组成。在商品载体λZAP(Stratagene)中从用GM-CSF处理的人单核细胞制备cDNA文库(Livi，G.P.et al.，Mol.Cell Biol.，10：2678-86(1990))，经与50∶50组合的用γ-³²P ATP标记的两种合成寡核苷酸混合物杂交，以低严格性筛选所说的文库。按照已介绍的方法(Current Protocols in Molecular Biology)标记寡核苷酸，一般用250μCi γ-³²P ATP标记3μg混合的寡核苷酸并将其全部用于250μl杂交体积中。按照制造商推荐的条件铺板和挑取噬菌体(参见StratageneλZAP protocol，Stratagene，La Jolla.Ca.)并使用BB4宿主菌株。一个附加步骤是在2×SSPE/0.1％SDS中于65℃将滤膜预洗涤两次30分钟，以除去细菌碎片然后预杂交。

然后，在6×SSPE、5×Denhardt氏溶液、0.1％SDS和100μg/ml苯酚/氯仿提取的酵母tRNA中与标记的寡核苷酸探针37℃预杂交和杂交24-72小时。20×SSPE是3M NaCl、0.2M NaH₂PO₄、0.02M EDtA pH7。4.50×Denhardt氏溶液是每升水中含10g聚乙烯吡咯烷酮(MW 40,000)、10g牛血清白蛋白和10g Ficoll 400。

杂交后，在下述条件下将滤膜洗两次：

1.6×SSPE，0.1％SDS，室温，10-15分钟。

2.6×SSPE，0.1％SDS，37℃，10-15分钟。

3.3M四甲基氯化铵溶液(500g Me₄NCl，1.38升H₂O，73ml 1M Tris pH8.0，5.8ml 0.5M EDTA，通过0.45μM滤膜过滤的7.3ml 20％SDS)，37℃，30分钟(参见Proc.Natl.Acad.Sci USA，82：1585-1588(1988)，用于描述该技术)。

于增强屏存在下使滤膜对Kodak胶片曝光3-5天，挑出复制滤膜中的交迭阳性噬斑并通过同样方法再次循环进行直到获得纯噬斑。

按照制得商推荐的方法(Stratagene)用M13辅助噬菌体R408缺切recA-大肠杆菌宿主XL-1兰中的噬菌体。

使用寡核苷酸混合物#1对阳性杂交噬斑进行两轮再铺板和杂交后，得到在Southern印迹中与寡核苷酸#1(Seq.I.D.No.3)杂交，但不与寡核苷酸#2(Seq.I.D.No.4)杂交的单一同源噬菌体。对该噬菌体的DNA***段进行测序分析，揭示出在编码部分上述No.2独特肽序列I.D.No.2的一个末端存在开放阅读框。所编码的氨基序列是：Asn Ile Val Lys Cys Gln.Lys Leu Thr(Seq.I.D.No.5)。

开放阅读框的其余部分(图13，Seq.I.D.No.6和7)同源于包括cdc2和MAP激酶家族在内的几类蛋白质激酶。基于这种同源性，推测从使用所得cDNA克隆的氨基末端区进行第二次文库筛选得到的氨基末端丢失约130个氨基酸。

cDNA的另一末端含有相当于从中得到该cDNA之mRNA的3′末端的polyA序列(图14，Seq.I.D.No.8)。

为此，基于初始cDNA(图13)，从正义链的5′末端设计寡核苷酸(5′-CCTCGGAGAATTTGGTAGATAAGG-3′(Seq.I.D.No.9)和5′-AACATTGTGAAATGTCAGAAGCTTACAGATGACCAT-3′(Seq.I.D.No.10)，并用于筛选编码CSBP之氨基末端的cDNA。用多核苷酸激酶和γ-³²P-ATP在其5′末端标记寡核苷酸。在已于杂交前在2×SSPE、0.1％SDS中50℃预洗涤过的复制硝酸纤维素滤膜上筛选得自构建于λZAP中之GM-CSF刺激的人单核细胞文库的10⁸个噬斑。用50％甲酰胺、6×SSPE、5×Denhardt′s和100μg/ml经过剪切并变性的鲑***DNA封闭48小时后，在同一缓冲液中使滤膜在42℃下与上述标记的寡核苷酸杂交24小时。然后用2×SSPE、0.1％SDS于室温下洗滤膜两次，在1×SSPE、0.1％SDS中42℃下洗两次，并在0.5×SSPE、0.1％SDS中于42℃下洗两次，然后以放射自显影术检测杂交噬斑。挑出并重新铺敷出现在复制滤膜上的阳性噬斑，将此处理重复两次直到分离出独特的噬斑并按照制造商推荐的方法(Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA)释出噬菌粒DNA。在Applied Biosystems自动DNA测序仪(ABI 373A)上使用通用和特异寡核苷酸引物和Taq聚合酶循环测序法测定cDNA的序列，并在Macintosh IIci上用Lasergene软件会合和检查序列。各cDNA克隆中的两条链至少完整地测序一次。

对cDNA的描述

图15中图解显示了分离的各种cDNA。有四个不同的cDNA已被完全测序并且除下述不同点外他们在交迭区是完全相同的。BP01/02是上述第一个被分离的cDNA，图13和14中给出了其部分序列。最长的cDNA是3.8Kb长(N 5)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，并含有370核苷酸的5′未翻译序列，1.1Kb编码区和2.4Kb 3′非翻译序列。极3′末端终止在扩展mRNA特征的polyA，并在前面接有预期的聚腺苷酸化共有序列。N7cDNA具有终止在某位点的仅1.4Kb的3′未翻译区和提示一可替代聚腺甘酸化位点的polyA延伸部分。在Northern印迹上，一衍生于编码区的探针与大约4.2Kb mRNA杂交，提示所分离的最长cDNA接近于全长度。

编码序列翻译成计算的分子量约为41.5KDa的合360氨基酸的蛋白质，其与通过光亲和交联¹²⁵I-标记的化合物IV鉴定之蛋白质的大小相匹配(图16)。推测的等电点(约5.6)也接近于测得的等电点(约5.0)。检查该序列表明其含有测定THP.1细胞中CSAID结合蛋白质的序列得知的胰酶解肽序列ITAAQ…(加方框部分)(SEQ IDNO：1)和溴化氰切割序列xxxLNNIVK…(加方框部分)(SEQ ID NO：2)。这些序列前面接有适合的切割位点(箭头)。推测的溴化氰片段(8Kda)的大小与用溴化氰处理CSAID结合蛋白质后仍连接¹²⁵I标记之放射亲和标记物[化合物IV]的片段大小相匹配。

N13cDNA(图15)SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14与其它三个cDNA相同，所不同的只是在N5cDNA之1054位上开始的75核苷酸区。这一差异即产生一种改变了氨基酸230-255的有相同长度的蛋白质(图17)。这两个不同的序列在核苷酸水平上有43％相同，且在氨基酸水平上有44％相同。虽然不希望拘泥于特定理论，但这一事实很可能是由于两变体是通过不同的内部内含子接切而产生的，但也不能排除等位变异。为了便于描述，两蛋白质在本文中被称为CSBP1(相应于N5cDNA)和CSBP2(相应于N13cDNA)。

将CSBP序列与GenBank/EMBL或Swissprot数据库中的蛋白质序列相比较，表明它密切同源于称为MAP(促***原活化的蛋白质)或erk(细胞外调节的)激酶(Boulton，et al.，“Erks；A Familyof Protein Serine-Threonine Kinases that are Activated andTyrosine Phosphorylated in Response to Insulin and NGF”，Cell.65：663-675(1992))的蛋白质家族。如图18的***树中所表明的，从酵母到人该蛋白质散酶的家族是很保守的，并且已发表的最密切的同源物是酵母HOG1基因(Brewster et al.，Science259：1760-63(1993))。将CSBP与选择的该家族成员的序列一一对齐比较显示(图19)，所有11种蛋白质激酶基序(I至XI)，包括所有蛋白质激酶中的相同残基(黑体部分)均被保留(Hanks etal.，Sciepce 241：42-52(1988))。区域VI和VIII中两个加方框的基序标示激酶磷酸化丝氨酸和苏氨酸(Hanks et al.，1988)。因此CSBP是一种蛋白质激酶。

已知接近区域VIII之Tx Y序列中的苏氨酸和酪氨酸(星号标)是Erk1和Erk2的调节性磷酸化位点(Payne，et al.，EMBO.J.，10：885-892，1991)。在对各种细胞外信号的反应中，导致MAP激酶的丝氨酸/苏氨酸激酶活性活化，而使这两个残基被MEK(MAPK或ERKKinase)磷酸化(Kosako，et al.，EMBO J.，12：787-794(1993))。在CSBP中保留这些氨基酸提示它们也在对细胞外刺激物如LPS反应中受MEK的调节。这些发现表明CSBP处于蛋白质磷酸化过程的级联内，这一级联过程可将细胞表面刺激传递于细胞内的翻译调节等过程。可以推测在适当刺激的细胞中CSBP的许多行为是以与MAP激酶的已知性质和行为的相似性为基础的(Marshall，et al.，Curr.Opin.Genetics&Develop.，4：82-89(1994))。

用编码区cDNA探针进行的多组Northern印迹分析提示大多数组织中均表达CSBP mRNA。高严格性Southern印迹分析(0.1％ SSPE，0.1％ SDS)显示存在单一基因；但低严格性洗涤则可揭示密切相关的激酶。使用一组可从市场上购得的人/小鼠杂交细胞系进行的基因作图实验表明CSBP基因存在于人染色体6中。

在大肠杆菌中表达

为了证实由分离的cDNA编码的蛋白质可以与CSAID结合，在大肠杆菌和酵母中表达cDNA。在大肠杆菌中，CSBP是作为与β-半乳糖苷酶和/或肠激酶可裂解的FLAG表位标记物的融合蛋白酶表达的(图20)(FLAG是可通过IBI-Kodak得到的商品表位试剂)。在后一种情况下，此可通过设计有起始位点、抗体识别序列和肠激酶裂解位点的合成寡核苷酸接头来实现。在pLac(如Bluescript KS载体，Stratagene，LaJolla，CA.)或λpL(Shatzman，et al.，N.Y.Acad.Sci.，478：233-248(1986))启动子控制下表达蛋白质，并且放射亲和探针[化合物IV]显示出细胞裂解物中有预期大小的特异***联蛋白质。细胞裂解物还含有化合物IA特异性结合活性。因此可以认为CSBP1和CSBP2是细胞内CSAID的分子靶。

按照制造商提供的说明书，通过含有抗FLAG表位之单克隆抗体的亲和基质纯化在大肠杆菌中表达的蛋白质。

在酵母中表达

不仅用于纯化而且还用于估计功能的表达CSBP的另一个***是啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酵母HOG1(高渗透性甘油反应)基因(Brewster et al.，supra)编码作为CSBP密切相关同系物的MAP激酶。突变hog 1D菌株显示在高渗透性培养基上降低了生长能力，并用试验了CSBP对这一表型的功能性补偿作用。

按下述方法对用于酵母表达的CSBP2进行工程化修饰。使用寡核苷酸引物：5′-cgccctcgagatgtctcaggagaggcccacg-3′SEQ ID NO：15和3′-ctaagacctaaaacctgaccg-5′，SEQ ID NO：16，通过聚合物酶链反应(Mullis and Faloona，Methodin Enzymd.，155：335-50(1987))在CSBP2的起始密码子处导入XhoI位点。用XhoI和Bgl II消化525bp PCR片段并亚克隆到p138NBU的同一位点中。p138NBU是其中用URA3取代了TRP1可选择标志的p138NB(McHale at al.，Mol.Pharm.，39：109-113(1991))的修饰产物。然后用Bgl II和SalI消化所得质粒并与含有CSBP2之3′末端的Bgl II/XholI片段相连接。最后的构建体合有用于以高拷贝数保留的部分2微米序列，可以进行由铜可诱导的CUP1启动子驱动并以酵母CYC1转录终止子终止的CSBP2 mRNA表达。发现质粒p138NBU-CSBPN13B编码野生型CSBP2蛋白质。分离亲本(YPH499MATa ura3-52 lys2-801^am ade2-101 trp1-D63 his3D200leu2-D1)和hog1D(JBY10[YPH499+hog1：：TRP1]菌株(Brewster，et al.，j.Bacteriol.，153：163-168(1983))Ura⁺异养型转化产物并使之在缺少尿嘧啶的合成的完全培养基(Hicks et al.，Genetics 83：245(1976))中生长到A540为1.0。经加入150mM CuSO₄诱导CSBP2表达。5小时后收获细胞，悬浮在20mM Tris-HCl pH7、1mM MgCl₂、1mM苯基甲基磺酰氟中并在0.45mm玻璃珠存在下涡动破碎细胞。4℃下以1,500×g离心提取物5分钟。

显示放射亲和探针(化合物IV)特异性地交联p138NBU-CSBPN13A和p138NBU-CSBPN13B裂解物中有预期分子大小的蛋白质，但所说的蛋白质不存在于含有对照质粒(p138NBU)并在相似条件下生长的野生型或hog1D菌株中。裂解物也含有³H-化合物Ia特异性结合活性，因此CSBP1(SEQ ID NO：12)和CSBP2(SEQ ID NO：14)均与CSAID结合。

较好使用重组基因工程技术制备本发明的蛋白质。可将分离的核酸特别是DNA可操作地连接到基因表达所需的必要表达控制区(如调节区)上，以将DNA导入表达载体中。可使用本领域已知的方法(Ausubel，et al.，Supra)将载体导入适当的宿主细胞如原核(例如细菌)或真核(例如酵母或哺乳动物)细胞中。已制备或分离了编码所需蛋白质的序列，并可将其克隆到任何适当的载体或复制子中。许多克隆载体都是本领域技术人员熟知的，而适当克隆载体的选择也只是一个选择问题。用于克隆的重组DNA载体和可被它们转化的宿主细胞的例子包括噬菌体λ(E.coli)，pBR322(E.coli)、pACYC177(E.col i)、pKT230(革兰氏阴性细菌)、pGV1106(革兰氏阴性细菌)、pLAFR1(革兰氏阴性细菌)、pME290(非大肠杆菌革兰氏阴性细菌)、pHV14(大肠杆菌和枯草杆菌)、pBD9(芽孢杆菌)、pIJ61(链霉菌)、pUC6(链霉菌)、YIp5(酵母属)、杆状病毒昆虫细胞***、YCp19(酵母属)(参见“DNA Cloning”：Vol.I& II，Glover et al.，eds.IRL Press Oxford(1985)(1987)；T.Maniatis et al.，“Molecular Cloning”，Cold Spring HarborLaboratory(1982))。

可以将基因置于启动子、核糖体结合位点(细菌表达)和任选的操纵子(本文称为“控制”元件)控制下，以使编码所需蛋白质的DNA序列在被含有该表达构建体的载体转化的宿主细胞中转录成RNA。编码序列可以含有或不含信号肽或前导序列。例如可使用大肠杆菌tac启动子或蛋白A基因(spa)启动子及信号序列表达本发明的亚基抗原。可在翻译后加工中由细菌宿主除去前导序列(如参见美国专利No.4,431，739、4,425,437、4,338，397)。

除控制序列外，可期望加入调节序列，借以调节与宿主细胞生长相关的蛋白质序列的表达。调节序列是本技术领域已知的，其例子包括在对化学或物理刺激的反应中，包括在调节化合物存在下引起打开或关闭基因表达的序列。载体中还可存在其他类型的调节元件，例如增强子序列。

构建一表达载体，以使特定编码序列位于带有适当调节序列的载体中，就控制序列来说编码序列的定位和方向应是使编码序列在控制序列的“控制”下被转录(即RNA聚合酶在控制序列处与DNA分子结合，以转录编码序列)。为此目的，可以对编码特定感兴趣之蛋白质的序列进行修饰。例如，在某些情况下有必要修饰编码序列以使之连接到有适当方向的对照序列上，即保留阅读框架。可在***载体如上述克隆载体中之前，将控制序列和其他调节序列连接到编码序列上。另外，也可以将编码序列直接克隆到已经含有控制序列和适当限制性位点的表达载体中。

在某些情况下，可以加上引起多肽从宿主生物体内分泌，继后裂解分泌信号的序列。另外，也可以产生基因融合体，从而使编码感兴趣之结合蛋白质的基因融合到编码有其他所期望之性质的产物的基因上。例如，融合对象可提供已知可检测的活性(如酶促活性)，从而可被用作选择结合蛋白质的可代用工具。融合对象可以是结构元件，例如细胞表面元件，从而可使结合蛋白质(一种正常胞质成分)以融合蛋白质的形式呈现在细胞表面上。还可以期望产生有用蛋白质的突变体或类似物。可以删除一部分蛋白质编码序列、或***一个序列，和/或取代序列内的一个或多个核苷酸以制得所说的突变体或类似物。用于修饰核苷酸序列的技术，例如位点特异性诱变和形成融合蛋白质，都是本领域技术人员熟知的(例如参见T.Maniatis et al.，Supra；DNA Cloning，Vol.I and II，supra；Nucleic AcidHybridization，supra)。

许多原核细胞表达载体都是本领域已知的(例如参见美国专利Nos.4,578,355；4,440,859；4,436,815；4,431,740；4,431,739；4,428,941；4,425,437；4,418,149；4,411,994；4,366,246；4,342,832；还可参见美国专利申请GB 2,121,054；GB 2,008,123；GB 2,007,675；及欧洲专利申请103,395)。酵母表达载体也是本领域已知的(例如参见美国专利Nos.4,446,235；4,443,539；4,430,428；还可参见欧洲专利申请103,409；100,561；96,491)。pSV2neo(参见J.Mol.Appl.Genet.1：327-341)使用SV40晚期启动子驱动在哺乳动物细胞内的表达；pCDNAlneo为衍生于pCDNAl(Mol.Cell Biol.，7：4125-29)的使用CMV启动子驱动表达的载体。可以利用这后两个载体在哺乳动物细胞中进行暂时或稳定地(如使用G418或潮霉素抗性)表达。昆虫细胞例如果蝇细胞表达***(例如参见PCT申请US 89/05155和US 91/06838及EP申请88/304093.3)和杆状病毒表达***也是可以使用的。

可根据所选用的表达***和宿主，在适于表达所需蛋白质的条件下培养用上述表达载体转化的宿主细胞，以产生本发明的蛋白质。然后从宿主细胞中分离该蛋白质并纯化之。如果表达***将蛋白质分泌到生长培养基中，便可以直接从培养基中纯化该蛋白质。如果蛋白质不被分泌，则从细胞裂解物中分离或从细胞膜部分中回收之。适当的培养条件和回收方法的选择是本领域技术人员熟知的。

鉴定本发明的蛋白质的另一种方法是构建基因文库，使用所得克隆转化大肠杆菌细胞，并使用抗所需结合蛋白质的单克隆抗血清或单克隆抗体收集和筛选出单个集落。

还可以基于已知的氨基酸序列或由有义基因DNA序列推测的氨基酸序列，以化学合成技术例如固相肽合成法生产本发明的蛋白质。这类方法是本领域技术人员已知的。肽的化学合成法不是特别优选的方法。

可使用本发明的结合蛋白质或其至少包含一个抗原表位的片段生产其多克隆和单克隆抗体。如期望得到多克隆抗体，可以用本发明的结合蛋白质或其片段或突变的结合蛋白质免疫选择的哺乳动物(如小鼠、兔、羊、马等)。收集被免疫动物的血清并按照已知方法进行处理。当使用含有多克隆抗体的血清时，可用免疫亲和层析或其他已知方法纯化多克隆抗体。

本领域技术人员可以很容易地生产出抗本发明蛋白质或其片段的单克隆抗体。使用杂交瘤技术制备单克隆抗体的一般方法学是已知的。可通过细胞融合，或其他技术例如用致癌DNA转化或用E-B病毒转染B淋巴细胞来产生无限增殖的抗体生成细胞系(例如参见M.Schreier et al.，“Hybridoma Techniques”(1980)；Hammerlinget al.，“Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas”(1981)：Kennett et al.，“Monoclonal Antibodies”(1980)；另外还参见美国专利Nos.4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,452,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632和4,493,890)。可针对同种型、抗原表位、亲和性等不同的性质来筛选所产生的抗目的蛋白质的单克隆抗体或其片段。或者也可以用本领域已知的PCR技术从杂交瘤中分离编码目的单克隆的基因，克隆到适当载体中并表达之。可使用免疫亲和技术将单克隆抗体应用于纯化它们所针对的个别蛋白质。本发明的抗体(包括多克隆或单克隆抗体)还可以用作免疫检测、RIA、ELISA等检测方法的试剂。此外，它们可被用于从人细胞中分离CSBP并确定不同的刺激和化合物对内源性CSBP之磷酸化状态和蛋白质激酶活性的影响。这些抗体可被用于建立以组织培养物为基础的检测法，以发现或修饰可阻断CSBP之磷酸化或激酶活性的新化合物。这种检测法的一个例子应是将人单核细胞或单核细胞系与某种化合物或化合物的混合物一起保温，再用LPS处理一定的时间，然后用抗体免疫沉淀CSBP，并通过免疫印迹或层析法估测其磷酸化状态，或用适当的蛋白质或肽底物检测其激酶活性。

本发明提供了检测一种以前未知与CSBP结合的配体是否可与这种蛋白质结合的方法。该方法包括使待鉴定的配体与得自THP.1细胞的胞质部分接触，并以如上述的CSAID结合检测法检测其与已知的放射活性CSAID竞争的能力。可代替方法包括使待鉴定的配体在足以使以前鉴定为结合的配体与这种受体结合的条件下，与表达编码CSBP之序列的全细胞接触。在其他实施方案中，可以使用包含CSBP融合体或分离的游离或固定于固相载体上之CSBP的细胞膜部分检测被检配体的结合。当使用重组体细胞表达CSBP时，较好使用很少或没有内源性CSBP活性的细胞，从而使结合(如有的话)只能发生在被表达之目的蛋白质存在的条件下。如以前提到的，可从构建特别设计的受体结合指示物。例如可以将本发明的CSBP与对CSBP/配体结合敏感的蛋白质区域相融合以制成融合蛋白质。这样一个本文称为指示区域的区域本身，或其与辅助分子的结合形式能够产生作为受体-配体结合指征的分析上可检测的信号。这种方法的一种改变是在THP.1或其他哺乳动物细胞中表达作为融合蛋白质(例如与FLAG肽融合)的CSBP，并在适当地刺激和预处理THP.1细胞之后使用该融合肽作为分离重组体CSBP的工具。可以使用许多哺乳动物表达载体完成这样的表达，其中所说的表达载体中利用了病毒启动子例如CMV、RSV，和磷酸化序列如SV40、牛生长激素、以及用于选择稳定转染体的可选择标记如G418或潮霉素。

可以利用得自被转染或转化的表达这种融合体之细胞的胞质制剂。用于配体鉴定的上述所有技术均可用于药物筛选和药物开发。

另外，在用化合物Ia进行的竞争结合试验中，也可以使用纯化的重组蛋白质代替粗制THP.1细胞裂解物。该方法可用于筛选结合CSBP的新的化合物，或用于估计对已知能够结合之化合物进行的改变。纯化之蛋白质的可利用性得以对以前使用粗制材料完成的检测法进行可替代的配置改动。例如，如果蛋白质被共价连接到某种蛋白质结合位点适于配置在比色检测法中的标记如结合的抗体上，或者连接到适于直接检测酶活性的酶如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶上，则可以检测与呈现在固相基质上的新化合物的结合。这样的化合物可包括低分子量有机分子、肽、类肽(peptoids)和蛋白质。在后一种情况下，该蛋白质可用作分离其信号级联中的其他蛋白质，例如那些在被激活之单核细胞中活化细胞因子翻译途径中之蛋白质的工具。该蛋白质还可用于分离受CSAID结合机制作用的哺乳动物细胞内的天然调节分子。最后，该蛋白质可用于鉴定展现于噬菌体表面上的靶肽。

CSBP编码蛋白质激酶的知识提示可使用重组形式蛋白质确定蛋白质激酶活性。一般该方法包括在γ-³²P-ATP存在下将CSBP与蛋白质或肽底物一起直接保温，然后经分离和计数检测掺入底物中的放射活性。分离方法包括免疫沉淀、使底物与可经离心分离小珠结合或以闪烁亲和检测法、SDS-PAGE及继后的放射自显影或生物传感器分析法检测掺入水平。虽然尚不知道特异性底物，但候选底物包括CSBP本身(自身磷酸化)和与已知的MAP激酶底物相关的肽。可以将CSBP与连接到固相载体上的或由噬菌体呈现的(详见上文)随机肽一起保温，或将CSBP与哺乳动物细胞裂解物(如THP.1细胞裂解物)及γ-³²P-ATP一起保温，然后分离被标记的靶蛋白质并测序，以发现其他物质。也可以使用抗磷酸酪氨酸抗体检测激酶活性。CSBP的蛋白质激酶活性可能需要加特异性MEK保温。为此将CSBP与由经过刺激的真核细胞(如LPS处理的THP.1细胞)得到的溶胞产物和ATP一起预保温。或者，也可以从表达人CSBP并生长在高克分子渗透压浓度条件下之酵母的HOG1缺失菌株中分离有更强活性的CSBP。

这些检测允许发现和修饰抑制CSBP体外激酶活性的化合物。可以预期这些化合物能够以与本文所述化合物差不多的方式阻断细胞因子合成。它们也可导致发现一些新的底物，这些底物本身可以是用于发现阻断细胞因子产生之新化合物的活靶。

预期CSBP如同其他MAP激酶一样将被MEK激活，因此重组蛋白质应允许建立第二种检测法，借以检测CSBP将受推测的MEK作用发生磷酸化的能力。此种情况下将经过刺激的细胞(如用LPS刺激的THP.1细胞)裂解物部分与CSBP和γ-³²P-ATP一起保温，然后分离并计数检测掺入到CSBP中的³²P标记。可以用许多方法进行分离：一种方法是使用与肽或蛋白质融合的CSBP用抗相应肽或蛋白质的抗体通过亲和层析或免疫沉淀进行分离。或者，可以将CSBP直接连接到小珠上或通过融合肽或蛋白质(如FLAG(肽)谷胱甘肽S转移酶)连接，并在与细胞裂解物保温后进行离心分离。也可以用市售的抗磷酸酪氨酸抗体以免疫沉淀或免疫印迹法检测CSBP的酪氨酸磷酸化作用。

可以使用这些检测法发现那些阻断CSBP蛋白质激酶活性之活化作用的化合物并改善已发现之化合物的效力。由于这些化合物可阻断细胞因子合成，所以期望它们具有其实用性。也可以使用这些检测法找到新的MEK，这些MEK本身可以变成将阻断细胞因子合成之新化合物的靶。

人CSBP拯救在高渗透压浓度条件下生长的HOG1缺失菌株的能力，得以直接筛选体内阻断CSBP活性的化合物。例如，可以根据其阻止CSBP⁺/HOG1^-酵母菌株在高渗透压条件下生长但对同样菌株在正常渗透压条件下生长，或对在高渗透压下的CSBP^-/HOG1⁺则没有影响的特征来筛选化合物。可以在宿主细胞中引入影响细胞膜或其通透性的突变以提高以酵母为基础之检测法的敏感性(Gaber，et al.，Mol.Cell.Biol..9：3447-3456(1989))。

在本发明的化合物筛选实施方案中，使分离的、固相化的或细胞结合形式的CSBP与许多候选分子接触，并选择出与蛋白质结合或相互作用的候选分子。可以使用放射活性标记的感兴趣的候选化合物直接检测这种结合或相互作用，或可通过与候选化合物的相互作用或结合所导致的效应间接检测到这种结合或相互作用。或者，也可以对侯选化合物进行竞争筛选检测，其中随待检化合物导入较好用分析上可检测试剂，最好是用放射活性标记的已知配体，并检测化合物抑制或增强标记之配体结合的能力。筛选提高对CSBP之亲和性和选择性的化合物。

为了举例说明本发明的这一个方面，进行天然产物筛选。

在标准检测法中，使用以小柱经排阻层析而从游离物中分离出的结合的配体开始进行筛选努力。试验大约625份海样生物提取物、202份微生物提取物和233份植物材料提取物对³H-化合物I与THP.1胞质结合的抑制作用。证实两种提取物为这种结合的拮抗剂，其IC₅₀值分别为大约200和80μg/ml。这一低击中率(0.2％)与在任何一组选择的“损害提取物”中没有表现抑制作用这一观察结果结合起来，表明该检测法是有足够选择性的，并且完全可用于筛选工作。虽然这两份击中样品的效力相当弱，但它们仍可被接受作为分离其活性要素的先导，从而得以估计该基本检测法以及鉴定生物活性化合物。然后分级分离两种提取物并鉴定其性质。

对使用旋转柱从游离配体中分离结合配体的方法作小的改动可以进一步改善该结合检测法，以有利于高度彻底的筛选。

本发明还包括其中含有用上述方法鉴定之化合物和药学上可接受之载体的药物组合物。本发明蛋白质药物的药物组合物特别适于经胃肠道外途径如皮下、肌肉内或静脉内给药。胃肠道外途径给药的组合物通常含有本发明化合物的溶液或其溶解于可接受载体，较好是水性载体中的混合物。可用多种水性载体，如水、缓冲的水、0.4％盐水、0.3％甘油等。这些溶液无菌且一般不含颗粒物。用常规已熟知的消毒技术对这些溶液消毒。必要时组合物可含有药学上可接受的辅助物质如pH调节剂和缓冲剂，以使之尽可能地接近生理使用条件。在这种药物制剂中本发明化合物的浓度可以有很宽的变化范围，例如从小于约0.5％，通常在或至少约1％到多至15或20％(重量比)，并且将基于液体体积、粘度等因素，根据所选用的特定给药方式来确定化合物含量。

因此，本发明用于肌肉内注射的药物组合物可含有1ml无菌缓冲水和50mg本发明的化合物。同样，本发明的用于静脉内输注的药物组合物可含有250ml无菌林格氏液和150mg本发明的化合物。制备可经胃肠道外途径给药之组合物的实际方法是本领域技术人员已知的或显而易见的，并且在例如Remington′s Phamacecutical Science，15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania中已有详细描述。

本文所述化合物可以冻干储存并可在使用前重新溶解于适当的载体中。已显示这一技术对于常规蛋白质是有效的，并可以利用已知的冻干和重建技术。

当已鉴定的药物是非蛋白质物质时，其可以单独给药或与药学上可接受的载体联合给药。其比例可限据化合物的溶解度和化学性质、选择的给药途径及常规药学实践来确定。例如，可以将组合物制成含有淀粉、乳糖、某种类型的粘土等赋形剂的片剂或胶囊，经口服给药。可以将活性成分与糖和玉米糖浆、香精及染料混合，然后充分脱水将其压制成固体糖锭剂，用以经舌下给药。经胃肠道外途径如肌肉内、静脉内或皮下注射的溶液剂也可以口服给药。胃肠道外注射给药时，可以将其制成含有其他溶质如足够的盐分或葡萄糖的无菌溶液使用，以使溶液保持等渗压。

医生可根据给药方式和所选用的特定化合物，以及被治疗的特定病人来确定最适当的治疗剂剂量。医生通常希望在开始治疗时给予小于最适化合物剂量的给药量，然后逐渐小量增加直至达到特定条件下的最佳治疗效果。通常将会发现，当口服组合物时，为达到相同的效果所需要的活性剂剂量要大于胃肠道外给药的剂量。这些化合物可以按其他血清强度剂的同样方式使用，并且其剂量水平一般也与其他治疗剂所用的剂量为同一数量级水平。治疗剂量一般从每天，1mg到10mg或更高，尽管可分几个不同的剂量单位给药。含有0.5到10mg活性剂的片剂是特别适用的。

根据病人状态，本发明的药物组合物可用于预防和/或治疗目的。在治疗应用中，将组合物以足以治愈或至少部分地缓解病情及其并发症的量投用于已患病的病人。在预防应用中，可将含有本发明化合物或其混合物的组合物投入用尚未处在患病状态的病人以提高其抗病能力。

可以按临床医生选定的剂量水平和方式一次或多次投用该药物组合物。在任何情况下，本发明的药物组合物均应提供是以有效地治疗病人量的本发明化合物。

本发明的核酸实例特别适用于提供能够与人CSBP序列特异性杂交的探针。探针检测技术是本领域已知的，并且探针的大小可以有很宽的变化范围，但探针长度较好是包含至少15个核苷酸。这样的探针可以是并且最好是用分析上可检测的试剂标记的，以便于鉴定探针。有用的试剂包括但不仅限于放射活性、荧光染料或能够催化可检测产物生成的酶。本发明包括例如在诊断性评估以异常的例如提高或降低了的受体基因表达水平为特征的疾病状态中使用受体编码探针。或者，也可以使用探针鉴定携带有编码受体之基因的染色体或分子突变的病人。依据普通技术人员所采用的条件，可以使用探针从其他类型细胞和个体中识别并回收其他形式的这种受体(以其基因组或cDNA形式)。作为一般规律，杂交条件越严格，所回收的基因相关性越密切。

本发明范围内还包括基于本文所述CSBP的序列推测的反义寡核苷酸。设计合成的寡核苷酸或相关反义化学结构类似物，以只别并特异性地结合编码受体基因的靶核酸，并抑制基因表达，例如当靶核酸是mRNA时则抑制基因的翻译。对于反义药物作用的机理，虽然不希望拘泥于理论，但据信这样药物可通过下述的一种或多种机制发挥作用：与mRNA结合并借助内源性核酸酶如RNaseI诱导降解，或者通过抑制mRNA与生产性蛋白质合成所需的调节因子或核糖体成分结合来抑制mRNA的翻译。另外，可使用反义序列作为复杂大分子列阵的成分，其中反义序列与核酶序列或反应性化学基因结合，并用于特异性击中目的mRNA以及降解所说的mRNA或对其进行化学修饰。下列作为背景技术列入本文的参考文献举例说明了反义技术的一般性方面：Cohen，J.S.，Trends.in Pharm.Sci.，10：435(1989)和Weintraub，H.M.，Scientific American Jan.(1990)，page 40。

本发明还包括在基因治疗中使用本文公开的DNA序列。因为CSBP是一种蛋白质激酶，所以有可能制成没有激酶活性但当在同样细胞中共表达时仍可阻断内源性CSBP活化的位点特异性突变体。即其为一种优势阴性突变体(Kolch et al.，Nature 349：426-428(1991))。可将编码该突变蛋白质的DNA用于基因治疗以减轻慢性炎症。有许多载体和传送***可用于在体内将DNA导入靶细胞，例如有腺病毒和反转录病毒。

本发明还包括抗相当于本文公开之CSBP氨基酸序列的抗原表位的单克隆或多克隆抗体。适于免疫学目的的特别重要的受体区域是那些与蛋白质的配体结合区相关联的区域。因为这些区域对蛋白质-受体相互作用的影响，所有抗这些区域的抗体特别适用于诊断和治疗目的。生产多克隆和单克隆抗体的方法是已知的(例如参见Ausubel etal.(supra)的第11章)。

本发明还提供包含有效量抗CSBP抗体或其片段的药物组合物，所说的抗体或其片段可阻断天然配体与该蛋白质的结合，从而得以治疗或缓解与蛋白质活化相关联的疾病状态。

可用编码本文公开之CSBP的核酸转染宿主的适当受精卵或胚胎以得到转基因的非人动物(例如参见美国专利4,736,866、5,175,385、5,175,384和5,175,386)。用使用所得到转基因动物作为研究CSBP/配体相互作用的模型。具体地说，有用的转基因动物是呈现与蛋白质的表达相关之可检测表型的动物。然后根据其逆转或加深相关表型的能力来筛选药物。本发明也包括使CSBP编码基因可操作地连接到调节元件上，所说的调节元件可在分化上对各种不同的温度或代谢条件起反应，从而在对那些条件的反应中有效地打开或关闭表型表达。

可使用本文公开的核酸探针克隆得自所需实验动物品种的人CSBP基因的关联译本，例如小鼠基因译本。可以发展其中已用常规基因剔除技术除掉了所说基因的小鼠品系。然后可用本发明的人CSBP DNA取代/或置换该基因以得到用于体内筛选候选药物的小鼠。还可用酵母进行相似的基因易除和人蛋白质抑制研究。

本发明的纯化蛋白质还可用于进行结构研究的试剂中，其中加或不加结合的候选药物以作为合理设计影响CSBP之新药的借鉴工具。例如，可使用重组蛋白质，通过X射线外壳光谱法(X-raycrystallography)、NMR或模拟已公开的相关蛋白质激酶如CSK的结构，以推导出单独蛋白质或与化合物Ia及相关化合物复合之蛋白质的结构。结构分析将促成进一步了解抑制性化合物如何结合，并导致设计或发现其也可阻断CSBP活性并因而成细胞因子合成之抑制剂的化合物。现已有几个这种以结构为基础设计其他蛋白质靶如HIV蛋白酶的例子。已知了CSBP与几种其他激酶(如MAP和CDC激酶)的相似性，即可利用这些结构信息设计用于抑制激酶家族之其他成员的新化合物。序列表(1)一般信息：(i)申请人：Lee，John C.

Adams，Jerry L.

Gallagher，Timothy F.

Green，David W.

Heys，J.Richard

McDonnell，Peter

McNulty，Dean E.

Strickler，James E.

Young，Peter R.

(ii)发明名称：药物结合蛋白质

(iii)序列数：16

(iv)通讯地址：

(A)地址：Smithkline Beecham Corporation

(B)街道：Corporate Intellectual Property/P.O.

Box 1539

(C)城市：King of Prussia

(D)州：PA

(E)国家：USA

(F)邮编：19406-0939

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：Floppy disk

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25

(vi)当前的申请资料：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类：

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：US 08/123,175

(B)申请日：1993，9，17

(viii)代理人/代理机构信息：

(A)名称：Jervis，Herbert H.

(B)登记号：31,171

(C)参考/备案号：P50195-1

(ix)电信信息：

(A)电话：(610)270-5019

(B)电传：(610)270-5090(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设序列：否

(iv)反义序列：否

(v)片段类型：中间片段

(vi)来源：

(A)生物体：Homo sapiens

(G)细胞类型：单核细胞

(H)细胞系：THP.1

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Ile Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ala His Ala Tyr Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：14个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设序列：否

(iv)反义序列：否

(v)片段类型：中间片段

(vi)来源：

(A)生物体：HOMO SAPIENS

(G)细胞类型：单核细胞

(H)细胞系：THP.1

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Xaa Gln Leu Leu Asn Asn Ile Val Lys Phe Gln Lys Leu Thr

1 5 10(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：22碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假设序列：是

(iv)反义序列：否

(vi)来源：

(A)生物体：HOMO SAPIENS

(G)细胞类型：单核细胞

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GCYCAYGCTA YTTYGCYCAR TA 22(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：22碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假设序列：是

(iv)反义序列：否

(vi)来源：

(A)生物体：HOMO SAPIENS

(G)细胞类型：单核细胞

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：AAYAAYATYK TBAARTTYCA AA 22(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设序列：否

(iv)反义序列：否

(v)片段类型：中间片段

(vi)来源：

(A)生物体：HOMO SAPIENS

(G)细胞类型：单核细胞

(H)细胞系：THP.1

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

Asn Ile Val Lys Cys Gln Lys Leu Thr

1 5(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：285碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设序列：否

(iv)反义序列：否

(vi)来源：

(A)生物体：HOMO SAPIENS

(G)细胞类型：单核细胞

(H)细胞系：THP.1

(ix)序列特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)定位：1..285

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：AAC ATT GTG AAA TGT CAG AAG CTT ACA GAT GAC CAT GTT CAG TTC CTT 48Asn Ile Val Lys Cys Gln Lys Leu Thr Asp Asp His Val Gln Phe Leu1 5 10 15ATC TAC CAA ATT CTC CGA GGT CTA AAG TAT ATA CAT TCA GCT GAC ATA 96Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asp Ile

20 25 30ATT CAC AGG GAC CTA AAA CCT AGT AAT CTA GCT GTG AAT GAA GAC TGT 144Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Val Asn Glu Asp Cys

35 40 45GAG CTG AAG ATT CTG GAT TTT GGA CTG GCT CGG CAC ACA GAT GAT GAA 192Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Thr Asp Asp Glu

50 55 60ATG ACA GGC TAC GTG GCC ACT AGG TGG TAC AGG GCT CCT GAG ATC ATG 240Met Thr Gly Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met65 70 75 80CTG AAC TGG ATG CAT TAC AAC CAG ACA GGT GGT ATT TGG GTC AAG 285Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gln Thr Gly Gly Ile Trp Val Lys

85 90 95(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：95个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Asn Ile Val Lys Cys Gln Lys Leu Thr Asp Asp His Val Gln Phe Leu1 5 10 15Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asp Ile

20 25 30Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Val Asn Glu Asp Cys

35 40 45Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Thr Asp Asp Glu

50 55 60Met Thr Gly Tyr Val Ala Thr Arq Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met65 70 75 80Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gln Thr Gly Gly Ile Trp Val Lys

85 90 95(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：392碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设序列：否

(iv)反义序列：否

(vi)来源：

(A)生物体：HOMO SAPIENS

(G)细胞类型：单核细胞

(H)细胞系：THP.1

(ix)序列特征：

(A)名称/关键：3′UTR

(B)定位：1..392

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CAAGTCCCAA TCCTCCCCAA CCACAGCAAG TTGAATTTAT CAACCATGTT GGGTTGTAAA 60TGCTCGTGTG ATTTCCTACA AGAAATACCT GCTCTGAATA TTTTTGTAAT AAAGGTCTTT 120GCACATGTGA CCCACAATAC GTGTTAGGAG CCTGCATGCT CTGGAAGCCT GGACTCTAAG 180CTGGAGCTCT TGGAAGAGCT CTTCGGTTTC TGAGCATAAT GCTCCCATCT CCTGATTTCT 240CTGAACAGAA AACAAAAGAG AGAATGAGGG AAATTGCTAT TTTATTTGTA TTGATGAACT 300TGGCTGTAAT CAGTTATGCC GTATAGGATG TCAGACAATA CCACTGGTTA AAATAAAGCC 360TATTTTTCAA ATTTAAAAAA AAAAAAAAAA AA 392(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设序列：否

(iv)反义序列：否

(vi)来源：

(A)生物体：Home sapiens

(G)细胞类型：单核细胞(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：CCTCGGAGAA TTTGGTAGAT AAGG 24(2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：36碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设序列：否

(iv)反义序列：否

(vi)来源：

(A)生物体：Home sapiens

(G)细胞类型：单核细胞(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

AACATTGTGA AATGTCAGAA GCTTACAGAT GACCAT 36(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：3813碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设序列：否

(iv)反义序列：否

(vi)来源：

(A)生物体：HOMO SAPIENS

(G)细胞类型：单核细胞

(ix)序列特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)定位：379..1461

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：CCTCCTGGTA TAATCTGGAA CCGCGACCAC TGGAGCCTTA GCGGGCGCAG CAGCTGGAAC 60GGGAGTACTG CGACGCAGCC CGGAGTCGGC CTTGTAGGGG CGAAGGTGCA GGGAGATCGC 120GGCGGGCGCA GTCTTGAGCG CCGGAGCGCG TCCCTGCCCT TAGCGGGGCT TGCCCCAGTC 180GCAGGGGCAC ATCCAGCCGC TGCGGCTGAC AGCAGCCGCG CGCGCGGGAG TCTGCGGGGT 240CGCGGCAGCC GCACCTGCGC GGGCGACCAG CGCAAGGTCC CCGCCCGGCT GGGCGGGCAG 300CAAGGGCCGG GGAGAGGGTG CGGGTGCAGG CGGGGGCCCC ACAGGGCCAC CTTCTTGCCC 360GGCGGCTGCC GCTGGAAA ATG TCT CAG GAG AGG CCC ACG TTC TAC CGG CAG 411

Met Ser Gln Glu Arg Pro Thr Phe Tyr Arg Gln

1 5 10GAG CTG AAC AAG ACA ATC TGG GAG GTG CCC GAG CGT TAC CAG AAC CTG 459Glu Leu Asn Lys Thr Ile Trp Glu Val Pro Glu Arg Tyr Gln Asn Leu

15 20 25TCT CCA GTG GGC TCT GGC GCC TAT GGC TCT GTG TGT GCT GCT TTT GAC 507Ser Pro Val Gly Ser Gly Ala Tyr Gly Ser Val Cys Ala Ala Phe Asp

30 35 40ACA AAA ACG GGG TTA CGT GTG GCA GTG AAG AAG CTC TCC AGA CCA TTT 555Thr Lys Thr Gly Leu Arg Val Ala Val Lys Lys Leu Ser Arq Pro Phe

45 50 55CAG TCC ATC ATT CAT GCG AAA AGA ACC TAC AGA GAA CTG CGG TTA CTT 603Gln Ser Ile Ile His Ala Lys Arg Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Leu Leu60 65 70 75AAA CAT ATG AAA CAT GAA AAT GTG ATT GGT CTG TTG GAC GTT TTT ACA 651Lys His Met Lys His Glu Asn Val Ile Gly Leu Leu Asp Val Phe Thr

80 85 90CCT GCA AGG TCT CTG GAG GAA TTC AAT GAT GTG TAT CTG GTG ACC CAT 699Pro Ala Arg Ser Leu Glu Glu Phe Asn Asp Val Tyr Leu Val Thr His

95 100 105CTC ATG GGG GCA GAT CTG AAC AAC ATT GTG AAA TGT CAG AAG CTT ACA 747Leu Met Gly Ala Asp Leu Asn Asn Ile Val Lys Cys Gln Lys Leu Thr

110 115 120GAT GAC CAT GTT CAG TTC CTT ATC TAC CAA ATT CTC CGA GGT CTA AAG 795Asp Asp His Val Gln Phe Leu Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys

125 130 135TAT ATA CAT TCA GCT GAC ATA ATT CAC AGG GAC CTA AAA CCT AGT AAT 843Tyr Ile His Ser Ala Asp Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn140 145 150 155CTA GCT GTG AAT GAA GAC TGT GAG CTG AAG ATT CTG GAT TTT GGA CTG 891Leu Ala Val Asn Glu Asp Cys Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu

160 165 170GCT CGG CAC ACA GAT GAT GAA ATG ACA GGC TAC GTG GCC ACT AGG TGG 939Ala Arg His Thr Asp Asp Glu Met Thr Gly Tyr Val Ala Thr Arg Trp

175 180 185TAC AGG GCT CCT GAG ATC ATG CTG AAC TGG ATG CAT TAC AAC CAG ACA 987Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gln Thr

190 195 200GTT GAT ATT TGG TCA GTG GGA TGC ATA ATG GCC GAG CTG TTG ACT GGA 1035Val Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Ala Glu Leu Leu Thr Gly

205 210 215AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC CAT ATT AAC CAG CTT CAG CAG ATT 1083Arg Thr Leu Phe Pro Gly Thr Asp His Ile Asn Gln Leu Gln Gln Ile220 225 230 235ATG CGT CTG ACA GGA ACA CCC CCC GCT TAT CTC ATT AAC AGG ATG CCA 1131Met Arg Leu Thr Gly Thr Pro Pro Ala Tyr Leu Ile Asn Arg Met Pro

240 245 250AGC CAT GAG GCA AGA AAC TAT ATT CAG TCT TTG ACT CAG ATG CCG AAG 1179Set His Glu Ala Arg Asn Tyr Ile Gln Ser Leu Thr Gln Met Pro Lys

255 260 265ATG AAC TTT GCG AAT GTA TTT ATT GGT GCC AAT CCC CTG GCT GTC GAC 1227Met Asn Phe Ala Asn Val Phe Ile Gly Ala Asn Pro Leu Ala Val Asp

270 275 280TTG CTG GAG AAG ATG CTT GTA TTG GAC TCA GAT AAG AGA ATT ACA GCG 1275Leu Leu Glu Lys Met Leu Val Leu Asp Set Asp Lys Arg Ile Thr Ala

285 290 295GCC CAA GCC CTT GCA CAT GCC TAC TTT GCT CAG TAC CAC GAT CCT GAT 1323Ala Gln Ala Leu Ala His Ala Tyr Phe Ala Gln Tyr His Asp Pro Asp300 305 310 315GAT GAA CCA GTG GCC GAT CCT TAT GAT CAG TCC TTT GAA AGC AGG GAC 1371Asp Glu Pro Val Ala Asp Pro Tyr Asp Gln Set Phe Glu Set Arg Asp

320 325 330CTC CTT ATA GAT GAG TGG AAA AGC CTG ACC TAT GAT GAA GTC ATC AGC 1419Leu Leu Ile Asp Glu Trp Lys Ser Leu Thr Tyr Asp Glu Val Ile Ser

335 340 345TTT GTG CCA CCA CCC CTT GAC CAA GAA GAG ATG GAG TCC TGAGCACCTG 1468Phe Val Pro Pro Pro Leu Asp Gln Glu Glu Met Glu Ser

350 355 360GTTTCTGTTC TGTTGATCCC ACTTCACTGT GAGGGGAAGG CCTTTTCACG GGAACTCTCC 1528AAATATTATT CAAGTGCCTC TTGTTGCAGA GATTTCCTCC ATGGTGGAAG GGGGTGTGCG 1588TGCGTGTGCG TGCGTGTTAG TGTGTGTGCA TGTGTGTGTC TGTCTTTGTG GGAGGGTAAG 1648ACAATATGAA CAAACTATGA TCACAGTGAC TTTACAGGAG GTTGTGGATG CTCCAGGGCA 1708GCCTCCACCT TGCTCTTCTT TCTGAGAGTT GGCTCAGGCA GACAAGAGCT GCTGTCCTTT 1768TAGGAATATG TTCAATGCAA AGTAAAAAAA TATGAATTGT CCCCAATCCC GGTCATGCTT 1828TTGCCACTTT GGCTTCTCCT GTGACCCCAC CTTGACGGTG GGGCGTAGAC TTGACAACAT 1888CCCACAGTGG CACGGAGAGA AGGCCCATAC CTTCTGGTTG CTTCAGACCT GACACCGTCC 1948CTCAGTGATA CGTACAGCCA AAAAGGACCA ACTGGCTTCT GTGCACTAGC CTGTGATTAA 2008CTTGCTTAGT ATGGTTCTCA GATCTTGACA GTATATTTGA AACTGTAAAT ATGTTTGTGC 2068CTTAAAAGGA GAGAAGAAAG TGTAGATAGT TAAAAGACTG CAGCTGCTGA AGTTCTGAGC 2128CGGGCAAGTC GAGAGGGCTG TTGGACAGCT GCTTGTGGGC CCGGAGTAAT CAGGCAGCCT 2188TCATAGGCGG TCATGTGTGC ATGTGAGCAC ATGCGTATAT GTGCGTCTCT CTTTCTCCCT 2248CACCCCCAGG TGTTGCCATT TCTCTGCTTA CCCTTCACCT TTGGTGCAGA GGTTTCTTGA 2308ATATCTGCCC CAGTAGTCAG AAGCAGGTTC TTGATGTCAT GTACTTCCTG TGTACTCTTT 2368ATTTCTAGCA GAGTGAGGAT GTGTTTTGCA CGTCTTGCTA TTTGAGCATG CACAGCTGCT 2428TGTCCTGCTC TCTTCAGGAG GCCCTGGTGT CAGGCAGGTT TGCCAGTGAA GACTTCTTGG 2488GTAGTTTAGA TCCCATGTCA CCTCAGCTGA TATTATGGCA AGTGATATCA CCTCTCTTCA 2548GCCCCTAGTG CTATTCTGTG TTGAACACAA TTGATACTTC AGGTGCTTTT GATGTGAAAA 2608TCATGAAAAG AGGAACAGGT GGATGTATAG CATTTTTATT CATGCCATCT GTTTTCAACC 2668AACTATTTTT GAGGAATTAT CATGGGAAAA GACCAGGGCT TTTCCCAGGA ATATCCCAAA 2728CTTCGGAAAC AAGTTATTCT CTTCACTCCC AATAACTAAT GCTAAGAAAT GCTGAAAATC 2788AAAGTAAAAA ATTAAAGCCC ATAAGGCCAG AAACTCCTTT TGCTGTCTTT CTCTAAATAT 2848GATTACTTTA AAATAAAAAA GTAACAAGGT GTCTTTTCCA CTCCTATGGA AAAGGGTCTT 2908CTTGGCAGCT TAACATTGAC TTCTTGGTTT GGGGAGAAAT AAATTTTGTT TCAGAATTTT 2968GTATATTGTA GGAATCCCTT TGAGAATGTG ATTCCTTTTG ATGGGGAGAA AGGGCAAATT 3028ATTTTAATAT TTTGTATTTT CAACTTTATA AAGATAAAAT ATCCTCAGGG GTGGAGAAGT 3088GTCGTTTTCA TAACTTGCTG AATTTCAGGC ATTTTGTTCT ACATGAGGAC TCATATATTT 3148AAGCCTTTTG TGTAATAAGA AAGTATAAAG TCACTTCCAG TGTTGGCTGT GTGACAGAAT 3208CTTGTATTTG GGCCAAGGTG TTTCCATTTC TCAATCAGTG CAGTGATACA TGTACTCCAG 3268AGGGACGGGT GGACCCCCTG AGTCAACTGG AGCAAGAAGG AAGGAGGCAG ACTGATGGCG 3328ATTCCCTCTC ACCCGGGACT CTCCCCCTTT CAAGGAAAGT GAACCTTTAA AGTAAAGGCC 3388TCATCTCCTT TATTGCAGTT CAAATCCTCA CCATCCACAG CAAGATGAAT TTTATCAGCC 3448ATGTTTGGTT GTAAATGCTC GTGTGATTTC CTACAGAAAT ACTGCTCTGA ATATTTTGTA 3508ATAAAGGTCT TTGCACATGT GACCACATAC GTGTTAGGAG GCTGCATGCT CTGGAAGCCT 3568GGACTCTAAG CTGGAGCTCT TGGAAGAGCT CTTCGGTTTC TGAGCATAAT GCTCCCATCT 3628CCTGATTTCT CTGAACAGAA AACAAA GAG AGAATGAGGG AAATTGCTAT TTTATTTGTA 3688TTCATGAACT TGGCTGTAAT CAGTTATGCC GTATAGGATG TCAGACAATA CCACTGGTTA 3748AAATAAAGCC TATTTTTCAA ATTTAAAAAA AAAAAAAAAA AAGTCCAGCA ATTTCGTTAC 3808TTATG 3813(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：360个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Met Ser Gln Glu Arg Pro Thr Phe Tyr Arg Gln Glu Leu Asn Lys Thr1 5 10 15Ile Trp Glu Val Pro Glu Arg Tyr Gln Asn Leu Ser Pro Val Gly Ser

20 25 30Gly Ala Tyr Gly Ser Val Cys Ala Ala Phe Asp Thr Lys Thr Gly Leu

35 40 45Arg Val Ala Val Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Ser Ile Ile His

50 55 60Ala Lys Arg Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Leu Leu Lys His Met Lys His65 70 75 80Glu Asn Val Ile Gly Leu Leu Asp Val Phe Thr Pro Ala Arg Ser Leu

85 90 95Glu Glu Phe Asn Asp Val Tyr Leu Val Thr His Leu Met Gly Ala Asp

100 105 110Leu Asn Asn Ile Val Lys Cys Gln Lys Leu Thr Asp Asp His Val Gln

115 120 125Phe Leu Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala

130 135 140Asp Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Val Asn Glu145 150 155 160Asp Cys Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Thr Asp

165 170 175Asp Glu Met Thr Gly Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu

180 185 190Ile Met Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gln Thr Val Asp Ile Trp Ser

195 200 205Val Gly Cys Ile Met Ala Glu Leu Leu Thr Gly Arg Thr Leu Phe Pro

210 215 220Gly Thr Asp His Ile Asn Gln Leu Gln Gln Ile Met Arg Leu Thr Gly225 230 235 240Thr Pro Pro Ala Tyr Leu Ile Asn Arg Met Pro Ser His Glu Ala Arg

245 250 255Asn Tyr Ile Gln Ser Leu Thr Gln Met Pro Lys Met Asn Phe Ala Asn

260 265 270Val Phe Ile Gly Ala Asn Pro Leu Ala Val Asp Leu Leu Glu Lys Met

275 280 285Leu Val Leu Asp Ser Asp Lys Arg Ile Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ala

290 295 300His Ala Tyr Phe Ala Gln Tyr His Asp Pro Asp Asp Glu Pro Val Ala305 310 315 320Asp Pro Tyr Asp Gln Ser Phe Glu Ser Arg Asp Leu Leu Ile Asp Glu

325 330 335Trp Lys Ser Leu Thr Tyr Asp Glu Val Ile Ser Phe Val Pro Pro Pro

340 345 350Leu Asp Gln Glu Glu Met Glu Ser

355 360(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1423碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设序列：否

(iv)反义序列：否

(vi)来源：

(A)生物体：HOMO SAPIENS

(G)细胞类型：单核细胞

(ix)序列特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)定位：227..1309

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：CCACTCCTGG TATAATCTCG CCCCAGTCGC AGGGGCACAT CCAGCCGCTG CGGCTGACAG 60CAGCCGCGCG CGCGGGAGTC TGCGGGGTCG CGGCAGCCGC ACCTGCGCGG GCGACCAGCG 120CAAGGTCCCC GCCCGGCTGG GCGGGCAGCA AGGGCCGGGG AGAGGGTGCG GGTGCAGGCG 180GGGGCCCCAC AGGGCCACCT TCCTTGCCCGG CGGCTGCCGC TGGAAA ATG TCT CAG 235

Met Ser Gln

1GAG AGG CCC ACG TTC TAC CGG CAG GAG CTG AAC AAG ACA ATC TGG GAG 283Glu Arg Pro Thr Phe Tyr Arg Gln Glu Leu Asn Lys Thr Ile Trp Glu

5 10 15GTG CCC GAG CGT TAC CAG AAC CTG TCT CCA GTG GGC TCT GGC GCC TAT 331Val Pro Glu Arg Tyr Gln Asn Leu Ser Pro Val Gly Ser Gly Ala Tyr20 25 30 35GGC TCT GTG TGT GCT GCT TTT GAC ACA AAA ACG GGG TTA CGT GTG GCA 379Gly Ser Val Cys Ala Ala Phe Asp Thr Lys Thr Gly Leu Arg Val Ala

40 45 50GTG AAG AAG CTC TCC AGA CCA TTT CAG TCC ATC ATT CAT GCG AAA AGA 427Val Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Ser Ile Ile His Ala Lys Arg

55 60 65ACC TAC AGA GAA CTG CGG TTA CTT AAA CAT ATG AAA CAT GAA AAT GTG 475Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Leu Leu Lys His Met Lys His Glu Asn Val

70 75 80ATT GGT CTG TTG GAC GTT TTT ACA CCT GCA AGG TCT CTG GAG GAA TTC 523Ile Gly Leu Leu Asp Val Phe Thr Pro Ala Arg Ser Leu Glu Glu Phe

85 90 95AAT GAT GTG TAT CTG GTG ACC CAT CTC ATG GGG GCA GAT CTG AAC AAC 571Asn Asp Val Tyr Leu Val Thr His Leu Met Gly Ala Asp Leu Asn Asn100 105 110 115ATT GTG AAA TGT CAG AAG CTT ACA GAT GAC CAT GTT CAG TTC CTT ATC 619Ile Val Lys Cys Gln Lys Leu Thr Asp Asp His Val Gln Phe Leu Ile

120 125 130TAC CAA ATT CTC CGA GGT CTA AAG TAT ATA CAT TCA GCT GAC ATA ATT 667Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asp Ile Ile

135 140 145CAC AGG GAC CTA AAA CCT AGT AAT CTA GCT GTG AAT GAA GAC TGT GAG 715His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Val Asn Glu Asp Cys Glu

150 155 160CTG AAG ATT CTG GAT TTT GGA CTG GCT CGG CAC ACA GAT GAT GAA ATG 763Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Thr Asp Asp Glu Met

165 170 175ACA GGC TAC GTG GCC ACT AGG TGG TAC AGG GCT CCT GAG ATC ATG CTG 511Tnr Gly Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu180 185 190 195AAC TGG ATG CAT TAC AAC CAG ACA GTT GAT ATT TGG TCA GTG GGA TGC 859Asn Trp Met His Tyr Asn Gln Thr Val Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys

200 205 210ATA ATG GCC GAG CTG TTG ACT GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC 907Ile Met Ala Glu Leu Leu Thr Gly Arg Thr Leu Phe Pro Gly Thr Asp

215 220 225CAT ATT GAT CAG TTG AAG CTC ATT TTA AGA CTC GTT GGA ACC CCA GGG 955His Ile Asp Gln Leu Lys Leu Ile Leu Arg Leu Val Gly Thr Pro Gly

230 235 240GCT GAG CTT TTG AAG AAA ATC TCC TCA GAG TCT GCA AGA AAC TAT ATT 1003Ala Glu Leu Leu Lys Lys Ile Ser Ser Glu Ser Ala Arg Asn Tyr Ile

245 250 255CAG TCT TTG ACT CAG ATG CCG AAG ATG AAC TTT GCG AAT GTA TTT ATT 1051Gln Ser Leu Thr Gln Met Pro Lys Met Asn Phe Ala Asn Val Phe Ile260 265 270 275GGT GCC AAT CCC CTG GCT GTC GAC TTG CTG GAG AAG ATG CTT GTA TTG 1099Gly Ala Asn Pro Leu Ala Val Asp Leu Leu Glu Lys Met Leu Val Leu

280 285 290GAC TCA GAT AAG AGA ATT AGA GCG GCC CAA GCC CTT GGA CAT GCC TAC 1147Asp Ser Asp Lys Arg Ile Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ala His Ala Tyr

295 300 305TTT GCT CAG TAC CAC GAT CCT GAT GAT GAA CCA GTG GCC GAT CCT TAT 1195Phe Ala Gln Tyr His Asp Pro Asp Asp Glu Pro Val Ala Asp Pro Tyr

310 315 320GAT CAG TCC TTT GAA AGC AGG GAC CTC CTT ATA GAT GAG TGG AAA AGC 1243Asp Gln Ser Phe Glu Ser Arg Asp Leu Leu Ile Asp Glu Trp Lys Ser

325 330 335CTG ACC TAT GAT GAA GTC ATC AGC TTT GTG CCA CCA CCC CTT GAC CAA 1291Leu Thr Tyr Asp Glu Val Ile Ser Phe Val Pro Pro Pro Leu Asp Gln340 345 350 355GAA GAG ATG GAG TCC TGAGCACCTG GTTTCTGTTC TGTTGATCCC ACTTCACTGT 1346Glu Glu Met Glu Ser

360GAGGGGAAGG CCTTTTCACG GGAACTCTCC AAATATTATT CAAGTGCCAA AAAGGTCCAG 1406CAATTTCGTT ACTTATG 1423(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：360氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Met Ser Gln Glu Arg Pro Thr Phe Tyr Arg Gln Glu Leu Asn Lys Thr1 5 10 15Ile Trp Glu Val Pro Glu Arg Tyr Gln Asn Leu Ser Pro Val Gly Ser

20 25 30Gly Ala Tyr Gly Ser Val Cys Ala Ala Phe Asp Thr Lys Thr Gly Leu

35 40 45Arg Val Ala Val Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Ser Ile Ile His

85 90 95Glu Glu Phe Asn Asp Val Tyr Leu Val Thr His Leu Met Gly Ala Asp

100 105 110Leu Asn Asn Ile Val Lys Cys Gln Lys Leu Thr Asp Asp His Val Gln

115 120 125Phe Leu Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala

130 135 140Asp Ile Ile His Asg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Val Asn Glu145 150 155 160Asp Cys Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Thr Asp

165 170 175Asp Glu Met Thr Gly Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu

180 185 190Ile Met Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gln Thr Val Asp Ile Trp Ser

195 200 205Val Gly Cys Ile Met Ala Glu Leu Leu Thr Gly Arg Thr Leu Phe Pro

210 215 220Gly Thr Asp His Ile Asp Gin Leu Lys Leu Ile Leu Arg Leu Val Gly225 230 235 240Thr Pro Gly Ala Glu Leu Leu Lys Lys Ile Ser Ser Glu Ser Ala Arg

245 250 255Asn Tyr Ile Gln Ser Leu Thr Gln Met Pro Lys Met Asn Phe Ala Asn

260 265 270Val Phe Ile Gly Ala Asn Pro Leu Ala Val Asp Leu Leu Glu Lys Met

275 280 285Leu Val Leu Asp Ser Asp Lys Arg Ile Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ala

325 330 335Trp Lys Ser Leu Thr Tyr Asp Glu Val Ile Ser Phe Val Pro Pro Pro

340 345 350Leu Asp Gln Glu Glu Met Glu Ser

355 360(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：31碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设序列：否

(iv)反义序列：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：CGCCCTCGAG ATGTCTCAGG AGAGGCCCAC G 31(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：21碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设序列：否

(iv)反义序列：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：GCCAGTCCAA AATCCAGAAT C 21

Claims

1.编码细胞因子抑制性抗炎药物结合蛋白质(CSBP)的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14，其保守替换变体和其天然存在的等位基因变体，所述变体被进一步特征化为具有激酶活性。

2.权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述的分离的多核苷酸是DNA或RNA。

3.权利要求1所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14，所述蛋白质被进一步特征化为具有激酶活性。

4.权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸是DNA或RNA。

5.权利要求1所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含选自下列的多核苷酸序列：SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13。

6.权利要求5所述的分离的多核苷酸，其中所述的分离的多核苷酸是DNA或RNA。