CN1160370C - 新的人细胞周期控制相关蛋白及其编码序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类新的具有抑癌功能的人蛋白，编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生该多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病如癌症等的方法。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这类新的具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸的用途。

Description

新的人细胞周期控制相关蛋白及其编码序列

发明领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码具有抑癌功能的人细胞周期控制相关基因(crn-like gene，CLG)蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。

发明背景

细胞***和增殖是细胞生命活动的基本特征之一。人体及其他多细胞生物体生长发育时，细胞数目的增加，衰老、死亡细胞的更新，生命的延续，均需通过细胞的增殖来完成。细胞增殖周期是细胞通过一系列细胞内事件，实现细胞生长和增殖的过程，各个事件之间存在严格的顺序性，其调控机制涉及多个层次和多种因子，不仅涉及生长因子、环核苷酸、激素、原癌基因等，更重要的是还受到细胞周期调控***的控制，如细胞***周期基因、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖激酶及其抑制蛋白等的调控。

细胞周期的调控，是细胞生物学研究中的核心问题，它涉及到胚胎细胞的有序发育，机体细胞的正常增生，细胞的再生和分化，以及细胞的衰老、凋亡等问题。正常细胞周期必须进行严格有序的调控，细胞周期调控异常将会使细胞发生突变、畸变或癌变。

近年来对细胞周期调控***进行了深入研究，该***主要包括细胞***周期(celldivision cycle，cdc)基因，细胞周期蛋白(cyclin)，细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)和细胞周期蛋白依赖激酶的抑制蛋白(CKI)等。人们依据酵母(yeast)、果蝇(drosophila)和线虫(c.elegans)等模式生物，已经分离到了多种人的细胞周期调控基因。如Lieberman等依据同源分析方法，分离到一个与酵母rad9+同源的人细胞周期检查点(checkpoint)控制基因(Lieberman，H.B.，Hopkins，K.M.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：13890-13895；1996)。

癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤，目前人们已越来越关注肿瘤的基因治疗。因此，本领域迫切需要开发研究具有抑癌功能的人蛋白及其激动剂/抑制剂，尤其是参与细胞周期调控作用的蛋白。

发明概述

本发明的目的是提供一类新的具有抑癌功能的人蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的具有抑癌功能的蛋白多肽，它包含具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性：(a)编码上述的CLG蛋白多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组：SEQ ID NO：3的编码区序列(22-2586位)或全长序列(1-2659位)。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有CLG蛋白活性的多肽的制备方法，该方法包含：(a)在适合表达CLG蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有CLG蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的CLG蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-800个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的CLG蛋白多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。

本发明其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

图1是CLG的RNA表达谱。

图2显示了CLG全长cDNA对人肝癌细胞SMMC-7721集落形成的抑制作用。其中图2A为载体对照(pCMV-Script)，集落数为56个；图2B为CLG(pCMV-Script/CLG)，集落数仅为3个。

图3是用CLG转染的SMMC-7721细胞接种裸鼠后形成的肿瘤组织的石蜡切片照片。图3A为坏死灶内，可见较多阳性凋亡细胞；图3B为未坏死区，可见散在的凋亡细胞。

图4显示了转染CLG基因后的″梯形″DNA(DNA ladder)电泳图。其中各泳道为：1.转染空载体；2.转染p53；3.转染CLG；4.未转染对照点；5.分子量标准。

图5 CLG蛋白表达的SDS-PAGE电泳图。其中，各泳道是：1.蛋白分子量标准；2.pET32a-CLG菌体超声上清；3.pET32a菌体超声上清；4.pET32a-CLG菌体超声沉淀；5.pET32a菌体超声沉淀。

发明详述

本发明采用大规模cDNA克隆转染癌细胞，在获得具有抑癌作用的基础上，经测序证明为新的基因，进一步得到全长cDNA克隆。DNA转染试验证明，本发明的具有抑癌功能的蛋白对癌细胞(肝癌细胞)具有抑制克隆形成的作用，其抑制率≥50％。

在一个实例中，从人胎盘cDNA文库中分离到一个与线虫、果蝇和酵母的细胞周期调控蛋白高度同源的新基因，它与线虫的细胞周期调控蛋白具有66％(557/837)同源性，与果蝇的细胞周期调控蛋白(crooked neck，crn)有41％(157/375)同源性，与酵母的细胞周期控制蛋白有37％(228/599)同源性。从生物信息学可以判定人CLG(crn-like gene；原序号为PP3898，GenBank登录号AF258567，登录日期2000年4月24日)是一个新的人细胞周期相关基因。经过初步功能研究发现，CLG可在体外抑制人肝癌细胞SMMC-7721的生长；肝癌细胞SMMC-7721裸鼠移植瘤组织的原位凋亡检测和DNA电泳分析表明，CLG基因转染SMMC-7721细胞后能诱导肿瘤细胞凋亡，并抑制肿瘤细胞的生长。

在本文中，“细胞周期控制相关基因蛋白”、“CLG蛋白”、和“PP3898蛋白”可互换使用，都指具有人细胞周期控制相关基因蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的细胞周期控制相关基因蛋白。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的CLG蛋白或多肽”是指CLG蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CLG蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。CLG蛋白多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人CLG蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人CLG蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。以CLG蛋白为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列+各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(+任选的附加编码序列)+非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码CLG蛋白的多聚核苷酸。

本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。

编码CLG蛋白的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。

上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时，DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。如果所需的氨基酸的整个序列不清楚时，DNA序列的直接化学合成是不可能的，选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。

可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交：(2)标志基因的功能出现或丧失；(3)测定CLG蛋白的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。

在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2kb之内，较佳地为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。

在第(4)种方法中，检测CLG蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，74；5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或CLG蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CLG蛋白多肽(Science，1984；224：1431)。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人CLG蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人CLG蛋白多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人CLG蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞：CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人CLG蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗CLG蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗CLG蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如，抗体可用于激活或抑制人CLG蛋白的功能。用表达的重组人CLG蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人CLG蛋白功能的多肽分子。

本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)人CLG蛋白的药剂的方法。激动剂提高人CLG蛋白刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达人CLG蛋白的膜制剂与标记的人CLG蛋白一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。

人CLG蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。人CLG蛋白的拮抗剂可以与人CLG蛋白结合并消除其功能，或是抑制人CLG蛋白的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。人CLG蛋白的拮抗剂可用于治疗用途。

在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将CLG蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响CLG蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，各种恶性肿瘤、和细胞异常增殖等。

本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。

可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。

本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。

药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。CLG蛋白以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的CLG蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。

人CLG蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于CLG蛋白的无表达或异常/无活性的CLG蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的CLG蛋白，以抑制内源性的CLG蛋白活性。例如，一种变异的CLG蛋白可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的CLG蛋白，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗CLG蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将CLG蛋白基因转移至细胞内。构建携带CLG蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人CLG蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。

抑制人CLG蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明还提供了针对人CLG蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。抗人CLG蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人CLG蛋白。

与人CLG蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人CLG蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人CLG蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人CLG蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人CLG蛋白阳性的细胞。

多克隆抗体的生产可用人CLG蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

人CLG蛋白单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256：495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al，PNAS，1985，81：6851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.PatNo.4946778)也可用于生产抗人CLG蛋白的单链抗体。

能与人CLG蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人CLG蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人CLG蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人CLG蛋白水平，可以用作解释人CLG蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断CLG蛋白起作用的疾病。

CLG蛋白的多聚核苷酸可用于CLG蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，CLG蛋白的多聚核苷酸可用于检测CLG蛋白的表达与否或在疾病状态下CLG蛋白的异常表达。如CLG蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断CLG蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用CLG蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CLG蛋白的转录产物。

检测CLG蛋白基因的突变也可用于诊断CLG蛋白相关的疾病。CLG蛋白突变的形式包括与正常野生型CLG蛋白DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具***置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具***点。现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色***置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。

简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色本定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。

将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomes：a Manual of BasicTechniques，Pergamon Press，New York(1988)。

一旦序列被定位到准确的染色***置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA，可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。

本发明的CLG蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关序列，就可以用重组法来大批量地获得该序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

此外，由于本发明的CLG蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：cDNA基因片段的获得及对癌细胞克隆形成的抑制作用

PP3898(即CLG)来自于用常规方法构建人胎盘cDNA文库。取3、6、10月龄的胎盘组织，用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA，用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用pCMV-script TMXR cDNA文库构建试剂盒(Seratagene公司)构建上述mRNA的cDNA文库。其中反转录酶改用MMLV-RT-Superscript II(GIBCOBRL)，反转录反应在42℃进行。转化XL 10-Gold感受细胞，获得了1×10⁶cfu/μg cDNA滴度的cDNA文库。第一轮随机挑取cDNA克隆，其后以高丰度cDNA克隆和已证明有抑癌细胞生长功能的cDNA克隆为探针，杂交筛选cDNA文库，挑取弱阳性及阴性克隆。用Qiagen 96孔板质粒抽提试剂盒，按厂家说明书进行质粒DNA的提取。质粒DNA和空载体同时转染肝癌细胞系7721。100ng DNA酒精沉淀干燥后，加6μl H2O溶解，待转染。每份DNA样品中加0.74μl脂质体及9.3μl无血清培液，混匀后，室温放置10分钟。每管中加150μl无血清培液，均分加入3孔生长于96孔板的7721细胞中，37℃放置2小时，每孔再加50μl无血清培液，37℃24小时。每孔换100μl全培液，37℃ 24小时，换含G418的全培液100μl，37℃24-48小时，边观察，边换G418浓度不等的培液。约2-3次后，直到镜检细胞有克隆形成，计数。发现PP3898(即CLG)有抑制细胞克隆形成作用(抑制率在50％或50％以上)，结果如下表所示。

           表1  cDNA克隆转染细胞(7721)克隆形成情况

cDNA克隆名称    CDNA克隆数(三个重复)    空载体克隆数(三个重复)

PP3898(即CLG)          200                    33  34  38

对cDNA克隆采用双脱氧终止法，在ABI377 DNA自动测序仪上测定其一端近500bp的核苷酸序列。分析后，确定为新基因克隆，再进行完全测序，发现CLG片段为非全长序列，需用RACE方法获取全长cDNA克隆。

实施例2：RACE法获得全长cDNA克隆和RT-PCR法获得CLC基因

1.RACE法获得全长cDNA克隆

对PP3898 cDNA克隆序列分析后发现基因尚不完整，采用Clontech公司SMART RACEcDNA扩增试剂盒(Cat.No.K1811-1)，设计基因特异引物(如下表2所示)，按说明书进行操作，获得全长克隆。

                          表2 CLG基因特异引物

克隆名称	特异引物1(pp3898-NB)	特异引物2(pp3898-B)
			PP3898	5’TCATCCAGCCGGTCACTTGACTTGA 3’	5’GCCACAGCTGGTAGTTGGACTTGCC 3’

具体而言，对PP3898克隆使用如下引物：

通用引物mix(UPM)Long  5’CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT3’

巢式通用引物(NUP)     5’AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT 3’

pp3898-NB             5’TCATCCAGCCGGTCACTTGACTTGA 3’

pp3898-B              5’GCCACAGCTGGTAGTTGGACTTGCC 3’

用人胎盘组织mRNA为起始材料，按Clontech公司SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Cat#1811-1)说明书获得cDNA.然后分别以UPM引物和基因特异的pp3898-B引物进行第一轮PCR，再以NUP引物和基因特异的pp3898-NB引物进行第二轮PCR，获得基因片段。

反应条件如下：94℃ 1分钟，一个循环；94℃  30秒，72℃  4分钟，5个循环；94℃  30秒，70℃  4分钟，5个循环；94℃  20秒，65℃  30秒，68℃  4分钟，27个循环。

SMART RACE反应，获得CLG基因的5’延伸片段，经重组连接，获得全长CLG基因的cDNA克隆，如SEQ ID NO：1所示。

2.RT-PCR法获得CLG基因

合成引物CLG-F(5’ATGGTGGTGATGGCGCGACTCTCG 3’，bp 22-45位)和CLG-R(5’GGTCAGTCTTCCTTCAGGCTCCC 3’，bp 2569-2591位)，采用RT-PCR的方法(其中RT-PCR反应条件与上述SMART RACE反应条件相同)，从而获得含有完整编码区的CLG基因，RT-PCR产物大小为2570bp。

实施例3：CLG cDNA克隆的序列分析

A：核苷酸序列(SEQ ID NO：1)长度：2659

GGTACCTGGG CATCCAGAAA AATGGTGGTG ATGGCGCGAC TCTCGCGGCC CGAGCGGCCG  60

GACCTTGTCT TCGAGGAAGA GGACCTCCCC TATGAGGAGG AAATCATGCG GAACCAATTC  120

TCTGTCAAAT GCTGGCTTCG CTACATCGAG TTCAAACAGG GCGCCCCGAA GCCCAGGCTC  180

AATCAGCTAT ACGAGCGGGC ACTCAAGCTG CTGCCCTGCA GCTACAAACT CTGGTACCGA  240

TACCTGAAGG CGCGTCGGGC ACAGGTGAAG CATCGCTGTG TGACCGACCC TGCCTATGAA  300

GATGTCAACA ACTGTCATGA GAGGGCCTTT GTGTTCATGC ACAAGATGCC TCGTCTGTGG  360

CTAGATTACT GCCAGTTCCT CATGGACCAG GGGCGCGTCA CACACACCCG CCGCACCTTC  420

GACCGTGCCC TCCGGGCACT GCCCATCACG CAGCACTCTC GAATTTGGCC CCTGTATCTG  480

CGCTTCCTGC GCTCACACCC ACTGCCTGAG ACAGCTGTGC GAGGCTATCG GCGCTTCCTC  540

AAGCTGAGTC CTGAGAGTGC AGAGGAGTAC ATTGAGTACC TCAAGTCAAG TGACCGGCTG  600

GATGAGGCCG CCCAGCGCCT GGCCACCGTG GTGAACGACG AGCGTTTCGT GTCTAAGGCC  660

GGCAAGTCCA ACTACCAGCT GTGGCACGAG CTGTGCGACC TCATCTCCCA GAATCCGGAC  720

AAGGTACAGT CCCTCAATGT GGACGCCATC ATCCGCGGGG GCCTCACCCG CTTCACCGAC  780

CAGCTGGGCA AGCTCTGGTG TTCTCTCGCC GACTACTACA TCCGCAGCGG CCATTTCGAG  840

AAGGCTCGGG ACGTGTACGA GGAGGCCATC CGGACAGTGA TGACCGTGCG GGACTTCACA  900

CAGGTGTTTG ACAGCTACGC CCAGTTCGAG GAGAGCATGA TCGCTGCAAA GATGGAGACC  960

GCCTCGGAGC TGGGGCGCGA GGAGGAGGAT GATGTGGACC TGGAGCTGCG CCTGGCCCGC  1020

TTCGAGCAGC TCATCAGCCG GCGGCCCCTG CTCCTCAACA GCGTCTTGCT GCGCCAAAAC  1080

CCACACCACG TGCACGAGTG GCACAAGCGT GTCGCCCTGC ACCAGGGCCG CCCCCGGGAG  1140

ATCATCAACA CCTACACAGA GGCTGTGCAG ACGGTGGACC CCTTCAAGGC CACAGGCAAG  1200

CCCCACACTC TGTGGGTGGC GTTTGCCAAG TTTTATGAGG ACAACGGACA GCTGGACGAT  1260

GCCCGTGTCA TCCTGGAGAA GGCCACCAAG GTGAACTTCA AGCAGGTGGA TGACCTGGCA  1320

AGCGTGTGGT GTCAGTGCGG AGAGCTGGAG CTCCGACACG AGAACTACGA TGAGGCCTTG  1380

CGGCTGCTGC GAAAGGCCAC GGCGCTGCCT GCCCGCCGGG CCGAGTACTT TGATGGTTCA  1440

GAGCCCGTGC AGAACCGCGT GTACAAGTCA CTGAAGGTCT GGTCCATGCT CGCCGACCTG  1500

GAGGAGAGCC TCGGCACCTT CCAGTCCACC AAGGCCGTGT ACGACCGCAT CCTGGACCTG  1560

CGTATCGCAA CACCCCAGAT CGTCATCAAC TATGCCATGT TCCTGGAGGA GCACAAGTAC  1620

TTCGAGGAGA GCTTCAAGGC GTACGAGCGC GGCATCTCGC TGTTCAAGTG GCCCAACGTG  1680

TCCGACATCT GGAGCACCTA CCTGACCAAA TTCATTGCCC GCTATGGGGG CCGCAAGCTG  1740

GAGCGGGCAC GGGACCTGTT TGAACAGGCT CTGGACGGCT GCCCCCCAAA ATATGCCAAG  1800

ACCTTGTACC TGCTGTACGC ACAGCTGGAG GAGGAGTGGG GCCTGGCCCG GCATGCCATG  1860

GCCGTGTACG AGCGTGCCAC CAGGGCCGTG GAGCCCGCCC AGCAGTATGA CATGTTCAAC  1920

ATCTACATCA AGCGGGCGGC CGAGATCTAT GGGGTCACCC ACACCCGCGG CATCTACCAG  1980

AAGGCCATTG AGGTGCTGTC GGACGAGCAC GCGCGTGAGA TGTGCCTGCG GTTTGCAGAC  2040

ATGGAGTGCA AGCTCGGGGA GATTGACCGC GCCCGGGCCA TCTACAGCTT CTGCTCCCAG  2100

ATCTGTGACC CCCGGACGAC CGGCGCGTTC TGGCAGACGT GGAAGGACTT TGAGGTCCGG  2160

CATGGCAATG AGGACACCAT CAAGGAAATG CTGCGTATCC GGCGCAGCGT GCAGGCCACG  2220

TACAACACGC AGGTCAACTT CATGGCCTCG CAGATGCTCA AGGTCTCGGG CAGTGCCACG  2280

GGCACCGTGT CTGACCTGGC CCCTGGGCAG AGTGGCATGG ACGACATGAA GCTGCTGGAA  2340

CAGCGGGCAG AGCAGCTGGC GGCTGAGGCG GAGCGTGACC AGCCCTTGCG CGCCCAGAGC  2400

AAGATCCTGT TCGTGAGGAG TGACGCCTCC CGGGAGGAGC TGGCAGAGCT GGCACAGCAG  2460

GTCAACCCCG AGGAGATCCA GCTGGGCGAG GACGAGGACG AGGACGAGAT GGACCTGGAG 2520

CCCAACGAGG TTCGGCTGGA GCAGCAGAGC GTGCCAGCCG CAGTGTTTGG GAGCCTGAAG 2580

GAAGACTGAC CCGTCCCTCC CCCCTCCCCA CCCCCTCCCC AATACAGCTA CGTTTGTAAA 2640

AAAAAAAAAA AAAAAAAAA                                              2659

B：氨基酸序列  (SEQ ID NO：2)  长度：855

1    MVVMARLSRP ERPDLVFEEE DLPYEEEIMR NQFSVKCWLR YIEFKQGAPK

51   PRLNQLYERA LKLLPCSYKL WYRYLKARRA QVKHRCVTDP AYEDVNNCHE

101  RAFVFMHKMP RLWLDYCQFL MDQGRVTHTR RTFDRALRAL PITQHSRIWP

151  LYLRFLRSHP LPETAVRGYR RFLKLSPESA EEYIEYLKSS DRLDEAAQRL

201  ATVVNDERFV SKAGKSNYQL WHELCDLISQ NPDKVQSLNV DAIIRGGLTR

251  FTDQLGKLWC SLADYYIRSG HFEKARDVYE EAIRTVMTVR DFTQVFDSYA

301  QFEESMIAAK METASELGRE EEDDVDLELR LARFEQLISR RPLLLNSVLL

351  RQNPHHVHEW HKRVALHQGR PREIINTYTE AVQTVDPFKA TGKPHTLWVA

401  FAKFYEDNGQ LDDARVILEK ATKVNFKQVD DLASVWCQCG ELELRHENYD

451  EALRLLRKAT ALPARRAEYF DGSEPVQNRV YKSLKVWSML ADLEESLGTF

501  QSTKAVYDRI LDLRIATPQI VINYAMFLEE HKYFEESFKA YERGISLFKW

551  PNVSDIWSTY LTKFIARYGG RKLERARDLF EQALDGCPPK YAKTLYLLYA

601  QLEEEWGLAR HAMAVYERAT RAVEPAQQYD MFNIYIKRAA EIYGVTHTRG

651  IYQKAIEVLS DEHAREMCLR FADMECKLGE IDRARAIYSF CSQICDPRTT

701  GAFWQTWKDF EVRHGNEDTI KEMLRIRRSV QATYNTQVNF MASQMLKVSG

751  SATGTVSDLA PGQSGMDDMK LLEQRAEQLA AEAERDQPLR AQSKILFVRS

801  DASREELAEL AQQVNPEEIQ LGEDEDEDEM DLEPNEVRLE QQSVPAAVFG

851  SLKED

C.核苷酸及氨基酸组合序列：(SEQ ID NO：3)  克隆号：CLG(即PP3898)起始编码子：22 ATG  终止编码子：2589 TGA蛋白质分子量：100004.44

1   GGT ACC TGG GCA TCC AGA AAA ATG GTG GTG ATG GCG CGA CTC TCG CGG    48

1                               Met Val Val Met Ala Arg Leu Ser Arg    9

49  CCC GAG CGG CCG GAC CTT GTC TTC GAG GAA GAG GAC CTC CCC TAT GAG    96

10  Pro Glu Arg Pro Asp Leu Val Phe Glu Glu Glu Asp Leu Pro Tyr Glu    25

97  GAG GAA ATC ATG CGG AAC CAA TTC TCT GTC AAA TGC TGG CTT CGC TAC    144

26  Glu Glu Ile Met Arg Asn Gln Phe Ser Val Lys Cys Trp Leu Arg Tyr    41

145 ATC GAG TTC AAA CAG GGC GCC CCG AAG CCC AGG CTC AAT CAG CTA TAC    192

42  Ile Glu Phe Lys Gln Gly Ala Pro Lys Pro Arg Leu Asn Gln Leu Tyr    57

193 GAG CGG GCA CTC AAG CTG CTG CCC TGC AGC TAC AAA CTC TGG TAC CGA    240

58  Glu Arg Ala Leu Lys Leu Leu Pro Cys Ser Tyr Lys Leu Trp Tyr Arg    73

241 TAC CTG AAG GCG CGT CGG GCA CAG GTG AAG CAT CGC TGT GTG ACC GAC    288

74  Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ala Gln Val Lys His Arg Cys Val Thr Asp    89

289 CCT GCC TAT GAA GAT GTC AAC AAC TGT CAT GAG AGG GCC TTT GTG TTC    336

90  Pro Ala Tyr Glu Asp Val Asn Asn Cys His Glu Arg Ala Phe Val Phe    105

337 ATG CAC AAG ATG CCT CGT CTG TGG CTA GAT TAC TGC CAG TTC CTC ATG    384

106 Met His Lys Met Pro Arg Leu Trp Leu Asp Tyr Cys Gln Phe Leu Met    121

385 GAC CAG GGG CGC GTC ACA CAC ACC CGC CGC ACC TTC GAC CGT GCC CTC    432

122 Asp Gln Gly Arg Val Thr His Thr Arg Arg Thr Phe Asp Arg Ala Leu    137

433 CGG GCA CTG CCC ATC ACG CAG CAC TCT CGA ATT TGG CCC CTG TAT CTG    480

138 Arg Ala Leu Pro Ile Thr Gln His Ser Arg Ile Trp Pro Leu Tyr Leu    153

481 CGC TTC CTG CGC TCA CAC CCA CTG CCT GAG ACA GCT GTG CGA GGC TAT    528

154 Arg Phe Leu Arg Ser His Pro Leu Pro Glu Thr Ala Val Arg Gly Tyr    169

529 CGG CGC TTC CTC AAG CTG AGT CCT GAG AGT GCA GAG GAG TAC ATT GAG    576

170 Arg Arg Phe Leu Lys Leu Ser Pro Glu Ser Ala Glu Glu Tyr Ile Glu    185

577 TAC CTC AAG TCA AGT GAC CGG CTG GAT GAG GCC GCC CAG CGC CTG GCC    624

186 Tyr Leu Lys Ser Ser Asp Arg Leu Asp Glu Ala Ala Gln Arg Leu Ala    201

625   ACC GTG GTG AAC GAC GAG CGT TTC GTG TCT AAG GCC GGC AAG TCC AAC    672

202   Thr Val Val Asn Asp Glu Arg Phe Val Ser Lys Ala Gly Lys Ser Asn    217

673   TAC CAG CTG TGG CAC GAG CTG TGC GAC CTC ATC TCC CAG AAT CCG GAC    720

218   Tyr Gln Leu Trp His Glu Leu Cys Asp Leu Ile Ser Gln Asn Pro Asp    233

721   AAG GTA CAG TCC CTC AAT GTG GAC GCC ATC ATC CGC GGG GGC CTC ACC    768

234   Lys Val Gln Ser Leu Asn Val Asp Ala Ile Ile Arg Gly Gly Leu Thr    249

769   CGC TTC ACC GAC CAG CTG GGC AAG CTC TGG TGT TCT CTC GCC GAC TAC    816

250   Arg Phe Thr Asp Gln Leu Gly Lys Leu Trp Cys Ser Leu Ala Asp Tyr    265

817   TAC ATC CGC AGC GGC CAT TTC GAG AAG GCT CGG GAC GTG TAC GAG GAG    864

266   Tyr Ile Arg Ser Gly His Phe Glu Lys Ala Arg Asp Val Tyr Glu Glu    281

865   GCC ATC CGG ACA GTG ATG ACC GTG CGG GAC TTC ACA CAG GTG TTT GAC    912

282   Ala Ile Arg Thr Val Met Thr Val Arg Asp Phe Thr Gln Val Phe Asp    297

913   AGC TAC GCC CAG TTC GAG GAG AGC ATG ATC GCT GCA AAG ATG GAG ACC    960

298   Ser Tyr Ala Gln Phe Glu Glu Ser Met Ile Ala Ala Lys Met Glu Thr    313

961   GCC TCG GAG CTG GGG CGC GAG GAG GAG GAT GAT GTG GAC CTG GAG CTG    1008

314   Ala Ser Glu Leu Gly Arg Glu Glu Glu Asp Asp Val Asp Leu Glu Leu    329

1009  CGC CTG GCC CGC TTC GAG CAG CTC ATC AGC CGG CGG CCC CTG CTC CTC    1056

330   Arg Leu Ala Arg Phe Glu Gln Leu Ile Ser Arg Arg Pro Leu Leu Leu    345

1057  AAC AGC GTC TTG CTG CGC CAA AAC CCA CAC CAC GTG CAC GAG TGG CAC    1104

346   Asn Ser Val Leu Leu Arg Gln Asn Pro His His Val His Glu Trp His    361

1105  AAG CGT GTC GCC CTG CAC CAG GGC CGC CCC CGG GAG ATC ATC AAC ACC    1152

362   Lys Arg Val Ala Leu His Gln Gly Arg Pro Arg Glu Ile Ile Asn Thr    377

1153  TAC ACA GAG GCT GTG CAG ACG GTG GAC CCC TTC AAG GCC ACA GGC AAG    1200

378   Tyr Thr Glu Ala Val Gln Thr Val Asp Pro Phe Lys Ala Thr Gly Lys    393

1201  CCC CAC ACT CTG TGG GTG GCG TTT GCC AAG TTT TAT GAG GAC AAC GGA    1248

394   Pro His Thr Leu Trp Val Ala Phe Ala Lys Phe Tyr Glu Asp Asn Gly    409

1249  CAG CTG GAC GAT GCC CGT GTC ATC CTG GAG AAG GCC ACC AAG GTG AAC    1296

410   Gln Leu Asp Asp Ala Arg Val Ile Leu Glu Lys Ala Thr Lys Val Asn    425

1297  TTC AAG CAG GTG GAT GAC CTG GCA AGC GTG TGG TGT CAG TGC GGA GAG    1344

426   Phe Lys Gln Val Asp Asp Leu Ala Ser Val Trp Cys Gln Cys Gly Glu    441

1345  CTG GAG CTC CGA CAC GAG AAC TAC GAT GAG GCC TTG CGG CTG CTG CGA    1392

442   Leu Glu Leu Arg His Glu Asn Tyr Asp Glu Ala Leu Arg Leu Leu Arg    457

1393  AAG GCC ACG GCG CTG CCT GCC CGC CGG GCC GAG TAC TTT GAT GGT TCA    1440

458   Lys Ala Thr Ala Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Tyr Phe Asp Gly Ser    473

1441  GAG CCC GTG CAG AAC CGC GTG TAC AAG TCA CTG AAG GTC TGG TCC ATG    1488

474   Glu Pro Val Gln Asn Arg Val Tyr Lys Ser Leu Lys Val Trp Ser Met    489

1489  CTC GCC GAC CTG GAG GAG AGC CTC GGC ACC TTC CAG TCC ACC AAG GCC    1536

490   Leu Ala Asp Leu Glu Glu Ser Leu Gly Thr Phe Gln Ser Thr Lys Ala    505

1537  GTG TAC GAC CGC ATC CTG GAC CTG CGT ATC GCA ACA CCC CAG ATC GTC    1584

506   Val Tyr Asp Arg Ile Leu Asp Leu Arg Ile Ala Thr Pro Gln Ile Val    521

1585  ATC AAC TAT GCC ATG TTC CTG GAG GAG CAC AAG TAC TTC GAG GAG AGC    1632

522   Ile Asn Tyr Ala Met Phe Leu Glu Glu His Lys Tyr Phe Glu Glu Ser    537

1633  TTC AAG GCG TAC GAG CGC GGC ATC TCG CTG TTC AAG TGG CCC AAC GTG    1680

538   Phe Lys Ala Tyr Glu Arg Gly Ile Ser Leu Phe Lys Trp Pro Asn Val    553

1681  TCC GAC ATC TGG AGC ACC TAC CTG ACC AAA TTC ATT GCC CGC TAT GGG    1728

554   Ser Asp Ile Trp Ser Thr Tyr Leu Thr Lys Phe Ile Ala Arg Tyr Gly    569

1729  GGC CGC AAG CTG GAG CGG GCA CGG GAC CTG TTT GAA CAG GCT CTG GAC    1776

570   Gly Arg Lys Leu Glu Arg Ala Arg Asp Leu Phe Glu Gln Ala Leu Asp    585

1777  GGC TGC CCC CCA AAA TAT GCC AAG ACC TTG TAC CTG CTG TAC GCA CAG    1824

586   Gly Cys Pro Pro Lys Tyr Ala Lys Thr Leu Tyr Leu Leu Tyr Ala Gln    601

1825  CTG GAG GAG GAG TGG GGC CTG GCC CGG CAT GCC ATG GCC GTG TAC GAG    1872

602   Leu Glu Glu Glu Trp Gly Leu Ala Arg His Ala Met Ala Val Tyr Glu    617

1873  CGT GCC ACC AGG GCC GTG GAG CCC GCC CAG CAG TAT GAC ATG TTC AAC    1920

618   Arg Ala Thr Arg Ala Val Glu Pro Ala Gln Gln Tyr Asp Met Phe Asn    633

1921  ATC TAC ATC AAG CGG GCG GCC GAG ATC TAT GGG GTC ACC CAC ACC CGC    1968

634   Ile Tyr Ile Lys Arg Ala Ala Glu Ile Tyr Gly Val Thr His Thr Arg    649

1969  GGC ATC TAC CAG AAG GCC ATT GAG GTG CTG TCG GAC GAG CAC GCG CGT    2016

650   Gly Ile Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Val Leu Ser Asp Glu His Ala Arg    665

2017  GAG ATG TGC GTG CGG TTT GCA GAC ATG GAG TGC AAG CTC GGG GAG ATT    2064

666   Glu Met Cys Leu Arg Phe Ala Asp Met Glu Cys Lys Leu Gly Glu Ile    681

2065  GAC CGC GCC CGG GCC ATC TAC AGC TTC TGC TCC CAG ATC TGT GAC CCC    2112

682   Asp Arg Ala Arg Ala Ile Tyr Ser Phe Cys Ser Gln Ile Cys Asp Pro    697

2113  CGG ACG ACC GGC GCG TTC TGG CAG ACG TGG AAG GAC TTT GAG GTC CGG    2160

698   Arg Thr Thr Gly Ala Phe Trp Gln Thr Trp Lys Asp Phe Glu Val Arg    713

2161  CAT GGC AAT GAG GAC ACC ATC AAG GAA ATG CTG CGT ATC CGG CGC AGC    2208

714   His Gly Asn Glu Asp Thr Ile Lys Glu Met Leu Arg Ile Arg Arg Ser    729

2209  GTG CAG GCC ACG TAC AAC ACG CAG GTC AAC TTC ATG GCC TCG CAG ATG    2256

730   Val Gln Ala Thr Tyr Asn Thr Gln Val Asn Phe Met Ala Ser Gln Met    745

2257  CTC AAG GTC TCG GGC AGT GCC ACG GGC ACC GTG TCT GAC CTG GCC CCT    2304

746   Leu Lys Val Ser Gly Ser Ala Thr Gly Thr Val Ser Asp Leu Ala Pro    761

2305  GGG CAG AGT GGC ATG GAC GAC ATG AAG CTG CTG GAA CAG CGG GCA GAG    2352

762   Gly Gln Ser Gly Met Asp Asp Met Lys Leu Leu Glu Gln Arg Ala Glu    777

2353  CAG CTG GCG GCT GAG GCG GAG CGT GAC CAG CCC TTG CGC GCC CAG AGC    2400

778   Gln Leu Ala Ala Glu Ala Glu Arg Asp Gln Pro Leu Arg Ala Gln Ser    793

2401  AAG ATC CTG TTC GTG AGG AGT GAC GCC TCC CGG GAG GAG CTG GCA GAG    2448

794   Lys Ile Leu Phe Val Arg Ser Asp Ala Ser Arg Glu Glu Leu Ala Glu    809

2449  CTG GCA CAG CAG GTC AAC CCC GAG GAG ATC CAG CTG GGC GAG GAC GAG    2496

810   Leu Ala Gln Gln Val Asn Pro Glu Glu Ile Gln Leu Gly Glu Asp Glu    825

2497  GAC GAG GAC GAG ATG GAC CTG GAG CCC AAC GAG GTT CGG CTG GAG CAG    2544

826   Asp Glu Asp Glu Met Asp Leu Glu Pro Asn Glu Val Arg Leu Glu Gln    841

2545  CAG AGC GTG CCA GCC GCA GTG TTT GGG AGC CTG AAG GAA GAC TGA CCC    2592

842   Gln Ser Val Pro Ala Ala Val Phe Gly Ser Leu Lys Glu Asp ***        856

2593  GTC CCT CCC CCC TCC CCA CCC CCT CCC CAA TAC AGC TAC GTT TGT AAA    2640

2641  AAA AAA AAA AAA AAA AAA A                                          2659

实施例4：同源比较和结构分析

应用Blast软件，对CLG的氨基酸序列进行同源性分析，发现与果蝇、线虫和酵母的细胞周期调控蛋白高度同源：与果蝇的细胞周期调控蛋白(crooked neck，crn)有41％(157/375)的同源性，与线虫的细胞周期调控蛋白具有66％(557/837)的同源性，与酵母的细胞周期控制蛋白有37％(228/599)的同源性。

Query＝CLG    Sbjct＝crn(果蝇)

＞crn基因     长度＝702

分值＝69.9bits(168)，预计值＝6e-11

相同性＝88/375(23％)，相似性＝157/375(41％)，缺口＝33/375(8％)

Query：398 WVAFAKFYEDNGQLDDARVILEKATKVNFKQVDDLAS-VWCQCGELELRHENYDEALRLL 456

           W+ FA+F E +G +  +R + E+A  V F   D +   ++    E     + +D A  +

Sbjct：213 WIKFARFEESHGFIHGSRRVFERA--VEFFGDDYIEERLFIAFARFEEGQKEHDRARIIY 270

Query：457 RKATA-LPARRAEYFDGSEPVQNRVYKSLKVWSMLADLEESLGTFQSTKAVYDRILDLRI 515

           + A   LP       D ++ +     K  K +   A +E+ +      K  Y++ +

Sbjct：271 KYALDHLPK------DRTQELFKAYTKHEKKYGDRAGIEDVI--VSKRKYQYEQEVAANP 322

Query：516 ATPQIVINYAMFLEEHKYFEESFKAYERGISLFKWPNVSDIWSTYLTKFI-----ARYGG 570

                  +Y   +E     ++  + YER IS     N  + W  Y+  +I

Sbjct：323 TNYDAWFDYLRLIEAEGDRDQIRETYERAISNVPPANEKNFWRRYIYLWINYALYEELEA 382

Query：571 RKLERARDLFEQALDGCPPKYA--KTLYLLYAQLE---EEWGLARHAMAVYERATRAVEP 625

              ER R +++  L+  P K      L+LLYAQ E   +E   AR A+ +      A+

Sbjct：383 EDAERTRQIYKTCLELIPHKQFTFSKLWLLYAQFEIRCKELQRARKALGL------AIGM 436

Query：626 AQQYDMFNIYIKRAAEIYGVTHTRGIYQKAIEVLSDEHAREMCLRFADMECKLGEIDRAR 685

             +  +F  YI    ++      R +Y+K +E   +     M  +FA++E  LG+ DRAR

Sbjct：437 CPRDKLFRGYIDLEIQLREFERCRMLYEKFLEFGPENCVTWM--KFAELENLLGDTDRAR 494

Query：686 AIYSFCSQICDPRTTGAFWQTWKDFEVRHGNEDTIKEMLRIRRSVQATYNTQV-NFMASQ 744

           AI+    Q          W+ + DFEV  G  +  +++    R ++ T + +V N  A

Sbjct：495 AIFELAVQQPRLDMPEELWKAYIDFEVALGETELARQL--YERLLERTQHVKVWNSFAKF 552

Query：745 MLKVSGSATGTVSDL 759

            + +S   +G  ++L

Sbjct：553 EMGLSHGDSGPDAEL 567

Query＝CLG  Sbjct＝与果蝇细胞周期调控蛋白同源的线虫(C.Elegans)蛋白＞与果蝇细胞周期调控蛋白同源的线虫(C.Elegans)蛋白. 长度＝855分值＝792 bits(2023)，预计值＝0.0相同性＝395/837(47％)，相似性＝557/837(66％)，缺口＝17/837(2％)

Query：20  EDLPYEEEIMRNQFSVKCWLRYIEFK--QGAPKPRLNQLYERALKLLPCSYKLWYRYLKA 77

           ED+P+EE+I+RN  SV CW RYI+ K    +P  ++  +YERAL +   SYKLWY YLK

Sbjct：25  EDVPFEEDIIRNPTSVNCWQRYIDHKLQNKSPAKQMFLIYERALAVFERSYKLWYHYLKY 84

Query：78  RRAQVKHRCVTDPAYEDVNNCHERAFVFMHKMPRLWLDYCQFLMDQGRVTHTRRTFDRAL 137

           R + + ++C TD ++  + + +ER  + +HKMPR+W+ YC+ ++ +G +T TRR FDRAL

Sbjct：85  RESTIVNKCPTDNSWRALCDTYERCLMRLHKMPRIWICYCEVMIKRGLITETRRVFDRAL 144

Query：138 RALPITQHSRIWPLYLRFLRSHPLPETAVRGYRRFLKLSPESAEEYIEYLKSSDRLDEAA 197

           R+LP+TQH RIW LY+ FL SH LPET +R YRR+LK++P++ E+Y+EYL   D++DEAA

Sbjct：145 RSLPVTQHMRIWTLYIGFLTSHDLPETTIRVYRRYLKMNPKAREDYVEYLIERDQIDEAA 204

Query：198 QRLATVVNDERFVSKAGKSNYQLWHELCDLISQNPDKVQSLNVDAIIRGGLTRFTDQLGK 257

           +L  T+VN ++ VS+ G++ +QLW +LCDLIS+NP K+ SLNVDAIIR G+ R+TDQ+G

Sbjct：205 KELTTLVNQDQNVSEKGRTAHQLWTQLCDLISKNPVKIFSLNVDAIIRQGIYRYTDQVGF 264

Query：258 LWCSLADYYIRSGHFEKARDVYEEAIRTVMTVRDFTQVFDSYAQFEESMIAAKMETASXX 317

           LWCSLADYYIRS  FE+ARDVYEEAI  V TVRDF QV+D+YA FEE  ++  M+

Sbjct：265 LWCSLADYYIRSAEFERARDVYEEAIAKVSTVRDFAQVYDAYAAFEEREVSIMMQEVEQS 324

Query：318 XXXXXXXXXXXXXXXXFEQLISRRPLLLNSVLLRQNPHHVHEWHKRVALHQGRPREIINT 377

                           ++ L+ R+ L+NSVLLRQNPH+V  EW  RV +++G   + I T

Sbjct：325 GDPEEEVDLEWMFQR-YQHLMERKNELMNSVLLRQNPHNVGEWLNRVNIYEGNYNKQIET 383

Query：378 YTEAVQTVDPFKATGKPHTLWVAFAKFYEDNGQLDDARVILEKATKVNFKQVDDLASVWC 437

           +EAV++V+P     GK   LW+  AK YEDNG LD AR   E A    F  V +LA+VWC

Sbjct：384 FKEAVKSVNPKIQVGKVRDLWIGLAKLYEDNGDLDAARKTFETAVISQFGGVSELANVWC 443

Query：438 QCGELELRHENYDEALRLLRKATALPARRAEYFDGSEPVQNRVYKSLKVWSMLADLEESL 497

              E+E++H+    AL ++++A  +P  +   ++  + VQ RV++S  +W+M AD EE

Sbjct：444 AYAEMEMKHKRAKAALTVMQRACVVP--KPGDYENMQSVQARVHRSPILWAMYADYEECC 501

 Query：498 GTFQSTKAVYDRILDLRIATPQIVINYAMFLEEHKYFEESFKAYERGISLFKWPNVSDIW 557

           GT +S + VYD++++LR+A+PQ+++NYAMFLEE++YFE +F+AYE+GI+LFKWP V DIW

SbjCt：502 GTVESCRKVYDKMIELRVASPQMIMNYAMFLEENEYFELAFQAYEKGIALFKWPGVFDIW 561

Query：558 STYLTKFIARYGGRKLERARDLFEQALDGCPPKYAKTLYLLYAQLEEEWGLARHAMAVYE 617

           +TYL KFI RYGG+KLERARDLFEQ L+ CPP +AK ++LLYA+LEEE GLARHA+++Y

Sbjct：562 NTYLVKFIKRYGGKKLERARDLFEQCLENCPPTHAKYIFLLYAKLEEEHGLARHALSIYN 621

Query：618 RATRAVEPAQQYDMFNIYIKRAAEIYGVTHTRGIYQKAIEVLSDEHAREMCLRFADMECK 677

           RA   V+ A  + M+NIYIK+  E+YG+   R I+++AI  L ++ +R M LR+A +E

Sbjct：622 RACSGVDRADMHSMYNIYIKKVQEMYGIAQCRPIFERAISELPEDKSRAMSLRYAQLETT 681

Query：678 LGEIDRARAIYSFCSQICDPRTTGAFWQTWKDFEVRHGNEDTIKEMLRIRRSVQATYNTQ 737

           +GEIDRARAIY+  ++I DP+    FW TWK+FEV HGNE T+++MLR+RRSV+A+YN

Sbjct：682 VGEIDRARAIYAHAAEISDPKVHVKFWDTWKNFEVAHGNEATVRDMLRVRRSVEASYNVN 741

Query：738 VNFMASQM-LKVSGSATGTVSDLAPGQSGMDDMKXXXXXXXXXXXXXXXDQPLRAQSKIL 796

           V   + QM +     A  T +   P  S +D  +                Q    +  I

Sbjct：742 VTLTSVQMRVDAERKAQETTTSSNPMDS-LDQQQQQPSDGAGSIT-----QVSMNKGNIS 795

Query：797 FVRSDASREELAELAQQVNPEEIQLGXXXXXXXXXXXXXXVRLEQQSVPAAVFGSLK 853

           FVR      +  +     NP+EI L               + +  + VPA +FG+LK

Sbjct：796 FVRGAG---KTVQQNTTENPDEIDLDEDDDDEEDDGGDADISV--KVVPAQIFGNLK 847

Query＝CLG    Sbjct＝推定的细胞周期调控蛋白(酵母)

＞推定的细胞周期调控蛋白    长度＝674

分值＝78.4bits(190)，预计值＝1e-13

相同性＝125/599(20％)，相似性＝228/599(37％)，缺口＝115/599(19％)

Query：24  YEEEIMRNQFSVKCWLRYIEFKQGAPK-PRLNQLYERALKLLPCSYKLWYRYLKARRAQV  82

           +E+ I RN+ ++  W+RY +++    +  R   ++ERAL +      LW +Y++    ++

Sbjct：59  FEDAIRRNRLAMGHWMRYGQWELDQKEFARARSVFERALDVDSTYIPLWLKYIEC---EM  115

Query：83  KHRCVTDPAYEDVNNCHERAFVFMHKMPRLWLDYCQFLMDQGRVTHTRRTFDRALRALPI  142

           K+R+          N  +RA   + ++ +LW  Y       G +T  R+ F+R L+  P

Sbjct：116 KNRNINH-----ARNLFDRAVTQLPRVDKLWYKYVYMEEMLGNITGCRQVFERWLKWEP-  169

Query：143 TQHSRIWPLYLRFLRSHPLPETAVRGYRRFLKLSPESAEEYIEYLKSSDRLDEAAQRLAT  202

                 W  Y+R  R+    E A   Y RF+ +PE     ++ + +  +    AA

Sbjct：170 --DENCWMSYIRMERRYHENERARGIYERFVVVHPE-VTNWLRWARFEEECGNAA-----  221

Query：203 VVNDERFVSKAGKSNYQLWHELCDLISQNPDKVQSLNVDAIIRGGLTRFTDQLGKLWCSL  262

                                       N  +V    +DA+ +  L        + + +

Sbjct：222 ----------------------------NVRQVYLAAIDALGQEFLNE------RFFIAF  247

Query：263 ADYYIRSGHFEKARDVYEEAIRTVMTVRDFTQVFDSYAQFEESMIAAKMETASXXXXXXX  322

           A + IR   +E+AR +++ AI   M      +++  Y  FE+

Sbjct：248 AKFEIRQKEYERARTIFKYAI-DFMPRSKSMELYKEYTHFEKQF----------------- 290

Query：323 XXXXXXXXXXXFEQLISRRPLLLNSVLLRQNPHHVHEWHKRVALHQ--GRPREIINTYTE  380

                       E  +  +  L    LL+ +P+    W   + L +  G    I  TY +

Sbjct：291 ------GDHLGVESTVLDKRRLQYEKLLKDSPYDYDTWLDLLKLEESAGDINTIRETYEK  344

Query：381 AVQTVDPF---KATGKPHTLWVAFAKFYE-DNGQLDDARVILEKATKVNFKQVDDLASVW  436

           A+  V       A  +   +W+ +  F E D   +D AR + ++A K+   +    A +W

Sbjct：345 AIAKVPEVVEKNAWRRYVYIWLNYCLFEEIDVKDVDRARKVYQEALKLIPHKKFTFAKLW  404

Query：437 CQCGELELRHENYDEALRLLRKATAL---PARRAEYFDGSEPVQN----RVY--------  481

                 ELR    D A + L +A  +   P     Y +  + ++     R+

Sbjct：405 LMYAMFELRQRKIDVARKTLGRALGMCPKPKLFRGYIEFEDAIKQFDRCRILYEKWILYD  464

Query：482 -KSLKVWSMLADLEESLGTFQSTKAVYDRILDLRI-ATPQIVIN-YAMFLEEHKYFEESF  538

            ++   W   A LE  LG     +A+Y+  ++  I  TP++V   Y  F  E   + ++

Sbjct：465 PEACAPWLGYAALETKLGDSDRARALYNLAVNQPILETPELVWKAYIDFEFEEMEYGKAR  524

Query：539 KAYERGISLFKWPNVSDIWSTYLTKFIARYGGRKLE-------------RARDLFEQAL 584

              Y++    L  P+V  +W ++   IA       E             RAR++FE AL

Sbjct：525 SIYQQ--LLRTAPHVK-VWISFANFEIAHLEDDDEEPPNEEVASPTAVVRARNVFENAL 580

对CLG蛋白的氨基酸序列进行结构分析，发现含有与果蝇crn蛋白类似的crn共有序列(crn consensus)，这种果蝇中的crn共有序列类似于酵母有关基因蛋白中的TPR基序(tetratrico peptide repeat motif)。现已知酵母中具有TPR基序的基因家族是一系列细胞周期控制基因，如CDCl6、CDC23、nuc2+和bimA等。另外，酵母中的TPR基因家族成员还有蔗糖诱导基因的负调控因子SSN6、酵母杀手毒素(yeast killer toxin)的负调控因子SKI3以及蛋白输入有关的线粒体膜蛋白MAS70等。CLG基因与这些果蝇和酵母基因一样，这种保守的基序在CLG的蛋白序列中呈串联直线重复排列，反复出现，具有共性。

                CLG基因中含有的crn蛋白保守序列

1-  VKCWLRYIEFKQGAPK-PRLNQLYERALKLLPCS     (35-67)    13

    || |::| :|::   :  |  ::|||||::||

2-  PRLWLDYCQFLMDQGRVTHTRRTFDRALRALPIT     (110-143)  10

     :||: | :|     :: ::|: ::|||: ||

3-  SRIWPLYLRFLRSHPLPETAVRGYRRFLKLSPES     (146-179)  9

     ::|  | || :     : | : |:| |:: |:

4-  GKLWCSLADYYIRSGHFEKARDVYEEAIRTVMTV     (256-289)  9

     ||| : | :     ::::||::||:|::

5-  TQVFDSYAQFEESMIAAKMETASELGREEEDD--     (293-324)  7

          ||:|||  :  ::: | |:

6-  VDLELRLARFEQLISRRPLLLNSVLLRQNPHHVH     (325-358)  7

    | | :: ||||:|::

7-  HTLWVAFAKFYEDNGQLDDARVILEKATKVNFKQ     (395-428)  11

      ||: :|:| |   ::| || | |:|

8-  LKVWSMLADLEESLGTFQSTKAVYDRILDLRIAT     (484-517)  9

    :|:|   | :|| |  :: :: :|:| |::

9-  PQIVINYAMFLEEHKYFEESFKAYERGISLFKWP     (518-551)  9

     :: |:|| | |  | :::: : |||:: ::

10- KTLYLLYAQLEEEWGLARHAMAVYERATRAVEPA     (593-626)  10

      |:: ||::||      :|  :||||

11- YDMFNIYIKRAAEIYGVTHTRGIYQKAIEVLSDE     (629-662)   6

                    : ::| ||::|:| |

12- REMCLRFADMECKLGEIDRARAIYSFCSQICDPR     (665-698)   11

        :::| :|  | |||||| ||

    VKLWIKYARFEELLKEIDRAREIYERALEFLPRD     crn共有序列

    VKLWIKYARFEELLKEIDRAREIYERALEFLPRD     crn共有序列

       |:  ::: | | ::::| : :::|||: | :

    AEAWFGLGHIYEKLGDLEKALDAFQKALELDPNN     TPR基序

实施例5：CLG在人组织中的RNA表达谱

用CLG为探针，与人多种组织的mRNA膜片(Clontech)进行杂交。结果如图1所示，发现CLG在人心(H)、脑(B)、胎盘(P)、肺(Lu)、肝(Li)、肌肉(SM)、肾(K)和胰腺(Pa)组织中广泛表达，且表达量较为均一，其中在人脑、胎盘、肺、肝、肾和胰腺组织中的转录本大小约为2.6kb，与实施例2中所获得的CLG的全长cDNA大小一致，而在心和肌肉组织中则出现一大小约为3.0kb的转录本。

实施例6：CLG对人肝癌细胞集落形成(Colony Formation)的抑制作用

RT-PCR获得的含完整编码区的CLG基因(实施例2)，采用AdvanTAge^TM PCR Cloning试剂合(Clontech，Cat#：K1901-1)克隆于pT-Adv载体(Clontech)，然后EcoR I酶切，回收含完整编码区的CLG基因片段，再亚克隆至真核细胞表达载体pCMV-Script(Stratagene，Cat#：212220)，获得质粒pCMV-Script/CLG，用Qiagen质粒抽提试剂盒进行质粒DNA的提取，供转染用。

取5μg CLG质粒DNA(载体为pCMV-Script)，加无血清无抗生素的DMEM到600μl，空白对照用消毒milli-Q水代替质粒DNA。另取25μl脂质体Lipofectamine(GIBCOBRL)，加无血清抗生素的DMEM至600μl，将上述质粒DNA和脂质体混合，轻柔摇匀，室温放置30-45分钟，再加入无血清无抗生素的DMEM 1800μl，总体积为3ml。将3ml转染复合物加入生长于6cm培养皿的SMMC-7721细胞中(1-2×10⁵细胞/每培养皿)，37℃培养6小时后，换用全培养液，24小时后，再换用G418的全培液，约两周左右出现集落，结晶紫(crystal violet)染色，观察着色的集落数目。

结果显示，CLG全长cDNA转染SMMC-7721细胞能显著抑制集落形成。转染CLG后SMMC-7721细胞只形成3个集落，而转染空载体的SMMC-7721细胞则形成56个集落，CLG基因对人肝癌细胞SMMC-7721在体外有明显的抑制作用(图2A和2B)。

实施例7：CLG基因转化细胞的成瘤实验及凋亡检测

通过实施例6相同的方法，用CLG基因转染人肝癌细胞SMMC-7721，然后将转化细胞及未转染CLG基因的对照组细胞扩大培养，皮下接种裸鼠，观察CLG基因对成瘤作用的影响，实验分为CLG转染组和对照组，每组6只裸鼠，每只裸鼠接种2×10⁶细胞，观察期为6周，成瘤实验结果见表3。

                表3 SMMC-7721细胞成瘤实验结果

组别                瘤重(g)                 平均瘤重(g)  T检验结果

        1     2     3     4     5     6

对照    0.24  0.11  0.15  0.16  0.12  0.18    0.16        P＜0.05

CLG     0.14  0.07  0.01  0.03  0.10  0.07    0.07

在成瘤实验中，6只实验裸鼠接种CLG转染的SMMC-7721细胞后，形成的肿瘤平均瘤重为0.07克，而6只接种SMMC-7721细胞自身对照组所形成的瘤重为0.16克，经平均值的成对两样本分析T检验，二者间有显著性差异，p＜0.05，抑瘤率为50％。

CLG转染的SMMC-7721细胞，接种裸鼠后形成的肿瘤组织，作石蜡切片，用Tunel法进行凋亡原位检测(Roche公司)，可见蓝紫色的阳性凋亡细胞，其中在坏死灶内可见较多阳性凋亡细胞(图3A所示)，在未坏死区可见散在的凋亡细胞(图3B所示)。

-80℃冷冻的成瘤组织碾碎后，用含RNA酶和蛋白酶K的DNA抽提溶液消化，50℃消化2小时，然后酚抽提2次，酒精沉淀DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，观察是否有“梯形”DNA条带。转染CLG全长基因的SMMC-7721细胞形成的肿瘤组织DNA经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，可见明显的″梯形″DNA条带，与注射转染p53的SMMC-7721细胞形成的肿瘤组织DNA的电泳行为相似。未经转染的SMMC-7721细胞形成的肿瘤组织DNA和转染pCMV-Script空载体质粒DNA的SMMC-7721细胞形成的肿瘤组织DNA，都只出现单一大片段DNA条带，无″梯形″DNA条带。表明CLG基因的全长cDNA转染SMMC-7721细胞后，具有诱导SMMC-7721细胞发生凋亡的作用。

实施例8：CLG基因的蛋白表达

根据CLG全长cDNA序列，设计引物3(5’ TCG GAATTCGTGGTGATGGCGCGACTT 3’，5’端含EcoR I位点)和引物4(5’TCT AAGCTTTCAGTCTTCCTTCAGGCT 3’，5’端含Hind III位点)，PCR扩增CLG编码区序列。PCR反应条件为：94℃，变性5 min；然后按94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，进行40个循环；最后72℃延伸10min。反应产物电泳检测后再进行酶切回收。将经PCR扩增及酶切回收的CLG编码区片断***载体pET32a(Novagen)的EcoR I-Hind III位点，得到pET32a-CLG重组质粒。

将构建好的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑单菌落接种于LB培养基(含氨卞青霉素50mg/L)，37℃培养过夜，2％接种量转接于5ml LB培养基，培养至OD600≤0.5时，再按1％量转接到150ml LB(含氨卞青霉素50mg/L)中，至OD600＝0.5-1.0时，IPTG诱导(1mM)，继续培养3小时左右，离心收集菌体，超声破碎菌体，高速离心后，发现在上清及沉淀中均出现较高表达的CLG蛋白(图5)。CLG蛋白的分子量为100kDa，与预测分子量一致。

Claims (10)

1.一种分离的人CLG蛋白，其特征在于，它选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或***而形成的，且具有抑制肝癌细胞集落形成的功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它含有一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码的多肽具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组：

SEQ ID NO：3中第22-2258位的编码区序列，或1-2659位全长序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞：

(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞；

(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

8.一种具有人CLG蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达人CLG蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有人CLG蛋白活性的多肽。

9.一种能与权利要求1所述的人CLG蛋白特异性结合的抗体。

10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。

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