ES2926931T3 - Inhibidores de caseína quinasa 1 basados en azoles 2,4,5-tri-sustituidos como inductores de la cardiomiogénesis - Google Patents

Inhibidores de caseína quinasa 1 basados en azoles 2,4,5-tri-sustituidos como inductores de la cardiomiogénesis Download PDF

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Joo Leng Low
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Christina Li Lin Chai
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Abstract

Esta invención se refiere a un método para inducir o potenciar la diferenciación de células madre pluripotentes en cardiomiocitos a través de la inhibición de la caseína quinasa 1, comprendiendo dicho método cultivar las células madre en presencia de un medio que comprende un inhibidor de la caseína quinasa 1 de fórmula (I) o (II) o un estereoisómero, tautómero, o una de sus sales, donde R1, R2 y R3, independientemente entre sí, representan hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo opcionalmente sustituidos; X representa NR4, O o S; y R4 representa hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo opcionalmente sustituidos. El método puede usarse en la fase tardía de la diferenciación de células madre y en los compuestos de fórmula (I) o (II) en combinación con otras moléculas pequeñas puede conducir a una diferenciación especialmente alta de células madre en cardiomiocitos. La invención se refiere además a nuevos compuestos que pueden usarse en el método de la invención y kits para la diferenciación de células madre. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores de caseína quinasa 1 basados en azoles 2,4,5-tri-sustituidos como inductores de la cardiomiogénesis
Campo técnico
La presente invención se refiere en general al método para inducir o potenciar la diferenciación de células madre pluripotentes a cardiomiocitos a través de la inhibición de la caseína quinasa 1, comprendiendo dicho método cultivar las células madre en presencia de un medio que comprende un inhibidor de caseína quinasa 1 que es un compuesto de azol 2,4,5-tri-sustituido como se especifica en las reivindicaciones. La presente invención también se refiere a nuevos azoles 2,4,5-tri-sustituidos y al uso de azoles 2,4,5-tri-sustituidos como se especifica en las reivindicaciones en los métodos anteriores.
Técnica anterior
En medicina regenerativa se han logrado avances significativos en la terapia con células madre. Las enfermedades del corazón que están asociadas con la degeneración de los cardiomiocitos pueden tratarse mediante el uso de células madre. Tales células madre, especialmente las células madre embrionarias humanas (hESC), deben diferenciarse a cardiomiocitos. Para tal diferenciación, se ha encontrado que el uso de moléculas pequeñas es una forma particularmente ventajosa de apoyar el proceso de diferenciación. Tales moléculas pequeñas se pueden sintetizar fácilmente, son reversibles con respecto al efecto sobre las células y se pueden administrar temporalmente. Una molécula adecuada que se ha notificado es SB203580 (véanse los documentos WO2013056072 A1, US20130189785) que se utiliza como inhibidor de p38a MAPK en la vía de diferenciación. Chang L. L. et al. (Bioorganic and medicinal letters, Vol. 11, Núm.
18, páginas 2549-2553) describen compuestos similares para otros usos.
Se ha encontrado adicionalmente que un método preferido para generar cardiomiocitos consiste en inhibir la ruta canónica Wnt en ciertos momentos durante el proceso de diferenciación. Aunque hay muchos inhibidores potentes que pueden inhibir partes de la ruta Wnt, la investigación hasta el momento indica que solo la inhibición de la porcina y la tankirasa dentro de la ruta canónica Wnt era eficaz para generar cardiomiocitos. Esto limita el número de moléculas pequeñas adecuadas que pueden utilizarse para la diferenciación a cardiomiocitos.
Además, existe la necesidad de métodos más eficientes para generar cardiomiocitos a través del método de cultivo en suspensión del cuerpo embrionario (CE) que se pueda aumentar proporcionalmente en biorreactores para futuras terapias con células madre, investigación y pruebas de fármacos farmacológicos. Todas las aplicaciones exigen cardiomiocitos de alta calidad (es decir, funcionalidad basada en parámetros tales como el recuento de latidos, el área de latidos y la frecuencia de latidos) y en grandes cantidades. Todavía existe la necesidad de superar las dificultades asociadas con la baja eficiencia (<10%) y los bajos rendimientos de los protocolos convencionales de diferenciación a cardiomiocitos a través de CE.
Por lo tanto, existe la necesidad de abordar la ruta Wnt de una manera diferente utilizando otros puntos de tiempo y/o nuevas moléculas pequeñas para proporcionar un método que supere, o al menos mejore, una o más de las desventajas descritas anteriormente.
Compendio de la invención
Según un primer aspecto, se proporciona un método in vitro para inducir o potenciar la diferenciación de células madre pluripotentes a cardiomiocitos a través de la inhibición de la caseína quinasa 1, comprendiendo dicho método cultivar las células madre en presencia de un medio que comprende un inhibidor de la caseína quinasa 1 de fórmula (I) o una de sus sales:
[Fórmula (I)]
Figure imgf000002_0001
en donde
R1 representa arilo C6 a C10 sustituido con flúor que está opcionalmente sustituido adicionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados entre amino, -COOH, hidroxilo, alquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, alcoxi(C1-C4)carbonilo, cloro, bromo, yodo, nitro o un puente de -O-alquil(C1-C4)-O-;
R2 representa fenilo sustituido con flúor que está opcionalmente sustituido adicionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados entre amino, -COOH, hidroxilo, alquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, alcoxi(C1 -C4)carbonilo, cloro, bromo, yodo o nitro;
R3 representa heterocicloalquilo saturado de 5 a 6 miembros anulares que tiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N u O, o un radical heteroaromático que tiene de 5 a 6 átomos en el anillo en donde de 1 a 3 átomos son heteroátomos seleccionados entre O y N; y
X representa NH.
Ventajosamente, el uso de moléculas pequeñas que inhiben la ruta Wnt durante la diferenciación a cardiomiocitos de células madre pluripotentes a través de la inhibición de la caseína quinasa 1 (CK1 o CK 1) conduce a una diferenciación mejorada. La diferenciación a cardiomiocitos a través de la inhibición de CK1 puede usarse en células madre pluripotentes inducidas humanas y células madre embrionarias humanas después de la formación de CE, preferiblemente a partir del día 2. Las moléculas pequeñas según la invención se dirigen a CK 1 épsilon y CK 1 delta para proporcionar 10-20% de cardiomiocitos cuando se aplican como el único inhibidor, lo que es significativamente mejor en comparación con otros métodos de ruta de inhibición. En el método de la invención, no solo se aborda la ruta Wnt, sino también la ruta de estrés. Esta doble inhibición de las rutas Wnt la invención es única. Se sabe que la inhibición de la ruta Wnt inhibe el crecimiento en las células. Muchos protocolos compensan este efecto con suplementos de medio de diferenciación muy costosos (p. ej., B27) que proporcionan varios factores de crecimiento para compensar la inhibición del crecimiento y estimular el crecimiento celular. Tal compensación no es necesaria con el uso de moléculas pequeñas seleccionadas según el método de la invención.
De acuerdo con la invención, los compuestos de fórmula (I), (Ia) y (Ia)', especialmente IM-31 y ZQX-19, pueden por lo tanto usarse en métodos para promover el crecimiento y la supervivencia celular.
Según un segundo aspecto de la invención, el inhibidor de caseína quinasa 1 se añade aproximadamente 3 a 4 días después de que se haya establecido el mesodermo. Esto permite el uso de moléculas pequeñas que abordan específicamente la inhibición de CK1 de la ruta Wnt en esta última etapa. Ventajosamente, las moléculas pequeñas de fórmula (I) incluso muestran una acción que no está presente cuando se usan más temprano (día 0-2). La ventana de aplicación tardía también mejora los resultados de diferenciación, como lo demuestran los porcentajes más altos de cardiomiocitos obtenidos. Un marco de tiempo establecido entre los días 3 a 8 permite probar una gama más amplia de compuestos utilizando el método de la invención sin cambiar la concentración de las moléculas pequeñas añadidas. Esta es una gran ventaja, que puede reducir el número de experimentos a una concentración y un curso de tiempo para investigar las correlaciones entre el efecto in vitro de un compuesto sobre una o varias proteínas diana y su actividad cardiomiogénica. Por otra parte, el efecto de los compuestos de fórmula (I) sobre la cardiomiogénesis en el curso de tiempo de los días 4 a 8 indica un intervalo de tiempo de aplicación de fase tardía nueva preferida.
Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona un método en donde el compuesto CHIR99021 se añade a los cuerpos embrioides después de que se haya establecido el mesodermo. Ventajosamente, esto da como resultado rendimientos aún mayores de cardiomiocitos de más de 50%.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporcionan nuevos compuestos. Tales compuestos incluyen compuestos de fórmula (I) o sales de los mismos:
[Fórmula (I)]
Figure imgf000003_0001
en donde
R1 representa arilo C6 a C10 sustituido con flúor que está opcionalmente sustituido adicionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados entre amino, -COOH, hidroxilo, alquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, alcoxi(C1-C4)carbonilo, cloro, bromo, yodo, nitro o un puente de -O-alquil(C1-C4)-O-;
R2 representa fenilo sustituido con flúor que está opcionalmente sustituido adicionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados entre amino, -COOH, hidroxilo, alquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, alcoxi(C1-C4)carbonilo, cloro, bromo, yodo o nitro;
R3 representa piridinilo o piranilo; y
X representa NH.
Ventajosamente, se ha demostrado que este nuevo grupo de compuestos y los otros compuestos descritos en la memoria descriptiva son especialmente adecuados para su uso en el método de la invención y para lograr los beneficios mencionados anteriormente de diferenciación mejorada.
Definiciones
Las siguientes palabras y términos utilizados en el presente documento tendrán el significado que se indica:
Los expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en el presente documento es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe entenderse que la invención incluye todas estas variaciones y modificaciones. La invención también incluye todos los pasos, características, composiciones y compuestos referidos o indicados en esta memoria descriptiva, individualmente o en conjunto, y cualquiera y todas las combinaciones o dos o más de dichos pasos o características.
Como se emplea en el presente documento, el término "grupo alquilo" incluye dentro de su significado grupos alifáticos saturados monovalentes ("alquilo") y divalentes ("alquileno") de cadena lineal o de cadena ramificada que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 átomos de carbono. Por ejemplo, el término alquilo incluye, pero sin limitarse a, metilo, etilo, 1 -propilo, isopropilo, 1 -butilo, 2-butilo, isobutilo, terc-butilo, amilo, 1,2-dimetilpropilo, 1, 1 -dimetilpropilo, pentilo, isopentilo, hexilo, 4-metilpentilo, 1 -metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 1,2,2-trimetilpropilo, 1,1,2-trimetilpropilo, 2-etilpentilo, 3- etilpentilo, heptilo, 1-metilhexilo, 2,2-dimetilpentilo, 3,3-dimetilpentilo, 4,4-dimetilpentilo, 1,2-dimetilpentilo, 1,3-dimetilpentilo, 1,4-dimetilpentilo, 1,2,3-trimetilbutilo, 1,1,2-trimetilbutilo, 1,1,3-trimetilbutilo, 5-metilheptilo, 1-metilheptilo, octilo, nonilo, decilo, y similares.
El término "grupo alquenilo" incluye dentro de su significado grupos hidrocarbonados alifáticos insaturados monovalentes ("alquenilo") y divalentes ("alquenileno") de cadena lineal o ramificada que tienen de 2 a 10 átomos de carbono, p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 átomos de carbono y que tiene al menos un doble enlace, ya sea de estereoquímica E, Z, cis o trans, según corresponda, en cualquier parte de la cadena de alquilo. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, pero sin limitarse a, etenilo, vinilo, alilo, 1 -metilvinilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 2-metil-1-propenilo, 2-metil-1-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 1,3-butadienilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4- pentenilo, 1,3-pentadienilo, 2,4-pentadienilo, 1,4-pentadienilo, 3-metil-2-butenilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 1,3-hexadienilo, 1,4-hexadienilo, 2-metilpentenilo, 1-heptenilo, 2-heptenilo, 3-heptenilo, 1-octenilo, 1-nonenilo, 1-decenilo y similares.
El término "grupo alquinilo", como se emplea en el presente documento, incluye dentro de su significado grupos hidrocarbonados alifáticos insaturados monovalentes ("alquinilo") y divalentes ("alquinileno") de cadena lineal o ramificada que tienen de 2 a 10 átomos de carbono y que tienen al menos un triple enlace en cualquier parte la cadena de carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, pero sin limitarse a, etinilo, 1 -propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1-metil-2-butinilo, 3-metil-1 -butinilo, 1 -pentinilo, 1-hexinilo, metilpentinilo, 1 -heptinilo, 2-heptinilo, 1 -octinilo, 2-octinilo, 1-nonilo, 1 -decinilo y similares.
El término "cicloalquilo", como se emplea en el presente documento, se refiere a grupos alifáticos saturados cíclicos e incluye dentro de su significado radicales monovalentes ("cicloalquilo") y divalentes ("cicloalquileno"), saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o policíclicos fusionados que tienen de 3 a 10 átomos de carbono, p. ej., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen, pero sin limitarse a, ciclopropilo, 2-metilciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 2-metilciclopentilo, 3-metilciclopentilo, ciclohexilo y similares.
"Heterociclilo" o "heterocíclico" se refieren a un grupo saturado o insaturado que tiene un solo anillo o múltiples anillos condensados, de 1 a 10 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, azufre u oxígeno dentro del anillo, en donde, en los sistemas de anillos fusionados, uno o más anillos pueden ser cicloalquilo, arilo o heteroarilo siempre que el punto de unión sea a través del anillo heterocíclico. Los ejemplos de heterociclilos incluyen, pero sin limitarse a, piridinilo, pirrolilo, indolilo, tienilo, furilo, benzotienilo, benzofuranilo, imidazolilo, benzimidazolilo, pirazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, isoindolilo, purinilo, quinolilo, isoquinolilo, dihidroquinolinilo, 2,3-dihidro-1 H-indolilo, quinoxalinilo, benzodioxolilo, indanilo, indenilo, triazolilo, azetidinilo, indolizinilo, dihidroindolilo, indazolilo, quinolizinilo, ftalazinilo, naftilpiridinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, carbazolilo, carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenoxazinilo, fenotiazinilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, piperidinilo, piperazinilo, indolinilo, ftalimidilo, 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolinilo, 4,5,6,7-tetrahidrobenzo[b]tiofenilo, tiazolidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo (también denominado tiamorfolinilo), piperidinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo y tetrahidrofuranilo.
El término "arilo" como se emplea en el presente documento se refiere a restos de hidrocarburos aromáticos simples, polinucleares, conjugados y fusionados monovalentes ("arilo") y divalentes ("arileno") que tienen de 6 a 10 átomos de carbono. Los ejemplos de tales grupos incluyen fenilo, bifenilo, naftilo, fenantrenilo y similares.
El término "grupo heteroaromático" y variantes tales como "heteroarilo" o "heteroarileno" como se emplea en el presente documento, incluye dentro de su significado radicales aromáticos simples, polinucleares, conjugados y fusionados monovalentes ("heteroarilo") y divalentes ("heteroarileno"), que tienen 6 a 20 átomos en donde de 1 a 6 átomos son heteroátomos seleccionados entre O, N, NH y S. Los ejemplos de tales grupos incluyen piridilo, 2,2'-bipiridilo, fenantrolinilo, quinolinilo, tiofenilo y similares.
El término "radical aromático" puede referirse a radicales arilo o heteroarilo a menos que se especifique lo contrario.
El término "halógeno" o variantes tales como "haluro" o "halo" como se emplean en el presente documento se refieren a flúor, cloro, bromo y yodo.
El término "heteroátomo" o variantes tales como "hetero-" como se emplean en el presente documento se refieren a O, N, NH y S.
El término "aralquilo", como se emplea en el presente documento, incluye dentro de su significado radicales hidrocarbonados aromáticos simples, polinucleares, conjugados y fusionados ("arilo") y divalentes ("arileno"), anclados a radicales alquileno C1-C6 de cadena lineal o ramificada, saturados, divalentes.
El término "heteroaralquilo", como se emplea en el presente documento, incluye dentro de su significado radicales hidrocarbonados aromáticos simples, polinucleares, conjugados y fusionados, monovalentes ("heteroarilo") y divalentes ("heteroarileno"), anclados a radicales alquileno C1-C6 de cadena lineal y ramificada, saturados, divalentes.
Preferiblemente, el arilo o arileno en el aralquilo tiene 6 o 10 átomos de carbono. Preferiblemente, el heteroarilo o heteroarileno en el heteroaralquilo forma un anillo de cinco o seis miembros que tiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, S u O.
El término "opcionalmente sustituido" como se emplea en el presente documento significa que el grupo al que se refiere este término puede no estar sustituido o puede estar sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre alquilo C1-C6 , alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6 , tioalquilo C1-C6 , cicloalquilo C3-C8 , cicloalquenilo C3-C8 , heterocicloalquilo de cinco a seis miembros, halo, -COOH, -CONH2 , carboxilo C1-C6 , haloalquilo C1-C6 , haloalquinilo C2-C6 , hidroxilo, alcoxi C1-C6 , tioalcoxi C1-C6 , alquenil(C2-C6)oxi, haloalcoxi C1-C6 , haloalquenil(C2-C6)oxi, nitro, amino, nitroalquilo C1-C6 , nitroalquenilo C2-C6 , nitroalquinilo C2-C6 , nitroheterociclilo de cinco a seis miembros anulares, alquil(C1-C6)amino, dialquil(C1-C6)amino, alquenil(C2-C6)amino, alquinil(C2-C6)amino, acilo C1-C6 , alquenoilo C2-C6 , alquinoilo C2-C6 , acil(C1-C6)amino, diacil(C1-C6)amino, acil(C1-C6)oxi, alquil(C1-C6)sulfoniloxi, heterocicloxi de cinco a seis miembros anulares, heterocicloamino de cinco a seis miembros anulares, haloheterocicloalquilo de cinco a seis miembros anularse, alquil(C1-C6)sulfenilo, alquil(C1-C6)carboniloxi, alquil(C1-C6)tio, acil(C1-C6)tio, grupos que contienen fósforo tales como fosfono y fosfinilo, arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, heteroarilo de cinco a seis miembros anulares, alquil(C1-C4)arilo que tiene 6 o 10 átomos de carbono en el arilo, alquil(C1-C6)heteroarilo de cinco a seis miembros anulares, ciano, cianato, isocianato, -C(O)NH(alquilo C1-C6) y -C(O)N(alquilo C1-C6)2. Si se emplea el término "opcionalmente sustituido", se refiere a todos los sustituyentes enumerados después de este término, p. ej. "metilo o etilo opcionalmente sustituido" significa "metilo opcionalmente sustituido" o "etilo opcionalmente sustituido". El término "sustituido" como se emplea en el presente documento significa que el grupo al que se refiere este término puede estar sustituido con uno o más grupos que se seleccionan independientemente de lista de sustituyentes mencionados.
La presente invención incluye dentro de su alcance todas las formas isoméricas de los compuestos divulgados en el presente documento, incluidos todos los tautómeros, isómeros diastereoisoméricos, racematos y enantiómeros, a menos que la estereoquímica esté fijada en el dibujo de la fórmula. Por lo tanto, debe entenderse que las fórmulas incluyen, por ejemplo, las formas E, Z, cis, trans, (R), (S), (L), (D), (+) y/o (-) de los compuestos, según corresponda en cada caso, a menos que la estereoquímica esté fijada en el dibujo de la fórmula. Se pueden mencionar especialmente los tautómeros.
A menos que se especifique lo contrario, se pretende que los términos "que comprende" y "comprenden", y sus variantes gramaticales, representen un lenguaje "abierto" o "inclusivo" de modo que incluyan elementos enumerados pero también permiten la inclusión de elementos adicionales no enumerados.
Como se emplea en el presente documento, el término "aproximadamente", en el contexto de las concentraciones de los componentes de las formulaciones, típicamente significa /- 5% del valor indicado, más típicamente /- 4% del valor indicado, más típicamente /- 3% del valor indicado, más típicamente, /- 2% del valor indicado, incluso más típicamente /- 1% del valor indicado, e incluso más típicamente /- 0,5% del valor indicado.
A lo largo de esta divulgación, ciertas realizaciones pueden divulgarse en un formato de rango. Debe entenderse que la descripción en formato de rango es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de los rangos divulgados. En consecuencia, se debe considerar que la descripción de un rango ha revelado específicamente todos los posibles sub-rangos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese rango. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un rango tal como de 1 a 6 ha revelado específicamente subrangos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese rango, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del rango.
Ciertas realizaciones también pueden describirse amplia y genéricamente en el presente documento. Cada una de las especies más estrechas y los grupos subgenéricos que caen dentro de la divulgación genérica también forman parte de la divulgación. Esto incluye la descripción genérica de las realizaciones con una condición o limitación negativa que elimina cualquier tema del género, independientemente de si el material eliminado se cita específicamente o no en el presente documento.
Divulgación detallada de realizaciones
Los ejemplos no limitantes de la invención y un ejemplo comparativo se describirán más detalladamente con referencia a ejemplos específicos, que no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.
Según un primer aspecto, se proporciona un método in vitro para inducir o potenciar la diferenciación de células madre pluripotentes a cardiomiocitos a través de la inhibición de la caseína quinasa 1, comprendiendo dicho método cultivar las células madre en presencia de un medio que comprende un inhibidor de la caseína quinasa 1 de fórmula (I) o una de sus sales:
[Fórmula I]
Figure imgf000006_0001
en donde
R1 representa arilo C6 a C10 sustituido con flúor que está opcionalmente sustituido adicionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados entre amino, -COOH, hidroxilo, alquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, alcoxi(C1-C4)carbonilo, cloro, bromo, yodo, nitro o un puente de -O-alquil(C1-C4)-O-;
R2 representa fenilo sustituido con flúor que está opcionalmente sustituido adicionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados entre amino, -COOH, hidroxilo, alquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, alcoxi(C1 -C4)carbonilo, cloro, bromo, yodo o nitro;
R3 representa heterocicloalquilo saturado de 5 a 6 miembros anulares que tiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N u O, o un radical heteroaromático que tiene de 5 a 6 átomos en el anillo en donde de 1 a 3 átomos son heteroátomos seleccionados entre O y N; y
X representa NH.
El inhibidor de caseína quinasa se selecciona preferiblemente entre inhibidores de caseína quinasa 1 5 (delta) o inhibidores de caseína quinasa 1s (épsilon). Por lo tanto, de acuerdo con el método, la ruta canónica de inhibición de Wnt se aborda mediante la inhibición de CK 15 y/o CK 1 £.
La inhibición de la ruta Wnt se ha realizado en una etapa de desarrollo del mesodermo de las células madre. Las moléculas pequeñas de acuerdo con la fórmula (I), (Ia) y (Ia)' pueden funcionar independientemente de esas restricciones en el transcurso del tiempo debido a su mecanismo de acción sobre CK1. En comparación con otros protocolos para generar cardiomiocitos, el uso de las moléculas pequeñas presentadas es flexible.
Las células madre pluripotentes en el método de la invención pueden ser células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) o células madre embrionarias humanas (hESC). Pueden recolectarse como cuerpos embrionarios (CE) según métodos conocidos y usarse como tales en el medio de cultivo para la diferenciación según el método de la invención. Las moléculas pequeñas de fórmula (I), (Ia) y (Ia)' se añaden según puntos de tiempo específicos como se menciona a continuación. Los azoles 2,4,5-tri-sustituidos para la diferenciación cardíaca son robustos en varias líneas de células madre pluripotentes inducidas y embrionarias.
El método de la invención se puede aplicar en diferentes plataformas de cultivo celular. Las plataformas de cultivo celular que se pueden mencionar especialmente son los cuerpos embrionarios y los microportadores. Los microportadores (MP) son pequeñas esferas o partículas (típicamente de 90 a 300 pm de diámetro) que se utilizan para cultivar células adherentes en biorreactores de tanque agitado. Los CE son agregados de células tridimensionales que imitan alguna estructura del embrión en desarrollo y pueden diferenciarse a células de las tres capas germinales. Los CE se benefician en el inicio de la diferenciación específica del linaje hacia muchos linajes, tales como el cardíaco.
El método de la invención puede modificarse para tener una etapa de recolección al final aproximadamente de 10 a 12 días después del comienzo de la diferenciación.
Los compuestos de fórmula (I), (Ia) y (Ia)' pueden usarse en los rangos de concentración típicos de moléculas pequeñas en tal diferenciación de medio de cultivo tal como de 0,5 a 20 pM, preferiblemente de 1 a 10 pM. Sin embargo, los compuestos también se pueden añadir de manera efectiva a concentraciones por debajo de 3 pM. Se puede mencionar específicamente un rango de concentración de 0,1 a 3 pM. Las concentraciones preferidas que aún conducen a muy buenos resultados de diferenciación incluyen 0,5 pM, 1 pM, 2 pM, 3 pM o 5 pM.
La temperatura de cultivo en los métodos de la invención durante la diferenciación suele ser de aproximadamente 37°C.
El medio para el cultivo de las células madre puede ser un medio de cultivo típico conocido en la técnica, tal como un medio de células madre sin suero básico. En los ejemplos se proporcionan ejemplos de medios y excipientes adecuados. Tales medios incluyen DMEM o RPMI con o sin suplemento B27. Sin embargo, la elección del medio no es crítica.
El compuesto de fórmula (I), (Ia) y (Ia)' puede usarse en diferentes momentos durante el cultivo celular, tal como a partir de los días 1-8, 2-6, 3-6 o a partir de los días 4-8 de la diferenciacion. La diferenciación de cardiomiocitos a través de la inhibición de CK1 se puede utilizar en células madre pluripotentes inducidas humanas y células madre embrionarias humanas después de la formación de CE desde el día 2 en adelante. Preferiblemente, el compuesto se añade los días 1 a 8, 3 a 8 o 4 a 8 del proceso de diferenciación después de que se haya establecido el mesodermo.
El compuesto de fórmula (I), (la) y (Ia)' puede usarse con varias líneas de células madre pluripotentes inducidas y embrionarias.
El compuesto de fórmula (I), (Ia) y (Ia)' se puede utilizar en diferentes plataformas de cultivo celular 2D y 3D tales como cuerpos embrioides o plataformas de cultivo de microportadores conocidas en la técnica.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, el inhibidor de caseína quinasa se añade aproximadamente 3 a 4 días después de que se haya establecido el mesodermo. La adición de acuerdo con esta realización es, por lo tanto, durante el desarrollo tardío (posterior al mesodermo) de los cardiomiocitos. Esta última adición del inhibidor sólo es posible utilizando el método de la invención que aborda específicamente la inhibición de CK1. Se obtienen diferentes resultados de diferenciación mediante la adición posterior del compuesto de fórmula (I), (Ia) y (Ia)' después de la adición habitual los días 1-2 a 8. La razón es que en tal método preferido solo se utiliza específicamente la inhibición de CK 1. Por lo tanto, el método según la invención es adecuado para influir únicamente en el desarrollo tardío (posmesodermo) de los cardiomiocitos (días 4 a 8 de diferenciación). Por lo tanto, tal método ha sido desconocido y conduce a mejores tasas de diferenciación.
En otra realización del método, el inhibidor de caseína quinasa se añade desde aproximadamente el día 3 hasta el día 8 después de que se haya establecido el mesodermo. Esto significa que el inhibidor de caseína quinasa está presente durante este tiempo después de una sola adición o se añade continuamente durante todo el tiempo. A partir de las realizaciones se puede observar que el inhibidor de CK 1 está presente desde el día 3 al 8, o desde el 4 al 8, durante la diferenciación.
Entre los compuestos de fórmula (I) se prefieren los compuestos para su uso en el método de la invención de acuerdo con la fórmula (I)' o una de sus sales:
[Fórmula (I)’]
Figure imgf000007_0001
en donde R1 representa fenilo o naftilo sustituido con flúor que está opcionalmente sustituido adicionalmente con amino, alquilo C1-C4 , alcoxi C1-C4 , cloro, bromo, yodo, nitro o un puente de -O-(alquil C1-C4)-O-.
Preferiblemente, el fenilo o naftilo de R1 están opcionalmente sustituidos adicionalmente con amino, metilo, etilo, metoxi, etoxi, cloro, bromo, yodo, nitro o un puente de -O-(CH2)-O.
Los siguientes compuestos son especialmente adecuados para su uso en el método de la invención. Algunos de ellos son compuestos novedosos que, y en la medida en que están cubiertos por la reivindicación 6, también se proporcionan de acuerdo con la invención, tales como:
Compuestos de fórmula (I) o una de sus sales, en donde R1 representa restos de hidrocarburos aromáticos simples, polinucleares, conjugados y fusionados, monovalentes y divalentes sustituidos con flúor que tienen de 6 a 10 átomos de carbono; R2 representa hidrocarburos aromáticos sustituidos con flúor que tienen 6 átomos de carbono; R3 representa heterocicloalquilo saturado de 5 a 6 miembros anulares que tiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N u O, o un radical aromático que tiene de 5 a 6 átomos en el anillo en donde de 1 a 3 átomos son heteroátomos seleccionados entre O y N; y X representa NH
Entre los compuestos, los compuestos en donde R1 representa arilo C6 a C10 sustituido con flúor, R2 representa fenilo sustituido con flúor, R3 representa piridinilo o piranilo; y X representa NH son los preferidos.
Más preferidos son los compuestos y sus tautómeros enumerados a continuación:
[Fórmula Illa]
Figure imgf000008_0001
[Fórmula llld]
Figure imgf000008_0002
[Fórmula lile]
Figure imgf000009_0001
El compuesto 1a (4-(2-(2,6-difluorofenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1 H-imidazol-5(4)-il)piridina; IM-31, TA-01) o su tautómero se pueden mencionar como especialmente preferidos y tienen la siguiente fórmula (1a):
[Fórmula 1a]
Figure imgf000009_0002
El compuesto 4-[2-(2-cloro-6-fluorofenil)-5(4)-(4-fluorofenil)-3H-imidazol-4(5)-il]piridina (ZQX-19) 1a o su tautómero también se pueden mencionar como especialmente preferido y tienen la siguiente fórmula:
[Fórmula 1b]
Figure imgf000009_0003
De acuerdo con la invención, se ha encontrado que estos compuestos tienen la capacidad de funcionar como un inductor de cardiomiocitos así como también como un inhibidor cardíaco, cuando se aplican a alta concentración premesodermo. Esto indicó otro uso de estos compuestos más allá de la diferenciación cardíaca.
De acuerdo con la descripción, los compuestos de fórmula (I), (Ia) y (Ia)' también se pueden usar como inhibidores cardíacos a concentraciones más altas o pre-mesodermo.
Además, IM-31 se puede utilizar a una concentración 5 veces menor que los inhibidores de caseína quinasa 1 basados en azoles 2,4,5-tri-sustituidos comparables para generar 10-20% de cardiomiocitos. El compuesto es un compuesto sobresaliente de gran importancia tecnológica no solo para la diferenciación de cardiomiocitos de acuerdo con el método de la invención, sino también en su capacidad para inhibir dianas de quinasa comparables de SB203580 de manera más eficiente. Usando este compuesto, también como ejemplo para otros compuestos según la invención, se ha logrado una diferenciación de cardiomiocitos más eficiente en comparación con IWP-2 (véase más abajo) con una formulación de medio simple.
Los compuestos 4-(2-(2-fluorofenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1 H-imidazol-5(4)-il)piridina IM-30 (TA-02), 4-[2-(2-cloro-6-fluorofenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1 H-imidazol-5(4)-il]piridina (ZQX-19) y 4-[2-(2-fluoro-6-metoxifenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1 H-/'m/'dazol-5(4)-il]piridina (ZQX-20) también son inhibidores de CK 1 más fuertes que SB203580 y muestran resultados de diferenciación de cardiomiocitos más altos en un curso de tiempo específico. Estos compuestos también se mencionan específicamente. Esto reviste importancia tecnológica ya que se pueden lograr mayores rendimientos de cardiomiocitos con moléculas pequeñas tales como IM-31 (TA-01), IM-30 (TA-02), z Qx -19 y ZQX-20. Especialmente con el protocolo basado en el cuerpo embrioide presentado en cultivo en suspensión, es posible aumentar la producción de cardiomiocitos a una magnitud de importancia terapéutica. IM-31 (TA-01) y, alternativamente, TA-01, ZQX-19 y ZQX-20 pueden inducir una mayor diferenciación cardiovascular cuando se aplican en el curso de tiempo específico descrito en el presente documento.
Los compuestos adicionales que se pueden mencionar para su uso en la divulgación son: Compuestos de fórmula (Ia), o un estereoisómero, tautómero o una de sus sales:
[Fórmula (Ia)]
Figure imgf000010_0001
en donde B y B1 están ausentes o cada uno se selecciona independientemente entre alquilo C1-C6 , alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6 , tioalquilo C1-C6 , cicloalquilo C3-C8 , cicloalquenilo C3-C8 , heterocicloalquilo de cinco a seis miembros, halo, -COOH, -CONH2 , carboxilo C1-C6 , haloalquilo C1-C6 , haloalquinilo C2-C6 , hidroxilo, alcoxi C1-C6, tioalcoxi C1-C6 , alquenil(C2-C6)oxi, haloalcoxi C1-C6 , haloalquenil(C2-C6)oxi, nitro, amino, N-hidroxi-imidamida, nitroalquilo C1-C6 , nitroalquenilo C2-C6 , nitroalquinilo C2-C6 , nitroheterociclilo de cinco a seis miembros anulares, alquil(C1-C6)amino, dialquil(C1-C6)amino, alquenil(C2-C6)amino, alquinil(C2-C6)amino, acilo C1-C6 , alquenoilo C2-C6, alquinoilo C2-C6 , acil(C1-C6)amino, diacil(C1-C6)amino, acil(C1-C6)oxi, alquil(C1-C6)sulfoniloxi, heterocicloxi de cinco a seis miembros anulares, heterocicloamino de cinco a seis miembros anulares, haloheterocicloalquilo de cinco a seis miembros anulares, alquil(C1-C6)sulfenilo, alquil(C1-C6)sulfinilo, alquil(C1-C6)sulfonilo, alquil(C1-C6)sulfinilamino, alquil(C1-C6)sulfonilamino, alquil(C1-C6)carboniloxi, alquil(C1-C6)tio, acil(C1-C6)tio, grupos que contienen fósforo tales como fosfono y fosfinilo, arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, heteroarilo de cinco a seis miembros anulares, alquil(C1-C4)arilo que tiene 6 o 10 átomos de carbono en el arilo, alquil(C1-C6)heteroarilo de cinco a seis miembros anulares, ciano, cianato, isocianato, -C(O)NH(alquilo C1-C6), o -C(O)N(alquilo C1-C6)22 o dos sustituyentes que forman un puente de -O-alquil(C2-C6)-O-; siempre que al menos dos de B, B1, Y, Y1, Z y Z1 no estén ausentes;
Y y Z son flúor; e
Y1 está ausente o se selecciona entre amino, -COOH, hidroxilo, alquilo C1-C4 , alcoxi C1-C4 , alcoxi(C1-C4)carbonilo, cloro, bromo, yodo o nitro; y
Z1 está ausente o se selecciona entre amino, -COOH, hidroxilo, alquilo C1-C4 , alcoxi C1-C4 , alcoxi(C1-C4)carbonilo, cloro, bromo, yodo, nitro o un puente de -O-alquil(C1-C4)-O-.
Los compuestos de fórmula (Ia)' también se pueden utilizar en el método divulgado.
[Fórmula (Ia)’]
Figure imgf000010_0002
en donde B y B1 están ausentes o cada uno se selecciona independientemente entre alquilo C1-C6 , alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6 , tioalquilo C1-C6 , cicloalquilo C3-C8 , cicloalquenilo C3-C8 , heterocicloalquilo de cinco a seis miembros, halo, -COOH, -CONH2 , carboxilo C1-C6 , haloalquilo C1-C6 , haloalquinilo C2-C6 , hidroxilo, alcoxi C1-C6, tioalcoxi C1-C6 , alquenil(C2-C6)oxi, haloalcoxi C1-C6 , haloalquenil(C2-C6)oxi, nitro, amino, N-hidroxi-imidamida, nitroalquilo C1-C6 , nitroalquenilo C2-C6 , nitroalquinilo C2-C6 , nitroheterociclilo de cinco a seis miembros anulares, alquil(C1-C6)amino, dialquil(C1-C6)amino, alquenil(C2-C6)amino, alquinil(C2-C6)amino, acilo C1-C6 , alquenoilo C2-C6, alquinoilo C2-C6 , acil(C1-C6)amino, diacil(C1-C6)amino, acil(C1-C6)oxi, alquil(C1-C6)sulfoniloxi, heterocicloxi de cinco a seis miembros anulares, heterocicloamino de cinco a seis miembros anulares, haloheterocicloalquilo de cinco a seis miembros anulares, alquil(C1-C6)sulfenilo, alquil(C1-C6)sulfinilo, alquil(C1-C6)sulfonilo, alquil(C1-C6)sulfinilamino, alquil(C1-C6)sulfonilamino, alquil(C1-C6)carboniloxi, alquil(C1-C6)tio, acil(C1-C6)tio, grupos que contienen fósforo tales como fosfono y fosfinilo, arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, heteroarilo de cinco a seis miembros anulares, alquil(C1-C4)arilo que tiene 6 o 10 átomos de carbono en el arilo, alquil(C1-C6)heteroarilo de cinco a seis miembros anulares, ciano, cianato, isocianato, -C(O)NH(alquilo C1-C6), o -C(O)N(alquilo C1-C6)2 o dos sustituyentes que forman un puente de -O-alquil(C2-C6)-O-;
— representa un enlace sencillo o doble enlace;
Y y Z son flúor; e
Y1 está ausente o se selecciona entre amino, -COOH, hidroxilo, alquilo C1-C4 , alcoxi C1-C4 , alcoxi(C1 C4)carbonilo, cloro, bromo, yodo o nitro; y
Z1 está ausente o se selecciona entre amino, -COOH, hidroxilo, alquilo C1-C4 , alcoxi C1-C4 , alcoxi(Ci-C4)carbonilo, cloro, bromo, yodo, nitro o un puente de -O-alquil(C1-C4)-O-;
X representa NH;
R5 está ausente;
siempre que al menos dos de B, B1, Y, Y1, Z y Z1 no estén ausentes.
Los compuestos de fórmula (Ia) o (Ia)' en donde al menos tres de B, B1, Y, Y1, Z y Z1 no están ausentes se pueden mencionar específicamente como los preferidos.
Los compuestos de fórmula (I), (Ia) y (Ia)' se pueden preparar como se describe en los ejemplos detallados o por métodos análogos conocidos por los expertos en la técnica.
Por consiguiente, todos estos compuestos pueden usarse para inducir o potenciar la diferenciación de células madre pluripotentes a cardiomiocitos.
Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona una realización adicional del método en donde el compuesto CHIR99021 se añade a los cuerpos embrioides antes de que se haya establecido el mesodermo.
CHIR99021 es un derivado de aminopirimidina de fórmula (IV) que es un inhibidor extremadamente potente de GSK3, que inhibe GSK3P (CI50 = 6,7 nM) y GSK3a (CI50 = 10 nM) y funciona como activador de Wnt.
[Fórmula (IV)]
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De acuerdo con una realización preferida, CHIR99021 se añade al cultivo de células madre antes que los compuestos del inhibidor de CK 1 (preferiblemente el día 0-1 o antes). Las concentraciones de CHIR99021 que se pueden usar están en el rango de aproximadamente 0,1 a 20 |iM o también de 2 a 20 |iM, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 5 |iM, lo más preferiblemente de aproximadamente 3 a 7 ^ . Tal exposición temprana en el medio de cultivo a CHIR99021 dura preferiblemente aproximadamente de 1 a 36 h, más preferiblemente aproximadamente de 10 a 30 h y lo más preferiblemente aproximadamente de 20 a 28 horas. El pretratamiento con CHIR99021 a una concentración alta de 3 a |jM durante aproximadamente 20 a 28 horas puede estar seguido por un tratamiento a una concentración más baja de 0,5 a 2 ^ en otra realización. A continuación, se puede añadir el inhibidor de CK1 (días 1 a 8 o, preferiblemente, los días 3 a 8 o 4 a 8 de diferenciación). La adición tardía los días 3 a 8 o 4 a 8 proporciona los mejores resultados con respecto a la diferenciación obtenible según esta realización. El medio de cultivo para el paso de activación con CHIR99021 puede ser uno comúnmente conocido en la técnica, tal como los divulgados en los ejemplos.
El pretratamiento con una molécula pequeña activa pre-mesodermo, tal como CHIR99021, como otro paso en el método de acuerdo con la invención, es por lo tanto una realización preferida de la invención que conduce a mejores rendimientos y éxito en la diferenciación. El inhibidor de CK 1 de fórmula (I), (Ia) o (Ia)' se aplica preferiblemente a una concentración de 0,5 a 20 ^ o de 0,5 a 5 |iM, preferiblemente de 1 a 3 ^ , en este protocolo de dos pasos de la realización.
De acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona un kit para su uso en la diferenciación de células madre a cardiomiocitos a través de la inhibición de la caseína quinasa que comprende un compuesto seleccionado entre los siguientes compuestos, o una de sus sales:
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Dichos compuestos pueden formularse en composiciones que comprenden como excipientes diluyentes, disolventes, que pueden ser soluciones tampón u otros portadores acuosos y no acuosos.
Los excipientes adicionales en las composiciones pueden ser coadyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos se puede asegurar mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares. La capacidad de uso prolongado de la composición puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
En tal realización, se proporciona un kit que comprende un recipiente con una composición de dichos compuestos, o una de sus sales, junto con excipientes. En tal kit o paquete, se puede encontrar un recipiente que tenga una dosis unitaria del agente o los agentes. Los kits pueden incluir una composición que comprenda un agente eficaz ya sea como concentrados, que pueden diluirse adicionalmente antes de su uso o pueden proporcionarse a la concentración de uso, donde los viales pueden incluir una o más dosis. Convenientemente, en los kits, se pueden proporcionar dosis únicas en viales estériles y de tamaños adecuados para que el científico pueda emplear los viales directamente, donde los viales tendrán la cantidad y concentración deseadas de agente o agentes. Los viales con medios, tales como DMEM o RPMI con o sin suplementos B27, pueden formar parte del kit. Asociados con tal o tales recipientes puede haber varios materiales escritos tales como instrucciones de uso. Tales instrucciones de uso pueden describir el uso de los inhibidores de CK 1 de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención descrito anteriormente. Pueden referirse especialmente a una aplicación del inhibidor de CK1 durante 3 a 8 (o 4 a 8) de la diferenciación o el desarrollo tardío (post-mesodermo) de los cardiomiocitos.
El más preferido es un kit que comprende adicionalmente el compuesto CHIR99201. Este kit se puede utilizar en la realización preferida del método de la invención mencionado anteriormente. Preferiblemente, CHIR99201 se añade en un recipiente separado en el kit, p. ej. junto con instrucciones de cuándo aplicarlo con relación al inhibidor de CK 1. Preferiblemente describe un protocolo de dos pasos para aplicar primero el compuesto CHIR99201 y a continuación aplicar el inhibidor de caseína de fórmula (I) durante el desarrollo tardío (post-mesodermo) de los cardiomiocitos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Materiales y Métodos
En los ejemplos que se describen a continuación, a menos que se indique lo contrario, todas las temperaturas en la siguiente descripción están en grados Celsius y todas las partes y porcentajes son en peso, a menos que se indique lo contrario. Los reactivos útiles para sintetizar compuestos pueden adquirirse de proveedores comerciales, tales como Sigma-Aldrich Pte Ltd, Life Technologies u otros y usarse sin purificación adicional, a menos que se indique lo contrario, u obtenerse o prepararse según mecanismos conocidos en la técnica.
La identidad de todos los compuestos se evaluó después de la purificación mediante análisis HRMS-ESI en un LC/MS de tiempo de vuelo (TOF) de masa precisa de la serie Agilent 6200 en modo positivo de ionización por electropulverización (ESI).
En todos los experimentos de RMN 1D y 2D para 1H (400,13 MHz), los núcleos se ejecutaron en un espectrómetro de RMN digital Bruker AVANCE-400. Los espectros de RMN se notifican en ppm con referencia a un patrón interno de tetrametilsilano (0,00 ppm para 1H) o pico o picos de disolvente de CDCh (7,26 y 77,1 ppm) o CD3OD (3,31 y 49,0 ppm), o DMSO-d6 (2,50 y 39,5 ppm). Se usaron otros disolventes de RMN según fuera necesario. Cuando se notifican las multiplicidades de los picos, se utilizan las siguientes abreviaturas: s = singlete, d = doblete, t = triplete, q = cuarteto, m = multiplete, br = ancho, dd = doblete de dobletes, dt = doblete de tripletes, bs = singlete ancho. Las constantes de acoplamiento, cuando se proporcionan, se expresan en hercios.
Lista de abreviaturas utilizadas
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Cultivo de HESC
Se cultivó hESC3 Nkx2.5eGFP/w (Línea celular informadora para la diferenciación cardíaca proporcionada amablemente por Laboratorio de David Elliot. Melbourne Australia, véase Nat. Methods 23 de octubre de 2011; 8(12): 1037-40. doi: 10.1038/nmet. 1740, NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes, Elliott DA1, Braam SR, Koutsis K, Ng ES, Jenny R, Lagerqvist EL, Biben C, Hatzistavrou T, Hirst CE, Yu q C, Skelton RJ, Ward-van Oostwaard D, Lim SM, Khammy O, Li X, Hawes SM, Davis RP, Goulburn a L, Passier R, Prall OW, Haynes JM, Pouton CW, Kaye DM, Mummery CL, Elefanty AG, Stanley EG) en fibroblastos embrionarios de ratón irradiados derivados de la progenie de ratones 129X1/SvJ, en medio DMEM/F12 complementado con reemplazo de suero Knockout (KSR) al 20%, solución de aminoácidos no esenciales al 1%, 50 U/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, 0,1 mmoles/L de p-mercaptoetanol y 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico, todos adquiridos de Life Technologies.
hESC7 (H7, véanse Science 6 de noviembre de 1998: vol. 282 núm. 5391 pág. 1145-1147; DOI: 10.1126/science.282.5391.1145; Report Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts; James A. Thomson, Joseph Itskovitz-Eldor, Sander S. Shapiro, Michelle A. Waknitz, Jennifer J. Swiergiel, Vivienne S. Marshall, Jeffrey M. Jones) y hiPSC 00208 (obtenidos en la Universidad de Tampere, proporcionados amablemente por la Dra. Katriina Aalto-Setala) se cultivaron en fibroblastos embrionarios de ratón irradiados derivados de la progenie de ratones 129X1/SvJ, en DMEM Knockout complementado con reemplazo de suero Knockout al 20% (KSR), solución de aminoácidos no esenciales al 1%, 50 U/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, 0,1 mmol/L de p-mercaptoetanol y 100 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico, todos adquiridos de Life Technologies.
Todos los medios se renovaron diariamente y los cultivos se pasaron cada 4-5 días. Los cultivos se incubaron a 37°C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5%.
Diferenciación y análisis de cardiom iocitos
Se cosecharon hESC y hiPSC en grupos de 100 pm y se sembraron a 2,2 x 10678células/pocillo como CE en placas de 12 pocillos de fijación ultrabaja (Nunc) en medio básico de células madre libres de suero (bSFS): DMEM (Life Technologies) complementado con L-glutamina 2 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 0,182 mM (Life Technologies), 1% de aminoácidos no esenciales (Life Technologies), p-mercaptoetanol 0,1 mM, 5,6 mg/L de transferrina (Life Technologies), 20 pg/L de selenito de sodio (Sigma), Albúmina de Suero Bovino al 0,5% (p/vol) (Life Technologies) y Hysoy al 0,25% (p/vol) (Sheffield Bioscience). Las células se incubaron durante 24 horas a 37°C y CO2 al 5% para permitir la formación de CE. Después de eso, el medio se renovó y a continuación, cada 2 o 3 días, las células se estimularon con los compuestos respectivos (Tabla 1 y 2) en cantidades iguales de DMSO (1 pl de DMSO/ml de medio) (Sigma-Aldrich) en un curso de tiempo específico.
Los CE se recolectaron 11 días después de la inducción de la diferenciación y se disociaron en una sola suspensión mediante incubación durante 8-12 min en TrypLE (Invitrogen). El número de células y la viabilidad se evaluaron con Nucleocount según el protocolo del fabricante. Las células en suspensión individuales recogidas se fijaron y permeabilizaron (FIX&p Er M, BD).
Las células se incubaron con anticuerpos contra troponina T cardíaca (dilución 1:400, Pierce) y MLC2a auricular cardíaca (dilución 1:800, SYSY Synaptic Systems) durante 30 minutos, y se detectaron con un anticuerpo secundario apropiado Alexa Fluor 647 (1:500, Life Technology) en el citómetro de flujo Guava (Millipore) utilizando el soporte lógico Flowjo.
La citoinmunofluorescencia se realizó en cuerpos embrioides (CE) de 16 días de edad. Los CE se transfirieron el día 6 a placas de fijación para permitir que las células crecieran sobre el material objetivo. Los CE y las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron con anticuerpos contra troponina T cardíaca (dilución 1:200, Pierce), actinina sarcomérica (dilución a 1:200, Sigma-Aldrich), MLC2a auricular cardíaca (dilución 1:400, SYSY Synaptic Systems) y marcador de mesodermo muscular MEF2C (dilución 1:200, Cell Signaling) en BSA-PBS al 3% con T riton-X al 0,2% durante la noche. Se utilizaron anticuerpos secundarios apropiados Alexa Fluor 488 y 594 (1:500; Life Technologies) para detectar la señal con un microscopio de fluorescencia Olympus. Las tinciones nucleares para la detección de células fueron DAPI (R&D) y DracQ (Cell Signaling). Las imágenes de fluorescencia multicapa se combinaron con Image J.
Protocolo detallado de diferenciación de cardiom iocitos y análisis con citómetro de flu jo
Preparaciones: las células madre se expandieron en placas de cultivo de 10 centímetros durante 5-6 días hasta una confluencia de 80-90% antes del experimento. Una placa de cultivo convencional proporciona suficiente material (aprox. 28x106 células) para un experimento de placa de 12 pocillos.
1. Lavar las células madre con PBS x 1 (sin Mg ni Ca)
2. Sumergir con PBS x 1 (sin Mg ni Ca)
3. Retirar las células madre alimentadoras y no similares a colonias (diferenciadas) aspirando con una punta afilada (punta de 20 pm)
4. Sumergir en medio de diferenciación de células madre sin suero básico (bSFS) (6-8 ml)
5. Utilizar una herramienta de pase (herramienta de pase EZ, Life Technology) para que las células madre corten en direcciones verticales y horizontales para obtener cuadrados de cúmulos de células de dimensiones similares de aproximadamente 50-100 pm
6. Separar las mallas de cúmulos flotantes muy cuidadosamente para minimizar la muerte celular pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica.
7. Dejar que los cúmulos de células madre se sedimenten en una placa Petri durante 5 a 10 minutos.
8. Aspirar al menos 2/3 del volumen para eliminar las células alimentadoras flotantes y las células madre individuales, pero no los cúmulos de células madre.
9. Añadir 20 ml de medio bSFS
10. Estimar la viabilidad y el número de células
11. Sembrar entre 2,2 y 2,5x106 células/pocillo (recuento total de células con una viabilidad mínima de 75%) en placas de 12 pocillos de fijación ultrabaja.
12. Ajustar el volumen total por pocillo a 2 ml. (El medio mínimo por pocillo es de 1,5 ml y el máximo de 3 ml).
13. Opcional para una diferenciación de alta eficiencia: añadir CHIR99021 diluido en DMSO por pocillo a 3 pM para hESC3, 4 pM para hESC7 y 2-3 pM para hiPSC durante 24 h.
14. Dispersar los cúmulos de células madre uniformemente sobre la superficie (no permitir que se agrupen en el medio)
15. Colocar el cultivo celular durante la noche o 24 h en condiciones de cultivo
16. Cambiar el medio bSFS (2-3 ml) y eliminar todos los cúmulos pequeños por debajo de 150 micras tanto como sea posible
17. Protocolo de diferenciación opcional para los días 1-8 o 1-3: añadir los compuestos disueltos en DMSO a 1 pl/ml a la concentración pM deseada (Tabla 1 y 2) a los cultivos y mezclar bien.
18. Dispersar los cuerpos embrioides uniformemente sobre la superficie y dejar el cultivo celular durante 3 días más en condiciones de cultivo
19. Cambiar el medio bSFS (2-3 ml) y añadir compuestos disueltos en DMSO a 1 pl/ml a la concentración pM deseada (Tabla 1 y 2) a los cultivos
20. Renovar los medios bSFS con compuestos cada 2 días durante los próximos 4 días
21. Renovar solo los medios bSFS (3 ml) y cultivar durante 3 días más
22. Analizar los cuerpos embrioides (recuento de latidos, frecuencia de latidos, citometría de flujo, citoinmunofluorescencia y recuento de células).
Evaluación de la diferenciación de cardiom iocitos con citómetro de flu jo
1. Transferir todos los cuerpos embrioides (CE) de placas de 12 pocillos a un tubo Eppendorf de 1,5 ml el día 11/12 del experimento.
2. Centrifugar las células a 13000 rpm durante 30 segundos y aspirar el sobrenadante
3. Lavar las células una vez con PBS-/-(sin calcio ni magnesio)
4. Centrifugar las células a 13000 rpm durante 30 segundos y aspirar el sobrenadante
5. Digerir células con 500 pL TrypLE (Life Technology)
6. Incubar al baño maría a 37°C con agitación (golpeando el tubo eppendorf de vez en cuando) durante 8 min (máx. 15 min).
7. Añadir 500 pl de medio de cultivo para detener la digestión y pipetear hacia arriba y hacia abajo para descomponer los cúmulos de células hasta una suspensión homogénea.
a. Opcional: recuento celular
b. Transferir una alícuota de 95 pl a un tubo eppendorf nuevo
c. Añadir 5 pl de solución 13 (Nucleocount) y mezclar bien
d. Cargar 10 pl de la solución en la sonda de vidrio
e. Realizar la lectura (ensayo: célula única y viabilidad) con Nucleocounter
8. Repetir el paso de lavado 2-4
9. Colar las células a través de una malla de nailon de 20-40 um o una placa de malla para eliminar los cúmulos de células.
a. Opcional: Fijación y citoinmunofluorescencia (cTnT y MLC2a)
b. Fijar las células con 100 |jL de BD cytofix/cytoperm (kit BD) durante 20 min en hielo
c. Lavar la célula dos veces con 1 x tampón Perm/Wash (kit BD)
d. Resuspender las células en tampón de flujo (PBS con albúmina de suero bovino al 1%) con anticuerpo contra cTnT 1:400 o MLC2a 1:800
e. Incubar en hielo en la oscuridad durante 30 min.
f. Añadir 100 gL de tampón de flujo y centrifugar a 13000 rpm durante 30 segundos
g. Lavar las células una vez más con tampón de flujo
h. Volver a suspender las células con tampón de flujo con el segundo anticuerpo (anti-IgG1 de ratón de cabra con Alexa Fluor-647, 1:500)
i. Incubar en hielo en la oscuridad durante 20 min.
j. Añadir 100 gL de tampón de flujo y centrifugar a 13000 rpm durante 30 segundos
k. Lavar las células una vez más con tampón de flujo
10. Resuspender no más de 200.000 células/ml en tampón de flujo (PBS con albúmina de suero bovino al 1%) 11. Transferir 250 gL a placas con fondo en U de 96 pocillos (Greiner)
12. Realizar la lectura de fluorescencia con el citómetro de flujo (Guava, Millipore)
Ensayo funcional de cardiom iocitos desarrollados
Los videos microscópicos de los pocillos de cultivo se capturaron a través de una cámara montada en una plataforma de microscopio Nikon Eclipse Ti y a continuación, se analizaron para identificar y cuantificar objetivamente los agregados con latido en términos de frecuencia, amplitud, tamaño, etc. Para mantener los cultivos a largo plazo, los cultivos en la plataforma se mantuvieron a 37°C con CO2 al 5% a través de una incubadora superior de platina. Métodos alternativos de diferenciación de cardiom iocitos de alta eficiencia (Figuras 9 a 11)
Cultivo de HESC para los métodos alternativos de diferenciación de cardiom iocitos
Líneas de células madre embrionarias humanas (hESC) HES-3 (NKS2.5eGFP/w línea celular informadora para la diferenciación cardíaca proporcionada amablemente por David Elliot Lab. Melbourne (Australia) y H7, así como líneas de células madre pluripotentes inducidas (IPS) humanas IMR-90, Donor 11 (línea celular IPS interna) e IPS00208 (obtenidas en la Universidad de Tampere, proporcionadas amablemente por la Dra. Katriina Aalto-Setala ) se cultivaron en Geltrex® recubierto (Gletrex, Life Technologies) en medio E8 (Life technologies). Todos los medios se renovaron diariamente y los cultivos se pasaron cada 4-5 días. Los cultivos se incubaron a 37°C en una atmósfera humidificada con CO25%. Para los experimentos se utilizaron placas con una confluencia de 50-70%.
Diferenciación en placas de pocillos de fijación ultrabaja con fondo 96 U (Figura 9)
Líneas de células madre embrionarias humanas (hESC) HES-3 (NKS2.5eGFP/w línea celular informadora para la diferenciación cardíaca proporcionada amablemente por David Elliot Lab. Melbourne, Australia) se disociaron con T rypLE (Invitrogen) y se sembraron a 1,5 x 104 células/pocillo en placas de 12 pocillos de fijación ultrabaja (Nunc) en medio bSFS: DMEM o RPMI (Life Technologies) complementado con L-glutamina 2 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 0,182 mM (Life Technologies), aminoácidos no esenciales al 1% (Life Technologies), p-mercaptoetanol 0,1 mM, 5,6 mg/L de transferrina (Life Technologies), 20 gg/L de selenito de sodio (Sigma), Albúmina de Suero Bovino al 0,5% (p/vol) (Life Technologies) e Hysoy al 0,25% (p/vol) (Sheffield Bioscience). Las células se pusieron al sol a 400 rpm para formar un CE y se incubaron durante 24 h con CHIRR99021 6 gM (Selleck, EE. UU.), Y276327,5 gM (Selleck, Ee . UU.) y 50 gg/ml de Matrigel® (BD, Reino Unido) a 37°C y CO2 al 5% para permitir la formación de CE. Después de eso, el medio se renovó y la concentración de CHIR99021 se redujo a 1,5 gM. Veinticuatro horas más tarde, las células recibieron medio bSFS de nueva aportación. El día 2 o 3, los CE se estimularon con los respectivos compuestos inhibidores (Tabla 1) en cantidades iguales de DMSO (1 gl de DMSO/ml de medio) (Sigma-Aldrich) durante 5 días. El día 14, se capturaron imágenes Microscópicas de cada CE a través de una cámara montada en una plataforma de microscopio Nikon Eclipse Ti en modo de contraste de fase y con generación de imágenes de fluorescencia. Las imágenes se analizaron para identificar y cuantificar objetivamente las áreas de fluorescencia verde y el tamaño del cuerpo embrioide con Image J®. Los cultivos en la plataforma se mantuvieron a 37°C con CO2 al 5% a través de una incubadora superior de platina.
Diferenciación en placas de fijación ultrabaja de 12 pocilios (Figura 10)
hESC (H7) e IPS (Donor 11, IMR-90) se cosecharon en cúmulos de 100 pm y se sembraron a 2,2 x 106 células/pocillo como CE en placas de 12 pocillos de fijación ultrabaja (Nunc) en medio bSFS: DMEM (Life Technologies) complementado con L-glutamina 2 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 0,182 mM (Life Technologies), aminoácidos no esenciales al 1% (Life Technologies), p-mercaptoetanol 0,1 mM, 5,6 mg/L de transferrina (Life Technologies), 20 pg/L de selenito de sodio (Sigma), albúmina de suero bovino al 0,5% (p/vol) (Life Technologies) y Hysoy al 0,25% (p/vol) (Sheffield Bioscience). Las células se incubaron durante 24 h con c H|RR99021 6 pM (Shelleck, EE. UU.) a 37°C y CO2 al 5% para permitir la formación de CE. Después de eso, el medio se renovó y la concentración de CHIR99021 fue inferior a 1,5 pM. Veinticuatro horas después, la autores de la presente invención suministraron a las células medio bSFS de nueva aportación, las células se estimularon con los respectivos compuestos TA en cantidades iguales de DMSO (1 pl de DMSO/ml de medio) (Sigma-Aldrich) durante 6 días.
Los CE se recolectaron 14 días después de la inducción de la diferenciación y se disociaron en una sola suspensión mediante incubación durante 8-12 min en TrypLE (Invitrogen). El número de células y la viabilidad se evaluaron con Nucleocount según el protocolo del fabricante. Las células en suspensión individuales recogidas se fijaron y permeabilizaron (FIX&p Er M, BD).
Las células se incubaron con anticuerpos contra troponina T cardíaca (dilución 1:400, Pierce) y MLC2a auricular cardíaca (dilución 1:800, SYSY Synaptic Systems) durante 30 min, y se detectaron con un anticuerpo secundario apropiado Alexa fluor 647 (1:500, Life Technology) en el citómetro de flujo Guava (Millipore) utilizando el soporte lógico Flowjo.
Diferenciación sobre m icroportadores (Figura 11)
Se sembraron HES-3 a 2 x 105 células/ml en el matraz giratorio de 50 ml que contenía 25 ml de medio hESC y 200 mg de MP recubierto con PLL LN (microportador recubierto con poli-L-lisina y laminina). La muestra se incubó a 37°C/dióxido de carbono al 5% durante 24 horas en condiciones estáticas, tras lo cual se añadieron otros 25 ml de medio hESC y a continuación, se agitó el cultivo a 30 rpm durante 6 días. El ochenta por ciento del medio gastado se reemplazó diariamente por medio hESC de nueva aportación. La concentración celular y la viabilidad celular se determinaron diariamente utilizando un Nucleocounter NC-3000 (Chemometec, Davis, CA, EE. UU.). Los marcadores pluripotentes se midieron mediante citometría de flujo el día 7. El tamaño de los agregados de hESC/MP se midió a partir de imágenes tomadas con un microscopio Olympus IX70 (Olympus, Shinjuku-ku, Tokoyo, Japón), con dimensiones promedio determinadas con el soporte lógico NIH image J.
Se incubaron aproximadamente 50 agregados de hESC/MP de cultivos giratorios en una placa de fijación ultrabaja de 12 pocillos (Nunc, Rochester, NY, EE. UU.) y se sometieron directamente a diferenciación cardíaca cambiando simplemente el medio hESC por DMEM o RPMI que contenía CHIR99021 15 pM con suplementos de medios de diferenciación basados en B27. Después de 24 horas, se repuso el medio de diferenciación y se añadieron IWP-2 o TA-01 5 pM el día 3. Estos IWP-2 y TA-01 se eliminaron durante el intercambio de medio el día 5. A continuación, las células se mantuvieron en medio de diferenciación con insulina desde el día 11 hasta el día 20 seguido de tratamiento con IWP-2, TA-01. El día 20 del protocolo de diferenciación, las células de todos los cultivos se recolectaron y analizaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para marcadores cardíacos MLC2a y troponína T (cTnt) y MF20.
Ejemplo 2: Síntesis de compuestos
Los compuestos diana se sintetizaron utilizando las rutas descritas en las Figuras 1 a 5. Todos los imidazoles sintetizados con nitrógeno N1 no sustituido se obtuvieron como una mezcla de tautómeros anulares que se interconvierten rápidamente en solución. Para los compuestos que contenían un centro quiral, estos se sintetizaron como una mezcla racémica de estereoisómeros y se aplicaron en los estudios biológicos como una mezcla racémica. Los detalles de la síntesis de los compuestos son los siguientes:
Todos los compuestos sintetizados (excepto IM-44) poseen el patrón de 2,4,5-tri-sustitución en la estructura central del azol y pueden clasificarse de acuerdo con las estructuras generales que se muestran en la Figura 1. Los compuestos 1a - 1c y otros compuestos que contenían el radical piridin-4-il/4-fluorofenilo vecinal similar a SB203580 se sintetizaron de acuerdo con la Figura 2. El acoplamiento de Sonogashira entre 4-fluorofenilacetileno 6 y 4-bromopiridina 7 proporcionó alquino 1,2-disustituido 8 que se oxidó a 1,2-dicetona 9 utilizando permanganato de potasio en condiciones ligeramente alcalinas. La dicetona 9 a continuación, se condensó con los aldehídos apropiados y acetato de amonio en condiciones ácidas para proporcionar imidazoles 1a - 1c. La dicetona 9 también se condensó con los aldehídos apropiados y acetato de amonio en condiciones ácidas para proporcionar los imidazoles ZQX-14-23 y ZQX-25-32.
La síntesis de compuestos 2a - 2e que contienen el radical piridin-4-il/3-tolilo vecinal había sido notificada por Low, J. L. et al. en Bioorg Med Chem Lett 2013, 23, 3300. Otros compuestos que contenían el radical piridin-4-il/3-tolilo vecinal (2f-2t) fueron sintetizados como se muestra en la Figura 3. Los imidazoles 2f - 2h y 2t se obtuvieron a través de la reacción de condensación de 1,2-dicetona 10a y 10b respectivamente con los diversos aldehídos y acetato de amonio en ácido acético. La condensación de 1,2-dicetona 10a con 4-formilbenzonitrilo proporcionó 2i después de lo cual la reacción con hidroxilamina en etanol a reflujo proporcionó 2j. El compuesto 2k se obtuvo por condensación de la 1,2-dicetona 10a con ácido 4-formilbenzoico. La reacción de 2k con cloruro de tionilo generó el cloruro de ácido que a continuación, se hizo reaccionar con amoníaco acuoso y metanol para proporcionar la amida 2l y el éster 2m respectivamente. El imidazol 2o se obtuvo mediante la condensación de 4-nitrobenzaldehído con 1,2-dicetona 10a para proporcionar 2n, seguido de reducción utilizando paladio sobre carbono.
Para imidazoles que contienen sustituyentes no aromáticos en la posición C-2 la 1,2-dicetona 10a se hizo reaccionar primero con formaldehído y acetato de amonio en ácido acético en condiciones de microondas para proporcionar imidazol 4,5-disustituido 2p . El calentamiento de 2p con formaldehído y dimetilamina en etanol dio como resultado resultó 2q. La yodación de 2p en la posición C-2 de imidazol con N-yodosuccinimida proporcionó el compuesto 11 después de lo cual el acoplamiento de Sonogashira con 3-butin-1-ol proporcionó 2r. El compuesto 2s se sintetizó protegiendo primero el nitrógeno N-1 del imidazol de 2p con cloruro de tritilo para proporcionar el compuesto 12 seguido de una adición nucleófila al 1-ciclohexeno-1-carbaldehído para proporcionar el compuesto 13. La posterior desprotección del tritilo del compuesto 13 proporcionó el compuesto 2s.
Con respecto a los compuestos que contienen un sustituyente piran-4-ilo en la posición C-5 del imidazol, estos se sintetizaron de acuerdo con la Figura 4. La preparación de los imidazoles 3a y 4a había sido notificada por Low, J. L. et al. en Bioorg Med Chem Lett 2013, 23, 3300, y no estaban incluidos en el esquema. Los compuestos 3b - 3e y 3f fueron sintetizados por condensación de la 1,2-dicetona 14a y 14b respectivamente con los aldehídos apropiados y acetato de amonio en ácido acético. Del mismo modo los compuestos 4b - 4k se obtuvieron haciendo reaccionar la 1,2-dicetona 15 con los respectivos aldehídos y acetato de amonio en ácido acético.
Los oxazoles OZ-06 y OZ-12 se sintetizaron a través de la secuencia que se muestra en la Figura 5. El primer paso implicó una bromación C4 regioselectiva de oxazoles 5-sustituidos 16a y 16b para proporcionar los oxazoles 4,5-disustituidos 17a y 17b. A continuación, una reacción de acoplamiento cruzado de Suzuki instala el grupo arilo deseado en la posición C4 de los oxazoles 17a y 17b proporcionar 4,5-diaril oxazoles 18a y 18b que a continuación, se sometieron a arilación directa en la posición C2 del oxazol para proporcionar 2,4,5-triaril oxazoles 19a y 19b. El grupo tiometilo del oxazol 19a y 19b a continuación, se oxidó al grupo metilsulfóxido en oxazoles OZ-06 (5a) y OZ-12 (5b) respectivamente utilizando persulfato de potasio en condiciones ácidas.
Procedimientos generales para la síntesis de imidazoles 2,4,5-trisustituidos.
A menos que se indique lo contrario, los procedimientos para la síntesis de los imidazoles 2,4,5-trisustituidos son los siguientes:
Método A
A una solución de 1,2-diona (1 equiv) en ácido acético glacial se le añadió NH4OAc (10 equiv) seguido de aldehído (1,1 - 1,3 equiv). A continuación, la mezcla de reacción se calentó a 115°C en un baño de aceite y se dejó agitando durante la noche. Después de que la reacción se enfriara a temperatura ambiente, el pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8 con una solución saturada de NaHCO3 y NaHCO3 sólido y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se eliminó el solvente a vacío para proporcionar el producto bruto que se purificó por cromatografía en gel de sílice para proporcionar el producto final.
Método B
A una solución de 1,2-diona (1 equiv) en ácido acético glacial se le añadieron NH4OAc (10 equiv), aldehído (1,1 - 1,3 equiv) y Cu(OAc)2 -H2O (0,3 - 2,0 equivalentes). A continuación, la mezcla de reacción se calentó a 80°C en un baño de aceite y se dejó agitando durante la noche. Después de que la reacción se enfriara a temperatura ambiente, el pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8 con una solución saturada de NaHCO3 y NaHCO3 sólido y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se eliminó el solvente a vacío para proporcionar el producto bruto que se purificó por cromatografía en gel de sílice para proporcionar el producto final.
En consecuencia, se han sintetizado los siguientes compuestos:
4-(2-(2,6-difluorofenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il)piridina (1a, IM-31, TA-01)
Sintetizada según el procedimiento general A utilizando 9 y 2,6-difluorobenzaldehído. 1a se obtuvo como un sólido de color blanco con un rendimiento de 97% (74 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD/DMSO-d63: 1): 5 = 8,51 (d, J = 6,1 Hz, 2H), 7,66 - 7,56 (m, 5H), 7,31 - 7,23 (m, 4H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C20H13F3N3 : 352,1056, encontrado: 352,1065.
4-(2-(2-fluorofenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1 H-imidazol-5(4)-il)piridina (1b, IM-30, TA-02)
Sintetizada según el procedimiento general A utilizando 9 y 2-fluorobenzaldehído. 1b se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 68% (36 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD/DMSO-d64: 1): 5 = 8,48 (d, J = 4,4 Hz, 2H), 8,06 (td, J= 7,6, 1,5 Hz, 1H), 7,60 - 7,57 (m, 4H), 7,55 - 7,51 (m, 1H), 7,40 - 7,32 (m, 2H), 7,26 (t, J = 8,7 Hz, 2H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C20H14F2N3 : 334,1150, encontrado: 334,1156.
4-(2-(1-fluoronaftalen-2-¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-¡midazol-5(4)-¡l)p¡r¡d¡na (1c, IM-29)
Sintetizada según el procedimiento general A utilizando 9 y 1-fluoro-2-naftaldehído. 1c se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 56% (50 mg). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6/CD3OD 4: 1): 5 = 8,50 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 8,18 - 8,12 (m, 2H), 8,03 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,71 - 7,64 (m, 2H), 7,60 (dd, J = 8,8, 5,5 Hz, 2H), 7,50 (dd, J = 4,6, 1,6 Hz, 2H), 7,30 (t, J = 8,7 Hz, 2H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C24H16F2N3 : 384,1307, encontrado: 384,1313.
4-(2-(naftalen-2-¡l)-4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol-5(4)-¡l)p¡r¡d¡na (2f, IM-01) - ejemplo comparat¡vo
Sintetizada según el procedimiento general B utilizando 10a y 2-naftaldehído. 2f se obtuvo como un sólido de color amarillo pálido con un rendimiento de 49% (39 mg). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 13,08 (s, 1H), 8,63 (s, 1H), 8,48 (s, 2H), 8,26 (dd, J = 8,6, 1,7 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,00 - 7,90 (m, 2H), 7,62 - 7,50 (m, 4H), 7,49 -7,21 (m, 4H), 2,38 (s, 3H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C25H20N3 : 362,16517, encontrado: 362,16574.
4-(2-(4-(met¡lsulfon¡l)fen¡l)-4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol-5(4)-¡l)p¡r¡d¡na (2g, IM-33) - ejemplo comparat¡vo
Sintetizada según el procedimiento general A utilizando 10a y 4-(metilsulfonil)benzaldehído. 2g se obtuvo como un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 45% (43 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 8,40 (s, 2H), 8,23 (d, J = 8 Hz, 2H), 8,04 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,58 (d, J = 4 Hz, 2H), 7,35 - 7,27 (m, 4H), 3,17 (s, 3H), 2,37 (s, 3H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C22H20N3O2S: 390,1271, encontrado: 390,1269.
W-(4-(5(4)-(p¡r¡d¡n-4-¡l)-4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol-2-¡l)fen¡l)metanosulfonam¡da (2h, IM-35) - ejemplo comparat¡vo
Sintetizada según el procedimiento general A utilizando 10a y W-(4-formilfenil)metanosulfonamida. 2h se obtuvo como un sólido de color amarillo con un rendimiento de 52% (76,8 mg). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 12,83 (s, br, 1H), 9,98 (s, br, 1H), 8,54 - 8,44 (m, 2H), 8,03 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,49 (s, 2H), 7,38 (s, 2H), 7,31 - 7,29 (m, 4H), 3,06 (s, 3H), 2,37 (s, 3 H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C22H21N4O2S: 405,1380, encontrado: 405,1383.
4-(5(4)-(p¡r¡d¡n-4-¡l)-4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol-2-¡l)benzon¡tr¡lo (2¡, IM-36) - ejemplo comparat¡vo
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 10a y 4-formilbenzonitrilo. 2¡ se obtuvo como un sólido de color blanco con un rendimiento de 80% (62 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 8,44 (d, J = 4 Hz, 2H), 8,19 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,85 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 4 Hz, 2H), 7,38 - 7,29 (m, 4H), 2,39 (s, 3H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C22H17N4 : 337,1448, encontrado: 337,1458.
(Z)-N'-h¡drox¡-4-(5(4)-(p¡r¡d¡n-4-¡l)-4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol-2-¡l)benz¡m¡dam¡da (2j, IM-37) - ejemplo comparat¡vo
A una solución de 2¡ (40 mg, 0,12 mmoles, 1 equiv) en etanol (10 ml) se le añadieron hidrocloruro de hidroxilamina (26 mg, 0,37 mmoles, 3 equiv) y trietilamina (37 mg, 0,37 mmoles, 3 equiv). La mezcla de reacción se calentó a reflujo a 95°C y se dejó agitando durante la noche. Se eliminó el solvente a vacío para proporcionar el producto bruto que se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (éter de petróleo/acetato de etilo/metanol 20:20:1) para proporcionar 2j como un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 61% (42 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 8,41 (s, 2H), 8,04 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,78 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,57 (d, J = 4 Hz, 2H), 7,36 - 7,26 (m, 4H), 2,38 (s, 3H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C22H20N5O: 370,1662, encontrado: 370,1665.
Ác¡do 4-(5(4)-(p¡r¡d¡n-4-¡l)-4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol-2-¡l)benzo¡co (2k, IM-38) - ejemplo comparat¡vo
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 10a y ácido 4-formilbenzoico. 2k se obtuvo como un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 45% (222 mg). r Mn 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 8,42 (s, J = 4 Hz, 2H), 8,07 (d, J = 8 Hz, 2H), 8,01 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,59 (d, J = 4 Hz, 2H), 7,38 - 7,26 (m, 4H), 2,39 (s, 3H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C22H18N3O2 : 356,1394, encontrado: 356,1399.
4-(5(4)-(p¡r¡d¡n-4-¡l)-4(5)-(m-tol¡l)-1 H-¡m¡dazol-2-¡l)benzam¡da (2l, IM-39) - ejemplo comparat¡vo
El compuesto 2k (36,5 mg, 0,10 mmoles, 1 equiv) se disolvió en cloruro de tionilo (8 ml) y la mezcla de reacción se calentó a 80°C y se agitó durante 3 h. Se eliminó el cloruro de tionilo a vacío, el residuo resultante se disolvió en diclorometano (5 ml) y se añadió gota a gota a una solución de hidróxido de amonio (28 - 30%) (10 ml) a 0°C y se agitó durante 30 min durante los cuales el producto precipita fuera de la solución. El producto bruto se recogió por filtración y purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 40:1) proporcionó 21 como un sólido de color amarillo con un rendimiento de 72% (25,5 mg). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 13,08 (s, br, 1H), 8,48 (s, 2H), 8,17 (d, J= 8 Hz, 2H), 8,04 (s, 1H), 7,99 (d, J= 8 Hz, 2H), 7,52 (d, J= 4 Hz, 2H), 7,41 - 7,27 (m, 5H), 2,36 (s,3H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C22H19N4O: 355.1553, encontrado: 355.1554.
4-(5(4)-(p¡r¡d¡n-4-¡l)-4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol-2-¡l)benzoato de met¡lo (2m, IM-40) - ejemplo comparat¡vo
El compuesto 2k (40 mg, 0,11 mmoles, 1 equiv) se disolvió en cloruro de tionilo (8 ml) y a continuación, la mezcla de reacción se calentó a 80°C y se agitó durante 3 h. Se eliminó el cloruro de tionilo a vacío y el residuo resultante se disolvió en metanol (5 mL) y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. La eliminación del disolvente proporcionó el producto bruto que se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) y proporcionó 2m como un sólido de color amarillo con un rendimiento de 74% (30 mg). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8,48 (s, 2H), 8,23 (d, J = 8 Hz, 2H), 8,07 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,52 (d, J = 4 Hz, 2H), 7,41 - 7,31 (m, 4H), 3,88 (s, 3H), 2,36 (s, 3H); h Rm S-ESI m/z [M+H]+ calculado para C23H20N3O2 : 370,1550, encontrado: 370,1552.
4-(2-(4-nitrofenil)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol-5(4)-il)piridina (2n, IM-32) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el procedimiento general A utilizando 10a y 4-nitrobenzaldehído. 2n se obtuvo como un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 40% (35 mg). Rm N 1H (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8,49 (s, 2H), 8,38 - 8,33 (m, 4H), 7,53 (s, 2H), 7,42 - 7,33 (m, 4H), 2,38 (s, 3H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C21H17N4O2 : 357,1346, encontrado: 357,1347.
4-(5(4)-(piridin-4-il)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol-2-il)anilina (2o, IM-34) - ejemplo comparativo
A una solución de 2n (21 mg, 0,06 mmoles, 1 equiv) en metanol se le añadió paladio al 10% sobre carbono (3,2 mg, 0,003 mmoles, 0,05 equiv). Se introdujo gas hidrógeno en la solución a través de un balón y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. La mezcla de reacción se filtró sobre celite y se eliminó el metanol a vacío para proporcionar el producto bruto. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (éter de petróleo/acetato de etilo 1:5) proporcionó 2o como un sólido de color amarillo con un rendimiento de 55% (10,8 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 8,39 (s, 2H), 7,74 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,54 (d, J = 4 Hz, 2H), 7,34 - 7,23 (m, 4H), 6,78 (d, J = 8 Hz, 2H), 2,37 (s, 3H); Hr Ms -ESi m/z [M+H]+ calculado para C21H19N4 : 327,1604, encontrado: 327,1604.
4-(4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol-5(4)-il)piridina (2p, IM-44) - ejemplo comparativo
El compuesto 10a (68 mg, 0,30 mmoles, 1 equiv), una solución de formaldehído al 37% (25 pL, 0,33 mmoles, 1,1 equiv), NH4OAc (231 mg, 3,0 mmoles, 10 equiv) y ácido acético glacial (1,5 ml) se combinaron en un vial de reacción de microondas y se sellaron. A continuación, la mezcla de reacción se calentó en un reactor de microondas durante 6 min a 180°C. Después de enfriar, la mezcla de reacción se añadió gota a gota a una solución concentrada de hidróxido de amonio a 0°C. El precipitado de color amarillo obtenido se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para producir 2p con un rendimiento de 44% (31 mg) que se utilizó sin purificación adicional. RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 8,40 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 7,85 (s, 1H), 7,50 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 7,32 - 7,22 (m, 4H), 2,36 (s, 3H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C15H14N3 : 236,1182, encontrado: 236,1190.
N, N-dimetil-1-(5(4)-(piridin-4-il)-4(5)-(m-tolil)-1 H-imidazol-2-il)metanamina (2q, IM-42) - ejemplo comparativo
A una solución de 2p (52 mg, 0,22 mmoles, 1 equiv) en etanol, se le añadió solución de formaldehído al 37% (19 pl, O, 26 mmoles, 1,2 equiv) y dimetilamina (29 mg, 0,89 mmoles, 1,2 equiv). La mezcla de reacción se calentó a 70°C y se agitó durante 15 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, se eliminó el solvente a vacío para proporcionar el producto bruto. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 10:1) proporcionó 2q como un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 64% (41 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 8,40 (s, 2H), 7,50 (s, 2H), 7,33 - 7,21 (m, 4H), 3,67 (s, 3H), 2,38 (s, 6H), 2,35 (s, 3H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C18H21N4 : 293,1761, encontrado: 293,1761.
4-(5(4)-(piridin-4-il)-4(5)-(m-tolil)-1 H-imidazol-2-il)but-3-in-1-ol (2r, IM-41) - ejemplo comparativo
El compuesto 2p (180 mg, 0,77 mmoles, 1 equiv) se disolvió en THF (5 ml) seguido de la adición de N-yodosuccinimida (207 mg, 0,92 mmoles, 1,2 equiv) en dos porciones a intervalos de 30 min. La solución se dejó agitando a temperatura ambiente durante otras 3 horas en la oscuridad. Una vez completada, la mezcla de reacción se inactivó con una solución saturada de Na2S2O3 y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se filtró. La eliminación del disolvente a vacío proporcionó el producto bruto que se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 10:1) para proporcionar 11 como un sólido de color amarillo con un rendimiento de 80% (226 mg).
La trietilamina seca (1,7 ml) se desgasificó primero haciendo burbujear N2 a través de la solución durante 15 min. A esto se le añadieron 11 (47 mg, 0,13 mmoles, 1,0 equiv), Pd(PPh3)4 (7,5 mg, 0,0065 mmoles, 0,05 equiv), Cul (2,5 mg, 0,013 mmoles, 0,1 equiv) y 3-butin-1-ol (11 mg, 0,16 mmoles, 1,2 equiv) en este orden bajo N2. A continuación, la solución se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. Una vez completada la reacción, se eliminó la trietilamina a vacío y el residuo obtenido se disolvió en acetato de etilo y se filtró a través de celite. El producto filtrado se lavó con salmuera y los extractos orgánicos se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se filtraron. La eliminación del disolvente a vacío proporcionó el producto bruto que se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 100:5) para proporcionar 2r como un aceite de color amarillo con un rendimiento de 37% (15 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 8,58 (d, J = 4 Hz, 2H), 8,03 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,45 - 7,36 (m, 3H), 7,31 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 3,78 (t, J = 8 Hz, 2H), 2,71 (t, J = 8 Hz, 2H), 2,41 (s, 3H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C19H18N3O: 304,1444, encontrado: 304,1444.
Ciclohex-1-en-1-il(5(4)-(piridin-4-il)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol-2-il)metanol (2s, IM-43) - ejemplo comparativo
A una solución de 2p (50 mg, 0,21 mmoles, 1 equiv) en diclorometano (5 ml), se le añadieron trietilamina (43 mg, 0,42 mmoles, 2 equiv) y cloruro de trifenilmetilo (59 mg, 0,21 mmoles, 1 equiv). La mezcla de reacción se dejó agitando a temperatura ambiente durante 12 horas. Una vez completada, se añadió agua para extinguir la reacción y se extrajo con diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera y se secaron sobre Na2SO4 anhidro. Después de la filtración, el solvente se eliminó a vacío para proporcionar el producto bruto. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó 12 como un sólido de color blanco con un rendimiento de 85% (86 mg).
A una solución de 12 (40 mg, 0,084 mmoles, 1 equiv) en THF anhidro se le añadió una solución de n-BuLi (1,15 M en hexanos, 100 uL, 0,12 mmoles, 1,2 equiv) a 0°C bajo N2. La mezcla de reacción se dejó calentando a temperatura ambiente y se agitó durante 30 min, después de lo cual se enfrió nuevamente a 0°C y se añadió 1-ciclohexeno-1-carboxaldehído (11 mg, 0,1 mmoles, 1,2 equiv). La mezcla de reacción se dejó calentando de nuevo a temperatura ambiente y se agitó durante otras 6 h. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con salmuera. La eliminación del disolvente a vacío proporcionó el producto bruto que se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) para producir 13 como un aceite de color amarillo pálido que contenía una mezcla 1,4:1 de atropisómeros con un rendimiento combinado de 60% (29 mg).
A una solución de 13 (40 mg, 0,07 mmoles, 1 equiv) en THF (2 ml), se le añadieron ácido trifluoroacético (23 mg, 0,2 mmoles, 3 equiv) y agua desionizada (8 mg, 0,42 mmoles, 6 equiv). La mezcla de reacción se dejó agitando a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con salmuera. La eliminación del disolvente a vacío proporcionó el producto bruto que se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 60:1) para producir 2s como un aceite de color amarillo pálido con un rendimiento de 80% (19 mg). RMN 1H (400 MHz, CDC13): 5 = 8,46 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,49 (d, J = 4,4 Hz, 2H), 7,32 - 7,20 (m, 4H), 5,95 (s, 1H), 5,28 (s, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,17 (s,4H), 1,91 - 1,57 (m, 4H) HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C22H24N3O: 346,1914, encontrado: 346,1914.
4-(2-(1-fluoronaftalen-2-il)-4(5)-(3-(tr¡fluoromet¡l)fen¡l)-1 H-im¡dazol-5(4)-¡l)p¡r¡d¡na (2t, IM-02) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el procedimiento general B utilizando 10b y 1-fluoro-2-naftaldehído. 2t se obtuvo como un sólido de color amarillo pálido con un rendimiento de 32% (32 mg). r Mn 1H (400 MHz, CDC13 ): 5 = 10,21 (s, 1H, NH), 8,67 (s, br, 1H), 8,44 (dd, J= 11,1,5,2 Hz, 1H), 8,20 - 8,13 (m, 2H), 7,90 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,84 - 7,36 (m, 9H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C25H16F4N3 : 434,12749, encontrado: 434,12802.
2-(2,6-d¡fluorofen¡l)-5(4)-(3,6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-¡m¡dazol (3b, IM-23)
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 14a y 2,6-difluorobenzaldehído. 3b se obtuvo como un sólido de color amarillo pálido con un rendimiento de 55% (31 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 7.58 (dd, J = 8,4, 5,5 Hz, 2H), 7,55 - 7,47 (m, 1H), 7,16 - 7,09 (m, 4H), 5,98 (s, 1H), 4,23 (d, J = 2,6 Hz, 2H), 3,84 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 2,35 (s, 2H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C20H16F3N2O: 357,1209, encontrado: 357,1208.
4-(5(4)-(3,6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-¡m¡dazol-2-¡l)fenol (3c, IM-24) - ejemplo comparat¡vo
Sintetizado según el procedimiento general B utilizando 14a y 4-hidroxibenzaldehído. 3c se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 63% (50 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 7,75 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,57 (dd, J = 8,9, 5,4 Hz, 2H), 7,13 (t, J = 8,9 Hz, 2H), 6,86 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,08 - 5,82 (m, 1H), 4,24 (q, J = 2,8 Hz, 2H), 3,84 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 2,32 (td, J = 5,2, 2,6 Hz, 2H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C20H18FN2O2 : 337,1347, encontrado: 337,1345.
5(4)-(3,6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-2-(2-fluorofen¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-¡m¡dazol (3d, IM-20)
Sintetizado según el procedimiento general B utilizando 14a y 2-fluorobenzaldehído. 3d se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 46% (25 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 7,91 (td, J = 7,6, 1,6 Hz, 1H), 7,60 -7,57 (m, 2H), 7,47 - 7,41 (m, 1H), 7,31 - 7,23 (m, 2H), 7,14 (t, J = 8,4 Hz, 2H), 5,98 (s, 1H), 4,23 (d, J = 2 Hz, 2H), 3,84 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 2,34 (s, 2H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C20H17F2N2O: 339,1303, encontrado: 339,1300.
5(4)-(3,6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-2-(1-fluoronaftalen-2-¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1 H-¡m¡dazol (3e, IM-22)
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 14a y 1-fluoro-2-naftaldehído. 3e se obtuvo como un sólido de color amarillo pálido con un rendimiento de 90% (49 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 8,17 - 8,15 (m, 1H), 7,98 (dd, J = 8,6, 7,4 Hz, 1H), 7,93 - 7,91 (m, 1H), 7,75 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,62 - 7,56 (m, 4H), 7,14 (t, J = 8,7 Hz, 2H), 6,00 (s, 1H), 4,24 (d, J = 2,2 Hz, 2H), 3,85 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 2,36 (s, 2H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C24H19F2N2O: 389,1460, encontrado: 389,1455.
5(4)-(3,6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-2-(2-fluorofen¡l)-4(5)-(p-tol¡l)-1H-¡m¡dazol (3f, IM-21) - ejemplo comparat¡vo
A una solución de 1 -etinil-4-metilbenceno (460 mg, 4 mmoles, 2 equiv) en THF seco (8 ml) a temperatura ambiente se le añadió una solución de n-BuLi (4 mmoles, 2 equiv) en hexanos (2,4 M) gota a gota mientras se agitaba. La solución se agitó durante 5 min más, después de lo cual se añadió LiBr anhidro (695 mg, 8 mmoles, 4 equivalentes) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min más. Después de lo cual, la mezcla se enfrió a -78°C y se transfirió gota a gota a una solución preenfriada de tetrahidro-4H-piran-4-ona (200 mg, 2 mmoles, 1 equiv) en THF seco (6 mL) a -78°C. A continuación, se retiró el baño refrigerante y se dejó calentando la reacción hasta temperatura ambiente. Se continuó agitando durante otros 40 minutos, después de lo cual la reacción se diluyó con éter dietílico, se lavó con una solución saturada de NH4Cl y se secó sobre Na2SO4 anhidro. La eliminación del disolvente a vacío proporcionó el producto bruto que se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para proporcionar 4-(ptoliletinil)tetrahidro-2H-piran-4-ol como un sólido de color blanco con un rendimiento cuantitativo (580 mg).
Una solución de 4-(p-toliletinil)tetrahidro-2H-piran-4-ol (550 mg, 2,5 mmoles, 1 equivalente) en una mezcla 6:1 de 1,4-dioxano/H2O se enfrió a 0°C. Se añadió en porciones KMnO4 (1,6 g, 10,2 mmoles, 4 equiv) y la reacción se agitó a 0°C durante 5 min, después de lo cual se retiró el baño de hielo y la reacción se agitó a temperatura ambiente. La reacción se controló por TLC cada 5 min y cuando TLC indicó la desaparición del alquino de partida, la reacción se detuvo con una solución saturada de NaHSO3 a 0°C. La reacción se extrajo con acetato de etilo y los extractos orgánicos se secaron con Na2SO4 anhidro. La eliminación del disolvente a vacío proporcionó el producto bruto que se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice para proporcionar 14b como un líquido viscoso de color amarillo con un rendimiento de 52% (320 mg).
El compuesto 3f se sintetizó según el procedimiento general A utilizando 14b y 2-fluorobenzaldehído. 3f se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 79%. RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 7,90 (td, J = 7.6, 2 Hz, 1H), 7,45-7,39 (m, 3H), 7,29-7,25 (m, 1H), 7,25-7,20 (m, 3H), 5,97 (m, 1H), 4,22 (dd, J = 5,6, 2,8 Hz, 2H), 3,81 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 2,35 (s, 3H), 2,33 (m, 2H); Hr Ms -ESI m/z [M+H]+ calculado para C21H20FN2O: 335,1554, encontrado: 335,1555.
2-(2,6-difluorofenil)-5(4)-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol (4b, IM-18 ) - ejemplo comparativo
Sintetizado según el procedimiento general B utilizando 15 y 2,6-difluorobenzaldehído. 4b se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 52% (60 mg). RMN 1H (400 MHz, CDC13 ): 5 = 9,65 (s, 1H), 7,52-7,41 (m, 1H), 7,33-7,26 (m, 3H), 7,16-7,11 (m, 1H), 7,05-6,98 (m, 2H), 6,09 (m, 1H), 4,26 (s, 2H), 3,83 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 2,43 (m, 2H), 2,39 (s, 3H); h Rm S-ESI m/z [M+H]+ calculado para C21H19F2N2O: 353,1460, encontrado: 353,1456.
2-(2-bromofenil)-5(4)-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol (4c, IM-13) - ejemplo comparativo
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 15 y 2-bromobenzaldehído. 4c se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 84% (105 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 7,73 (dd, J = 8, 0,8 Hz, 1H), 7,62 (dd, J = 7,6, 2 Hz, 1H), 7,46 (td, J = 7,2, 1,2 Hz, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,38 - 7,34 (m, 2H), 7,28 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,99 (m, 1H), 4,24 (dd, J = 5,6, 2,8 Hz, 2H), 3,83 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 2,37 (s, 3H), 2,36 (m, 2H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C21H2üBrN2O: 395,0754, encontrado: 395,0751.
5(4)-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-2-(4-nitrofenil)-4(5)-(m-tolil)-1 H-imidazol (4d, IM-17) - ejemplo comparativo
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 15 y 4-nitrobenzaldehído. 4d se obtuvo como un sólido de color naranja con un rendimiento de 54% (92 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 8,27 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 8,10 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,41 (s, 1H), 7,36 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,30 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,17 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 6,02 (s, 1H), 4,25 (s, 2H), 3,83 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2,39 (s, 3H), 2,34 (s, 2H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C21H20N3O3 : 362,1499, encontrado: 362,1510.
4-(5(4)-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-4(5)-(m-tolil)-1H-imidazol-2-il)fenol (4e, IM-15) - ejemplo comparativo
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 15 y 4-hidroxibenzaldehído. 4e se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 74% (28 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 7,76 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,38 (s, 1H), 7,33 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,26 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,97 (m, 1H), 4,24 (dd, J = 5,6, 2,8 Hz, 2H), 3,82 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 2,37 (s, 3H), 2,32 (m, 2H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C21H21N2O2 : 333,1598, encontrado: 333,1613.
2-(2-clorofenil)-5(4)-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-4(5)-(m-tolil)-1 H-imidazol (4f, IM-12) - ejemplo comparativo
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 15 y 2-clorobenzaldehído. 4f se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 91% (100 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 7,70 - 7,67 (m, 1H), 7,55 - 7,53 (m, 1H), 7,45 - 7,39 (m, 3H), 7,36 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,28 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5,99 (s, 1H), 4,24 (d, J = 2,8 Hz, 2H), 3,83 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 2,38 (s, 5H); HRm S-eS i m/z [M+H]+ calculado para C21H20ClN2O: 351,1259, encontrado: 351,1270.
5(4)-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-2-(2-fluorofenil)-4(5)-(m-tolil)-1 H-imidazol (4g, IM-06) - ejemplo comparativo
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 15 y 2-fluorobenzaldehído. 4g se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 70% (66 mg). RMN 1H (400 MHz, CDC13 ): 5 = 9,62 (s, 1H), 8,34 (q, J = 8 Hz, 1H), 7,54 - 7,43 (m, 1H), 7,35 - 7,24 (m, 4H), 7,18 - 7,10 (m, 2H), 6,10 (s, 1H), 4,30 (s, 2H), 3,85 ( yo, J = 5,2 Hz, 2H), 2,40 (m, 5H); HRMS-e Si m/z [M+H]+ calculado para C21H20FN2O: 335,1554, encontrado: 335,1572.
5(4)-(3,6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-2-(1-fluoronaftalen-2-¡l)-4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol (4h, IM-03) - ejemplo comparativo
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 15 y 1-fluoro-2-naftaldehído. 4h se obtuvo como un sólido de color amarillo pálido con un rendimiento de 45% (28 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 8,19 - 8,17 (m, 1H), 8,00 (dd, J = 8,6, 7,3 Hz, 1H), 7,94 (dt, J = 8,3, 1,9 Hz, 1H), 7,77 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,65 - 7,56 (m, 2H), 7,44 (s, 1H), 7,39 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,30 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,16 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,03 (s, 1H), 4,26 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 3,85 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 2,39 (m, 5H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C25H22FN2O: 385,1711, encontrado: 385,1682.
5(4)-(3,6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-2-fen¡l-4(5)-(m-tol¡l)-1H-¡m¡dazol (4¡, IM-11) - ejemplo comparat¡vo
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 15 y benzaldehído. 4¡ se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 67% (23 mg). RMN 1H (400 MHz CD2Cl2): 5 = 7,90 - 7,88 (m, 2H), 7,44 - 7,40 (m, 3H), 7,37 -7,33 (m, 2H), 7,26 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,00 (m, 1H), 4,23 (dd, J = 5,4, 2,7 Hz, 2H), 3,81 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 2,37 (s, 3H), 2,33 (s, 2H); HRMS-ESl m/z [M+H]+ calculado para C21H21N2O: 317,1648, encontrado: 317,1663.
5(4)-(3,6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-2-(6-metox¡naftaleno-2-¡l)-4(5)-(m-tol¡lo)-1 H-imidazol (4j, IM-09) - ejemplo comparat¡vo
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 15 y 6-metoxi-2-naftaldehído. 4j se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 92% (170 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 8,31 (s, 1H), 7,99 (dd, J = 8,4, 1,2 Hz, 1H), 7,84 - 7,79 (m, 2H), 7,42 (s, 1H), 7,37 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,29 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,17 - 7,15 (m, 2H), 6,02 (s, 1H), 4,26 (dd, J = 4,8, 2,4 Hz, 2H), 3,91 (s, 3H), 3,84 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 2,39 (s, 3H), 2,35 (m, 2H); HRMS-ESI m/z [M+h ]+ calculado para C26H25N2O2 : 397,1911, encontrado: 397,1913.
2-(5(4)-(3,6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-4(5)-(m-tol¡lo)-1 H-imidazol-2-¡l)fenol (4k, IM-14)-ejemplo comparat¡vo
Sintetizado según el procedimiento general A utilizando 15 y 2-hidroxibenzaldehído. 4k se obtuvo como un sólido blanquecino con un rendimiento de 97% (91 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 = 7,77 (dd, J = 7,6, 1,2 Hz, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,36 (d, J = 8H, 1H), 7,27 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,21 (ddd, J = 8,4, 7,2, 1,6 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 7,6 H, 1H), 6,94 (dd, J = 8,4, 1,2 Hz, 1H), 6,88 (ddd, J = 8, 7,2, 1,2 Hz, 1H), 6,01 (m, 1H), 4,23 (dd, J = 5,6, 2,8 Hz, 2H), 3,83 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 2,37 (s, 3H), 2,36 (m, 2H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C21H21N2O2 : 333.1598, encontrado: 333.1610.
5-(4-fluorofen¡l)-2-(4-(met¡lsulf¡n¡l)fen¡l)-4-(p¡r¡d¡n-4-¡l)oxazol (5b, OZ-12) - ejemplo comparat¡vo
A un vial de microondas que contenía una barra agitadora se le añadieron ácido piválico (17 mg, 0,2 mmoles, 40% en moles), K2CO3 (170 mg, 1,3 mmoles, 3 equivalentes), Pd(OAc)2 (9 mg, 0,04 mmoles, 10% en moles), 2-diciclohexilfosfino-2',6'-diisopropoxi bifenilo (RuPhos, 39 mg, 0,08 mmoles, 20% en moles) y 18b (100 mg, 0,4 mmoles, 1 equivalente). El vial de microondas se tapó, se evacuó y se rellenó tres veces con argón. Se añadió tolueno seco desgasificado (2,1 ml) mediante una jeringa, seguido de 4-bromotioanisol (130 mg, 0,6 mmoles, 1,5 equivalentes). El vial de microondas se selló con Parafilm y se calentó en un baño de aceite a 115°C durante la noche. Después de enfriar, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con agua. La fase orgánica se secó con Na2SO4 anhidro y se filtró. La eliminación del disolvente a vacío produjo el producto bruto que se purificó por cromatografía en gel de sílice para proporcionar 19b como un sólido blanquecino con un rendimiento de 90% (140 mg).
A una solución de 19b (74 mg, 0,2 mmoles, 1 equiv) en una mezcla de ácido acético glacial (2,7 mL) y agua (1,8 mL) se le añadió K2S2O8 (66 mg, 0,25 mmoles, 1,2 equivalentes) a temperatura ambiente. La mezcla se dejó agitando durante 2 días a temperatura ambiente (44 horas). La mezcla de reacción se sofocó con NaHCO3 sat. y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica combinada se secó con Na2SO4 anhidro y se filtró. La eliminación del disolvente a vacío proporcionó el producto bruto. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 100:3) proporcionó 5b como un sólido de color blanco con un rendimiento de 85% (66 mg). RMN 1H (400 MHz CD3OD) 58,57 (dd, J = 4,6, 1,6 Hz, 2H), 8,34 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,88 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,76 - 7,72 (m, 4H), 7,27 (t, J = 8,8 Hz, 2H), 2,87 (s, 3H); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C21H16FN2O2S: 379,0911, encontrado: 379,0911.
Los siguientes compuestos se han sintetizado adicionalmente y se ha encontrado que son cardiogénicos de la misma manera. Estos azoles 2,4,5-trisustituidos también promueven la diferenciación cardíaca en varias líneas celulares iPS y embrionarias, y también en microportadores:
4-[4(5)-(4-fluorofen¡l)-2-fen¡l-1H-/'m/'dazol-5(4)-¡l]p¡r¡d¡na (ZQX-14) - ejemplo comparat¡vo
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofen¡l)-2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)etano-1,2-d¡ona (20 mg, 0,1 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (72 mg, 0,9 mmoles, 10 equivalentes) y benzaldehído (12 mg, 0,11 mmoles, 1,1 equivalentes) en ácido acético glacial (3 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-14 como un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 46% (13 mg). R f = 0,2 (diclorometano/metanol 20:1); p .f.: 232-233°C descomp.; RMN 1H (400 MHz CD3OD): 58,45 (s, 2H), 8,00 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,54 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,52­ 7,42 (m, 5H), 7,20 (t aparente, J = 8,4 Hz, 2H); RMN 13C (100 MHz CD3OD): 5 164,39 (d, J = 245,5 Hz), 150,1, 149,3, 132,17 (d, J = 8,4 Hz), 130,9, 130,4, 130,0, 127,1, 123,4, 117,0, 116,78 (d, J = 22 Hz); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C20HuFN3+H+ : 316,1250, encontrado : 316,1252. Pureza HPLC: >99%.
4-[2-(2,6-d¡clorofenil)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1 H-imidazol-5(4)-ií\piridina (ZQX-15) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(p irid in^ -iOetano-l^ -diona (23 mg, 0,1 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (77,8 mg, 1 mmoles, 10 equiv.) y 2,6-diclorobenzaldehído (19,3 mg, 0,11 mmoles, 1,1 equiv.) en ácido acético glacial (3 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-15 como un sólido de color pálido con un rendimiento de 55% (21 mg). R f = 0,3 (diclorometano/metanol 20:1); pf: 258-260°C. RMN 1H (400 MHz CD3OD): 58,45 (s, 2H), 7,67-7,50 (m, 7H), 7,21 (br s, 2H); RMN 13C (100 MHz CD3OD): 5 164,39 (d, J = 246 Hz) 150,3, 137,8, 133,77 (d, J = 3 Hz), 133,3, 133,1, 133,0, 131,88 (d, J = 9 Hz), 130,8, 129,97 (d, J = 12 Hz), 129,4, 123,1, 117,05 (d, J = 22 Hz); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C2üH12Cl2FN3+H+: 384,0471, encontrado: 384,0481, Pureza Hp LC: >96%.
4-[2-(2-metox¡fen¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-/'m/'dazol-5(4)-¡l\p¡r¡d¡na (ZQX-16) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)etano-1,2-d¡ona (32 mg, 0,14 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (108,9 mg, 1,4 mmoles, 10 equiv.) y 2-metoxibenzaldehído (22 mg, 0,16 mmoles, 1,1 equiv.) en ácido acético glacial (3 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-16 como un sólido pálido con un rendimiento de 62,5% (30 mg). R f = 0,2 (diclorometano/metanol 20:1); p.f.: 184-185°C; RMN 1H (400 MHz CD3OD): 58,41 (s, 2H), 8,03 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,53-7,49 (m, 4H), 7,45-7,41 (m, 1H), 7,21 -7,15 (m, 3H), 7,10 (t aparente, J = 7,6 Hz 1H), 3,98 (s, 3H); RMN 13C (100 MHz CD3OD) 5 164,36 (d, J = 245,5), 158,1, 150,1, 132,05 (d, J = 30,1 Hz), 130,5, 123,2, 122,0, 119,3, 116,83 (d, J = 21,9 Hz), 112,5, 56,2; HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C21H16FN3O+H+: 346,1356, encontrado: 346,1363, Pureza HpLC: >96%.
4-[2-(2-clorofen¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-/'m/'dazol-5(4)-¡l\p¡r¡d¡na (ZQX-17) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)etano-1,2-d¡ona (23 mg, 0,1 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (77,8 mg, 1 mmoles, 10 equivalentes) y 2-clorobenzaldehído (15,5 mg, 0,11 mmoles, 1,1 equivalentes) en ácido acético glacial (3 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-17 como un sólido de color blanco con un rendimiento de 51% (17,8 mg). R f = 0,2 (diclorometano/metanol 20:1); p.f.: 220-221°C. RMN 1H (400 MHz CD3OD): 5 8,43 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,77-7,74 (m, 1H), 7,59-7,57 (m, 1H), 7,55-7,51 (m, 4H), 7,49-7,45 (m, 2H), 7,20 (t aparente, 2H) ; RMN 13C (100 MHz CD3OD) 5 =164,35 (d, J = 245,8 Hz), 150,2, 146,7, 134,1, 132,9, 132,1, 132,01 (d, J = 8,2 Hz), 131,3, 130,8, 128,3, 123,1, 116,97 (d, J = 21,9 Hz); HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C20H13CFN 3+H+: 350,0860, encontrado: 350,0869, Pureza HpLC: >96%.
4-[2-(2,6-d¡metox¡fen¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-/'m/'dazol-5(4)-¡l\p¡r¡d¡na (ZQX-18) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)etano-1,2-d¡ona (35 mg, 0,15 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (116,7 mg, 1,5 mmoles, 10 equiv.) y 2,6-dimetoxibenzaldehído (28 mg, 0,17 mmoles, 1,1 equiv.) en ácido acético glacial (3 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-18 como un sólido de color pálido con un rendimiento de 38% (21,4 mg). R f = 0,2 (diclorometano/metanol 20:1); p.f.: 199-200°C descomp. RMN 1H (400 MHz CD3OD): 58,41 (s, 2H), 7,53-7,50 (m, 4H), 7,44 (t, J=8,4 Hz, 1H), 7,18 (m, 2H), 6,77 (d, J=8,4Hz, 2H), 3,81 (seg, 6H), RMN 13C (100 MHz CD3OD) 5 164,19 (d, J = 245,2 Hz), 161,0, 151,0, 143,6, 132,8, 131,85 (d, J = 8,2 Hz), 123,0, 116,84 (d, J = 21,8 Hz), 109,6, 105,0, 61,5, 56,4; HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C22H18FN3O2+H+: 376,1461, encontrado: 376,1473, Pureza HPLC: >96%.
4-[2-(2-cloro-6-fluorofen¡l)-4(5)-(4-fluorofen¡l)-1H-/'m/'dazol-5(4)-¡l\p¡r¡d¡na (ZQX-19)
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(p¡r¡d¡n-4-¡l)etano-1,2-d¡ona (40 mg, 0,18 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (140,0 mg, 1,8 mmoles, 10 equiv.) y 2-cloro-6-fluorobenzaldehído (30 mg, 0,20 mmoles, 1,1 equiv.) en ácido acético glacial (5 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-19 como un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 45% (30 mg). R f = 0,2 (diclorometano/metanol 20:1); p.f.: 274-276°C. RMN 1H (400 MHz CD3OD) 5 8,45 (s, 2H), 7,59-7,52 (m, 5H), 7,46 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,32­ 7,27 (m, 1H), 7,21 (m, 2H); RMN 13C (100 MHz CD3OD) 5 162,95 (d, J = 250 Hz), 150,3, 136,88 (d, J = 3 Hz), 133,51 (d, J = 9 Hz), 131,93 (d, J = 8 Hz), 126,92 (d, J = 4 Hz), 123,1, 120,2, 120,0, 117,0, 115,8, 115,6; HRMS-ESI m /z [M+h ]+ calculado para C2oH12ClF2N3+H+: 368,0766, encontrado: 368,0761, Pureza HPLC: >98%.
4- [2-(2-fluoro-6-metoxifenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1 H -im idazo^^yi^p irid ina (ZQX-20)
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofen¡l)-2-(p¡r¡d¡n-4-il)etano-1,2-diona (40 mg, 0,18 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (140,0 mg, 1,8 mmoles, 10 equiv.) y 2-fluoro-6-metoxibenzaldehído (30 mg, 0,20 mmoles, 1,1 equiv.) en ácido acético glacial (5 ml) se agitó a 115°C durante la noche.
La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-20 como un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 38% (25 mg). R f = 0,2 (diclorometano/metanol 20:1); p.f.: 203-205°C. RMN 1H (400 MHz CD3OD) 58,42 (d, J = 4,9 Hz, 2H), 7,53-7,45 (m, 5H), 7,20 (br s, 2H), 6,98 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,93-6,88 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 3,88 (s, 3H); RMN 13C (100 MHz CD3OD) 5 162,88 (d, J = 246 Hz), 160,8 (d, J = 6 Hz), 150,2, 133,04 (d, J = 10 Hz), 131,96 (d, J = 8 Hz), 123,1, 116,83, 109,2, 109,0, 108,20 (d, J = 3 Hz), 56,8. HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C21H15F2N3O+H+: 364,1261, encontrado: 364,1256, Pureza HPLC: >97%.
4-[2-(2-bromo-6-fluorofenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-/'m/'dazo/-5(4)-il]piridina (ZQX-21)
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)etano-1,2-diona (40 mg, 0,18 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (140,0 mg, 1,8 mmoles, 10 equiv.) y 2-cloro-6-bromobenzaldehído (43 mg, 0,20 mmoles, 1,1 equiv.) en ácido acético glacial (5 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-21 como un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 37% (25 mg). R f = 0,2 (diclorometano/metanol 20:1); p.f.: 266-268°C. RMN 1H (400 MHz CD3OD) 5 8,45 (d, J = 4,6 Hz, 2H), 7,66-7,59 (m, 1H), 7,59 - 7,44 (m, 5H), 7,37 - 7,30 (m, 1H), 7,21 (t aparente, J = 8,7 Hz, 2H); RMN 13C (100 MHz CD3OD) 5 164,39 (d, J = 245,9 Hz), 162,89 (d, J = 250,2 Hz), 150,27, 142,16, 133,95 (d, J = 9,2 Hz), 131,91 (d, J = 8,4 Hz), 130,06 (d, J = 3,6 Hz), 126,15 (d, J = 2,2 Hz), 123,23, 122,04, 122,14 (d, J = 18,4 Hz), 117,03 (d, J = 22,0 Hz), 116,27, 116,04. HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C2üH12BrF2N3+H+: 412,0261, encontrado: 412,0246, Pureza HPLC: >95%.
4-[2-(2-bromofenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-/'m/'dazo/-5(4)-il]piridina (ZQX-22) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)etano-1,2-diona (40 mg, 0,18 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (140,0 mg, 1,8 mmoles, 10 equiv.) y 2-bromobenzaldehído (25 ml, 0,20 mmoles, 1,1 equiv.) en ácido acético glacial (5 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-22 como un sólido de color blanco con un rendimiento de 34% (24 mg). R f = 0,3 (diclorometano/metanol 20:1). p.f.: 198-200°C. RMN 1H (400 MHz CD3OD) 58,44 (d, J = 5,4 Hz, 2H), 7,77 (dd, J = 8,0, 1,1 Hz, 1H), 7,69 (dd, J = 7,6, 1,7 Hz, 1H), 7,56-7,49 (m, 5H), 7,43-7,39 (m, 1H), 7,20 (t aparente, J = 8,8 Hz, 2H);
RMN 13C (100 MHz CD3OD) 5164,36 (d, J = 246 Hz), 150,21,148,04, 134,54, 133,08, 132,33, 132,02, 131,94, 128,77, 123,74, 123,13, 117,09, 116,87. HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C20H13BrFN3+H+: 394,0355, encontrado: 394,0340, Pureza HPLC: >96%.
4-[2-(2H-1,3-benzodioxol-5-il)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-/'m/'cfazo/-5(4)-il]piridina (ZQX-23) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)etano-1,2-diona (40 mg, 0,18 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (140,0 mg, 1,8 mmoles, 10 equiv.) y piperonal (32 mg, 0,20 mmoles, 1,1 equiv.) en ácido acético glacial (5 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-23 como un sólido de color amarillo con un rendimiento de 56% (35 mg). R f = 0,2 (diclorometano/metanol 20:1). p.f.: 260-262°C. RMN 1H (400 MHz CD3OD) 58,43 (d, J = 5,1 Hz, 2H), 7,54-7,49 (m, 4H), 7,20 (t aparente, J = 8,7 Hz, 2H), 6,94 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,03 (s, 2H). RMN 13C (100 MHz, CDCh) 5 164.01 (d, J = 246 Hz), 149,86, 149,38, 149,06, 131,76 (d, J = 8,2 Hz), 129,51, 124,58, 121,16, 116,73(d, J = 21 Hz), 109,36, 107,24, 102,56. HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C21H14FN3O2+H+: 360.1182, encontrado: 360.1139, Pureza Hp LC: >96%.
4-[2-(2-cloro-6-nitrofenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-/'m/'dazo/-5(4)-il]piridina (ZQX-25) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el método general para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)etano-1,2-diona (40 mg, 0,18 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (140,0 mg, 1,8 mmoles, 10 equiv.) y 2-cloro-6-nitrobenzaldehído (40 mg, 0,20 mmoles, 1,1 equiv.) en ácido acético glacial (5 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-25 como un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 58% (40 mg). R f = 0,2 (diclorometano/metanol 20:1). p.f.: 268-270°C. RMN 1H (400 MHz CD3OD) 5 8,44 (s, 2H), 8,12 (dd, J = 8,2, 0,9 Hz, 1H), 7,97 (dd, J = 8,2, 0,9 Hz, 1H), 7,78 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 7,56-7,50 (m, 4H), 7,24 - 7,18 (m, 2H); RMN 13C (100 MHz, Acetona-Da) 5 163,62 (d, J = 245 Hz), 152,47, 150,78, 140,39, 136,69, 134,81, 132,53, 131,52, 126,03, 123,92, 121,97, 116,77, 116,56. HRMS-ESI m/z [M+H]+ calculado para C20H12CFN 4O2+H+: 395,0711, encontrado: 395,0720, Pureza HPLC: >97%.
2-[4(5)-(4-fluorofenil)-5(4)-(piridin-4-il)-1H-/m/dazo/-2-il]-3,5-dimetoxifenol (ZQX-26) - ejemplo comparativo
Sintetizado según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)etano-1,2-diona (40 mg, 0,18 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (140,0 mg, 1,8 mmoles, 10 equiv.) y 2-hidroxi-4,6-dimetoxibenzaldehído (40 mg, 0,20 mmoles, 1,1 equiv.) en ácido acético glacial (5 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-26 como un sólido de color amarillo con un rendimiento de 44% (30 mg). R f = 0,2 (diclorometano/metanol 20:1). p.f.: 204-206°C. RMN 1H (400 MHz CD3OD) 58,41 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,56 - 7,53 (m, 2H), 7,51- 7,49 (m, 2H), 7,22 (t aparente, J = 8,0 Hz, 2H), 6,21 (dd, J = 12,3, 2,3 Hz, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,82 (s, 3H). RMN 13C (100 MHz CD3OD) 5 164,47 (d, J = 245 Hz), 163,50, 161,76, 159,78, 150,13, 147,21, 132,37, 122,59, 117,03, 116,81,97,03, 95,38, 91,17, 56,37, 55,86. HRMS-ESI miz [M+H]+ calculado para C22HibFN303+H+: 392,1410, encontrado: 392,1405, Pureza HPLC: >97%.
4-[4(5)-(4-fluorofenil)-2-(2-nitrofenil)-1 H-imidazol-5(4)-ií\piridina (ZQX-27) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)etano-1,2-diona (100 mg, 0,44 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (342,0 mg, 4,4 mmoles, 10 equivalentes) y 2-nitrobenzaldehído (80 mg, 0,53 mmoles, 1,2 equivalentes) en ácido acético glacial (5 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometanoimetanol 20:1) proporcionó ZQX-27 como un sólido de color amarillo con un rendimiento de 34% (53,8 mg). R f = 0,2 (diclorometanoimetanol 20:1). p.f.: 227-2300C. RMN 1H (400 MHz CD3OD) 58,43 (s, 2H), 8,09 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,86 - 7,80 (m, 2H), 7,74 -7,70 (m, 1H), 7,55 - 7,52 (m, 4H), 7,21 (t aparente, J = 8,3 Hz, 2H). RMN 13C (100 MHz, CDCL) 5 163,49 (d, J = 247 Hz), 149,30, 148,92, 144,03, 133,47, 132,22, 131,14, 131,06, 130,83, 125,50, 125,22, 122,32, 116,55, 116,33. MS-ESI miz [M+H]+calculado para C20H13FN4O2 : 360,1, encontrado: 361,4, Pureza HPLC: >97%.
4-[2-(2,6-dimetilfenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imicfazol-5(4)-il\piridina (ZQX-28) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)etano-1,2-diona (85 mg, 0,37 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (288 mg, 3,7 mmoles, 10 equivalentes) y 2,6-dimetilbenzaldehído (60 mg, 0,45 mmoles, 1,2 equivalentes) en ácido acético glacial (5 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometanoimetanol 20:1) proporcionó ZQX-28 como un sólido de color rojo claro con un rendimiento de 40,5% (50 mg). R f = 0,2 (diclorometanoimetanol 20:1). p.f.: 285-2870C. RMN 1H (400 MHz CD3OD) 5 8,42 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,56 - 7,52 (m, 4H), 7,31 -7,27 (m, 1H) 7,22-7,16 (m, 4H), 2,24 (s, 6H). RMN 13C (100 MHz CD3OD) 5 164,25 (d, J = 245 Hz), 150,23, 148,59, 143,46, 139,67, 131,82 (d, J = 8,2 Hz), 130,73, 128,51, 122,95, 116,98 (d, J = 22Hz), 20.21. MS-ESI miz [M+H]+ calculado para C22H18FN3 : 343,2, encontrado: 344,1, Pureza h Pl C: >99%.
4-[4(5)-(4-fluorofenil)-2-(2-metilfenil)-1 H-imidazol-5(4)-il\piridina(ZQX-29) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)etano-1,2-diona (58 mg, 0,26 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (202 mg, 2,6 mmoles, 10 equiv.) y 2-metilbenzaldehído (40 mg, 0,31 mmoles, 1,2 equiv.) en ácido acético glacial (5 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometanoimetanol 20:1) proporcionó ZQX-29 como un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 21% (18 mg). R f = 0,2 (diclorometanoimetanol 20:1); p.f.: 218-2190C. RMN 1H (400 MHz CD3OD) 58,43 (s, 2H), 7,58-7,53 (m, 5H), 7,38 - 7,30 (m, 3H), 7,20 (aparente, J = 8,7 Hz, 2H), 2,54 (s, 3H). RMN 13C (100 MHz CD3OD) 5 164,32 (d, J = 245 Hz), 150,17, 149,62, 138,53, 132,03, 131,96, 131,18, 130,64 (d, J = 11,2 Hz), 126,99, 123,06, 116,94 (d, J = 22 Hz), 20,55. MS-ESI miz [M+H]+ calculado para C21H16FN3 : 329,1, encontrado: 330,4, Pureza Hp Lc : >97%.
4-[2-(2-fluoro-6-yodofenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il\piridina (ZQX-30)
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)etano-1,2-diona (64 mg, 0,28 mmoles, 1 equivalente), NH4OAc (218 mg, 2,8 mmoles, 10 equivalentes) y 2-fluoro-6-yodobenzaldehído (84 mg, 0,34 mmoles, 1,2 equivalentes) en ácido acético glacial (5 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometanoimetanol 20:1) proporcionó ZQX-30 como un sólido de color amarillo claro con un rendimiento de 16% (20 mg). R f = 0,2 (diclorometanoimetanol 20:1); p.f.: 250-2530C. RMN 1H (400 MHz CD3ODiCDCl3 1:1) 5 8,40 (s, 2H), 7,78 - 7,76 (m, 1H), 7,54 - 7,47 (m, 4H), 7,22 - 7,17 (m, 2H), 7,11 (t aparente, J = 8 Hz). RMN 13C (100 MHz CD3OD) 5 163,26 (d, J = 247 Hz) 160,96 (d, J = 252 Hz), 148,88, 143,31, 135,54 (d, J = 3,6 Hz), 133,03 (d, J = 8,7 Hz), 130,88 (d, J = 8,2 Hz), 124,95 (d, J = 17,4 Hz), 122,30, 116,40, 116,19, 116,12, 115,90, 99,81. MS-ESI miz [M+H]+ calculado para C20H12F2 IN3 : 459,0, encontrado: 460,2, Pureza HPLC: >97%.
4-[2-(2-aminofenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5(4)-il\piridina (ZQX-31) - ejemplo comparativo
A una solución de ZQX-27 (30 mg, 0,08 mol) en metanol y DCM (1:1,5 ml) se le añadió paladio sobre carbón vegetal (10%, 6 mg) bajo la protección de N2. Se introdujo gas hidrógeno en la solución a través de un balón y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. La mezcla de reacción se filtró sobre celite y se eliminó el metanol a vacío para proporcionar el producto bruto. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice proporcionó ZQX-31 como aceite de color amarillo claro con un rendimiento de 57% (15 mg). R f = 0,4 (diclorometanoimetanol 20:1). RMN 1H (400 MHz CD3ODiCDCl3 1:1) 5 8,32 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 7,64 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 7,57 (dd, J = 7,9, 1,2 Hz, 1H), 7,48 - 7,44 (m, 2H), 7,13 - 7,08 (m, 3H), 6,78 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,71 - 6,67 (m, 1H). RMN 13C (100 MHz CD3ODiCDCl3 1:1) 5 163,46 (d, J = 248 Hz), 148,66, 146,36, 146,04, 131,24 (d, J = 8,3 Hz), 130,31, 126,84, 121,88, 117,57, 117,26, 116,45 (d, J = 21 Hz), 112,49. MS-ESI miz [M+H]+ calculado para C20H15FN4 : 330,1, encontrado: 331,4, Pureza HPLC: >97%.
-[2-(2-metoxi-5-nitrofenil)-4(5)-(4-fluorofenil)-1 H-imidazol-5(4)-il\piridina (ZQX-32) - ejemplo comparativo
Sintetizada según el método general A para imidazoles 2,4,5-trisustituidos. Una solución de 1-(4-fluorofenil)-2(pir¡d¡n-4-¡l)etano-1,2-diona (40 mg, 0,17 mmoles, 1 equivalente), NhUOAc (140 mg, 1,7 mmoles, 10 equiv.) y 2-metoxil-5-nitrobenzaldehído (40 mg, 0,20 mmoles, 1,2 equiv.) en ácido acético glacial (5 ml) se agitó a 115°C durante la noche. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice (diclorometano/metanol 20:1) proporcionó ZQX-32 como aceite de color amarillo claro con un rendimiento de 57% (38 mg). R f = 0,3 (diclorometano/metanol 20:1). RMN 1H (400 MHz CD3OD) 59.01 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 8,46 (s, 2H), 8,31 (dd, J = 9,2, 2,8 Hz, 1H), 7,78 (s, 2H), 7,56-7,53 (m, 3H), 7,28 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,22 (t aparente, J = 8,6 Hz, 2H), 4,11 (s, 4H). RMN 13C (100 MHz CD3OD) 5 164,21 (d, J = 248 Hz) 161,91, 146,32, 144,29, 142,58, 131,96 (d, J = 8,4 Hz), 126,91, 125,81, 119,69, 117,03, 116,81, 112,64, 57,21. MS-ESI m /z [M+H]+ calculado para C21H15FN4O3 : 390,1, encontrado: 391,1; Pureza HPLC: >96%.
Se utilizaron compuestos comerciales conocidos como se muestra en la Tabla 1
[Tabla 1]
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Ejemplo 3: Ensayo de quinasa para determinar valores de CI50 frente a la proteína quinasa activada por mitógeno p38alfa (p38a MAPK), caseína quinasa 1 épsilon (CK1e) y 1 delta (CK15)
Se determinaron los valores de CI50 de p38 MAPK de compuestos seleccionados, excepto IM-32 a IM-44, utilizando el ensayo de unión de p38 MAP quinasa HitHunter™ de DiscoverRx Corporation (Fremont, CA, EE. UU.). Se determinaron los valores de CI50 de p38 MAPK de IM-32 a IM-44 y los valores de CI50 de CK1 de los compuestos seleccionados utilizando el ensayo de unión de Eu quinasa LanthaScreen™ de Invitrogen (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Los ensayos se realizaron siguiendo los protocolos de los fabricantes en placas de color blanco de 384 pocillos (Núm. de Cat. 3572; Corning Incorporated, Corning, NY, EE. UU.). Se utilizó SB203580 como control en todos los ensayos. Para el ensayo de unión de p38 MAP quinasa HitHunter™ los compuestos se disolvieron en DMSO (soluciones de partida 5 mM) y se diluyeron hasta una concentración final de 2% de DMSO (vol/vol) para todos los ensayos. Se utilizó la enzima p38a m A p quinasa activa recombinante etiquetada con GST (Millipore, Billerica, MA, EE. Uu .) para el ensayo de unión de p38 MAP quinasa HitHunter™. Para el ensayo de unión de Eu quinasa Lantha Screen™ los compuestos se disolvieron en DMSO (soluciones de partida 5 mM) y se diluyeron a una concentración final de 1% de DMSO (vol/vol) para todos los ensayos. Cada punto de datos se realizó por triplicado. El ensayo se realizó con la Estación de T rabajo Automatizada JANUS de acuerdo con el protocolo desarrollado con el soporte lógico WinPREP (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, EE. UU.). Se utilizó un lector de microplacas M1000 Tecan Infinite® (Tecan Group Ltd., Mannedorf, Suiza) para las mediciones de luminiscencia (ensayo de unión de p38 MAP quinasa HitHunter™) y mediciones de fluorescencia (ensayo de unión de Eu quinasa;LanthaScreen™ ex = 340 nm, em = 665, 615 nm). Todo el análisis de datos se realizó utilizando el soporte lógico GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.). Las curvas de inhibición y los valores CI50 se generaron mediante análisis de regresión no lineal y los datos representan la media ± ETM.
La Tabla 2 muestra las estructuras de los compuestos de azol 2,4,5-tri-sustituidos sintetizados u obtenidos como se menciona en el Ejemplo 2 (los compuestos publicados anteriormente se indican con *) y sus valores CI50 frente a p38a MAPK, CK15 y CK1s. Se resumen los valores de CI50 in vitro de los compuestos sintetizados frente a las dianas de quinasa relevantes. Los valores de CI50 se determinaron utilizando el ensayo de unión de p38 MAPK HitHunter™ de DiscoverRx o el ensayo de unión de Eu quinasa LanthaScreen™ (para p38alfa MAPK, CK1delta y CK1épsilon) de Invitrogen.
[Tabla 2]
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Ejemplo 4: Diferenciación de cardiom iocitos con compuestos de azol 2,4,5-tri-sustituidos
Los estudios iniciales con los compuestos de azol 2,4,5-tri-sustituidos se realizaron a una concentración fija de 5 pM. Las 44 moléculas pequeñas de la tabla 2 se aplicaron a células hESC3 Nkx2.5eGFP/w después de la formación de CE hasta el día 8 de diferenciación. El día 16 de diferenciación, los CE se disociaron y analizaron con citometría de flujo para determinar la expresión de la proteína de fluorescencia verde (GFP) como marcador de la diferenciación de los cardiomiocitos. Los resultados obtenidos se presentan como multiplicidad de GFP sobre el control de DMSO en la Figura 6a, donde 1 representa un efecto similar a DMSO. Solo los compuestos para los que la multiplicidad de expresión de GFP sobre DMSO excedía de 2 son significativamente cardiogénicos. El escrutinio inicial identificó un compuesto novedoso (IM-30) con propiedades cardiogénicas similares a las de SB203580 y SB202190, que son compuestos establecidos para la diferenciación de cardiomiocitos. Curiosamente, un compuesto muy similar, IM-31, mostró una inhibición completa del desarrollo de cardiomiocitos. La fiabilidad de la expresión de GFP como marcador de cardiomiocitos se confirmó mediante tinción conjunta con anticuerpos de cardiomiocitos tales como contra troponina T (Figura 6b). La solidez del protocolo de diferenciación se demostró con una línea de células madre embrionarias humanas adicional hESC7 (Figura 6c) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) (Figura 6d). La tinción de citoinmunofluorescencia de los CE del día 16 obtenidos a partir de hiPSC y cultivados en placas de unión mostró marcadores cardiovasculares característicos de los típicos sarcómeros de actina cardíaca del citoesqueleto, tales como troponina T (cTnT), cadena ligera de miosina 2a (MLC2a) y actinina sarcomérica (SA). El origen del mesodermo se confirmó con el marcador nuclear MEF2C (Figura 6e).
La diferenciación de cardiomiocitos también se repitió con una selección de moléculas pequeñas en un rango de concentración de 0,5 a 20 pM (Figura 6f). Los resultados mostraron que IM-31 puede inducir la diferenciación de cardiomiocitos, cuando se aplica a una dosis más baja. Además, los autores de la presente invención mostraron que 1 pM de IM-31 tiene el mismo efecto cardiogénico que 5 pM de SB203580 (Figura 6g). IM-31 se puede aplicar a una concentración 5 veces menor que otros análogos de SB203580 comparables para inducir la diferenciación de cardiomiocitos. Por lo tanto, IM-31 es el compuesto más potente según la invención.
Además, un estudio del curso del tiempo del proceso de diferenciación mostró que los compuestos probados se pueden aplicar entre los días 1 y 8 o incluso de manera más efectiva entre los días 4 y 8 (Figura 6h). El ejemplo incluía imidazoles 2,4,5-tri-sustituidos (SB203580, D4476, IM-...) y tiazol (TAK715). El estudio del curso del tiempo reveló varios compuestos falsos negativos, tales como IM-31, TAK715 y D4476, ya que no lograron inducir la cardiomiogénesis cuando se aplicaron a una concentración de 5 pM entre los días 1 y 8, pero resultaron ser buenos inductores cuando se aplicaron a la misma concentración entre los días 4-8. Un marco temporal establecido entre los días 4 y 8 permite probar una gama más amplia de compuestos sin cambiar la concentración de los compuestos. Esta es una gran ventaja, que reducirá el número de experimentos a una concentración y un curso de tiempo para investigar las correlaciones entre el efecto de un compuesto in vitro sobre una o varias proteínas diana y su actividad cardiomiogénica. Por otra parte, el efecto de los azoles 2,4,5-tri-sustituidos sobre la cardiomiogénesis en el curso del tiempo de los días 4-8 indica que se puede influir en el desarrollo tardío (post-mesodermo) de los cardiomiocitos con el método según la invención.
Ejemplo 5: Correlación de los valores IC50 de CK1 con la diferenciación de cardiom iocitos
Se probaron moléculas pequeñas para determinar sus actividades inhibidoras frente a la caseína quinasa 1 delta (CK15) y 1 épsilon (CK1s). Se utilizó el ensayo de unión de Eu quinasa LanthaScreen in vitro para determinar los valores de CI50 para 15 de los compuestos sintetizados y 5 inhibidores comerciales incluyendo SB203580 (Tabla 3). Los compuestos probados mostraron una amplia gama de afinidad entre 6,8 nM (alta afinidad = inhibición fuerte) y valores superiores a 1000 nM (afinidad baja = inhibición muy débil). Adicionalmente, la lista incluye azol 2,4,5-trisustituido de tres clases, tiazol (TAK-715), oxazoles (OZ-06, OZ-12) e imidazoles (todos los demás compuestos). Estos compuestos seleccionados se usaron para diferenciar hESC3 a dosis fijas de 5 pM y se aplicaron durante el proceso de diferenciación entre los días 4-8. Las tres clases de azol 2,4,5-tri-sustituido pueden inducir la diferenciación cardíaca (Figura 7a). La expresión de GFP de Nkx2.5 el día 11 se midió con citometría de flujo y se comparó con el control de DMSO. Los valores se expresan como multiplicidad sobre el control de DMSO (Figura 7a). Resultados de la Figura 7a (valores CI50 de CK1s/5) y la Figura 7b (multiplicidad de expresión de GFP sobre DMSO) se representaron entre sí en la Figura 7b. Se muestra una fuerte correlación entre la afinidad de CK15/s y los resultados de diferenciación con un ajuste de curva logarítmica. Los autores de la presente invención muestran aquí que la inhibición de CK1 se correlaciona con la diferenciación de cardiomiocitos.
La Tabla 3 muestra la diferenciación de hESC3 a cardiomiocitos con 20 moléculas pequeñas para las que se determinaron los valores de CI50 de CK1 utilizando un ensayo de unión de Eu quinasa LanthaScreen.
[Tabla 3]
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Ejemplo 6: Producción de alto rendimiento de cardiom iocitos
Para investigar si la producción de cardiomiocitos podría mejorarse aún más, se sembraron H3 hESC Nkx2.5eGFP/w a 2,5 x 106 células/pocillo de 12-ULA y se trataron con CHIR99021 3 pM durante 24 h. A continuación, se cambió el medio y se añadieron las moléculas pequeñas SB203580, IM-30 e IM-31 en dos cursos de tiempo separados, uno de los días 1 a 8 y el otro de los días 4 a 8 a una concentración 5 pM. También se añadió un inhibidor de Wnt conocido, IWP-2, en un curso de tiempo desde los días 4-8 a la misma concentración. Los cardiomiocitos generados el día 11 se analizaron con citometría de flujo y mostraron una población promedio de 30% de Nkx2.5 para el tratamiento solo con CHIR99021 y una población de 50% de Nkx2.5 cuando se combinó con moléculas pequeñas (Figura 8a, izquierda). El recuento total de células mostró que la combinación de CHIR99021 e IM-31 (aplicada en el curso de tiempo tardío de los días 4-8) tiene el mayor efecto sobre la expansión celular (aumento de 2 veces, Figura 8a, centro). El rendimiento de cardiomiocitos que se muestra en la Figura 8a, a la derecha, se calculó según la siguiente ecuación.
[Ecuación 1]
número de células día 11 * porcentaj e de cardiomiocitos (GFP)día 11 rendimiento =
número de siembra inicial
Los resultados mostraron que el uso de CHIR99021 e IM-31 (4 a 8 días) proporcionó el mejor rendimiento de cardiomiocitos el día 11, donde se obtuvieron casi 1,2 cardiomiocitos por hESC sembrada (Figura 8a, derecha). La combinación de IM-31 con CHIR99021 mostró un aumento del doble en la producción de cardiomiocitos en comparación con otros compuestos inhibidores de Wnt tales como IWP-2. IWP-2 mostró expresiones de Nkx2.5 comparables, pero un crecimiento celular fuertemente reducido (Figura 8a, centro y 8a, derecha). IM-31 no solo es un inductor cardíaco, sino que al mismo tiempo promueve el crecimiento celular.
Los cuerpos embrioides diferenciados también se analizaron visualmente para determinar la funcionalidad de los cardiomiocitos utilizando parámetros tales como el recuento de latidos (porcentaje de CE que muestran movimientos de contracción dentro de un marco de tiempo de 10 s), área de latido (mm2), y frecuencia de latido (s-1 contracción de CE medida dentro de un marco de tiempo de 10 s, Figura 8b). Los análisis de funcionalidad muestran resultados similares para tratamiento solo con CHIR99021 y tratamientos con CHIR99021 con SB203580 (días 1-8) o IM-31 (días 4-8). Con estos tratamientos, los recuentos de latidos superaron 75% con área de latido >5 mm2 y mostraron una frecuencia de latido promedio de 25-30 latidos por minuto (0,5 s-1). Sin embargo, la combinación de CHIR99021 e IWP-2 mostró una funcionalidad reducida en comparación con el resto. IM-31 (días 1 -8) mostró inhibición del desarrollo de cardiomiocitos, lo que está en línea con observaciones anteriores de que IM-31 aplicado a 5 pM entre los días 1-8 inhibe la cardiomiogénesis. Los resultados verifican una alta funcionalidad de los cardiomiocitos generados.
Ejemplo 7: Producción alternativa de alto rendimiento de cardiom iocitos
Los estudios con los compuestos de azol 2,4,5-tri-sustituidos se realizaron a una concentración fija de 5 pM el día de inducción 2 y, alternativamente, el día 3. Las moléculas pequeñas de la Tabla 4 (también se muestran las estructuras y afinidades de la quinasa CK1 5 de las moléculas) se aplicaron a células hESC3 Nkx2.5eGFP/w después de 24 h de formación de CE con CHIR99021 6 pM hasta el día 6 de diferenciación. El día 14 de la diferenciación, los CE se analizaron visualmente para determinar la diferenciación de cardiomiocitos. El área (pm2) de expresión de la proteína de fluorescencia verde (GFP) se midió frente al tamaño total (pm2) del cuerpo embrioide. La razón de estas medidas indica el porcentaje de cardiomiocitos generados (Tabla 5). El escrutinio inicial identificó compuestos novedosos (TA-01, ZQX-19 y TA-02, ZQX-20) con propiedades cardiogénicas más altas que SB203580 e IWP-2, que son compuestos establecidos para la diferenciación de cardiomiocitos en un curso de tiempo específico (Figura 9). La solidez del protocolo de diferenciación, la expresión del marcador cardíaco y el crecimiento celular, se demostraron con una línea adicional de células madre embrionarias humanas H7 y 2 células madre pluripotentes inducidas humanas (IMR-90, Donor 11) (Figura 10). La transferencia de tecnología de IM-31 (TA-01) de la diferenciación de cuerpos embrioides a la diferenciación de plataformas de microportadores es factible y puede producir las mismas cantidades de cardiomiocitos (número de células) en comparación con IWP-2, que es un compuesto establecido para la diferenciación de cardiomiocitos (Figura 11a, b y c).
[Tabla 4]
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[Tabla 5]
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Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos ilustran una realización divulgada y sirven para explicar los principios de la realización divulgada. Sin embargo, debe entenderse que los dibujos están diseñados únicamente con fines ilustrativos y no como una definición de los límites de la invención.
Fig. 1
La [Fig. 1] muestra las estructuras generales de los compuestos de azol 2,4,5-tri-sustituidos sintetizados Fig. 2
La [Fig. 2] muestra la ruta de síntesis esquemática de los imidazoles 1a - 1c, así como los imidazoles ZQX-14-23 y ZQX-25-32.
Fig. 3
La [Fig. 3] muestra la ruta de síntesis esquemática de los imidazoles 2f-2t.
Fig. 4
La [Fig. 4] muestra la ruta de síntesis esquemática de los imidazoles 3b - 3f y 4b - 4k.
Fig. 5
La [Fig. 5] muestra la ruta de síntesis esquemática de los oxazoles 5a y 5b.
Fig. 6a
La [Fig. 6a] muestra la diferenciación de las hESC con las 44 moléculas pequeñas.
Fig. 6b
La [Fig. 6b] muestra la tinción conjunta de la expresión de la proteína de fluorescencia verde y el marcador cardíaco troponina T en hESC3.
Fig. 6c
La [Fig. 6c] muestra la diferenciación de hESC7.
Fig. 6d
La [Fig. 6d] muestra la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas.
Fig. 6e
La [Fig. 6e] muestra una tinción IF de células madre pluripotentes inducidas humanas diferenciadas.
Fig. 6f
La [Fig. 6f] muestra la diferenciación dependiente de la dosis de hESC3 con moléculas pequeñas a diferentes concentraciones (pM).
Fig. 6g
La [Fig. 6(g)] muestra la expresión de Nkx2.5 de hESC3 tratadas con IM-31 (1 pM), IM-30 y SB203580 (5 pM). Fig. 6h
La [Fig. 6(h)] muestra la diferenciación dependiente del curso del tiempo de hESC3 con moléculas pequeñas.
Figura 7a y b
Las [Fig. 7a y b] muestran una correlación entre la inhibición de CK1 y la cardiomiogénesis.
Fig. 8a y B
Las [Fig. 8a y b] muestran una alta eficiencia en la diferenciación de cardiomiocitos.
Fig. 9
La [Fig. 9] combinada con la Tabla 4 muestra la dependencia del tiempo de azoles 2,4,5-tri-sustituidos con CHIR99021 para la diferenciación de cardiomiocitos.
Fig. 10
La [Fig. 10] muestra la solidez de las células madre para la diferenciación de cardiomiocitos de alta eficiencia con células madre pluripotentes inducidas humanas 3.
Fig. 11a, b y c
La [Fig. 11a] muestra la aplicación técnica de IM-31 (TA-01) en tecnologías de plataforma de microportadores para diferenciación cardíaca a gran escala
La [Fig. 11b] muestra la pluripotencia de células madre en tecnologías de plataforma de microportadores antes de la diferenciación
La [Fig. 11c] muestra la eficiencia de diferenciación cardíaca de IM-31 (TA-01) en tecnologías de plataforma de microportadores
Descripción detallada de los dibujos
Haciendo referencia a la Fig. 6, se muestra en detalle la diferenciación de células madre pluripotentes a cardiomiocitos con moléculas pequeñas. Los dibujos se explican con más detalle: (a) Diferenciación de hESC3 a cardiomiocitos con 44 compuestos a 5 pM aplicados entre los días 1 y 8 durante la diferenciación. (b) Expresión de la proteína de fluorescencia verde (GFP) en Nkx2.5 medida con citometría de flujo y comparada con el control de DMSO expresada como multiplicidad sobre DMSO. Los análisis de citometría de flujo representativos con tinción de GFP (verde) y troponina T (rojo2) muestran los valores absolutos de la población cardíaca. La solidez del proceso se demostró con (c) hESC7 y (d) hiPSC. (e) La citoinmunofluorescencia de células diferenciadas muestra segmentos estructurales de los sarcómeros cardíacos con cT nT, MLC2a y actinina sarcomérica (SA), así como el marcador de mesodermo nuclear MEF2c en cuerpos embrioides diferenciados. La tinción nuclear es DAPI. (f) La titulación de moléculas pequeñas seleccionadas durante los días 1-8 del protocolo de diferenciación muestra picos de expresión de GFP dependientes de la concentración e identifica IM-31 como el inductor de cardiomiocitos más fuerte. (g) Los análisis de flujo representativos de IM-31, IM-30 y SB203580 se muestran en el gráfico de puntos del citómetro de flujo. (h) Los resultados de diferenciación del curso de tiempo con compuestos pequeños seleccionados a una inducción de 5 pM durante 24 h, 0-3, 0-8 y 4-8 días ilustran la eficiencia de las moléculas pequeñas en la etapa tardía (post-mesodermo). GFP se midió como multiplicidad sobre el control de DMSO en (a), (f) y (g).
Haciendo referencia a la Fig. 7, los dibujos se explican con más detalle: (a) los compuestos se dosificaron a una concentración 5 pM durante los días 4-8 del proceso de diferenciación. La expresión de la proteína de fluorescencia verde (GFP) se midió con citometría de flujo y se comparó con el control de DMSO que mostró una multiplicidad de aumento sobre DMSO. (b) Los valores de CI50 para CK 1 delta y 1 épsilon de la (Tabla 3) se representaron frente a la multiplicidad de expresión de GFP (a), y se demostró una fuerte correlación.
Con referencia a la Fig. 8a, los dibujos se explican con más detalle: (izquierda) Diferenciación de hESC3 a cardiomiocitos con incubación de 24 h de CHIR99021 3 pM seguida de moléculas pequeñas SB203580, IM-30, IM-31 e IWP-2 a una concentración 5 pM suministradas durante los días 1-8 y los días 4-8 durante un proceso de diferenciación de 11 días. La expresión de la proteína de fluorescencia verde (GFP) medida con citometría de flujo se muestra en porcentaje sobre la población total. (centro) El número de células viables se midió el día 11 después de la disociación de CE con Nucleocounter. (derecha) Rendimientos de cardiomiocitos obtenidos con el protocolo de combinación de moléculas pequeñas. Los valores se calcularon utilizando los datos de citometría de flujo (izquierda) y el recuento de células (centro).
Con referencia a la Fig. 8b, los dibujos se explican con más detalle: Se utilizó un microscopio Nikon Eclipse Ti con un Análisis de Video de Resolución Temporal automatizado para la contracción de cardiomiocitos para calcular el latido y la frecuencia de CE. Las imágenes muestran CE en placas de 12 Pocillos después de 16 días de diferenciación. El porcentaje de CE con latido, así como el área de latido, se calcularon con el soporte lógico analítico y se mostraron en la tabla debajo de las imágenes. La contracción y la frecuencia del latido (s-1) se analizó a partir de una muestra de 16 CE. En la parte inferior de la figura se muestran tres imágenes representativas de un marco de tiempo de 10 s de análisis de video de movimiento contráctil.
Haciendo referencia a la Figura 9, el dibujo muestra que las GFP son mediciones de CE después de 14 días de diferenciación con azoles 2,4,5-trisustituidos inducidos el día 2 o el día 3. Grupos de compuestos (oscuro = día 3 inductores cardíacos altos; menos oscuros, pequeños = inductores cardiacos altos del día 2; color claro = control y otros inhibidores comerciales para la diferenciación cardiaca). El cuadro de color gris significa que no hay una diferencia significativa para controlar en esta área del gráfico.
Con referencia a la Figura 10, la parte superior del dibujo muestra la expresión de marcadores cardíacos (cTnt, MLC2a) de células madre embrionarias humanas diferenciadas (H7) y células madre pluripotentes inducidas (IMR-90, Donor 11) con CHIR99021 e IM-31 (TA-01) el día 14; y la parte inferior muestra el recuento celular de células madre embrionarias humanas diferenciadas (H7) y células madre pluripotentes inducidas (IMR-90, Donor 11) con CHIR99021 e IM-31 (TA-01) el día 14.
Haciendo referencia a la Figura 11a del dibujo, se muestran hPSC expandidas sobre microportadores y diferenciadas en agregados de cardiomiocitos con latido (barra de escala 500 pM); izquierda: HES-3 recién sembradas en microportadores (100 pm de diámetro), centro: expansión de hPSC en microportadores a cuerpos embrioides (500 pm), derecha: diferenciación cardíaca con TA-01 en microportadores a agregados con latido (> 1 mm). La Fig. 11b muestra la expresión de marcadores de pluripotencia de hPSC en microportadores durante la expansión celular, y la Fig. 11c muestra la expresión de marcadores cardíacos (cTnt, MLC2a, MF20) de cuerpos embrioides de microportadores diferenciados con IM-31 (TA-01) e IWP-2 Inhibidor comercial de wnt para la diferenciación cardiaca.
Aplicabilidad Industrial
El método y los compuestos novedosos como se definen anteriormente pueden encontrar un número múltiple de aplicaciones en las que son deseables nuevas formas para la diferenciación eficaz de células madre. Por ejemplo, los métodos definidos anteriormente se pueden usar para proporcionar cardiomiocitos con mayor eficacia utilizando moléculas pequeñas o combinaciones de moléculas pequeñas en diferentes etapas de diferenciación. La invención, que se define en las reivindicaciones, por lo tanto, proporciona un método mejorado y nuevos compuestos para su uso en tales métodos para generar células que pueden utilizarse potencialmente en medicina regenerativa para tratar enfermedades del corazón. Es de importancia tecnológica que se puedan lograr mayores rendimientos de cardiomiocitos con moléculas pequeñas de acuerdo con la invención. Especialmente con el protocolo basado en cuerpos embrioides presentado en cultivo en suspensión, el método de la invención se puede aumentar proporcionalmente para la producción de cardiomiocitos con tecnologías de bioprocesamiento a una magnitud de importancia terapéutica.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para inducir o potenciar la diferenciación de células madre pluripotentes a cardiomiocitos a través de la inhibición de la caseína quinasa 1, comprendiendo dicho método cultivar las células madre en presencia de un medio que comprende un inhibidor de caseína quinasa 1 de fórmula (I) o una de sus sales
[Fórmula (I)]
Figure imgf000037_0001
en donde R1 representa arilo C6 a C10 sustituido con flúor que está opcionalmente sustituido adicionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados entre amino, -COOH, hidroxilo, alquilo C1-C4 , alcoxi C1-C4 , alcoxi(Cr C4)carbonilo, cloro, bromo, yodo, nitro o un puente de -O-alquil(C1-C4)-O-;
R2 representa fenilo sustituido con flúor que está opcionalmente sustituido adicionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados entre amino, -COOH, hidroxilo, alquilo C1-C4 , alcoxi C1-C4 , alcoxi(C1-C4)carbonilo, cloro, bromo, yodo o nitro;
R3 representa heterocicloalquilo saturado de 5 a 6 miembros anulares que tiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N u O, o un radical heteroaromático que tiene de 5 a 6 átomos en el anillo en donde de 1 a 3 átomos son heteroátomos seleccionados entre O y N; y
X representa NH.
2. El método según la reivindicación 1, en donde
R3 representa piridinilo o piranilo; y
X representa NH.
3. El método según la reivindicación 1, en donde el inhibidor de caseína quinasa 1 de fórmula (I) se selecciona entre:
Figure imgf000037_0002
Figure imgf000038_0001
o su sal del mismo.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el inhibidor de la caseína quinasa se añade del día 3 al 8 después de que se haya establecido el mesodermo.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el compuesto CHIR99021 se añade a los cuerpos embrioides antes de que se haya establecido el mesodermo.
6. Un compuesto seleccionado entre los siguientes compuestos, o una de sus sales:
Figure imgf000038_0002
Figure imgf000039_0001
7. Un kit para uso in vitro en la diferenciación de células madre a cardiomiocitos a través de la inhibición de caseína quinasa 1 que comprende un compuesto de la reivindicación 6, o una de sus sales, junto con excipientes.
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