CN104611251B - 一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌及其应用 - Google Patents

一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌及其应用。所述的具有广谱抑菌活性的乳酸菌，命名为唾液乳杆菌GZPH2(Lactobacillus salivarius GZPH2)，于2014年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2014598；本发明提供的乳酸菌唾液乳杆菌GZPH2(Lactobacillus salivarius GZPH2)对多种人和水产养殖生物致病菌均具良好的抑菌作用；且具有不产组胺、不溶血、耐酸、耐胆盐等特性。

Description

一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌及其应用。
背景技术
弧菌(Vibrio)是海洋环境中最为常见的细菌类群之一，广泛存在于海水、海底沉积物及鱼、虾、贝、蟹、海参、海带等等海产品中。《伯杰氏细菌学手册》第8版记载了35种弧菌，它们中相当一部分是水产养殖生物的重要致病菌。在水产业界，由副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌等各种弧菌引发的养殖生物的疾病统称为弧菌病(vibriosis)，它每年给水产业界造成巨大的经济损失。与此同时，部分弧菌也是人类的致病菌。它们不仅能引起人类肠胃炎，还能引起肠道外感染。在食品中，弧菌(Vibrio)、沙门氏菌(Salmonella)、致病性大肠埃希菌(pathogenic Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等一起，成为细菌性食物中毒的主要病源菌。到目前为止，已知的如霍乱弧菌(Vibriocholerae)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、河流弧菌(V.fluvialis)等能引起人的肠胃炎，而创伤弧菌(V.vulnificus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)等引起伤口感染和败血症等肠道外感染。近年来，由致病性弧菌所引起的肠道疾病、传染病和食物中毒发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，超过沙门氏菌食物中毒，跃居细菌性食物中毒事件的首位，成为影响食品安全的重要因素，引起广泛的关注。
防治细菌性疾病最常用的方法是使用抗生素，但长期使用抗生素会导致细菌产生耐药性。因此，抗生素的有效替代品的研究显得尤为迫切。乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一类利用碳水化合物产生乳酸的益生菌的统称。虽然目前已有的研究表明它具有调节机体肠道菌群，保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，增强机体免疫力,提高机体抗病力等功能，有的甚至还可产生具抑菌活性的代谢产物，如乳酸菌肽、细菌素、乳酸、过氧化氢、乙酸等，对一些革兰氏阳性菌如李斯特氏菌等和/或革兰氏阴性菌如大肠杆菌等有一定的抑制作用，但针对乳酸菌抑制弧菌所进行的原创性的科学研究少之又少，基本上只停留在移 植乳酸菌抑菌这一概念而直接应用于水产养殖上。针对既可抑制能引起水产养殖生物致病的弧菌，又能抑制可导致人类食物中毒和/或感染的弧菌等的乳酸菌的创新性研究则更少。
由此可见，研究进而优选具有优良广谱抑菌效果的优良乳酸菌株以抑制可引发水产养殖生物和/或人的病害的弧菌，减少水产业界的损失和人类的感染和/或食物中毒的发生，具有重要的社会意义和经济价值。
唾液乳杆菌是乳酸菌中的一种，为革兰氏阳性菌，分离于健康母亲***或婴儿面部，也可从各年龄段人体肠道、鸡肠道黏膜、发酵食品等中分离取到。它也是2013年***《新食品原料安全性审查管理办法》公布的可用于食品生产的菌种之一。已有研究还表明，唾液乳杆菌具有免疫调节功能、抗炎症和抗感染等特性。但作为益生菌，目前所报道的唾液乳杆菌存在或在低pH下不能生长，或不耐胆盐等缺点。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌。
本发明的另一目的在于提供上述乳酸菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌，名称为唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)GZPH2，于2014年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO： M 2014598；
所述的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2从泡菜中分离纯化得到；
所述的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)GZPH2的培养温度优选为37℃；
培养所述的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)GZPH2的培养基优选为MRS培养基；
所述的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2，具有如下形态特征和生理生化特性：
a、所筛选的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2革兰氏染色为阳性，杆状，无芽孢，无鞭毛；
b、菌落的形态特征为：所述的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2在MRS固体培养基37℃培养24h后，菌落呈乳白色，突起，表面湿润，光滑有光泽， 边缘整齐；
c、主要的生理生化特征如下：过氧化氢酶阴性，硝酸盐还原阴性，产明胶酶阴性，产H2S阴性，利用葡萄糖产酸阳性，利用葡萄糖产气阴性；
所述的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2的16S rDNA序列(5’-3’)如下所示，与唾液乳杆菌模式株(L.salivarius ATCC 11741)的同源性为99％；ACTCTGTCACTTAGACGGCTGGCTCCTTGCGGTTACCCCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATGCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTAAACCTCGCGGTCTTGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTGGTCACCGGCAGTCTCGCCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGACAACAAGGGTTGCGCTCGTAGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCACTTTGTCCCCGAAAGGGAAAACCTAATAACCTTAGGTGGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTAGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGAGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTATTGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGAACCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCTCTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTTCCAGTTTCCAATGCACTACTCCGGCTAAGCCGAAAGCTTTCACATCAGACTTAAAAGACCGCCTGCGTTCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTAGCCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTGCTGGTTAGATACCGTCATCGAATGAACAGTTACTCTCACTCGTGGTTCTTTCTCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAGACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATCACCTTGGTAGGCCGTTACCCCACCAACTAGTTAATACGCCGCGGGTCCATCTAAAAGCGATAGCAGAACCATCTTTCATCTAAGGATCATGCGATCCTTAGAGATATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTTCTTTTAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCAACTTCTTACGATGAATGCAAGCATTCGGTGTAAGAAAGTTTCGTTCGACTGCATGTATAGCACGCGCCCTGCA
所述的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2既能抑制可引发人感染和食物中毒的弧菌，又可抑制会引发水产养殖生物病害的弧菌，同时对其他食源性致病菌同样具有很好的抑菌作用，可广泛应用于微生物制剂领域和食品发酵工业领域，也可用于制备抑菌剂或防腐剂。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一株具有广谱抑菌活性的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2；
(2)本发明提供的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2既能抑制可引发人感染和食物中毒的弧菌，又可抑制会引发水产养殖生物病害的弧菌，同时对其他食源性致病菌也具有很好的抑菌作用；
(3)本发明提供的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2具有不产组胺、不溶血、耐酸、耐胆盐等特性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中涉及到的培养基：
MRS(de Man-Rogosa-Sharpe)液体培养基的配方(g/L)：酪蛋白酶消化物10；牛肉膏粉10；酵母膏粉4；柠檬酸三铵2；乙酸钠5；硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.2；硫酸锰(MnSO4.4H2O)0.05；柠檬酸二钾2；葡萄糖20；吐温-801.08；最终pH5.7±0.2；
MRS固体培养基配方：MRS液体培养基中加入质量比为1.5％的琼脂粉，最终pH5.7±0.2；
血平板的配方：血平板成品培养基(羊血)，成品购于广东环凯生物有限公司。
营养肉汤液体培养基配方(g/L)：蛋白胨10；牛肉膏粉3；氯化钠5，最终pH7.4±0.2；
营养肉汤固体培养基配方：营养肉汤液体培养基中加入质量比为1.5％的琼脂粉，最终pH7.4±0.2。
本实施例中39株指示菌中，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)AS1.1865、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)AS 1.2420和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)CMCC 50115购买于中国普通微生物保藏管理中心；
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)ATCC 43305、河流弧菌(Vibrio fluvialis)ATCC33809、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)(tdh+)ATCC17802购于美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)；
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)1、溶藻弧菌(V.alginolyticus)2、溶藻弧菌(V.alginolyticus)3、溶藻弧菌(V.alginolyticus)4、霍乱弧菌(V.cholera)6、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)8、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)9、溶藻弧菌(V.alginolyticus)10、溶藻弧菌(V.alginolyticus)11、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)12、溶藻弧菌(V.alginolyticus)13、气味沙雷菌(Serratia ficaria)15、溶藻弧菌(V.alginolyticus)16、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)17、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)18、溶藻弧菌(V.alginolyticus)19、气味沙雷菌(Serratia ficaria)20、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)21、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)22、溶藻弧菌(V.alginolyticus)23、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)24、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)25、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)26、腐败希瓦氏菌(Sh.putrefaciens)27、腐败希瓦氏菌(Sh.putrefaciens)28、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)29、成团泛菌(Pantoea agglomerans)30、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)31、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)33、腐败希瓦氏菌(Sh.putrefaciens)34、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)35由华南理工大学轻工与食品学院提供(biological characterization of two marine bdellovibrio-and-likeorganisms isolated from Daya bay of Shenzhen,China and their application inthe elimination of Vibrio parahaemolyticus in oyster[J].Li H,Liu C,Chen L etal.International Journal of Food Microbiology,2011,151:36–43.)；
雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)32由华南理工大学轻工与食品学院提供(The protective effect of bdellovibrio-and-like organisms(BALO)on tilapiafish fillets against Salmonella enterica ssp.enterica serovar Typhimurium[J].Lu F,Cai J.Letters in Applied Microbiology,2010,51:625–631.)；
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)MVM425由华东理工大学生物反应器国家重点实验室赠送(海洋鱼类致病菌鳗弧菌MVM425毒力质粒pEIB1复制区域的最小化分析[J].吴海珍，张惠展,李刚,叶江,马悦,张元兴.食品与药品,2007, 04:1-4.)
实施例1唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2的筛选、驯化和分离
从广州集市随机购买泡菜样品，取样品液体1mL加入无菌处理的50mL MRS液体(添加终质量分数为0.05％的CaCO3)，150r/min 37℃富集培养12h；取富集液用无菌生理盐水稀释到10-8，各稀释梯度依次涂平板，37℃培养24h，选择单菌落数为30～300的平板，且选取菌落周围有明显碳酸钙溶解圈的单菌落，接种针挑取相应单菌落至MRS固体培养基三区交叉划线，直至出现的单菌落大小均一，选择革兰氏染色为紫色(阳性)，染色菌体形态大小均一的单菌落，初步确认为乳酸菌，并进行菌种鉴定；
将纯化得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：
a、所筛选的乳酸菌革兰氏染色为阳性，杆状，无芽孢，无鞭毛；
b、菌落的形态特征为：在MRS固体培养基37℃培养24h后，菌落呈乳白色，突起，表面湿润，光滑有光泽，边缘整齐；
c、主要的生理生化特征如下：过氧化氢酶阴性，硝酸盐还原阴性，产明胶酶阴性，产H2S阴性，利用葡萄糖产酸阳性，利用葡萄糖产气阴性；
分子生物学鉴定结果：
取单菌落接种于10mL MRS液体培养基中培养，37℃，150r/min，12h；抽提基因组，扩增16S rDNA片段，电泳胶回收目的片段，链接PMD18-T(Takara)空载体质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，扩增培养，选取单克隆测序(上海生工生物工程有限公司)；其中，PCR扩增引物为：
27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；
PCR反应条件为：94℃，预变性4min；94℃，变性30s；55℃，退火30s；72℃延伸90s；35个循环；72℃，延伸7min；本发明采用单克隆鉴定方法，经正向引物27F和反向引物1492R扩增得到两条片段，DNAStar拼接两条序列，得到1469bp目的片段。该乳酸菌16S rDNA序列(5’-3’)如下所示：
ACTCTGTCACTTAGACGGCTGGCTCCTTGCGGTTACCCCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATGCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTAAACCTCGCGGTCTTGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGT GTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTGGTCACCGGCAGTCTCGCCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGACAACAAGGGTTGCGCTCGTAGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCACTTTGTCCCCGAAAGGGAAAACCTAATAACCTTAGGTGGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTAGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGAGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTATTGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGAACCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCTCTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTTCCAGTTTCCAATGCACTACTCCGGCTAAGCCGAAAGCTTTCACATCAGACTTAAAAGACCGCCTGCGTTCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTAGCCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTGCTGGTTAGATACCGTCATCGAATGAACAGTTACTCTCACTCGTGGTTCTTTCTCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAGACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATCACCTTGGTAGGCCGTTACCCCACCAACTAGTTAATACGCCGCGGGTCCATCTAAAAGCGATAGCAGAACCATCTTTCATCTAAGGATCATGCGATCCTTAGAGATATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTTCTTTTAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCAACTTCTTACGATGAATGCAAGCATTCGGTGTAAGAAAGTTTCGTTCGACTGCATGTATAGCACGCGCCCTGCA
将16S rDNA基因测序结果序列通过NCBI BLAST在GenBank数据库中进行同源比对分析鉴定，RDP classifier搜索分类为乳杆菌(Lactobacillus)，进一步NCBI BLAST分析发现，该乳酸菌和唾液乳杆菌模式株(L.salivarius strain ATCC 11741)同源性为99％；依据同源性>97％则为同一种类的原则，因此，菌株GZPH2鉴定为唾液乳杆菌(L.salivarius)。
综述所述，本发明筛选到的乳酸菌归属于乳杆菌属(Lactobacillus)、唾液乳杆菌种(L.salivarius)，命名为唾液乳杆菌GZPH2(Lactobacillus salivarius GZPH2)，于2014年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO： M 2014598。
实施例2唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2的广谱抑菌活性
(1)39株指示菌的制备
39株指示菌(表1)单菌落接种营养肉汤液体培养基中，37℃，150r/min培养8h，调节其浓度至1×106CFU/mL，4℃保存，备用；
表1 39株不同的实验指示菌株
(2)乳酸菌的制备
将实施例1中已鉴定的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2单菌落接种于50mL MRS液体培养基，37℃，150r/min，培养12h，培养其浓度至1×108CFU/mL；10000RCF，4℃，10min离心乳酸菌培养液，取上清液为抑菌实验备用，4℃保存，备用；
(3)(上清液)抑菌活性筛选
抑菌实验：涂布步骤①制备得到的指示菌100μL在营养肉汤固体培养基上，将牛津杯轻放在涂布指示菌的培养基上，轻压使其充分接触，加入200μL上清液，37℃培养24h，记录抑菌圈直径；
结果分析：
实验采用10μg/mL氯霉素作为阳性对照，MRS空白液体涂布培养基作为阴性对照。上清液抑菌活性结果如表2所示，39株不同来源的致病菌作为本实验的指示菌，对于乳酸菌上清液抑菌活性来说，GZPH2对39株指示菌显示阳性的比例为33/39(84.6％)，GZPH2对39株指示菌中的14株指示菌具有极强抑菌活性(+++，抑菌圈直径大于15mm)；
因此，本发明中，GZPH2具有广谱抑菌活性，既能抑制可引发人肠炎的弧菌如含有tdh毒素基因的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，又可抑制会引发水产养殖生物病害的弧菌，如溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)等。
表2 GZPH2上清液对39株不同来源致病指示菌的抑菌活性分析
注：a，抑菌活性用抑菌圈的直径(mm)表示。-，无抑菌活性；+，7<抑菌圈直径<10mm；++，10mm<抑菌圈直径<15mm；+++，抑菌圈直径>15mm。
实施例3唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2的其他特性分析
(1)溶血分析
将实施例1中鉴定好的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2取5μL种子液(终浓度为8.0×108CFU/mL)在血平板(羊血，广东环凯生物有限公司)上点种，37℃培养24h，观察菌落周围是否有溶血现象。选择8号副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)作为阳性对照；
(2)组胺检测
配制营养肉汤液体培养基，含混合氨基酸(组氨酸10.0g/L)，调节培养基pH为5.5，加入溴甲酚紫(0.06g/L)，琼脂粉(20g/L，凝胶强度>1300g/cm2)，120℃灭菌15min倒平板；活化实施例1中已鉴定的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2菌株，适当稀释后，吸取100μL涂布平板，在37℃下培养48h，同时做阳性对照[大肠埃希氏菌(E.coli)AS 1.2420]和阴性对照(不涂布任何菌种)。实验做三次平行。由于生物胺是碱性物质，溴甲酚紫遇酸性物质显黄色，遇碱性物质则显紫或红色。因此，黄色为阴性，红或紫色为阳性。
(3)耐酸检测
接种实施例1中已鉴定的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2单菌落于50mL MRS液体培养中培养，37℃，12h，浓度为1×108CFU/mL；10000RCF，4℃，10min离心，弃上清取沉淀，取对应pH的MRS溶液悬浮，将悬浮液加入pH分别为6.5(对照)、2.0、2.5和3.5的50mL MRS液体培养基中，分别在0h、2h和4h取样稀释涂平板检测其浓度，每个时间点浓度检测做三个平行，结果取平均值，添加标准偏差，以对数Log10值表示。
(4)耐胆盐分析
乳酸菌单菌落接种于50mL MRS液体培养基中培养，37℃，12h(对数生长期)，浓度为1×108CFU/mL，10000RCF，4℃，10min离心。弃上清，将沉淀用含对应胆盐浓度的MRS溶液悬浮，并将沉淀悬浮液加入50mL含胆盐分别为0％ (对照组)、0.5％、1％、1.5％和2％(w/v)MRS液体培养基中，37℃，150r/min，开始计时。分别在0h、2h、4h和6h取100μL稀释并涂布于MRS固体培养基中，37℃，培养24h，计数，检测各菌液浓度。
(5)数据分析
本发明中，每个实验组设置3个平行，乳酸菌浓度变化以平均值±标准偏差形式表示。
试验结果如下：
(1)溶血分析
将GZPH2和指示菌(阳性对照)移液枪各吸取5μL种子液(终浓度为8.0×108CFU/mL)点种到血平板(广东环凯生物有限公司)上，37℃培养24h，表1中8号副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)作为阳性对照。结果，所筛选的GZPH2不溶血，阳性对照产生溶血现象。
(2)组胺检测
采用溴甲酚紫在酸性环境(pH<5.8)显示黄色，碱性环境显紫色的原理，定性分析乳酸菌产组胺情况。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)AS 1.2420作为阳性对照，阴性对照为pH5.5的营养肉汤空白培养基。结果显示：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)AS 1.2420平板培养基显紫色，而GZPH2平板培养基不显紫色，由此可判明GZPH2不产组胺。
(3)耐酸检测
从表3可知，与对照(pH6.5)组相比，pH2.0组的唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2浓度出现下降趋势，但pH2.5、pH3.5组的GZPH2浓度则呈现先下降后上升的趋势。由此揭示GZPH2至少具有耐受pH2.5的良好耐酸能力。
表3唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2耐酸分析(浓度以对数值表示)
注：a:平均数±标准偏差，n＝3；b:培养时间
(4)耐胆盐分析
发明设计不同的胆盐浓度，50mL GZPH2种子液(浓度为108CFU/mL)，1000 RCF/min，10min，4℃离心后，将沉淀用对应胆盐浓度的MRS溶液悬浮，接种悬浮液到不同胆盐浓度三角瓶中，37℃，150r/min摇床培养。分别在0h、2h、4h和6h取样涂布于MRS平板检测乳酸菌浓度，结果如表4所示。从表4可知，对照组(0％胆盐)中，随时间的延长，GZPH2的浓度呈现上升趋势。在0.5％胆盐浓度组，GZPH2在2h和4h时稍现增长，6h时大幅增长(2.68log)；1.0％和1.5％胆盐浓度组，GZPH2浓度则出现先下降(2h)再增长(4h、6h)的现象；2.0％胆盐浓度组，GZPH2浓度虽在各实验时间点出现小幅下降，但其下降幅度也仅在0.71log之内。由此可见，GZPH2至少具有耐受1.5％胆盐浓度的良好的耐胆盐能力。
表4唾液乳杆菌(L.salivarius)GZPH2的耐胆盐分析
注：a:平均数±标准偏差，n＝3；b:培养时间
作为一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌，唾液乳杆菌GZPH2既能抑制可引发人感染和食物中毒的弧菌和其它病菌，又可抑制会引发水产养殖生物病害的弧菌，同时具有不溶血、不产组胺和良好的耐酸和耐胆盐能力。由此表明唾液乳杆菌GZPH2是一株优良的乳酸菌。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一株乳酸菌，其特征在于：所述的乳酸菌的名称为唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)GZPH2，于2014年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2014598。
2.权利要求1所述的乳酸菌在制备抑菌剂中的应用。
3.权利要求1所述的乳酸菌在制备防腐剂中的应用。
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