CN107858302B - 一种枯草芽孢杆菌7k及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K及其应用。本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60226，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年8月31日。本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K具有耐100℃高温、耐低pH、耐胆汁盐、耐胃肠道消化酶等极端环境的特点，且通过实验证实，本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K新菌株可以促进水生动物生长并调节其多种免疫基因的表达，还可抑制多种水生动物致病菌的生长，进而提高水生动物的抗病原感染能力，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

一种枯草芽孢杆菌7K及其应用
技术领域
本发明属水产学和微生物学技术领域，更具体地说，本发明涉及分离鉴定一种具有抗病益生菌作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K新菌株，该菌株可以促进水生动物生长并调节其多种免疫基因的表达，还可抑制多种水生动物致病菌的生长，进而提高水生动物的抗病原感染能力。
背景技术
根据***粮农组织对全球水产行业的状况调查显示，在2014年全球渔业共生产167,200,000吨鱼并产生将近1480亿美元的贸易额。这也意味着人们对水产的消费量达到前所未有的高值(Fisheries F A O.The state of world fisheries and aquaculture2016[M].2016.)。与此同时，疾病的流行与爆发严重限制着水产行业的发展，几乎每年使水产业蒙受将近300亿美元的损失(Subasinghe R P,Bondad-Reantaso M G,McGladdery S Eet al.Aquaculture development,health and wealth[J].Bangkok and FAO,NACA,2012.)。为了应对疾病在水生动物间的流行，抗生素在水产业内一直有着广泛的应用。一份对泰国虾养殖者的调查报告显示，接收采访的76位虾农中有56位承认使用抗生素，并且他们中的许多人将每天使用抗生素作为预防疾病的一个日常措施，使用的抗生素也种类繁多，包括庆大霉素、氯霉素、四环素、喹诺酮类和甲氧卞啶等(
Figure BDA0001476321370000011
K,
Figure BDA0001476321370000012
S,
Figure BDA0001476321370000013
A,et al.Antibiotic use in shrimp farming and implications forenvironmental impacts and human health[J].International journal of foodscience&technology,2003,38(3):255-266.)。事实上，并不只有亚洲的养殖者才滥用抗生素，例如在墨西哥的养虾场中人们也大量使用土霉素，氟苯尼考、复方磺胺甲恶唑、沙拉沙星和恩诺沙星等抗生素(Roque A,Molina-Aja A,
Figure BDA0001476321370000014
C,et al.In vitrosusceptibility to 15 antibiotics of vibrios isolated from penaeid shrimps inNorthwestern Mexico[J].International journal of antimicrobial agents,2001,17(5):383-387.)。大规模的抗生素滥用也造成了另外一个同时危害人类以及水生动物的问题——细菌耐药性(Elmahdi S,DaSilva L V,Parveen S.Antibiotic resistance ofVibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus in various countries:A review[J].Food microbiology,2016,57:128-134.)。
一般认为抗药性细菌主要来源于养殖行业和医疗机构的抗生素使用这两个途径产生(Defoirdt T,Boon N,Sorgeloos P,et al.Alternatives to antibiotics tocontrol bacterial infections:luminescent vibriosis in aquaculture as anexample[J].Trends in biotechnology,2007,25(10):472-479.)。在医疗机构产生的耐药性细菌可以通过存活于病人的肠道、病人之间的接触或者吸附于医疗器械等行为从医院被带出，而在其他人群中传播扩散。而养殖业在使用抗生素时，生成的耐药性细菌能够保存于动物的肉中，当消费者在烹饪过程中采用某些无法很好杀灭细菌的烹饪方式时，耐药性细菌进入用餐者的肠道，而部分耐药性细菌的有效定植使得用餐者成为新的传染源。同时，含有耐药性细菌的粪便往往会污染农作物的灌溉用水，经过这些污染水浇灌的农产品本身又成为一个可靠的传播耐药性细菌的媒介(Centres for Disease Control and Prevention(US).Antibiotic resistance threats in the United States,2013[M].Centres forDisease Control and Prevention,US Department of Health and Human Services,2013.)。或许我们很难评价医疗行为和食品生产中哪一个对耐药性细菌的生成负更大的责任，但是很多调查指出在食品行业的抗生度滥用量是远远超过医疗机构的。
从1940年青霉素被引入临床使用，在70多年的使用过程其一直应对链球菌和葡萄球菌等革兰氏阳性菌感染的治疗药物(Chandra H,Bishnoi P,Yadav A,etal.Antimicrobial Resistance and the Alternative Resources with SpecialEmphasis on Plant-Based Antimicrobials—A Review[J].Plants,2017,6(2):16.)。随着抗生素的滥用，大量的革兰氏阳性菌似乎显得对任何可用抗生素都产生了耐药性，人们面临着再次回归无药可用的艰难处境。一旦细菌获得对某种抗生素的耐药性则再没有有效方法能使它失去这分特性，而抗药性在细菌基因组间的传播十分迅速，以至于可以预见在未来五年内常用抗生素将失效(Bush K.Antibacterial drug discovery in the 21 stcentury[J].Clinical Microbiology and Infection,2004,10(s4):10-17.)。以多粘菌素为例，由于其具有很大的肾脏与神经系毒性在投入临床使用不久便被停止使用，但由于其对许多耐药性革兰阳性菌的有效治疗作用，多粘菌素最近又被重新恢复临床应用，然而就在2015年，一种含mcr1的大肠杆菌便被从中国上海某养猪场中分离鉴定出来(Crofts T S,Gasparrini A J,Dantas G.Next-generation approaches to understand and combatthe antibiotic resistome[J].Nature Reviews Microbiology,2017.)。耐药性细菌已然在严重危害人类健康，据美国疾病预防控制中心的一份报道，仅在美国本土每年至少有2,000,000人遭受耐药性细菌相关的严重感染，并且至少有23,000人直接死于耐药性细菌感染(Defoirdt T,Boon N,Sorgeloos P,et al.Alternatives to antibiotics to controlbacterial infections:luminescent vibriosis in aquaculture as an example[J].Trends in biotechnology,2007,25(10):472-479.)。更具危害性的是，据世界卫生组织的报道，耐药性细菌的感染更容易出现在呼吸道感染、脑膜炎、淋病、腹泻、梅毒和肺结核等严重感染中(World Health Organization.Antimicrobial resistance[J].Retrievedonline August,2002,24:2008.)。这一系列的后果也使得欧洲当局选择限制抗生素作为促动物生长剂在动物养殖中的使用；而美国食品和药品管理局的指导手册也认为以促生长为目的在动物饲养中使用抗生素是完全没有必要的，并且应该严格管控抗生素使用行为(Food and Drug Administration.New Animal Drugs and New Animal DrugCombination Products Administered in or on Medicated Feed or Drinking Waterof Food-Producing Animals:Recommendations for Drug Sponsors for VoluntarilyAligning Product Use Conditions with GFI#209[J].2013.)。
在这一背景下，益生菌在水产养殖业的应用日益成为应对病害流行的方法之一。随着对肠道菌群功能的不断深入了解，人们普遍认为益生菌能够在许多方面促进动物的健康生长：(i)通过竞争性生长抑制病原菌；(ii)产生一些如维生素之类的营养因子，或这通过分解酶促进消化；(iii)分泌抑制病原的物质；(iv)增强宿主机体免疫表达，以及(v)净化水体环境等(Defoirdt T,Boon N,Sorgeloos P,et al.Alternatives to antibiotics tocontrol bacterial infections:luminescent vibriosis in aquaculture as anexample[J].Trends in biotechnology,2007,25(10):472-479.；
Figure BDA0001476321370000031
-Atienza E,Gómez-Sala B,Araújo C,et al.Antimicrobial activity,antibiotic susceptibilityand virulence factors of lactic acid bacteria of aquatic origin intended foruse as probiotics in aquaculture[J].BMC microbiology,2013,13(1):15.)。
已经有许多研究证明益生菌对病原细菌具有抑制能力，但病毒感染性疾病的爆发严重打击水产养殖产业的发展。同在人群上的抗生素滥用情况类似，在水产领域人们同样缺少应对病毒感染的有效武器，并且在现实的养殖过程中也难以及时分辨病毒感染与细菌感染，这也成为抗生素滥用的一个重要原因。因此如果不能控制病毒源性疾病在水产动物的爆发，将很难减少养殖者对抗生素及违禁药物的滥用行为。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有水产养殖业中存在的抗生素滥用等问题，提供一种具有抗病益生菌作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K新菌株，该菌株可以促进水生动物生长并调节其多种免疫基因的表达，还可抑制多种水生动物致病菌的生长，进而提高水生动物的抗病原感染能力，可作为水产养殖的饲料添加剂或药物等，减少抗生素和违禁药物的使用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K，该菌株是经分离培养、形态观察、生理生化实验及16S rDNA序列分析等方法，从健康石斑鱼肠道中分离得到的一株新菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：60226，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年8月31日。
本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
经实验发现，本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K具有较好的芽孢耐热、耐胃肠液特性，其发酵上清液中含有多种抑菌活性物质，具有广谱抑制常见海洋鱼类病原细菌的功能，将本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K喂食珍珠龙胆石斑鱼，发现其具有促进珍珠龙胆石斑鱼生长、提高珍珠龙胆石斑鱼免疫及抗病能力的作用，增加其对病毒感染的抵抗能力。另外，本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K还可提高石斑鱼体内多种免疫基因的表达水平。因此，本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K可用于促进水产动物生长、提高水产动物免疫基因的表达水平、提高水产动物免疫力、预防或治疗水产动物疾病。
优选地，所述水产动物为石斑鱼或鲳鱼。
优选地，所述免疫基因包括IL-1β、IL-8、TNFα、MX I、MX II和ISG15。
本发明还提供了一种水产动物饲料添加剂，其包括有效剂量的作为活性成分的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K。
本发明还提供了一种用于调节水产动物养殖水体环境的微生态制剂，其包括有效剂量的作为活性成分的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K。
本发明还提供了一种用于提高水产动物免疫力的药物，其包括有效剂量的作为活性成分的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K。
本发明还提供了一种用于预防或治疗水产动物疾病的药物，其包括有效剂量的作为活性成分的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明分离筛选得到新菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K，其具有耐100℃高温、耐低pH、耐胆汁盐、耐胃肠道消化酶等极端环境的特点。
(2)将本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K进行胞外抑菌实验，发现其对多种海洋鱼类常见病原菌具有显著抑制效果，可用于制备抑制水产动物相关病原菌的制剂和调节水产动物养殖水体环境的微生态制剂。
(3)将本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K进行石斑鱼生长影响实验，发现其可显著提高石斑鱼的体重，因此，本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K具有促进水产动物生长功能，可用于制备水产动物饲料添加剂。
(4)将本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K进行病毒感染实验，发现其可显著降低感染新加坡石斑鱼虹彩病毒的石斑鱼的死亡率，还可提高石斑鱼脾脏组织中多种免疫基因的表达水平，因此，本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K可用于制备提高水产动物免疫力的药物和预防或治疗水产动物疾病的药物。
一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60226，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年8月31日。
附图说明
图1为基于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的16S rDNA序列使用Neighbor-Joining法构建的***进化树。
图2为本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的耐热实验结果。
图3为本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的耐胃液实验结果。
图4为本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的耐肠液实验结果。
图5为本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K发酵培养后的上清液分别对(a)嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、(b)创伤弧菌(Vibro vulnificus)、(c)哈维氏弧菌(Vibro harveyi)、(d)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、(e)溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、(f)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)形成的抑菌圈。
图6为测定本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K发酵培养后上清液中的抑菌物质结果。
图7为珍珠龙胆石斑鱼感染SGIV 10天累计死亡率，其中，具有相同字母上标表示无统计学差异其中P＜0.05为具有统计学差异。
图8为珍珠龙胆石斑鱼感染SGIV 48h后脾脏IL-1β、IL-8、TNFα、MXⅠ、MXⅡ和ISG15mRNA相对表达水平。其中“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01，本图仅展示1010cfu g-1组与其它剂量组比较的统计学分析结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
如无特别说明，以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。
实施例
分离鉴定枯草芽孢杆菌7K
1)采样：养殖石斑鱼购于海南一养殖场；海洋底泥，来源于广东沿海红树林、南海、印度洋深海。
2)培养基：
富集用液体培养基(LB培养基)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，pH值7.0—7.2。
分离培养基：LB培养基中加质量分数1.5％—2％琼脂。
耐盐性试验培养基：改变LB培养基中的NaCl添加量以制成不同盐度(NaCl 2％、5％、7％、10％)的培养基。
糖发酵试验培养基：(NH4)2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.2g，KCl 0.2g，酵母膏0.2g，糖或醇类10g，蒸馏水1000mL，0.2％溴麝香草酚蓝溶液1.2ml，调节pH 7.0—7.2，分装试管，每管装10mL培养基，于115℃灭菌20min。
明胶培养基：NaCl 5g、蛋白胨10g、牛肉膏3g、明胶120g、蒸馏水1000mL，pH 7.2—7.4。
淀粉培养基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、可溶性淀粉2g，蒸馏水1000mL pH7.0—7.2琼脂20g。
牛奶平板：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中(或用50mL脱脂牛奶)，另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。
柠檬酸盐培养基：柠檬酸钠2g、NaCl 5g、MgSO4·7H2O 0.1g、(NH4)2HPO4 1g、K2HPO4·3H2O 1g、1％溴百里酚蓝水溶液10mL，琼脂20g,pH6.8—7.0。
发酵培养基：豆粕粉10g、葡萄糖10g、酵母粉2.5g、(NH4)2SO42.5g、K2HPO4·3H2O0.6g、KH2PO40.25g、MgSO4·7H2O 0.2g、CaCl20.05g、MnCl2·4H2O0.03g、蒸馏水1000mL，再加入微量元素溶液2mL、二价铁离子溶液2mL、消泡剂1mL制成。
以上培养基均需在高压蒸汽灭菌器中灭菌，110℃灭菌20min。
产孢培养基(DSM)：营养肉汤8g，10％(w/v)KCl 10ml，1.2％(w/v)MgSO4·7H2O10ml，蒸馏水1000ml，pH调至7.6。经121℃20min灭菌。冷却后，在使用之前加入无菌1MCa(NO3)2 1ml，0.01M MnCl2 1ml，1mM FeSO4 1ml。
模拟胃液：4.8g NaCl、1.56g NaHCO3、2.2g KCl、0.22g CaCl2，蒸馏水1000ml，调pH1.5。经121℃20min灭菌后备用。在芽孢耐胃液试验前，通过孔径为0.22μm的滤菌器加入胃蛋白酶溶液，使最终模拟胃液中的胃蛋白酶浓度为500u/L。
模拟肠液：将5gNaCl、0.6gKCl、0.25gCaCl2、8.5g牛胆汁加入到1L、1M的NaHCO3溶液中，调pH7.0。经121℃20min灭菌后备用。灭菌后通过孔径为0.22μm的滤菌器往其中加入浓度为20000U/L的脂肪酶溶液、16000U/L的淀粉酶溶液和1200U/L的蛋白酶溶液，制成模拟肠液。
3)分离芽孢杆菌：将石斑鱼外表用沾有75％酒精的棉花消毒后，置于超净台解剖。分离出石斑鱼肠道，用已经消毒过的镊子挤出肠道内容物。
将石斑鱼肠道内容物及海洋底泥约1g置于装有100ml无菌生理盐水的三角瓶中充分混匀，于80℃水浴10—15min，杀死非芽孢菌体。离心取上清。将所取上清接种于富集用液体培养基中，37℃、200r/min震荡培养24h。取富集后的菌液1ml进行梯度稀释。涂布于分离培养基中，反复划线至分离得纯菌株。从石斑鱼肠道分离得到1株菌，命名为7K。菌落形态为白色不透明，干燥，边缘不整齐中间有星状突起。从分离培养基平板上挑取纯化的菌落，接种于富集用液体培养基中，37℃，200r/min培养12h，4℃保存备用。革兰氏染色后在1000倍显微镜下观察。该两株菌为革兰氏阳性菌，可见菌体中透亮的芽孢，可初步鉴定为芽孢菌属。
4)测序鉴定分离的菌株：使用细菌DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取细菌总DNA。PCR扩增16S rDNA、PCR产物纯化后，测序。PCR反应的引物为：K1F如SEQ ID NO:2所示，K2R如SEQ ID NO:3所示。PCR的反应体系：细菌DNA1μl；Taq 0.2μl；dNTP 1μl；10Xbuffer 2.5μl；K1F 1μl；K2R 1μl；用dd H2O补足25μl。PCR条件为：95℃预变性3min；94℃变性1min、55℃退火45s、72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物的纯化与测序由上海立菲生物技术有限公司进行。将测得的序列(如SEQ ID NO:1所示)在NCBI中进行BLAST比对分析，并借助软件MEGA5.0将所得菌株的16S rDNA序列和参考的芽孢杆菌属、梭菌属、芽孢八叠球菌属、芽胞乳杆菌属、脱硫肠状菌属以及类芽孢杆菌属中的模式菌株序列进行比对分析，并用Neighbor-Joining法构建***进化发育树。
将所得7K 16S rDNA序列在NCBI中进行BLAST与已登陆的枯草芽孢杆菌16SrDNA进行同源性比对分析。结果表明，菌株7K的16SrDNA序列与枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列同源性为99％。根据《伯杰氏***细菌学手册》(“Bergry’s Manual of SystematicBacteriology”)，2001第二版，2001年春，Springer-Verlag公司，Gerge M.Garrity,MattewWinters和Nenise B.Searles.)，而判断分离得到的菌株为一株新的枯草芽孢杆菌株。借助软件MEGA5.0用Neighbor-Joining法对7K的16SrDNA序列构建所得的***进化发育树如图1。可以发现在***进化发育树中菌株7K的序列与枯草芽孢杆菌聚为一簇。通过以上序列分析进一步说明分离得到的菌株7K为枯草芽孢杆菌一个新的菌株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)7K。
5)生理生化特征试验鉴定分离的菌株
生理生化鉴定参照《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌***鉴定手册[M].北京:科学出版社，2001)进行。使用蜡样芽孢杆菌生化鉴定管(广东环凯微生物科技有限公司)进行接触酶，V-P反应，硝酸盐还原等生理生化鉴定。使用自行制备的牛奶平板、明胶培养基、淀粉培养基、柠檬酸盐培养基、糖发酵培养基、耐盐性试验培养基分别进行酪蛋白水解、淀粉水解、明胶液化、柠檬酸盐利用试验、糖发酵试验、耐盐性试验。
对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K进行生化鉴定及生理生化特征试验，实验结果见表1。与《常见细菌***鉴定手册》中枯草芽孢杆菌的生理生化特征相比较后，发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K与枯草芽孢杆菌的生理生化特征一致，进一步表明分离到的菌株为枯草芽孢杆菌新菌株。
表1 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的生化鉴定及生理生化特征试验结果
Figure BDA0001476321370000081
Figure BDA0001476321370000091
注：“+”为阳性反应，“—”为阴性反应。
实验例1 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K特征实验
(1)制备芽孢：挑取单克隆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K落接种于5ml LB液体培养基，37℃摇床培养过夜，然后按1:100稀释后，加入到DSM培养基中，在37℃下250r/min摇床培养。分别于芽孢培养的0h、12h、24h取100μL培养液涂片作芽孢染色镜检，观察芽孢生成情况。芽孢收集及洗涤方法:8000r/min离心15min收集菌体，去上清液，加入溶菌酶至终浓度4mg/mL，室温静置15min。用1mol/L NaCl洗涤芽孢，加PMSF至终溶度为1μmol/L，充分混匀，8000r/min离心15min收集菌体。再用1mol/L KCl洗涤1次，蒸馏水洗涤2次。将芽孢溶于一定量蒸馏水中，68℃1h杀灭残留的枯草杆菌繁殖体。取1μL芽孢用蒸馏水1:1000稀释，用细胞计数池显微镜下计数，其余芽孢保存于-20℃下备用。
(2)芽孢耐热试验：选取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的营养体、孢子及大肠杆菌在100℃沸水浴中进行耐热试验。将初始浓度相同的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)7K营养体、孢子及大肠杆菌置于100℃沸水浴中，在处理0s、30s、60s、90s、120s时分别取样涂布于LB平板，经37℃24h培养后进行菌落计数，每个样品做三个重复，取平均值绘制生存曲线。
耐热试验结果表明细胞存活曲线如图2所示。经100℃沸水浴2min后，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的孢子减少的速度缓慢，体现出较强的耐热性。对比起大肠杆菌和7k营养体。大肠杆菌在经沸水浴30s后便全部死亡，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K营养体在沸水浴60s后全部死亡。
(3)芽孢耐胃肠液试验：选取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的营养体、孢子及大肠杆菌进行耐胃肠液试验。将初始浓度相同的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K营养体、孢子及大肠杆菌置于模拟胃液、肠液中。在模拟胃液中处理0min、15min、30min、45min、60min，在模拟肠液中处理0h、1h、2h、3h时分别取样涂布于LB平板，经37℃24h培养后进行菌落计数，每个样品做三个重复，取平均值绘制生存曲线。
耐胃液试验结果表明的细胞存活曲线如图3所示。在模拟胃液中，15min内大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的营养体的存活数便急剧下降，至15min全部死亡。而枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K经过60min处理后显示孢子的死亡数低于0.03logCFU/mL。可见枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K孢子对模拟胃液有非常强的耐受性。
耐肠液试验表明细胞存活曲线如图4所示。在模拟肠液培养3小时，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的芽孢表现出较高的耐受性，存活率几乎为100％。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的营养体从6.43logCFU/mL的下降到1.56logCFU/mL，表现出高度的敏感性。而大肠杆菌在模拟肠液中的数量稳定。
(4)胞外抑菌试验：用LB培养基将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K在37℃下培养増菌24h，然后按1:100稀释后，加入到发酵罐中。在28℃下发酵培养基中发酵培养48h后，把发酵培养基在4000rpm 4℃的条件下离心10min，取上清液。将上清液通过孔径为0.22μm的滤菌过滤器后储存在20℃备用。用牛津杯法测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K胞外抗菌活性。试验中以金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、溶壁微球菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌等海洋鱼类常见致病菌作为病原体。取以上上清液150μL加入到已经接种105CFU/ml的病原体的LB琼脂平板的牛津杯中。每种病原体做三个重复。使用高效液相色谱结合高分辨质谱(HPLC-HRMS)法初步测定上清液中抗菌化合物的化学性质。
对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的胞外抑菌结果见表2。结果显示，菌株7K发酵培养后的上清液可以对六种海洋鱼类常见病原菌形成明显的圆形抑菌区(见图5)，提示具有胞外抑菌活性。在所选的6种常见细菌中，上清液对哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌、溶藻弧菌的抑菌效果更为显著。另外根据高效液相色谱结合高分辨质谱(HPLC-HRMS)法初步测定上清液中可能含有多种抑菌相关化学物质(图7)。
表2 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K发酵上清液的抑菌试验结果
Figure BDA0001476321370000101
注：“+”为抑菌区域直径5mm-1mm,，“++”为抑菌区域直径1mm-15mm,，“+++”抑菌区域直径为15mm-20mm。
实验例2 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的对石斑鱼的益生作用
1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K添加饲料的准备
将从珍珠龙胆石斑鱼肠道中分离的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K接种在LB液体培养基中，于37℃培养24h，之后按1:100的比例将培养液混入产芽孢培养基中(大豆粉10g/l,酵母粉2.5g/L，葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 2.5g/L，无机盐和微量元素)于5L自动发酵罐中于37℃培养48h。随后发酵液在8000rpm离心15min并弃去上清液。为了去除残留的营养体，所有的芽孢被转入溶菌酶溶液(4mg/ml)中于室温下处理15min，处理后的芽孢用无菌水冲洗并离心两次(8000rpm，15min)。水洗后的芽孢放入68℃的水浴锅中热处理1h。处理后的芽孢于4℃下短暂保存供饲料配置使用。
芽孢与经过灭菌处理(121℃，20min)的商品石斑鱼饲料混合，经过制粒并在70℃干燥后于室温下干燥密封保存。本实验中使用的四种饲料含枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)7K分别为0,106,108和1010cfu g-1。饲料的含菌量由平板菌落计数法测定，且为了保证饲料含菌量稳定，在实验开始、实验中期以及实验结束后均对各组饲料进行菌活性测量。
2)石斑鱼饲养
从养殖场购买健康的珍珠龙胆石斑鱼。在正式实验开始前，石斑鱼先在实验室动物房水缸中饲养两周适应环境，水缸采用循环海水并且在这段时间内饲喂消毒灭菌后的石斑鱼饲料。为了防止体型相差过大导致石斑鱼之间发生撕咬，体重介于7.5g到10.0g的石斑鱼被选中，再随机分成四个喂食剂量组(7k含量分别0,106,108和1010cfu g-1)。每组包括两个20L的水缸，分别装有20条石斑鱼。
3)数据分析
将记录的原始数据资料进行编码整理后输入计算机，建立Excel数据库，进行逻辑统计分析，删除带有异常值和缺失值的记录。对调查数据处理与分析主要为方差分析与t检验。方差分析内容包括：初试体重、最终体重、体重增量、百分增长体重、喂食效率、死亡率及免疫基因相对定量数据分析。当方差分析用于各组间比较时，采用Student-Newman-KeulsTest分析组间差异。t检验用于免疫基因相对表达量之间的比较。所有结果均表示为平均值±SD，p＜0.05为具有显著性差异。其中mRNA相对表达量数据由目的基因与β-actin通过2-△△ct法表示，采用LightCycler480软件进行分析。方差分析采用SAS9.3软件进行分析。
4)生长影响试验
生长影响试验包括4个喂食剂量组分别为：饲料中枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)7K含量分别0,106,108和1010cfu g-1。石斑鱼按照体重的3％-5％每天喂食两次(9:00am,5:00pm)。为防止各组菌相互污染，每组水缸采用独立循环***，并且每天会对水缸进行70％的清洁海水替换。此试验共进行4周，在试验开始及接下来的每周都会对各组石斑鱼进行称重，死亡个体将被及时清除并记录。其中百分增长体重(PWG)与喂食效率(FE)的计算公式分别为：
百分增长体重＝[100×(最终体重–初始体重)(初始体重)-1]；
喂食效率＝[(最终体重–初始体重)(食物摄入量)-1]。
枯草芽孢杆菌7k对石斑鱼生长影响实验数据结果如表3。在实验开始前各组石斑鱼的体重没有出现显著性差异(P＜0.05)。经过4周的喂养后，喂食含7k量为106,108和1010cfu g-1的石斑鱼的最终体重，体重增量，PWG和FE均显著高于饲料中无7k添加的石斑鱼组(P＜0.05)。但是含菌量为106,108和1010cfu g-1的三组在最终体重，体重增量，PWG和FE的差别并不具备统计学差异(P＜0.05)。另外，在4周生长试验中的四组石斑鱼均未出现死亡个体。
表3 饲料中添加枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的对石斑鱼生长影响实验
Figure BDA0001476321370000121
注：生长数据数值表示为平均值±标准差的形式，具有相同字母上标表示无统计学差异其中P＜0.05为具有统计学差异。
实验例3 病毒感染试验
感染实验使用的病毒株新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)由实验室保存。在病毒感染试验开始之前，各组石斑鱼分别喂食含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K量分别0,106,108和1010cfu g-1的饲料35天。每组包括40条鱼，其中30条平均装在3个水缸中作为统计死亡率的数据来源，另外10条鱼作为测量免疫基因表达水平的组织来源。所有石斑鱼实验组均通过浸泡染毒的方式浸入含有SGIV 103cfu L-1的海水中养殖2天。感染试验进行到48h时，将分别从每组作为用作测量免疫基因表达水平的鱼中随机选取4条鱼，取出脾脏组织并迅速放入液氮中在-80℃保存。整个实验中各组继续喂食相应含菌量的饲料，每天喂食两次(9:00am,5:00pm)，各组间采用独立循环水但不添加新海水更新。死亡个体将及时从水缸中清除并记录，整个试验过程共10天。
在石斑鱼接受SGIV浸泡感染后的前三天，可见到饲喂含菌量为108和1010cfu g-1两组的部分石斑鱼出现食欲下降，游动姿势异常甚至伤口溃疡等情况，但均未出现石斑鱼死亡个体。经过十天的病毒感染试验，饲喂108cfu g-1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K添加饲料的石斑鱼的累计死亡率(46.67±11.55％)显著高于1010cfu g-1的(30.00±0％)。无枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K添加的石斑鱼累计死亡率(73.33±5.77％)则显著高于108cfu g-1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K添加饲料的石斑鱼。但是喂食106cfu g-1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K添加饲料的石斑鱼(60.00±10.00％)与无枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K添加饲料的石斑鱼间的累计死亡率之间的差异并不具有统计学差异(P＜0.05)。实验结果见图8。
实验例4 免疫基因表达
检测实验例3各实验组石斑鱼脾脏组织中免疫基因的表达水平，包括：MX-1、MX-2、ISG、IL-1β、IL-8和TNF-α。采用SV Total RNA Isolation Kit(Promega)根据操作手册流程提取脾脏组织中全部RNA。抽提RNA的质量由1％琼脂凝胶电泳检测。提取的RNA由ReverTraAce Kit(TOYOBO,Japan)逆转录成cDNA。免疫基因表达水平采用相对定量PCR通过Roche480 Real Time Detection System(Roche,German)进行分析。所用相对定量PCR引物见表4。
表4 荧光定量PCR检测免疫相关基因表达的引物序列
Figure BDA0001476321370000131
Figure BDA0001476321370000141
在珍珠龙胆石斑鱼被SGIV病毒感染48h后，分析检测6个免疫相关基因的表达变化，分别是三个促炎症细胞因子基因(IL-1β，IL-8和TNFα)以及三个抗病毒相关基因(MXⅠ,MXⅡ和ISG15)。其中饲料中添加1010cfu g-1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的石斑鱼相较于106和0cfu g-1组的石斑鱼在IL-1β，IL-8和TNFα等三个促炎症因子上都有显著上调。喂食106cfu g-1组的石斑鱼IL-8基因表达水平也明显高于无7k添加的对照组。对于108和1010cfu g-1这两个剂量组，1010cfu g-1组IL-1β表达水平显著高于108cfu g-1组，但TNFα的水平上却显著低于108cfu g-1组。
三个抗病毒基因的表达量则显示出一定的剂量依赖关系(图8)，表现为1010cfu g-1组MXⅠ、MXⅡ和ISG15等三个基因表达水平均显著高于106和0cfu g-1组的基因表达水平，且1010cfu g-1组MXⅠ和ISG15也明显高于108cfu g-1组；而108cfu g-1组其MXⅠ、MXⅡ和ISG15等三个基因表达水平均显著高于106和0cfu g-1组的相应基因的表达水平。除此以外，喂食106cfu g-1的石斑鱼也比0cfu g-1组表达更高水平的ISG15。
综上所述，本发明通过分离、鉴定等到一株芽孢杆菌，进行16S rDNA测序，将所得序列在NCBI中进行BLAST比对分析，并通过生化鉴定、生理生化特征试验后，确定分离菌株7K为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K。通过耐热、耐胃肠液试验发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的芽孢表现出很强的耐热、耐胃肠消化液的抗逆特性，说明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的芽孢制剂可以较好地在饲料热加工以及海洋鱼类肠道中存活下来，为其进一步发挥益生作用奠定基础。通过胞外抑菌试验发现，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K发酵培养后的上清液可以对金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、溶壁微球菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌六种海洋鱼类常见病原菌形成明显的圆形抑菌圈，并且对哈维氏弧菌、金黄色酿脓葡萄球菌、溶壁微球菌、溶藻弧菌的抑菌效果较为显著。通过高效液相色谱结合高分辨质谱(HPLC-HRMS)法初步测定上清液中含有多种抑菌相关化学物质。说明枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K具有抑制病原菌的特征，具有作为海洋鱼类饲料微生物添加剂的应用潜力具有开发利用价值。
以含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K分别为0,106,108和1010cfu g-1的四组饲料喂食珍珠龙胆石斑鱼。结果表明，饲喂含0,106,108和1010cfu g-1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的石斑鱼最终体重，体重增量，百分增长体重及喂食效率显著高于对照组。在SGIV感染试验中，喂食1010，108cfu g-1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的石斑鱼死亡率显著低于106组和对照组。而相对定量PCR结果表明饲喂含108和1010cfu g-1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K饲料的石斑鱼其IL-1β，IL-8，TNFα、MXⅠ、MXⅡ和ISG15等六个基因表达水平都明显高于0和106cfu g-1组。动物实验说明在饲料中添加枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K可以促进珍珠龙胆石斑鱼的生长，并通过上调相关免疫基因表达，增加其对病毒感染的抵抗能力，从而降低由于病毒感染导致的死亡率。因此，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K的使用可以显著降低水产动物疾病发生，是一株具有应用价值的益生菌。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种枯草芽孢杆菌7K及其应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌16SrDNA(Bacillus subtilis 7K)
<400> 1
tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg 60
agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggggctaata 120
ccggatggtt gtttgaaccg catggttcag acataaaagg tggcttcggc taccacttac 180
agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc 240
gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 300
gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt 360
gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa gtgccgttca 420
aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag 480
ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag 540
gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc attggaaact 600
ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga 660
gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc 720
gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt 780
gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc 840
tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt 900
ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg 960
acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc 1020
gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta 1080
gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg 1140
gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac 1200
agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg 1260
gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat 1320
gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt 1380
aacacccgaa gtcggtgagg taacctttag gagccagcc 1419
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> K1F(Artificial Sequence)
<400> 2
aactgaagag tttgatcctg gctc 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> K2R(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggttacc ttgttacgac tt 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> MXI-RT-F(Artificial Sequence)
<400> 4
cgaaagtacc gtggacgaga a 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> MXI-RT-R(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtttgatct gctccttgac cat 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> MXII-RT-F(Artificial Sequence)
<400> 6
gcttcatcaa ctacaagacc ttcga 25
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> MXII-RT-R(Artificial Sequence)
<400> 7
cgccttccta acagtatctc ctattt 26
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> ISG15-RT-F(Artificial Sequence)
<400> 8
gggtgtccct gctggtgat 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> ISG15-RT-R(Artificial Sequence)
<400> 9
ctctctgccc tggtgaatga g 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> IL-1 β -RT-F(Artificial Sequence)
<400> 10
aacctcatca tcgccacaca 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> IL-1 β -RT-R(Artificial Sequence)
<400> 11
agttgcctca caaccgaaca c 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> IL-8-RT-F(Artificial Sequence)
<400> 12
gccgtcagtg aagggagtct ag 22
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> IL-8-RT-R(Artificial Sequence)
<400> 13
atcgcagtgg gagtttgca 19
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> TNFα-RT-F(Artificial Sequence)
<400> 14
gtgtcctgct gtttgcttgg ta 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> TNFα-RT-R(Artificial Sequence)
<400> 15
cagtgtccga cttgattagt gctt 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Actin- RT-F(Artificial Sequence)
<400> 16
tacgagctgc ctgacggaca 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Actin- RT-R(Artificial Sequence)
<400> 17
ggctgtgatc tccttctgca 20

Claims (6)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60226，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年8月31日。
2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K在制备促进水产动物生长、提高水产动物免疫力、提高水产动物免疫基因的表达水平、预防或治疗水产动物疾病的药物中的应用，所述水产动物为石斑鱼。
3.一种水产动物饲料添加剂，其特征在于，包括有效剂量的作为活性成分的权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K。
4.一种用于调节水产动物养殖水体环境的微生态制剂，其特征在于，包括有效剂量的作为活性成分的权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K。
5.一种用于提高石斑鱼免疫力的药物，其特征在于，包括有效剂量的作为活性成分的权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K。
6.一种用于预防或治疗石斑鱼疾病的药物，其特征在于，包括有效剂量的作为活性成分的权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7K。
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