CN105062922B - 一种抑制禽源致病性大肠杆菌的乳酸杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抑制禽源致病性大肠杆菌的乳酸杆菌及其应用。本发明的乳酸杆菌，是从健康鸡群中分离得到，命名为Lactobacillus ingluviei SCGZ‑9，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015337。Lactobacillus ingluviei SCGZ‑9具有良好的耐酸和耐胆盐能力，可以有效黏附在肠道细胞，并抑制禽源致病性大肠杆菌对细胞的黏附。其分泌的上清液能够抑制禽源致病性大肠杆菌的生长繁殖。因此，该菌株可应用于制备预防和/或治疗禽源致病性大肠杆菌病的制剂，或是制备改善禽类肠道菌群生态平衡的制剂。

Description

一种抑制禽源致病性大肠杆菌的乳酸杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株新菌种及其在生物防控技术中的应用，具体涉及一种抑制禽源致病性大肠杆菌的乳酸杆菌及其应用。

背景技术

益生菌是可直接作为食物添加剂，并有益宿主健康的一类活的微生物。乳酸杆菌是最常使用的一种益生菌，动物若长期摄入足量的乳酸菌，乳酸菌可在动物肠道内稳定定植，改善肠道微生物生态平衡并抑制病原菌的入侵，保障动物的免受疾病侵害，同时，一些乳酸菌还有促进消化，提高动物增重的功效。乳酸菌在人类食品中应用已经非常广泛，近些年也不断有乳酸菌制品用于禽类的饲养，为禽类养殖业带来了更多的经济效益。

乳酸杆菌的种类有很多，例如Lactobacillus salivarius，Lactobacillusbulgaricus，Lactobacillus ingluviei等，Lactobacillus ingluviei是在鸽子和鸵鸟的胃肠道内发现的一种乳杆菌，有研究发现，Lactobacillus ingluviei可以影响体重的增长，若提高Lactobacillus ingluviei在肠道微生物中的含量，能够显著提高动物的增重并导致新陈代谢的改变。将Lactobacillus ingluviei制成益生菌制剂，将有利于动物的生长和健康。

大肠杆菌是一类兼性厌氧的革兰氏阴性菌，大小为0.4～0.7μm×2～3μm，菌体一般呈直杆状，两端钝圆，散在或成对，不产生芽孢，是一种条件致病菌。大多数大肠杆菌在正常条件下是人和动物肠道内的共栖菌，在正常条件下是不致病的，但少数大肠杆菌有致病性，与人和动物的大肠杆菌病密切相关。被致病性大肠杆菌感染的病鸡精神沉郁，食欲下降，羽毛粗乱，消瘦，可导致急性败血症，腹泻，气囊炎，腹膜炎等症状，经被粪便污染的鸡胚传播后还会引起雏鸡的大批死亡，因此大肠杆菌病对养禽业造成巨大危害和严重的经济损失。被感染的禽类会通过蛋和肉等将大肠杆菌传染给人，人感染大肠杆菌后的临诊症状主要是腹泻，并伴有恶心，呕吐，腹痛，畏寒发热，里急后重，咳嗽等表现，感染小儿还会引起溶血性尿毒综合征。现今细菌性疾病对养禽业危害严重，尤其是大肠杆菌病，造成的损失不亚于病毒性疾病。随着细菌耐药性增加、抗生素滥用等情况，国家法律法规对抗生素的限制会更加严格，抗生素的使用将会越来越少。因此，必须采用新的方法来预防和减少禽类的大肠杆菌病，提高养殖业效益，进一步保障食品安全和人类健康，而益生菌制品将成为防治禽类细菌性疾病的新途径。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种抑制禽源致病性大肠杆菌的乳酸杆菌。该乳酸杆菌不仅能高效抑制禽源致病性大肠杆菌，并能在禽类消化道内稳定存在。

本发明的另一目的在于提供上述抑制禽源致病性大肠杆菌的乳酸杆菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抑制禽源致病性大肠杆菌的乳酸杆菌，是从健康鸡群中分离得到，命名为Lactobacillus ingluviei SCGZ-9。

申请人将菌株保藏在位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心于2015年5月28日收到申请人提供的菌株。保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCC NO：M2015337，提议的分类命名为Lactobacillus ingluviei SCGZ-9。

Lactobacillus ingluviei SCGZ-9在制备预防和/或治疗禽类致病性大肠杆菌病的制剂中的应用。

Lactobacillus ingluviei SCGZ-9在制备改善禽类肠道菌群生态平衡制剂中的应用。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)本发明乳酸杆菌Lactobacillus ingluviei SCGZ-9是一种高效抑制禽源大肠杆菌的益生菌，能够预防和/或治疗家禽的大肠杆菌病，保护食品安全和人类健康。

(2)本发明菌株是从健康母鸡体内分离而来，并且经过多重严格的筛选，安全可靠性高，稳定性好。

(3)本发明的菌株Lactobacillus ingluviei SCGZ-9具有良好的耐酸和耐胆盐能力，可以有效通过家禽的上消化道后黏附在肠道细胞，并抑制禽源致病性大肠杆菌对细胞的黏附。可应用于防治和/或治疗禽类大肠杆菌病和改善禽类肠道生态平衡，促进家禽生长。

附图说明

图1是乳酸杆菌SCGZ-9的光学显微镜图。

图2是乳酸杆菌SCGZ-9的生长曲线。

图3是乳酸杆菌SCGZ-9在不同pH环境下的生长情况。

图4是乳酸杆菌SCGZ-9在不同胆盐浓度环境下的生长情况。

图5是乳酸杆菌SCGZ-9对鸡致病性大肠杆菌O₇₈的琼脂扩散试验。

图6是实施例4中实验鸡的增重试验结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所述的乳酸杆菌，命名为Lactobacillus ingluviei SCGZ-9；所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2015年5月28日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2015337。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1

一、乳酸杆菌SCGZ-9的来源

该乳酸杆菌为本发明人于2013年中从广东养殖场的健康鸡群中分离得到，现由华南农业大学兽医学院禽病研究室保存和提供。

二、乳酸杆菌SCGZ-9的鉴定和分类

(1)生化鉴定

根据《伯杰细菌鉴定手册》，做如下生化试验：过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验、V-P试验和动力试验。该七项生化试验均为阴性。判定所筛选出的SCGZ-9菌株属于乳酸菌属(Lactobacillus)。

(2)16S rRNA基因测序

设计引物序列：fD1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，rD1：5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'，PCR反应参照宝生物公司rTaq DNA聚合酶的使用说明书进行，PCR反应体系(50μL)为：ddH₂O 21μL、rTaq(Premix Taq)25μL、引物fD1(20μmol/L)1μL、引物rD1(20μmol/L)1μL，模板DNA 2μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃，45s，55℃，45s，72℃，90s，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后取6μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶(0.5μg/mL EB)电泳检测。将目的产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行DNA双向测序。将测序结果与Genbank数据库中不同菌株16S rRNA基因序列进行同源性比较，比较结果显示所筛选出的SCGZ-9菌株与乳酸杆菌属的菌种相似度最高，为Lactobacillus ingluviei。

Lactobacillus ingluviei SCGZ-9菌株的16S rRNA序列如下：1498bp

AGTCTCTTGTTCGACTTCACCCCAGTCATCTGCCCTGCCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGCATTGCAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGCAGTCGAGTTGCAGACTGCAGTCCGAACTGAGAACGGTTTTAAGAGATTAGCTTGCCCTCGCGAGTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTCCCCGAAGGGAACGCCCTATCTCTAGGGTTGGCGCAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGGCAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGCCCTCTTCTGCACTCAAGTCATCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTAAGCCGAAAGGCTTTCACATCAGACTTAGAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTGAATACCGTCAATACAAGAACAGTACTCTCTGCACATTCTCTCAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGGCCGTGTCTCAGTCCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTACGCATCATCGCCTTGGTAGGCCGTTACCCCACCAACAAGCTAATGCGCCGCAGGCCCATCCCGAAGTGATAGCCGAAACCATCTTTTAAGCTTTGACCAGGCGGTCAAAGTTGTTATGCGGTATTAGCACTTGTTTCCAAATGTTGTCCCCCGCTTCGGGGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTGGGAAACCAACGTCAATCCTGTGCAAGCACAATCAATCAGTTGGGCCAACGCGTTCGACTGCATTATAGCACTCGCCCTC。

三、乳酸杆菌SCGZ-9的主要特性

(1)生物学形态特征

菌体形态特征：菌体呈短杆状，一般单个或呈短链状存在，如图1所示。

菌落形态特征：在MRS固体培养基(成分(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸氢二铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.04，琼脂14.0，吐温80 1.0，pH值6.5±0.2)上能形成均匀明显的菌落：其菌落呈圆形，边缘整齐，乳白色，不透明，不形成芽孢。

(2)生长特征：兼性厌氧条件下生长，生长温度范围32～42℃，最适温度37℃，生长pH范围为pH 6～8，最适pH6.5。

(3)生长曲线

取SCGZ-9菌株进行复壮，经MRS固体培养基传代两次后，用接种环挑取单菌落接种于MRS肉汤(成分(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸氢二铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.04，吐温80 1.0，pH值5.7±0.2)，37℃培养12～14h作为种子液。将种子液按1％(v/v，体积浓度)的量接种于100mLMRS肉汤中，混匀后分别取5mL肉汤分装于24个离心管内，于37℃静置培养。其间每隔1h取出一支，用分光光度计测定肉汤的OD_600nm值，计算菌体浓度，根据测定的结果绘成SCGZ-9的生长曲线，如图2所示。

结果显示，乳酸杆菌从第10h到第19h为对数增长期，22h后进入平台期，细菌的数量几乎不变，细菌的生长进入一个稳定的时期。

实施例2

一、体内环境耐受试验

机体的消化道是一个复杂的环境，特别是胃和肠道，鸡的胃内环境为强酸性，可以杀死大部分进入胃的微生物，而小肠内则有胆汁和各种分泌物，能抑制微生物的生长。益生菌要进入肠道并发挥作用，除了通过生产工艺菌株提供保护，菌株本身也应该对低pH值、胆盐存在等环境有一定的耐受性。目前的许多研究均采用体外模拟胃肠环境的方法来评价益生菌对体内环境的耐受性。

(1)耐酸性实验

将SCGZ-9菌株在MRS肉汤内传代3次，调节浓度在10⁸CFU/mL左右，再按5％(v/v)的量分别接种于pH值为2、3和5的10mL MRS肉汤中，于37℃恒温培养，于0h、4h分别吸取100μL菌液进行梯度稀释，选择合适稀释倍数作平板活菌计数，以0h的菌落数为对照，计算存活率。在培养4h，pH值为2的培养基中SCGZ-9菌株存活率为16.7％，pH值为3的存活率为45.1％。pH值为5的存活率为81.2％。说明本发明菌株对酸性环境有一定的抵抗能力，可以良好的存活，耐酸性结果如图3所示。

(2)耐胆盐试验

利用上述耐酸性实验制备的约10⁸CFU/mL浓度的菌液，按5％(v/v，体积浓度)的量接种于胆盐浓度(w/v，质量浓度)分别为0.1％、0.2％和0.3％的MRS肉汤中，置于37℃恒温培养箱，于0h、4h分别吸取100μL菌液进行梯度稀释，选择合适稀释倍数作平板活菌计数，以0h的菌落数为对照，计算存活率。耐胆盐实验结果如图4所示，结果发现，SCGZ-9菌株在0.1％(w/v)胆盐条件下菌株生长良好，存活率可达到73.3％，0.2％(w/v)胆盐浓度条件也有存活的菌，存活率约为43.4％，而在0.3％(w/v)胆盐浓度下4h后只有极少的乳酸菌存活，说明该菌株有一定的胆盐耐受能力。

二、乳酸杆菌SCGZ-9对细胞的黏附性

乳酸菌只有黏附在肠粘液和肠道上皮细胞上，才不会因肠的蠕动或肠道内液体的流动而流失。乳酸菌的黏附性与菌体表面的成分有关，黏附性强的菌株，在肠道内存在的时间长，能稳定地定植，增强与宿主细胞间的相互作用和信息交流，抑制病原菌在肠道的定植。乳酸菌的黏附性有特异性，不同的菌株对宿主的粘附能力都不同，因此，乳酸菌的黏附性是筛选益生菌的重要指标。

(1)SCGZ-9对Caco-2细胞间的黏附作用

将SCGZ-9菌株在MRS肉汤中传代两次，37℃培养20～24h，离心收集菌体，PBS洗涤三次后，用PBS制成浓度10⁸CFU/mL左右的乳酸杆菌SCGZ-9菌悬液；将消化后的Caco-2细胞(人克隆结肠腺癌细胞，编号3115CNCB00337，购于中国典型培养物保藏中心细胞库)按每孔1mL(浓度约为1×10⁵/mL)接种于24孔细胞培养板，24h长成致密单层(每孔约3×10⁵个细胞)；Hanks液洗涤，各组每孔分别加入0.9mL DMEM培养液(含1％(v/v)胎牛血清)(购自Gibco公司)、0.1mL SCGZ-9菌悬液，37℃孵育2h；吸去培养板内，PBS漂洗三次；各孔加入1mL含0.01％(v/v)TritonX-100的PBS裂解单层细胞；吸出各孔悬液，混匀，进行倍比稀释，选取合适的稀释度100μL涂布于MRS固体培养基上，培养36h后菌落计数，黏附力用黏附细菌数10的对数值CFU/mL表示。

结果表明：乳酸杆菌SCGZ-11与Caco-2细胞间的黏附力平均为6.52，具有统计学意义，结果说明本发明的SCGZ-9菌株与Caco-2细胞有较好的黏附能力。

实施例3：乳酸杆菌SCGZ-9对体内致病性大肠杆菌的抑制作用

一、琼脂扩散试验

将SCGZ-9菌株接种于MRS肉汤内，37℃复苏，24h后再传代两次，接种于MRS肉汤内，8000r/min离心20min后取上清液，即为乳酸杆菌SCGZ-9菌悬液。

用灭菌棉签将致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)(鸡致病性大肠杆菌O₇₈，血清型O78：K80，编号GIM1.739，购于广东省微生物菌种保藏中心)致密涂在在LB营养琼脂平板(成分(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，氯化钠10.0，琼脂15.0，pH值7.0±0.2)上，使鸡致病性大肠杆菌O₇₈均匀铺满平板，37℃放置20min。取出平板于超净台内，用直径7mm的无菌打孔器在平板上垂直打3个孔。3个孔中分别加入50μL SCGZ-9菌悬液，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)(购于广东省微生物菌种保藏中心，GIM编号：GIM1.730)，PBS缓冲液。放于37℃培养箱，培养24h后用游标卡尺测量抑菌圈直径的大小。以MRS肉汤作为空白对照。

实验结果如图5所示，加有SCGZ-9菌悬液的孔的抑菌圈直径为14.2mm，而嗜酸乳杆菌GIM1.730的抑菌直径只有9.7mm左右。说明该乳酸杆菌SCGZ-9可以良好的抑制禽源致病性大肠杆菌。

二、SCGZ-9在Caco-2细胞上抑制致病性大肠杆菌的作用

(1)排斥实验

将鸡致病性大肠杆菌O₇₈传代三次后，37℃培养24h，制成浓度约10⁸CFU/mL的鸡致病性大肠杆菌O₇₈菌悬液；将消化后的Caco-2细胞，按每孔1mL接种于24孔细胞培养板，培养48h长成单层(每孔约3×10⁵个细胞)；PBS洗涤两次，分为A、B两组，A组加入0.8mL含1％(v/v)胎牛血清的DMEM培养液和0.1mL乳酸杆菌SCGZ-9菌悬液(浓度约2×10⁷CFU/mL)，37℃孵育1h，再加入0.1mL鸡致病性大肠杆菌O₇₈菌悬液，37℃孵育2h；B组加入0.9mL含1％(v/v)胎牛血清的DMEM培养液和0.1mL鸡致病性大肠杆菌O₇₈菌悬液；37℃孵育2h；吸去孔内菌液，PBS洗涤三次；各孔加入1mL 0.01％(v/v)TritonX-100的PBS裂解单层细胞；吸出各孔悬液，混匀，经倍比稀释后取合适的稀释度100μL涂布于LB营养琼脂平板，培养24h后计数菌落，黏附力用黏附细菌数10的对数值CFU/mL表示，至少3次生物学重复。

计数结果显示，A组鸡致病性大肠杆菌O₇₈对细胞黏附力为2.35，B组只有鸡致病性大肠杆菌O₇₈存在的情况下，鸡致病性大肠杆菌O₇₈黏附力为3.62。结果表明，在SCGZ-9黏附在Caco-2细胞上后，可以有效地排斥鸡致病性大肠杆菌O₇₈对细胞的黏附，从而降低鸡致病性大肠杆菌O₇₈对细胞的感染(P＜0.05)。

(2)竞争实验

将Caco-2细胞在24孔细胞培养板上培养成单层；PBS洗涤两次，加入0.8mL含1％(v/v，体积浓度)胎牛血清的DMEM培养液、0.1mL鸡致病性大肠杆菌O₇₈菌悬液和0.1mL乳酸杆菌SCGZ-9菌悬液(浓度约2×10⁷CFU/mL)，对照组只加入0.9mL含1％(v/v)胎牛血清的DMEM培养液和0.1mL鸡致病性大肠杆菌O₇₈菌悬液；37℃孵育2h；吸去菌液，PBS洗涤三次；各孔加入1mL 0.01％(v/v)TritonX-100的PBS裂解单层细胞；吸出各孔悬液，混匀，经倍比稀释后取合适的稀释度100μL涂布于LB营养琼脂平板，培养24h后计数菌落，黏附力用黏附细菌数10的对数值CFU/mL表示，至少3次生物学重复。

计数结果表示，同时加入菌株SCGZ-9和鸡致病性大肠杆菌O₇₈组时鸡致病性大肠杆菌O₇₈对细胞的黏附力为2.35，而对照组鸡致病性大肠杆菌O₇₈的黏附力为3.22。结果说明，竞争实验中，乳酸杆菌SCGZ-9对鸡致病性大肠杆菌O₇₈在Caco-2细胞的粘附具有良好的抑制作用(P＜0.05)。

(3)取代实验

将Caco-2细胞在24孔细胞培养板上培养成单层；PBS洗涤两次，每孔分别加入0.9mL含1％(v/v)胎牛血清的DMEM培养液、0.1mL鸡致病性大肠杆菌O₇₈菌悬液，37℃孵育2h后，吸出孔内液体，PBS漂洗三次；分为两组，A组每孔分别加入0.9mL含1％(v/v)胎牛血清DMEM培养液、0.1mL乳酸杆菌SCGZ-9菌悬液(浓度约2×10⁷CFU/mL)，37℃孵育2h；B组加入0.9mL含1％(v/v)胎牛血清的DMEM培养液和0.1mL PBS，37℃孵育2h；吸去两组的菌液，PBS漂洗三次；各孔加入1mL 0.01％(v/v)TritonX-100的PBS裂解单层细胞；吸出各孔悬液，混匀，经1:100稀释后各取100μL涂布LB营养琼脂平板，24h计数菌落，黏附力用黏附细菌数10的对数值CFU/mL表示，至少3次生物学重复。

结果表明，A组中加入SCGZ-9菌株后，鸡致病性大肠杆菌O₇₈对Caco-2细胞的黏附力为3.37，而B组在只有鸡致病性大肠杆菌O₇₈的情况下，粘附力为3.83。说明在鸡致病性大肠杆菌O₇₈先黏附细胞的情况下，SCGZ-9菌株可以排除Caco-2细胞上的部分鸡致病性大肠杆菌O₇₈，从而对鸡致病性大肠杆菌O₇₈黏附细胞起到抑制作用(P＜0.05)。

综上所述，通过排斥、竞争、取代三种方式，都表明了SCGZ-9菌株对鸡致病性大肠杆菌O₇₈黏附Caco-2细胞有明显的抑制作用(P＜0.05)。

实施例4

动物试验

一、增重试验

选取体重相近的1日龄黄羽鸡60只，分为甲、乙两组，每组30只，甲组从1日龄开始口服乳酸杆菌SCGZ-9菌悬液(10⁸CFU/mL)200μL/只，一天一次。乙组为对照组不作任何处理，饲喂正常饲料和清水。在1d，3d，5d，7d，14d，21d，28d对两组的鸡进行称重，计算平均体重和平均日增重。两组鸡平均体重的变化情况见图6。

根据实验结果，甲组鸡的的平均体重大于对照组，而且试验组的鸡的平均日增达到10.9g，大于对照组的9.7g，两组平均日增重经统计学比较，P＜0.05，差异显著，说明本发明SCGZ-9菌株对鸡的增重有一定的促进作用。

二、攻菌保护试验

选取体重相近的30日龄SPF鸡150只，随机分为A、B、C、D、E五组，每组30只。A组为预防组，口服乳酸杆菌SCGZ-9菌悬液(10⁸CFU/mL)200μL/只，一天一次，连续服用七天后，经腹腔注射浓度约10⁸CFU/mL的鸡致病性大肠杆菌O₇₈菌悬液0.3mL；B组为治疗组，先经腹腔注射约10⁸CFU/mL的鸡致病性大肠杆菌O₇₈菌悬液后，再每天口服乳酸杆菌SCGZ-9菌悬液(10⁸CFU/mL)200μL/只，直到实验结束；C组为抗生素治疗组，先经腹腔注射约10⁸CFU/mL的鸡致病性大肠杆菌O₇₈菌悬液0.3mL后，再通过饮水添加青霉素(5mg/只)，连续三天；D组为攻毒对照组(阳性对照组)，经腹腔给鸡注射鸡致病性大肠杆菌O₇₈菌悬液0.3mL(浓度约10⁸CFU/mL)；E组为空白对照组，不作任何处理，正常饲喂。各组鸡均饲喂不添加抗生素的饲料，攻毒后五天内观察并记录鸡的死亡，精神状况，食欲，饮水，粪便等情况，各组死亡数情况见表1。

表1攻菌保护试验鸡的死亡情况

组别	死亡数(只)	存活数(只)	存活率(％)
				A(预防组)	5	25	83％
B(治疗组)	14	16	53％
				C(抗生素治疗组)	3	27	90％
D(阳性对照组)	27	3	10％
				E(空白对照组)	0	30	100％

根据对各试验组的观察，A组30只鸡中只有6只死亡；B组鸡死亡12只，18只鸡存活；C组抗生素治疗的鸡没有出现死亡；D组攻入鸡致病性大肠杆菌O₇₈后；48h内30只鸡死亡20只，之后的两天又继续死亡6只；空白对照组E的鸡没有出现死亡。A、C两组存活的鸡攻毒几个小时后精神不振，但一段时间后精神恢复正常，采食、饮水正常，***周围绒毛洁净无粪便，羽毛皮肤整齐，粪便情况正常。特别是预防组A，鸡的存活数接近抗生素治疗组。而D组鸡在攻入鸡致病性大肠杆菌O₇₈ 6h开始发病，精神沉郁，采食和饮水量下降，拉白色稀粪，16h开始出现死亡，最终只有4只鸡存活，并且存活鸡精神沉郁，采食、饮水大量减少。

上述结果说明，本发明的乳酸杆菌SCGZ-9不仅可以提高肉鸡的平均日增重，促进鸡的生长发育，而且还可以有效地抑制鸡致病性大肠杆菌O₇₈对鸡的感染，对鸡起到一定的保护作用。

根据上述实施例，本发明的Lactobacillus ingluviei SCGZ-9菌株能有效抑制禽源大肠杆菌的生长与繁殖，可应用于预防和/或治疗禽类大肠杆菌病，或用于制备改善禽类肠道菌群生态平衡的制剂。

我国的家禽养殖环境复杂，细菌性疾病给禽的养殖业带来了巨大的危害，大肠杆菌(Escherichia coli)，沙门氏菌(salmonella)，葡萄球菌(Staphylococcus)等都是养殖过程中容易遇到的细菌性疾病。细菌性疾病还容易与病毒性疾病发生混合感染或者继发感染，这将使疾病更加难以控制，严重影响禽类养殖的经济效益，加之政府和民众对抗生素问题的日益关注，以后抗生素在养殖业上的使用将会受到严格的限制。

在国外，益生菌用于增加动物体重和预防疾病已经有至少30年的历史，最近几年，国内的养殖企业也逐渐使用益生菌制品来代替一部分抗生素的使用。但由于可用的菌株少，生产工艺还不成熟，防治效果不如抗生素等原因，益生菌制品在养殖业的使用还不太广泛。寻找高效、安全、抵抗力好的菌株和改进益生菌生产工艺是益生菌制品能够广泛使用的关键。

近几年，乳酸菌微生态制剂多层包埋及肠道靶向定植技术是国内外研究的热点。利用高分子材料可以对乳酸菌进行包埋处理，可以让乳酸菌与外界隔离，使其对外界环境有一定的耐受能力，可以提高到达动物肠道的乳酸菌数量，确保其能够在特定的位置发挥作用。因此，可以利用各种技术进一步将本菌株制成能够预防和/或治疗禽致病性大肠杆菌或调节禽类肠道微生态平衡的制剂，应用与临床生产上，提高禽类养殖业的效益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一株乳酸杆菌(Lactobacillus ingluviei)SCGZ-9，其特征在于：所述菌株于2015年05月28日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015337。

2.权利要求1所述的Lactobacillus ingluviei SCGZ-9在制备预防和/或治疗鸡致病性大肠杆菌病的制剂中的应用。

3.权利要求1所述的Lactobacillus ingluviei SCGZ-9在制备改善鸡肠道菌群生态平衡制剂中的应用。