CN102559533A - 一种萎缩芽孢杆菌及其制剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12，其特征在于，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010316。本发明所筛选的萎缩芽胞杆菌对海参病原菌有显著的拮抗作用，并且具有提高刺参生长速度、免疫力和肠道消化酶活力的功能。是从海参肠道中筛选的土著菌，对海参安全无毒、繁殖速度快、易于培养、对环境适应能力强，能较快的繁殖形成优势菌。本发明微生物制剂作为饲料添加剂，能提高海参特定生长率、降低海参死亡率、增强海参的免疫能力和肠道的消化酶活力，同时提高海参的抗病力，达到了抗菌、免疫、促生长多重效果，可减少和取代抗生素的使用。

Description

一种萎缩芽孢杆菌及其制剂和应用

技术领域

本发明涉及水产应用微生物技术领域，特别涉及一种萎缩芽孢杆菌以及利用该萎缩芽孢杆菌生产微生物制剂及其制备方法和应用。 

背景技术

肠道益生菌是一种大多来源于消化道又作用于消化道的活菌制剂，能有效补充动物消化道内的有益微生物，抑制病原菌的生长，改善消化道菌群平衡，提高水产动物的免疫机能或者生长速度。 

刺参(Apostichopus japonicus Liao，又称仿刺参)，属无脊椎动物，棘皮动物门，海参纲，仿刺参属。因其营养价值高，养殖规模不断扩大，目前已经发展成为我国沿海最大的海水养殖品种之一。近年来由于刺参高密度养殖和不规范运作以及病害防治技术的相对滞后，病害问题日趋突出，尤其养殖刺参“腐皮综合征”的暴发，造成了严重的经济损失，制约了该产业的健康持续发展。由于刺参特殊的生活习性和养殖特点，且抗生素药物等疾病预防措施本身又存在一些缺点和局限性，故采用微生态制剂将成为防止刺参养殖疾病发生的有效措施之一。 

芽孢杆菌是目前最常用的益生菌种类。本发明根据来源于自然，回归自然的原则，从海参肠道筛选出具有拮抗刺参病原菌和高产酶活性的一株萎缩芽孢杆菌，并开发成微生态制剂，有效避免不同来源益生菌菌株之间的差异，保证微生态制剂的安全性和高效性，对海参健康养殖有现实意义。 

根据来源于自然，回归自然的原则，筛选与原宿主、原生境、原微生态区系、原微生物种群相适应的菌种是开发微生态制剂的最好途径。面对目前海参专用微生态制剂匮乏的局面，从海参肠道筛选益生菌并开发成微生态制剂，避免了不同菌株之间的差异，保证微生态制剂的安全性和高效性。因此，从海参肠道中分离土著益生菌，通过对相关菌株的配伍达到抗菌、免疫、促生长的多重效果，对海参健康养殖有现实意义。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供适应于海参肠道的萎缩芽孢杆菌菌株，并给出以该菌株制备微生物制剂的生产方法和该制剂在海参养殖中的使用方法。本发明微生物制剂作为饲料添加剂，能提高海参特定生长率、降低海参死亡率、增强海参的免疫能力和肠道的消化酶活力，同时提高海参的抗病力，达到了抗菌、免疫、促生长多重效果，可减少和取代抗生素的使用，对提高养殖成活率和产品质量，保障该产业的稳产、高产具有十分重要的意义。 

为解决上述技术问题，本发明提供了一种萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010316。 

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种饲料添加剂，包括：萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010316。 

所述饲料添加剂的制备方法可以包括以下步骤： 

A.平板培养复壮：将低温保存的萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12接种于TSB固体平板培养基上，于20～35℃培养12～36h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于20～35℃培养12～36h； 

B.种子液的制备：将步骤A培养的菌种用5～30‰灭菌的生理盐水制成1×10⁵CFU/mL的菌悬液，以2～10％的接种量接种于TSB液体培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养18～20h，获得种子液； 

C.发酵培养：将步骤B中的种子液以2～10％的接种量接种于发酵培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养50～150h，至活菌数为0.2～8×10⁹CFU/mL，中止发酵； 

所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为：葡萄糖1～5％，大豆粉饼1～5％，氯化钠1～3％，其余为水； 

D.微生物制剂的制备：向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每100mL发酵液中加入5～30g沸石粉，100～200rpm振荡20～60min后静止20～60min， 将上述发酵液于4℃6000rpm离心20min，弃上清，每100g沉淀中加入20～40g沸石粉混匀后，于30～60℃烘干2～5h。 

所述饲料添加剂优选为用于海参的饲料添加剂，添加剂量可以为海参饲料总重量的0.5～7‰。 

所述饲料添加剂可以为固态粉状制剂。 

为解决上述技术问题，本发明又提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂的制备方法包括以下步骤： 

A.平板培养复壮：将低温保存的菌株接种于TSB固体平板培养基上，于22～33℃培养14～38h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于22～33℃培养14～36h； 

B.种子液的制备：将步骤A培养的菌种用5～30‰灭菌的生理盐水制成1×10⁵CFU/mL的菌悬液，以3～10％的接种量接种于TSB液体培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养18～22h，获得种子液； 

C.发酵培养：将步骤B中的种子液以3～10％的接种量接种于发酵培养基中，23～35℃，100～200rpm振荡培养60～150h，至活菌数为0.2～8×10⁹CFU/mL，中止发酵； 

所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为：葡萄糖1～5％，大豆粉饼1～5％，氯化钠1～3％，其余为水； 

D.微生物制剂的制备：向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每100mL发酵液中加入6～30g沸石粉，100～200rpm振荡20～60min后静止20～60min，将上述发酵液于4℃6000rpm离心20min，弃上清，每100g沉淀中加入20～40g沸石粉混匀后，于30～60℃烘干2～5h。 

为解决上述技术问题，本发明再提供了一种微生物制剂的制备方法，包括以下步骤： 

A.平板培养复壮：将低温保存的菌株接种于TSB固体平板培养基上，于18～37℃培养14～36h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于24～38℃培养12～36h； 

B.种子液的制备：将步骤A培养的菌种用5～30‰灭菌的生理盐水制成1×10⁵CFU/mL的菌悬液，以3～9％的接种量接种于TSB液体培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养18～20h，获得种子液； 

C.发酵培养：将步骤B中的种子液以2～10％的接种量接种于发酵培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养50～150h，至活菌数为0.2～8×109CFU/mL，中止发酵； 

所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为：葡萄糖1～5％，大豆粉饼1～4％，氯化钠1～3％，其余为水； 

D.微生物制剂的制备：向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每100mL发酵液中加入7～30g沸石粉，100～200rpm振荡20～60min后静止20～60min，将上述发酵液于4℃6000rpm离心20min，弃上清，每100g沉淀中加入20～40g沸石粉混匀后，于32～60℃烘干2～5h。 

为解决上述技术问题，本发明也提供了一种所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12作为饲料添加剂和/或微生物制剂的应用。 

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12作为肠道益生元的应用。 

为解决上述技术问题，本发明另提供了一种所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12在饲料添加剂、微生物制剂和/或肠道益生元的制备中的应用。 

本发明具有以下有益的技术效果： 

1)所筛选的萎缩芽胞杆菌对海参病原菌有显著的拮抗作用，并且具有提高刺参生长速度、免疫力和肠道消化酶活力的功能。 

2)所筛选萎缩芽胞杆菌是从海参肠道中筛选的土著菌，对海参安全无毒、繁殖速度快、易于培养、对环境适应能力强，能较快的繁殖形成优势菌。 

3)所研制的微生物制剂使用操作方法简便，只需将该制剂添加到饲料中进行投喂即可，适用于幼参养殖培育和各种模式的刺参养殖过程中的疾病控制。 

4)使用本发明可减少或替代抗生素的使用，对减少药残、提高海参商品质量、保障食品安全具有重要作用。 

附图说明

图1为本发明实施例所述根据16S rDNA序列用PHYLIP软件获得的进化树结果图； 

图2为本发明实施例所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12制剂对海参 体腔液酶活力的影响结果图； 

图3为本发明实施例所述Aj080319IA-12萎缩芽孢杆菌制剂对海参肠道酶活力的影响结果图。 

具体实施方式

以下将结合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。 

实施例1： 

Aj080319IA-12菌株的筛选分离过程： 

Aj080319IA-12菌株是中国水产科学研究院黄海水产研究所从野生刺参肠道中分离得到的。2008年中国水产科学研究院黄海水产研究所从青岛太平角海域抓获的野生刺参，在无菌条件下对刺参进行活体解剖，取其肠道，挤出肠道内容物，用灭菌的15‰的生理盐水冲洗肠道三次，将冲洗后的肠道匀浆，等比稀释后涂布在TSB培养基和2216E海水琼脂培养基上，选择合适稀释度的平板进行细菌的分离并通过多次划线培养纯化细菌，记录细菌的形态结构、数量并拍照；以刺参常见病原菌-灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophlia)为指示菌，利用点种法、十字交叉法和牛津杯法检测所分离细菌对刺参病原菌的抑菌作用，将其抑菌效果与抗生素的抑菌效果对比，筛选出抑菌效果显著的菌株；同时利用点种法和牛津杯法测定具有拮抗作用菌株的产酶能力；结果从中筛选出1个抑菌作用大于或接近抗生素抑菌效且产酶能力强的菌株，编号为Aj080319IA-12。 

实施例2： 

Aj080319IA-12菌株的形态特征 

菌株Aj080319IA-12的细胞革兰氏染色为阳性，菌体为杆状，芽孢染色结果显示有芽孢，荚膜染色显示菌体无荚膜。在TSB固体平板培养基上菌落黄色，表面有皱折，拉丝状，不透明，边缘不整齐，凸起，培养48h后菌落周围发黑色，液体培养时有菌膜且有沉淀生成。 

实施例3： 

16S rDNA序列测定 

如图1所示，为本发明实施例所述根据16S rDNA序列用PHYLIP软件获得的进化树结果图。 

用于扩增细菌16S rDNA的通用引物为27F：5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’和反向引物1492R：5’-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3’。以Aj080319IA-12菌株的基因组DNA为模板扩增16S rDNA并进行转化测序，所得的序列见序列表。将所得的Aj080319IA-12菌株的16SrDNA序列在Genbank中进行同源性比较，采用Clustalw软件进行多序列匹配排列，用***发生推断软件包PHYLIP4.0进行统计分析和聚类分析，采用邻位相连法获得发育***树(图1)，通过自举分析进行***进化树的评估，自举的数据集为1000次。同源性比较结果表明，Aj080319IA-12菌株与萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)的同源性达到99.93％。 

实施例4： 

生理生化特征 

采用法国梅里埃公司API ID 32E鉴定试剂条分析菌株的生理生化特性，对于不确定的反应，采用北京陆桥技术有限责任公司的菌种鉴定管进行测定结果分别见表1。根据《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》(第9版)和Gordon《芽孢杆菌》属的特征对菌株进行分类地位鉴定，该菌株具有萎缩芽孢杆菌生理生化特征，同时结合16S rDNA序列同源性分析结果，说明Aj080319IA-12菌株属于一种萎缩芽孢杆菌。 

表1：Aj080319IA-12菌株API ID 32E生理生化反应结果 

注：+：表示反应阳性；-：表示反应阴性； 

实施例5： 

Aj080319IA-12微生物制剂的制备方法 

以所分离的萎缩芽孢杆菌Aj080319IA-12菌株生产的微生物制剂，为固态粉状制剂，其制备方法包括如下步骤： 

A.平板培养复壮：将低温保存的萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12接种于TSB固体平板培养基上，于28℃培养24h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于28℃培养24h； 

B.种子液的制备：将步骤A培养的菌种用15‰灭菌的生理盐水制成1×10⁵CFU/mL的菌悬液，以5％的接种量接种于TSB液体培养基中，28℃，170rpm振荡培养18～20h，获得种子液； 

C.发酵培养：将步骤B中的种子液以5％的接种量接种于发酵培养基中，28℃，170rpm振荡培养96h，至活菌数为2～4×10⁹CFU/mL，中止发酵； 

所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为：葡萄糖1～2％，大豆粉饼1～2％，氯化钠1％，其余为水； 

D.微生物制剂的制备：向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每100mL发酵液中加入10g沸石粉，170rpm振荡40min后静止40min，将上述发酵液于4℃6000rpm离心20min，弃上清，每100g沉淀中加入20～40g的沸石粉混匀后，于45～50℃烘干3～4h后，得到该萎缩芽孢杆菌的微生物制剂； 

利用稀释平板涂布法检测制剂中的活菌含量达到1×10⁹CFU/g以上。 

实施例6： 

本发明微生物制剂的使用方法 

本发明的萎缩芽胞杆菌制剂可作为海参饲料添加剂使用，使用方法为按照重量比3‰的添加量将本制剂与海参配合饲料混匀，进行海参投喂，以达到抗菌、免疫、促生长的作用。 

实施例7： 

Aj080319IA-12菌株的产酶能力及拮抗海参病原菌能力 

以刺参常见病原菌——灿烂弧菌(V.splendidus)、假交替单胞菌(P.nigrifaciens)和嗜水气单胞菌(A.hydrophlia)为指示菌，利用点种法、十字交叉法和牛津杯法检测该菌株对刺参病原菌的抑菌作用，将其抑菌效果与抗生素的抑菌效果对比。采用点种法、牛津杯法用酪素水解培养基和淀粉水解培养基培养测定该菌株的其产酶活力。菌落拮抗试验结果和产酶结果(表2)显示，该萎缩芽孢杆菌能显著的拮抗这三种刺参病原菌的生长，抑菌圈大小与抗生素效果几乎相当，且该菌株具有良好的产蛋白酶和淀粉酶活性。因此，该菌株可以作为具有抗菌、促生长的益生菌应用于刺参饲料添加剂。 

表2：Aj080319IA-12菌株的产酶能力及对海参病原菌的拮抗作用 

实施例8： 

以Aj080319IA-12菌株制备微生物制剂 

以所分离的萎缩芽孢杆菌Aj080319IA-12菌株制备微生物制剂，为固态粉状制剂，步骤如下： 

A.平板培养复壮：将-80℃冰箱保存的萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12接种于TSB固体平板培养基上，于28℃培养24h，使菌种复壮开形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于28℃培养 24h； 

B.种子液的制备：将步骤A培养的菌种用15‰灭菌的生理盐水制成1×10⁵CFU/mL的菌悬液，以5％的接种量接种于1000mL TSB液体培养基中，28℃，170rpm振荡培养18～20h，获得种子液； 

C.发酵培养：将步骤B中的种子液以5％的接种量接种于5L的发酵培养基中，28℃，170rpm振荡培养，每12h取样，平板涂布计算细菌量，并用芽孢染色法观察芽孢生成情况，发酵培养结果显示，该菌株在84h开始进入稳定期，芽孢染色显示大部分已形成芽孢，但96h的芽孢生成率高于84h，几乎所有的菌体均以孢子的形式存在，因此在96h中止发酵； 

所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为：葡萄糖1～2％，大豆粉饼1～2％，氯化钠1％，其余为水； 

D.微生物制剂的制备：向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每100mL发酵液中加入10g沸石粉，170rpm振荡40min后静止40min，将上述发酵液于4℃6000rpm离心20min，弃上清，每100g沉淀中加入20～40g的沸石粉混匀后，于45～50℃烘干3～4h后，得到该萎缩芽孢杆菌的微生物制剂。利用稀释平板涂布法检测制剂中的活菌含量为1.56×10⁹CFU/g，烘干法检测所制备的制剂含水量低于7％。将制备的制剂装袋后置于干燥处保存，定期检测制剂中的活菌含量，检测结果显示，该制剂保存半年后，其活菌含量仍在70％以上。 

实施例9： 

萎缩芽胞杆菌Aj080319IA-12制剂对海参的生长、存活率、免疫指标及肠道消化酶活力的影响. 

将所制备的萎缩芽胞杆菌Aj080319IA-12制剂按照饲料重量的3‰添加到饲料中，进行投喂海参试验。 

试验用海参来自烟台天源水产有限公司自然海区底播海参，暂养7天后，挑选大小相似、活力较好的海参进行试验，海参体重初始为55.01±1.293g，体长6～8cm，试验期间，海水盐度为29～30，pH值为7.46～8.02，溶解氧为5.0g/L以上，水温为16～18℃，饲料投喂量为刺参体重1％。试验分为3组，试验组1为投喂添加3‰萎缩芽孢杆菌制剂的海参饲料，试验组2为投喂添加1‰β-1，3葡聚糖的海参饲料，对照组投喂不添加任何添加剂的 海参饲料，每组3个重复，每个重复15头海参。投喂实验周期为42d，其中前28d投喂添加相关饲料添加剂的饲料，28d后改投无添加剂的海参饲料。 

在试验的第0d、4d、14d、28d和42d抽取刺参体腔液，用于测定体腔液的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)的酶活性以及海参肠道蛋白酶活性和淀粉酶活性，在第42天测定海参体重并计算增重率，此外，在伴饲投喂第28d从每个实验组中随机选取其中一个重复用假交替单胞菌进行人工攻毒感染试验，每头海参注射200μL浓度为1×10⁸CFU/mL的假交替单胞菌菌液，记录攻毒后两周内三组的死亡率，进而计算免疫保护率。 

试验结果如下： 

在促生长方面，由表3可以看出，添加β-1，3葡聚糖和本发明的萎缩芽孢杆菌制剂实验组，均能显著提高海参的增重率(P＜0.05)。 

表3：投喂萎缩芽胞杆菌制剂对海参生长的影响 

如图2所示，为Aj080319IA-12萎缩芽孢杆菌制剂对海参体腔液酶活力的影响结果图。其中，含有相同字母差异不显著(P＞0.05)；含有不同字母差异显著(P＜0.05)。在提高免疫力方面，试验结果如图2所示：在试验期间，除SOD酶活力在3个组之间无显著差异外，添加β-1，3葡聚糖和本发明的萎缩芽孢杆菌制剂实验组的ACP、AKP、LZM活性均高于对照组(P＜0.05)，说明本发明的萎缩芽胞杆菌制剂具有与β-1，3葡聚糖相同的提高海参体免疫活性的功能。 

如图3所示，为Aj080319IA-12萎缩芽孢杆菌制剂对海参肠道酶活力的影响结果图。其中，含有相同字母差异不显著(P＞0.05)；含有不同字母差异显著(P＜0.05)。在提高肠道消化酶活性方面，在试验期间，添加本发明的萎缩芽孢杆菌制剂组蛋白酶和淀粉酶活性显著高于对照组和添加β-1，3葡聚糖试验组。试验结果如图3所示：饲料中添加萎缩芽胞杆菌制剂能够显著提高刺参的消化酶活性。 

在提高海参抗病力方面，在进行人工攻毒后，实验结果如表4所示，添加β-1，3葡聚糖和本发明的萎缩芽孢杆菌制剂实验组海参的死亡率显著低于对照组(P＜0.05)，β-1，3葡聚糖和本发明的萎缩芽孢杆菌制剂对海参的免疫保护率均为85.71％，表明所发明的萎缩芽胞杆菌制剂能显著提高刺参的免疫力。 

表4：人工感染实验中不同组刺参的死亡率及萎缩芽孢杆菌制剂的免疫保护率 

实施例结果证明：本发明的萎缩芽胞杆菌菌株具有产蛋白酶和淀粉酶活性，同时具有拮抗海参病原菌的作用；所研制的萎缩芽胞杆菌制剂活菌含量达到1.56×10⁹CFU/g，存放半年后活菌含量仍大于70％；投喂海参结果显示该微生物制剂作为饲料添加剂，能提高海参特定生长率、降低海参死亡率、增强海参的免疫能力和肠道的消化酶活力，同时提高海参的抗病力，达到了抗菌、免疫、促生长多重效果，可减少和取代抗生素的使用，对提高养殖成活率和产品质量，保障该产业的稳产、高产具有十分重要的意义。 

实施例10： 

一种萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12。 

所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010316。 

实施例11： 

一种饲料添加剂。 

包括：萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010316。 

所述饲料添加剂的制备方法可以包括以下步骤： 

A.平板培养复壮：将低温保存的萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12接种于TSB固体平板培养基上，于20～35℃培养12～36h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于20～35℃培养12～36h； 

B.种子液的制备：将步骤A培养的菌种用5～30‰灭菌的生理盐水制成1×10⁵CFU/mL的菌悬液，以2～10％的接种量接种于TSB液体培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养18～20h，获得种子液； 

C.发酵培养：将步骤B中的种子液以2～10％的接种量接种于发酵培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养50～150h，至活菌数为0.2～8×10⁹CFU/mL，中止发酵； 

所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为：葡萄糖1～5％，大豆粉饼1～5％，氯化钠1～3％，其余为水； 

D.微生物制剂的制备：向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每100mL发酵液中加入5～30g沸石粉，100～200rpm振荡20～60min后静止20～60min，将上述发酵液于4℃6000rpm离心20min，弃上清，每100g沉淀中加入20～40g沸石粉混匀后，于30～60℃烘干2～5h。 

所述饲料添加剂优选为用于海参的饲料添加剂，添加剂量可以为海参饲料总重量的0.5～7‰。 

所述饲料添加剂可以为固态粉状制剂。 

实施例12： 

一种微生物制剂。 

所述微生物制剂的制备方法包括以下步骤： 

A.平板培养复壮：将低温保存的菌株接种于TSB固体平板培养基上，于22～33℃培养14～38h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于22～33℃培养14～36h； 

B.种子液的制备：将步骤A培养的菌种用5～30‰灭菌的生理盐水制成1×10⁵CFU/mL的菌悬液，以3～10％的接种量接种于TSB液体培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养18～22h，获得种子液； 

C.发酵培养：将步骤B中的种子液以3～10％的接种量接种于发酵培养基中，23～35℃，100～200rpm振荡培养60～150h，至活菌数为0.2～8×10⁹CFU/mL，中止发酵； 

所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为：葡萄糖1～5％，大豆粉饼1～5％，氯化钠1～3％，其余为水； 

D.微生物制剂的制备：向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每100mL 发酵液中加入6～30g沸石粉，100～200rpm振荡20～60min后静止20～60min，将上述发酵液于4℃6000rpm离心20min，弃上清，每100g沉淀中加入20～40g沸石粉混匀后，于30～60℃烘干2～5h。 

实施例13： 

一种微生物制剂的制备方法。 

包括以下步骤： 

A.平板培养复壮：将低温保存的菌株接种于TSB固体平板培养基上，于18～37℃培养14～36h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于24～38℃培养12～36h； 

B.种子液的制备：将步骤A培养的菌种用5～30‰灭菌的生理盐水制成1×10⁵CFU/mL的菌悬液，以3～9％的接种量接种于TSB液体培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养18～20h，获得种子液； 

C.发酵培养：将步骤B中的种子液以2～10％的接种量接种于发酵培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养50～150h，至活菌数为0.2～8×10⁹CFU/mL，中止发酵； 

所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为：葡萄糖1～5％，大豆粉饼1～4％，氯化钠1～3％，其余为水； 

D.微生物制剂的制备：向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每100mL发酵液中加入7～30g沸石粉，100～200rpm振荡20～60min后静止20～60min，将上述发酵液于4℃6000rpm离心20min，弃上清，每100g沉淀中加入20～40g沸石粉混匀后，于32～60℃烘干2～5h。 

实施例14：一种所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12作为饲料添加剂和/或微生物制剂的应用。 

实施例15：一种所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12作为肠道益生元的应用。 

实施例16：一种所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12在饲料添加剂、微生物制剂和/或肠道益生元的制备中的应用。 

所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于 保留的权利。 

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。 

其中，所述的萎缩芽孢杆菌Aj080319IA-12(Bacillus atrophaeus Aj080319IA-12)于2010年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。保藏编号为：CCTCC NO：M 2010316。 

Claims (10)

1.一种萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12，其特征在于，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2010316。

2.一种饲料添加剂，其特征在于，包括：萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010316。

3.根据权利要求2所述饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂的制备方法包括以下步骤：

A.平板培养复壮：将低温保存的萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12接种于TSB固体平板培养基上，于20～35℃培养12～36h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于20～35℃培养12～36h；

B.种子液的制备：将步骤A培养的菌种用5～30‰灭菌的生理盐水制成1×10⁵CFU/mL的菌悬液，以2～10％的接种量接种于TSB液体培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养18～20h，获得种子液；

C.发酵培养：将步骤B中的种子液以2～10％的接种量接种于发酵培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养50～150h，至活菌数为0.2～8×10⁹CFU/mL，中止发酵；

所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为：葡萄糖1～5％，大豆粉饼1～5％，氯化钠1～3％，其余为水；

D.微生物制剂的制备：向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每100mL发酵液中加入5～30g沸石粉，100～200rpm振荡20～60min后静止20～60min，将上述发酵液于4℃6000rpm离心20min，弃上清，每100g沉淀中加入20～40g沸石粉混匀后，于30～60℃烘干2～5h。

4.根据权利要求2或3所述的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂为用于海参的饲料添加剂，添加剂量为海参饲料总重量的0.5～7‰。

5.根据权利要求2～4中任一项所述的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂为固态粉状制剂。

6.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂的制备方法包括以下步骤：

A.平板培养复壮：将低温保存的菌株接种于TSB固体平板培养基上，于22～33℃培养14～38h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于22～33℃培养14～36h；

B.种子液的制备：将步骤A培养的菌种用5～30‰灭菌的生理盐水制成1×10⁵CFU/mL的菌悬液，以3～10％的接种量接种于TSB液体培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养18～22h，获得种子液；

C.发酵培养：将步骤B中的种子液以3～10％的接种量接种于发酵培养基中，23～35℃，100～200rpm振荡培养60～150h，至活菌数为0.2～8×10⁹CFU/mL，中止发酵；

所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为：葡萄糖1～5％，大豆粉饼1～5％，氯化钠1～3％，其余为水；

D.微生物制剂的制备：向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每100mL发酵液中加入6～30g沸石粉，100～200rpm振荡20～60min后静止20～60min，将上述发酵液于4℃6000rpm离心20min，弃上清，每100g沉淀中加入20～40g沸石粉混匀后，于30～60℃烘干2～5h。

7.一种微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.平板培养复壮：将低温保存的菌株接种于TSB固体平板培养基上，于18～37℃培养14～36h，使菌种复壮并形成单菌落；然后挑取单菌落接种于TSB斜面培养基上，于24～38℃培养12～36h；

B.种子液的制备：将步骤A培养的菌种用5～30‰灭菌的生理盐水制成1×10⁵CFU/mL的菌悬液，以3～9％的接种量接种于TSB液体培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养18～20h，获得种子液；

C.发酵培养：将步骤B中的种子液以2～10％的接种量接种于发酵培养基中，20～35℃，100～200rpm振荡培养50～150h，至活菌数为0.2～8×10⁹CFU/mL，中止发酵；

所述的发酵培养基的组分及其重量百分比分别为：葡萄糖1～5％，大豆粉饼1～4％，氯化钠1～3％，其余为水；

D.微生物制剂的制备：向步骤C的发酵液中加入沸石粉，每100mL发酵液中加入7～30g沸石粉，100～200rpm振荡20～60min后静止20～60min，将上述发酵液于4℃6000rpm离心20min，弃上清，每100g沉淀中加入20～40g沸石粉混匀后，于32～60℃烘干2～5h。

8.一种如权利要求1所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12作为饲料添加剂和/或微生物制剂的应用。

9.一种如权利要求1所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12作为肠道益生元的应用。

10.一种如权利要求1所述萎缩芽孢杆菌菌株Aj080319IA-12在饲料添加剂、微生物制剂和/或肠道益生元的制备中的应用。

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