CN112940982A - 一株鳢源贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WLYS23菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60890。本发明的贝莱斯芽孢杆菌分离自健康杂交鳢，是一种内源性菌株，该菌株对舒氏气单胞菌、简氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、水生气单胞菌、类志贺邻单胞菌和鰤鱼诺卡氏菌7种水产动物致病菌均具有较强的拮抗效果。

Description

一株鳢源贝莱斯芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株鳢源贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

背景技术

中国是世界上最大的水产品生产国和消费国，随着水产养殖高度集约化，水生态环境恶化日益突出，水产动物病害濒发，据统计，每年我国因病害造成损失达150亿元。其中，水产养殖过程中常见的细菌性病原主要有维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、无乳链球菌、鰤诺卡氏菌和迟缓爱德华氏菌等，这些病原菌在我国水产养殖动物中广泛传播与流行，常常造成水产经济动物相关病害的大规模暴发。

当前，我国水产养殖中常见细菌性病害主要是通过使用抗生素、消毒剂等传统的化学药物进行防控防治，虽然在短时间内可以取得较好的效果，但是长期使用会造成耐药因子的传递从而导致病原菌耐药性的产生，并且破坏和干扰养殖环境的微生生态平衡，增加水生动物疾病防控的难度。此外，抗生素、消毒剂等药物易在养殖动物体内及环境中残留，不仅污染环境，而且威胁着人类身体健康。

生物拮抗是自然界普遍存在的现象，某些种类的微生物通过竞争营养成分、产生抑菌物质、降解信号分子等不同方式以达到抑制其他微生物生长的目的。微生物防控技术就是基于这种自然法则，通过在饲料或养殖环境施加有益微生物控制肠道或水环境中致病微生物的数量，维持养殖动物肠道健康及良好的养殖环境。作为抗生素的一种替代方案，益生菌的使用在保证养殖动物生产性能及健康状况的同时，能够减少病害发生，降低水产养殖过程中抗生素、消毒剂等药物使用量，提升水产品质量安全，具有较好的经济和社会效益。

现有的益生菌产品种类繁多，主要包括光合细菌、酵母菌、乳酸菌及芽孢杆菌。其中芽孢杆菌属于芽孢杆菌科，广泛分布于养殖环境及动物肠道，因为具有较强的胞外酶分泌能力以及容易生产、保存等优点，在水产养殖中具有非常广泛的应用。同时由于芽孢杆菌种类繁多，不同种属甚至同一种属不同菌株之间，其特性(如胞外酶分泌能力、拮抗物质的种类及效果)可能也千差万别。因此在众多的芽孢杆菌中筛选到具有广谱抗菌效果，并且来源于杂交鳢肠道、适用于水产养殖的独特菌株尤为重要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明从健康杂交鳢的肠道分离出一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，将其命名为：WLYS23。经试验证明该菌株有广谱拮抗水产常见病原菌的功能，能有效抑制舒氏气单胞菌、简氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、水生气单胞菌、类志贺邻单胞菌或鰤鱼诺卡氏菌等病原菌的生长，而且使用安全无残留，有助于减少化学药物在水产养殖中的使用量和残留量，降低生产成本，实用性强等优点。本申请人已将该菌株于2019年11月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC No:60890，分类学名称为：Bacillus velezensis。

本发明的第一个目的在于提供一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)将其命名为：WLYS23，保藏号为GDMCC No:60890。该菌株分离自健康杂交鳢的肠道，能有效抑制舒氏气单胞菌、简氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、水生气单胞菌、类志贺邻单胞菌和鰤鱼诺卡氏菌病原菌的生长，具有广谱拮抗水产常见病原菌的作用。

进一步地，所述贝莱斯芽孢杆菌的基因组序列号为CP055160，其基因组中含有如下bacillaene、bacillibactin、bacilysin、difficidin、fengycin、macrolactin H和surfactin等7个拮抗物质合成相关基因簇。而且，WLYS23菌株基因组中不含有hblC、hblD、hblA、hblB、nheA、nheB、nheC、bacT、cytK、cesA、cesH、cesP、cesT、cesB、cesC和cesD等毒素合成相关基因。

本发明的第二个目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23在制备水产病原菌抑制剂中的应用。

优选地，所述水产病原菌包括舒氏气单胞菌、简氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、水生气单胞菌、类志贺邻单胞菌和鰤鱼诺卡氏菌。本发明通过实验研究发现，本发明的贝莱斯芽孢杆菌具有广谱拮抗水产常见病原菌的功能，尤其能有效抑制舒氏气单胞菌、简氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、水生气单胞菌、类志贺邻单胞菌和鰤鱼诺卡氏菌病原菌的生长。

优选地，所述水产病原菌抑制剂为下述中的任一种：

(a)所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23冻干菌粉；

(b)所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23的发酵液提取物；

(c)所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23的发酵液提取物冻干粉。

本发明的第三个目的在于提供一种水产病原菌抑制剂，所述抑制剂包括为下述中的任一种：

(a)所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23冻干菌粉；

(b)所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23的发酵液提取物；

(c)所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23的发酵液提取物冻干粉。

优选地，所述水产病原菌抑制剂为饲料添加剂。在本发明的其中一个实施例中，将WLYS23菌株及其提取物与颗粒膨化料混合制备成饲料，连续4周饲喂杂交鳢，然后进行人工感染病原菌，结果显示，添加贝莱斯芽孢杆菌WLYS23的实验组累积死亡率为40.00％，对照组杂交鳢的累积死亡率为76.67％，表明贝莱斯芽孢杆菌WLYS23可作为饲料添加剂，降低病原菌感染对鱼体造成的死亡率。在饲养罗非鱼的鱼缸中添加贝莱斯芽孢杆菌能够明显降低养殖水体中气单胞菌(如舒氏气单胞菌)的丰度，其丰度可下降1.45～8.25倍。

本发明提供了一种筛选本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌的方法，具体步骤如下：

1)取健康杂交鳢的肠道，清理剪碎并用无菌生理盐水冲洗后，对肠道组织进行匀浆，离心取上清液稀释得到不同浓度梯度的菌悬液，将其涂布在LB固体培养基进行培养，再将单菌落进行纯化培养得到分离菌株；

2)将分离菌株进行拮抗菌的筛选，获得抑菌活性最强的菌株，进一步筛选、鉴定，获得一株编号为WLYS23的菌株。

本发明的第四个目的在于提供贝莱斯芽孢杆菌WLYS23在制备水产免疫增强剂中的应用。

本发明的第五个目的在于贝莱斯芽孢杆菌WLYS23在制备养殖水体改善剂中的应用。

本发明的有益效果为：本发明的一种贝莱斯芽孢杆菌WLYS23分离自健康杂交鳢鱼的肠道，是一种内源性菌株，该菌株对包括舒氏气单胞菌、简氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、水生气单胞菌、类志贺邻单胞菌或鰤鱼诺卡氏菌等21株水产动物致病菌均具有较强的拮抗效果。

附图说明

图1为WLYS23形态学观察结果示意图，A表示在LB固体平板的菌落形态，B表示革兰氏染色，C表示芽孢染色。

图2为基于gyrA序列构建的***发育树图。

图3为WLYS23菌株及其发酵液在脱脂绵羊血琼脂平板上的溶血活性，A表示WLYS23菌株的溶血活性(28℃培养24h)；B表示WLYS23菌株的发酵液提取物在血平板上的溶血活性。

图4为菌株WLYS23的抑菌谱分析结果示意图。

图5为菌株WLYS23对淀粉、纤维素、三丁酸甘油酯和蛋白质的胞外水解酶活性检测结果示意图。

图6为菌株WLYS23基因组中7个拮抗物质合成基因簇的检测结果示意图。

图7为菌株WLYS23不同金属离子处理下抗菌粗提物的稳定性示意图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。

材料

实验动物：由中国水产科学研究院珠江水产研究所水产种质中心提供的健康杂交杂交鳢(Channa maculata♀×Channa argus♂)和健康斑马鱼(Danio rerio)。

供试菌株：从健康杂交鳢肠道分离获得到菌株作为体外拮抗实验菌株。

病原指示菌株：详见表1：

表1：病原指示菌菌株

2、主要试剂与仪器

LB培养基和BHI培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司；革兰氏染色试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自BIOMIGA公司；常用药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；PCR仪，购自力康生物医疗科技控股有限公司；生化培养箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；高速台式冷冻离心机，购自广州易测仪器有限公司。试验中所用引物均由广州艾基生物技术有限公司提供，引物序列详见表2。

表2：PCR扩增所需引物

3、培养基

LB培养基用于菌株WLYS23的培养，BHI培养基用于病原指示菌的培养。产淀粉酶定性培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaCl 5g，可溶性淀粉20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，调整pH为7.2～7.4，121℃灭菌15min。产纤维素酶定性培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaCl 5g，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌15min。产脂肪酶定性培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaCl 5g，三丁酸甘油酯10g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min。产蛋白酶定性培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaCl 5g，脱脂奶粉20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4，121℃灭菌15min。

实施例1菌株的筛选

1、分离筛选

筛选方法：健康杂交鳢，解剖后取其肠道(中肠)，纵向剪开后用无菌生理盐水冲洗3次，然后肠道组织进行匀浆，短暂离心后，取上清液组织液，置于80℃水浴10min，将组织液10倍、100倍稀释。组织原液、10倍和100倍稀释液分别涂布LB平板(3个重复)，置于37℃培养箱过夜培养。挑取单克隆菌落接种至LB液体培养基中，培养至对数生长期时备用。

病原指示菌为舒氏气单胞菌WL-23，该菌在BHI(脑心浸液培养基)培养基中培养至对数生长期，使用生理盐水稀释至10⁷CFU/mL，取200μL菌液涂布于BHI固体平板，用打孔器打孔(直径6mm，每个平板打4个孔)，晾干10min后，将上述单克隆菌液(50μL)加入小孔中(3个重复)，置于30℃培养24h，测量每个孔的抑菌圈大小，筛选出抑菌圈最大的拮抗菌株，将其命名为：WLYS23。并且，本申请人已将该菌株于2019年11月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC No:60890，分类学名称为：Bacillus velezensis。

实施例2鉴定

1、形态学观察

根据《常见细菌***鉴定手册》，将筛选得到的菌株WLYS23划线接种到LB固体平板上，于37℃培养12h后，观察菌落形态。对菌株WLYS23进行革兰氏染色，将单菌落转接到LB液体培养基中，37℃、180rpm培养6h，用无菌吸管吸取少量菌液于载玻片上，按常规方法进行革兰氏染色，观察菌体形态。对菌株WLYS23进行芽孢染色，将单菌落转接在LB液体培养基中，37℃、180rpm培养30h后，利用孔雀石绿进行芽孢染色，观察芽孢和菌体形态。

结果如图1所示，LB培养基上WLYS23菌株的菌落呈乳白色，表面粗糙且边缘不规则，向上凸起，表面湿润、有皱褶，不透明，菌落有粘液性，直径为3mm左右。经革兰氏染色镜检后发现菌体被染成紫色，形态呈短杆状，多数成对或呈链状排列，少数单个排列，为革兰氏阳性菌。经孔雀石绿和番红染色，菌体被染成红色，芽孢被染成绿色，呈椭圆形，其芽孢率≥90％。

2、生理生化鉴定

根据革兰氏结果对菌株WLYS23进行生理生化测定，利用API 50 CHB(购自bioMérieux公司)生理生化鉴定试剂条和HBI芽孢杆菌鉴定条(青岛海博生物技术有限公司)，按说明书程序操作，读取细菌鉴定结果，结果如表3所示，结果表明WLYS23菌株与贝莱斯芽孢杆菌CR-502^T的生理生化特征相近，WLYS23菌株初步被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。

表3：WLYS23菌株的生理生化特征

注：CR-502^T为参考菌株(参考文献：Ruiz-García,C.,Béjar,V.,Martínez-Checa,F.,Llamas,I.and Quesada,E.(2005)Bacillus velezensis sp.nov.,asurfactant-producing bacterium isolated from the river Vélez in Málaga,southernSpain.Int J Syst Evol Micr 55,191-195.)+，反应为阳性；–，反应为阴性；ND，不确定。

3、分子生物学鉴定

按BIOMIGA公司DNA提取试剂盒说明书提取菌株WLYS23的基因组DNA。使用16SrRNA基因通用引物和gyrA基因引物进行目的基因扩增。16SrRNA基因的PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃充分延伸10min。gyrA基因的PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，共35个循环；最后72℃充分延伸10min。取5μL扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后进行观察，将阳性PCR产物进行测序分析。将测得基因序列在GenBank数据库中进行Nucleotide BLAST序列比对，使用MEGA 7.0软件中邻接法(Neighbor joining，NJ)构建***进化树，并通过自检分析(Boostrap)进行置信度检测，自检数据集为1000次。

测序结果表明菌株WLYS23的16s rRNA基因全长约为1500bp，比对结果显示，菌株WLYS23与芽孢杆菌属的同源性最高，相似度为100％。再利用gyrA引物对菌株WLYS23的特异性序列进行PCR扩增，测序结果表明，菌株WLYS23的gyrA基因序列全长2500bp，将测序得到的gyrA基因序列提交至NCBI进行同源性检索分析，从数据库检索筛选出14株同源性高的序列进行***发育树的构建，结果如图2所示，通过比较发现，菌株WLYS23与贝莱斯芽孢杆菌属于同一个分支，并与Bacillus velezensis LG37相似性最高，相似度高达100％。结合细菌形态特征及生理生化特征，将菌株WLYS23鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。

4、生物安全性评价

将WLYS23菌株培养至对数生长期后，稀释至1×10⁴CFU/mL，吸取100μL菌液涂布至脱脂绵羊血琼脂平板上，置于28℃培养箱中培养24h，观察菌落周围是否有溶血环。结果显示，WLYS23菌株的菌落周围没有溶血环(图3A)，即该菌株不溶血。此外，WLYS23菌株的拮抗物质冻干粉经过0.2μm滤器过滤除菌后，分别制备成10mg/mL和5mg/mL的液体制剂，然后分别滴加10μL至脱脂绵羊血琼脂平板上，置于28℃培养箱中培养24h，观察拮抗物质是否具有溶血活性。结果显示，10mg/mL和5mg/mL的拮抗物质均不能产生溶血环(图3B)，表明WLYS23菌株的拮抗物质不具有溶血活性。综上可知，WLYS23及其拮抗物质均不溶血，表明它们具有较高的生物安全性。

通过腹腔注射法检测菌株WLYS23对杂交鳢[(38.52±4.12g)g/尾]和斑马鱼的生物安全性，杂交鳢和斑马鱼均于玻璃缸中暂养一周后分组，每组平行随机选取15尾。实验设置三个不同注射浓度的实验组和一个空白对照组。实验组注射浓度梯度分别为2×10⁹CFU/mL、2×10⁸CFU/mL、2×10⁷CFU/mL。杂交鳢实验组每尾腹腔注射WLYS23菌液100μL，阴性对照组每尾腹腔注射生理盐水100μL；斑马鱼实验组每尾注射20μL，阴性对照组每尾注射20μL。试验观察周期为7d，每天记录试验鱼的感染症状和死亡数量。

实验结果表明，实验期间内，实验组鱼均未出现死亡及其它异常现象，表明菌株WLYS23对杂交鳢和斑马鱼具有良好的生物安全性。

WLYS23菌株的拮抗物质冻干粉加入无菌水后经过0.2μm滤器过滤除菌后，配置成10mg/mL注射液。选取健康杂交鳢和斑马鱼，分别腹腔注射100和20μL的注射液，每组10尾；对照组分别腹腔注射等体积的无菌PBS(每组10尾)。实验组和对照组的杂交鳢、斑马鱼均连续观察2周，记录实验鱼的死亡和临床症状。结果发现，实验组和对照组的鱼均没有任何临床正常出现，而且未有实验鱼死亡，表明WLYS23的拮抗物质对杂交鳢和斑马鱼具有较高的生物安全性。

实施例3抗菌谱分析

采用打孔平板对峙法检测菌株WLYS23对淡水鱼类常见水产病原菌的拮抗活性，病原指示菌详见表1。新鲜过夜培养的指示菌菌液，调整浓度为1×10⁷CFU/mL，分别吸取200μL均匀涂布到BHI琼脂平板上，再用无菌打孔器(直径6mm)均匀打3个孔，每个小孔中加入50μL培养至OD₆₀₀＝1.5时的WLYS23菌液。放置30℃恒温培养箱培养24h，观察并测定抑菌圈直径(包括孔径)。数据分析采用SPSS 21.0进行处理分析。

抗菌谱实验结果表明，菌株WLYS-23对表1中常见水产病原菌均具有明显的抑菌作用(图4)。其中，WLYS23菌株对舒氏气单胞菌的抑菌作用最强，表现为抑菌圈直径最大(如对舒氏气单胞菌WL1372的抑菌圈直径为24.50mm)。整体而言，WLYS23菌株对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌的抑菌作用无显著差异。这表明本发明中的WLYS23菌株对多种水产病原菌具有广谱的抑菌活性。

实施例4胞外水解酶活性检测

对菌株WLYS23的淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶等胞外水解酶活性进行检测。用无菌打孔器(直径6mm)在定性培养基上打3个孔，每孔加入过夜培养的的菌液60μL，设置3个重复，30℃培养20h。向纤维素酶定性培养基中加入适量1％刚果红染液，覆盖整个平板，染色30min后倾去刚果红染液，加入1mol/mL的NaCl溶液脱色，静置30min后倾去NaCl溶液，记录透明水解圈直径。向淀粉酶定性培养基中加入适量碘液，均匀涂布覆盖平板，静置10min，记录碘液染色的蓝紫色平板上出现显色圈情况。测量并记录蛋白酶定性培养基和脂肪酶定性培养基上透明圈的直径。

实验结果如图5所示，菌株WLYS23在对应定性培养基中均能形成水解圈，说明菌株WLYS23对淀粉、纤维素、三丁酸甘油酯和蛋白质均具有一定的水解能力，均具有分泌胞外淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶的能力。

实施例5药物敏感性实验

采用纸片琼脂扩散法检测菌株WLYS23对抗菌药物的敏感性。将供试菌株接种到BHI液体培养基中，30℃、200rpm摇床过夜培养，用0.75％无菌生理盐水调整菌液浓度为0.5麦氏比浊度，采用涂布法接种200μL于BHI琼脂培养基中，待干后用无菌镊子将药敏纸片均匀地贴在培养基表面，将平板倒置，于30℃培养20h，测量抑菌圈直径。结果参照药敏纸片说明书，判断菌株的药物敏感特性。试验结果如表4所示，菌株WLYS23对乙酰螺旋霉素等20种抗菌药物均敏感，表明菌株WLYS23可能不含有以上这些药物的耐药基因。

表4：菌株WLYS23药物敏感性试验结果

实施例6WLYS23菌株的全基因组测序以及抗菌物质基因簇的分析

分离菌株WLYS23培养至对数生长期后，收集菌体，提取基因组DNA，进行全基因组测序分析。基因组测序结果显示，WLYS23菌株的全基因组序列长度为3929662bp，其G+C含量为46.50％，编码基因为3756个，该基因组提交至GenBank，序列号为：CP055160。通过antiSMASH(https://antismash.secondarymetabolites.org/)在线分析WLYS23基因组序列中的拮抗基因簇，结果显示，该菌基因组中含有7个拮抗物质合成基因簇，分别为bacillaene、bacillibactin、bacilysin、difficidin、fengycin、macrolactin H和surfactin(图6)。

实施例7：生物安全相关基因(簇)的分析

通过基因比对分析WLYS23菌株基因组中是否含有生物胺编码基因、肠毒素基因以及抗生素基因等。具体方法是将编码酪氨酸脱羧酶、胍丁胺脱氨酶、精氨酸脱羧酶、精氨酸脱氨酶、组氨酸脱羧酶和腐胺氨甲酰转移酶的生物胺合成相关基因核酸序列与WLYS23基因组(CP055160)进行比对分析。结果如表5所示，WLYS23菌株的基因组中不含以上生物胺合成相关的基因，表明WLYS23菌株不具有合成酪胺、组胺和腐胺的能力。

表5 WLYS23菌株基因组中主要生物胺编码基因的比对分析

此外，通过检索WLYS23菌株基因组中是否存在肠毒素基因如编码溶血素BL的基因hblC、hblD、hblA和hblB；编码非溶血性肠毒素NHE的基因nheA、nheB和nheC；编码肠毒素T的基因bacT；编码细胞毒素K的基因cytK和编码呕吐霉素的基因cesH、cesP、cesT、cesB、cesC和cesD等，结果如表6所示：WLYS23菌株的基因组中均不含以上基因，表明WLYS23不具有编码以上毒素的潜力，进一步证明WLYS23菌株具有较高的生物安全性。

表6：WLYS23菌株基因组中的毒素编码基因比对分析

进一步基于综合抗生素耐药性数据库(CARD)数据库分析WLYS23菌株基因组中的抗生素耐药基因时发现，该菌基因组中含有tet(L)和clbA耐药基因，这两个耐药基因分别与四环素类、林可霉素/链霉素等药物耐药有关，但是药敏试验结果显示WLYS23菌株对以上药物敏感。这表明tet(L)和clbA基因在WLYS23菌株中未呈现耐药表型(表4)。通过对tet(L)和clbA基因上下游序列分析，结果发现这两个基因的上下游序列中不含有可移动遗传元件，表明这两个耐药相关基因发生水平转移的可能性极小。这也进一步表明，虽然WLYS23菌株含有两个耐药相关基因，但是不表现耐药，而且这两个基因的上下游没有可移动遗传元件，不具有基因水平转移的能力，其风险甚小且可控。

综上可知，基于WLYS23菌株基因组中风险基因的分析，结果表明WLYS23菌株在基因组上不含主要生物胺合成相关基因、溶血素和肠毒素等基因，虽然含有两个耐药基因，但是该基因的上下游没有可移动遗传元件，表明WLYS23菌株具有较高的生物安全性。

实施例8 WLYS23菌株的拮抗物质分离及其对病原菌的最低抑菌浓度测定

按照脂肽类抗生素提取分离的方法，采用浓盐酸沉淀法，挑取菌株WLYS23单菌落，接种于LB液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养48h获得发酵培养液，将培养液10000rpm离心10min去掉菌体，上清液用浓盐酸调pH＝2.0，4℃静置过夜，10000rpm离心10min，按上清液体积100倍浓缩，加入适量无菌水，重悬沉淀，用1mol/LNaOH溶液调节pH至7.0左右，再进行真空冷冻干燥，将抗菌粗提液干燥脱水，最后得到粉末状的抗菌粗提物(即拮抗物质)。用无菌水将抗菌粗提物配制成10mg/mL的抗菌粗提液，再经0.22μm微孔滤膜过滤，制备成无菌提取物备用。通过二倍稀释法，将抗菌粗提液分别配制成1024μg/mL、512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL和0.5μg/mL，取50μL不同浓度的抗菌粗提液加入96孔微量培养板中，然后再加入浓度为5×10⁶CFU/mL病原菌的菌悬液。将该96孔微量培养板放置30℃培养箱中培养24h后观察，以不长菌的抗菌粗提液浓度为对病原菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果如表7所示：

表7：WLYS23菌株的无菌提取物对鱼类病原菌的最低抑菌浓度(MIC)

结果如表7显示，WLYS23菌株的无菌提取物对舒氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、简氏气单胞菌、水生气单胞菌、类志贺邻单胞菌、无乳链球菌、海豚链球菌的MIC分别为64、32-64、32-64、64、128、256、64和16μg/mL。以上结果表明，WLYS23菌株的无菌提取物对常见水产病原菌具有较好抑菌效果。

实施例9不同金属离子对抗菌粗提液抑菌活性影响

为了测定金属盐离子对WLYS23菌株无菌提取物的影响，分别将KCl,NaCl,CaCl₂,CdCl₂·2 ¹/₂H₂O,CoCl₂·6H₂O,CuCl₂·2H₂O,CrCl₂,MgCl₂·6H₂O,and FeCl₃·6H₂O盐离子溶液加入至无菌提取物中(1：1，v/v)，至其终浓度分别为1、10和20mmol/L。等体积的无菌水加入提取物中作为对照组样品。取200μL指示菌GYK1(10⁷CFU/mL)涂布至LB琼脂平板上，然后分别在平板上打孔(直径6mm)。每个小孔加入50μL盐处理样品液和对照组样品液。置于30℃恒温培养箱培养24h，测量抑菌圈直径(包括孔径)。数据分析采用SPSS 21.0进行处理分析。结果显示，在高浓度的Cd²⁺、Mg²⁺和Fe³⁺存在时，无菌提取物对嗜水气单胞菌的抑菌活性显著降低(P<0.05)；当K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Cu²⁺和Cr²⁺的浓度为1mmol/L时，无菌提取物对嗜水气单胞菌的抑菌活性无显著影响(P>0.05)，但是当其浓度为20mmol/L时，K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Co²⁺和Cr²⁺也显著抑制无菌提取物的抑菌活性(图7)。这表明金属离子能够影响WLYS23菌株拮抗物质的活性，在使用该拮抗物质时应注意养殖水体、饲料、添加剂等金属离子的含量。本研究为WLYS23菌株拮抗物质今后在不同场景下的应用提供了参考。

实施例10 WLYS23菌株及其提取物的生物防治作用

选取180尾健康杂交鳢(40.35±6.82g)随机分配2组，每组3个平行(250L的鱼缸)。WLYS23菌株接种至LB液体培养基中过夜培养，然后离心收集菌体，并使用无菌PBS缓冲液悬浮菌体，然后将菌体加入颗粒膨化料中，制备成1.0×10⁸CFU/g的饲料，饲喂实验组杂交鳢(每缸30尾，3个鱼缸)，饲喂量为鱼体重的2％。对照组杂交鳢饲喂等量的未处理颗粒膨化料。连续饲喂4周，然后进行人工感染实验，评估饲喂WLYS23菌株的生物防治作用效果。人工感染实验，使用杂交鳢源舒氏气单胞菌WL-23菌株，收集培养至对数生长期的菌株，加入无菌PBS重悬，制备成5×10⁷CFU/mL的菌悬液。实验组和对照组每个鱼缸随机取10尾鱼进行人工感染实验，每尾鱼腹腔注射0.1mL的菌悬液。每天记录实验鱼的死亡和发病情况，连续观察2周。结果显示，饲喂组杂交鳢的累积死亡率为40.00％，对照组杂交鳢的累积死亡率为76.67％，表明饲喂WLYS23菌株后能够明显提高杂交鳢对舒氏气单胞菌的抗病力。

选取120尾平均体重为42.95g的健康杂交鳢，随机分为2组，每组分为3个平行，每个平行20尾。WLYS23冻干粉加入无菌水溶解后制备成10mg/mL的液体，然后经0.22μm滤器过滤除菌，液体无菌提取物加入到颗粒膨化饲料，其终浓度为1g/kg。实验组杂交鳢饲喂含有无菌提取物的饲料，对照组杂交鳢饲喂不含提取物的基础饲料。实验鱼的饲喂量为其体重的2％，连续饲喂5d。通过人工感染实验，即实验组和对照组的杂交鳢每尾注射0.1mL的WL-23菌液，评估饲喂无菌提取物对杂交鳢的生防效果。结果显示，实验组杂交鳢的累积死亡率为36.67％，对照组杂交鳢的累积死亡率为86.67％。通过计算其相对保护率可知，饲喂无菌提取物后的RPS＝57.41％，RPS的计算方法为RPS＝[1-(实验组累积死亡率/对照组累积死亡率)]×100％。由此可知，饲喂WLYS23的无菌提取物能够显著提高杂交鳢对舒氏气单胞菌的抗病力。

实施例11 WLYS23菌株能够降低罗非鱼养殖水体中舒氏气单胞菌的丰度

选用20g左右的健康罗非鱼，每个鱼缸加入100L曝气后的自来水，并放入10尾健康罗非鱼。实验组1(3个平行，每个平行10尾鱼)同时加入贝莱斯芽孢杆菌WLYS23和罗非鱼源舒氏气单胞菌LF1708，并使水体中两种细菌的终浓度均为1×10⁶CFU/mL；实验组2(3个平行，每个平行10尾鱼)同时加入枯草芽孢杆菌BS168(该菌不能拮抗LF1708菌株)和舒氏气单胞菌LF1708，并使水体中两种细菌的终浓度均为1×10⁶CFU/mL。对照组(3个平行，每个平行10尾鱼)仅仅加入舒氏气单胞菌LF1708，并使水体中细菌的终浓度均为1×10⁶CFU/mL。分别于实验后的第1、2、3和5天取水样，分别稀释10倍和100倍，涂布气单胞菌选择性培养基，置于30℃培养箱中培养36h后观察菌落形态和颜色，同时挑取疑似菌落进行PCR检测验证，检测方法参考申请号为：201210467910.1，名称为《一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测引物组、试剂盒及方法》的专利文献。实验结果显示，实验组1的养殖水体中舒氏气单胞菌含量在第1、2、3和5天时分别为9356、3514、1237和322CFU/mL(以上为平均值)；实验组2的养殖水体中舒氏气单胞菌含量在第1、2、3和5天时分别为13606、10125、6451和2658CFU/mL(以上为平均值)。对照组养殖水体中舒氏气单胞菌含量在第1、2、3和5天时分别为35730、10661、7545和4281CFU/mL(以上为平均值)。这表明养殖水体中添加贝莱斯芽孢杆菌WLYS23菌株后，能够显著降低水体中舒氏气单胞菌的丰度，降低水体中的病原菌含量。根据水体中病原菌丰度计算可知，与不具有拮抗功能的枯草芽孢杆菌BS168菌株(阳性对照菌株)相比，WLYS23菌株使水体中的舒氏气单胞菌丰度降低了1.45～8.25倍。这进一步表明，贝莱斯芽孢杆菌WLYS23具有降低养殖水体中病原菌含量的作用，在水产养殖的病害防控过程中具有广阔的应用空间。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WLYS23，其特征在于，该菌分离自健康杂交鳢的肠道，保藏编号为：GDMCC No：60890。

2.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌的基因组序列号为CP055160，其基因组中含有如下bacillaene、bacillibactin、bacilysin、difficidin、fengycin、macrolactin H和surfactin 7个拮抗物质合成相关基因簇，WLYS23菌株基因组中不含有hblC、hblD、hblA、hblB、nheA、nheB、nheC、bacT、cytK、cesA、cesH、cesP、cesT、cesB、cesC和cesD毒素合成相关基因。

3.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌WLYS23在制备水产病原菌抑制剂中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水产病原菌包括舒氏气单胞菌、简氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、水生气单胞菌、类志贺邻单胞菌或/和鰤鱼诺卡氏菌。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水产病原菌抑制剂为下述中的任一种：

(a)所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23冻干菌粉；

(b)所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23的发酵液提取物；

(c)所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23的发酵液提取物冻干粉。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水产病原菌抑制剂为饲料添加剂。

7.一种水产病原菌抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括为下述中的任一种：

(a)所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23冻干菌粉；

(b)所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23的发酵液提取物；

(c)所述贝莱斯芽孢杆菌WLYS23的发酵液提取物冻干粉。

8.一种筛选本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)取健康杂交鳢的肠道，清理剪碎并用无菌生理盐水冲洗后，对肠道组织进行匀浆，离心取上清液稀释得到不同浓度梯度的菌悬液，将其涂布在LB固体培养基上进行培养，再将单菌落纯化培养得到分离菌株；

2)将分离菌株进行拮抗菌的筛选，获得具有较强抑菌活性的菌株，进一步筛选、鉴定，获得一株编号为WLYS23的菌株。

9.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌WLYS23在制备水产免疫增强剂中的应用。

10.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌WLYS23在制备养殖水体改善剂中的应用。

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