CN116784421B - 一种唾液乳杆菌在牛蛙蝌蚪养殖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种唾液乳杆菌在牛蛙蝌蚪养殖中的应用，属于水产养殖技术领域。本发明为保证唾液乳杆菌GZPH2对牛蛙蝌蚪良好的益生作用，在牛蛙蝌蚪养殖过程中，将唾液乳杆菌GZPH2培养液以浓度为106～108CFU/g直接拌喂于牛蛙蝌蚪饲料中，可降低潜在有害菌(包括细菌和真菌)的相对丰度，改善肠道菌群健康，进而强化机体各机能，显著提高体重增长率，降低蝌蚪红肚病的患病率和死亡率，更好地满足牛蛙蝌蚪绿色健康养殖生产实践的需要。

Description

一种唾液乳杆菌在牛蛙蝌蚪养殖中的应用
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种唾液乳杆菌在牛蛙蝌蚪养殖中的应用。
背景技术
牛蛙(Rana catesbeiana)属于脊索动物门(Chordate)、两栖纲(Amphibia)、无尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)，为蛙属中的大型食用蛙。其肉质鲜美，营养丰富，具有高蛋白、低脂肪等特点，其肌肉氨基酸总量占干物质总量90.01％，鲜味氨基酸含量27.91％，为食品中不可多得的优质蛋白质源之一。
牛蛙原产于北美洲，于1959年从古巴引入我国。近年来牛蛙养殖业在我国发展迅速，2021年全国牛蛙养殖产量超过50万吨，已成为新兴的特种水产养殖品种之一。
牛蛙养殖密度高，病害频发，不但给养殖业造成极大经济损失，而且也危害食品安全。牛蛙养殖中的疾病主要包括细菌性疾病(如：红腿病、腹水病)、真菌性疾病(如：壶菌病)、寄生虫疾病(如：隐孢子虫病)、病毒性疾病(雷纳病毒)等。其中细菌性疾病是牛蛙养殖中最常见、最严重的疾病之一。感染牛蛙发病的细菌病原菌主要有铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、摩根氏菌(Morganella morganii)等，主要症状包括红腿、皮肤溃烂、腹部肿大等。在广东省某牛蛙养殖场的牛蛙蝌蚪养殖生产中，有蝌蚪肚子出现红色症状，随后腹部积水肿大，进而死亡。目前尚未发现牛蛙蝌蚪中该症状的相关报道，故我们暂命名其为红肚病。
目前，在牛蛙养殖过程中主要通过使用抗生素等化学药物来防控病害。然而，这类药物长期使用易导致药物残留、引起致病菌产生抗药性，从而引发食品安全问题。因此，研究一种绿色安全环保且可有效预防病害发生的方法十分必要。
微生态制剂是从动物或自然界分离、鉴定或通过生物工程人工组建的有益微生物，经培养、发酵等工艺制成的含有活菌并用于动物的生物制剂。微生态制剂是利用特定微生物与病原菌之间的相互作用或竞争关系，控制病原菌繁殖，从而达到改善宿主健康的目的，为绿色安全环保且可替代化学药物的有效方法之一。
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)作为一类微生物制剂，凭借其良好的益生作用在水产养殖中应用广泛。乳酸菌为无芽孢、革兰氏染色阳性菌，为一类能够利用可发酵性碳水化合物产生大量乳酸的细菌总称。乳酸菌在水产养殖中的作用机制主要为：一，乳酸菌可分泌淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和植酸酶等消化酶，促进机体消化吸收；二，乳酸菌可产乳酸、乙酸等有机酸，降低环境pH值，抑制腐败菌和致病菌繁殖；三，乳酸菌产生类似细菌素的细小蛋白质或肽，可杀灭李斯特菌、金黄色葡萄球菌等致病菌，提高宿主存活率。
乳酸菌的作用主要体现在对水产动物肠道菌群的优化、生长性能的提高及其抗病能力的增强等方面。唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)隶属于乳杆菌属(Lactobacillus)，为有益菌之一。目前唾液乳杆菌在水产养殖中的研究应用主要集中在鱼、虾、蟹等，而国内针对乳酸菌来改善牛蛙肠道菌群、提高抗病能力的应用未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种唾液乳杆菌在牛蛙蝌蚪养殖中的应用。
本实验从市售泡菜中分离出一株唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)GZPH2。所述的唾液乳杆菌为Lactobacillus salivarius GZPH2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2014年11月27日，保藏地址：武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号：CCTCC M2014598。该菌株在专利“CN104611251A、一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌及其应用”中公开。
唾液乳杆菌GZPH2对39株受试致病菌株中的33株表现出抗菌活性，并且GZPH2(上清液)对13株致病菌达到了强抑菌活性(+++，抗菌直径>15mm)。
本发明利用唾液乳杆菌GZPH2调节牛蛙蝌蚪肠道菌群结构，提升有益菌的相对丰度，降低(潜在)有害菌的相对丰度，进而促进牛蛙蝌蚪的生长，抑制牛蛙蝌蚪红肚病的发生，提高蝌蚪存活率。通过将唾液乳杆菌GZPH2培养液拌喂于牛蛙蝌蚪饲料中实现。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种唾液乳杆菌在牛蛙蝌蚪养殖中的应用，所述的唾液乳杆菌为Lactobacillus salivariusGZPH2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2014年11月27日，保藏地址：武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号：CCTCCM2014598；
所述的应用是将唾液乳杆菌GZPH2培养液拌喂于牛蛙蝌蚪饲料中实现，拌喂于牛蛙蝌蚪饲料中的唾液乳杆菌GZPH2浓度为106～108CFU/g。
优选地，所述的唾液乳杆菌GZPH2培养液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将唾液乳杆菌菌株接种到MRS液体培养基中培养得到种子液；
(2)接种步骤(1)所述种子液到MRS液体培养基中再次培养，得到浓度为1～5×109CFU/mL的唾液乳杆菌。
更优选地，步骤(1)中，所述的培养的条件为在37℃的条件下培养24h；
步骤(2)中，所述的再次培养的条件为在37℃的条件下培养24h。
优选地，所述MRS液体培养基通过如下步骤制备得到：称取蛋白胨5g，牛肉浸粉5g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，吐温-80 1g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，七水合硫酸锰0.25g，七水合硫酸镁0.1g，最终pH6.5，在121℃、0.1MPa下灭菌处理20min，保存备用。
优选地，从蝌蚪刚孵出开始，到***发育前，每日投加2次含有唾液乳杆菌GZPH2培养液的牛蛙蝌蚪饲料。
本发明还提供一种牛蛙蝌蚪饲料，所述牛蛙蝌蚪饲料中含有唾液乳杆菌GZPH2，唾液乳杆菌GZPH2在饲料中的浓度为106～108CFU/g；
所述的唾液乳杆菌为Lactobacillus salivariusGZPH2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2014年11月27日，保藏地址：武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号：CCTCC M2014598。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一种唾液乳杆菌在牛蛙蝌蚪养殖中的应用。从蝌蚪刚孵出开始，到***发育前，将唾液乳杆菌GZPH2培养液拌喂于每天的牛蛙蝌蚪饲料中，可提高牛蛙蝌蚪体重增长率，降低蝌蚪红肚病的患病率，提高其存活率。同时，该方法有无药物残留、不产生耐药性、可大面积使用的优点。
(2)本发明提供了一种改善牛蛙蝌蚪肠道菌群的方法。唾液乳杆菌GZPH2培养液可调控牛蛙蝌蚪肠道菌群结构，降低潜在致病菌的丰度，进而蝌蚪肠道健康状况。具体地，唾液乳杆菌GZPH2可提高严格梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)、Romboutsia、微杆菌属(Microbacterium)等有益菌的相对丰度；能够显著降低引发蝌蚪红肚病的潜在细菌病原：摩氏摩根菌(Morganella)、漫球菌属(Vagococcus)、丛毛单胞菌属(Comamonas)的相对丰度；还可降低引发蝌蚪红肚病的潜在真菌病原：Meyerozyma-Candida_clade、Nakaseomyces-Candida_clade和unclassified_f__Aspergillaceae的相对丰度，且使用20天后，Meyerozyma-Candida_clade和Nakaseomyces-Candida_clade均不存在。
附图说明
图1是实施例1中正常组与红肚组牛蛙蝌蚪肠道细菌菌群在属水平上的的Student’s t-test检验；其中，N组代表正常组，R组代表红肚病组，纵坐标为两组具有显著差异的菌属(p-value<0.05)。
图2是实施例2中正常组与红肚组牛蛙蝌蚪肠道真菌菌群在属水平上的的Student’s t-test检验；其中，N组代表正常组，R组代表红肚病组，纵坐标为两组具有显著差异的菌属(p-value<0.05)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中涉及到的培养基：
MRS液体培养基：称取蛋白胨5g，牛肉浸粉5g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，吐温-801g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，七水合硫酸锰0.25g，七水合硫酸镁0.1g，最终pH6.5。分装后，在121℃、0.1MPa下灭菌处理20min，保存备用。
MRS固体培养基：MRS液体培养基中加入15‰的凝胶强度为1300g/cm2的琼脂粉，在121℃、0.1MPa下灭菌处理20min，冷却至60℃时，倾倒于无菌平板，待凝固后翻转保存备用。
实施例中所用的唾液乳杆菌为Lactobacillus salivarius GZPH2。
实施例1唾液乳杆菌对牛蛙蝌蚪(孵出0-40天)测试试验
1.试验准备
牛蛙蝌蚪幼苗：刚孵出的蝌蚪，本次实施例的蝌蚪幼苗全部由广东省的一个牛蛙蝌蚪孵化场提供，大小一致，活跃健康，无疾病迹象。
唾液乳杆菌菌液制备：取1mL唾液乳杆菌GZPH2菌液转接至50mL MRS液体培养基中，37℃恒温静止培养24h。将培养得到的乳酸菌菌液重复两次转接至新的MRS液体培养基中培养，使其充分活化，作为种子液保存于4℃冰箱中。取唾液乳杆菌GZPH2种子液10mL，转接至500mL MRS液体培养基中，37℃恒温静止培养24h，所得菌液去除MRS培养基，用生理盐水悬浮，得浓度为1～5×109CFU/mL的唾液乳杆菌，将其置于4℃冰箱中保存备用。
2.试验开展
蝌蚪饲喂实验在广东省某水产养殖基地进行，共40天。实验分为3组，除设置仅喂食基础日粮的对照C组外，另设置两不同剂量实验组，即H组(相对高浓度实验组)和L组(相对低浓度实验组)，前者在基础日粮中添加唾液乳杆菌GZPH2，使其最终浓度为1.0×108CFU/g；后者最终浓度为1.0×106CFU/g。
选取9个大小为20×5×1.2m和培养条件相同培养池。先用0.01M高锰酸钾溶液对每个培养池进行消毒，然后灌入经过40目过滤除杂的洁净水至培养池水高度为50cm。之后，每池放入购于同一个育苗基地的刚孵出的健康牛蛙蝌蚪幼苗10万尾。养殖水体盐度为0‰，溶氧量维持在5mg/L以上，室温保持25℃左右，每隔4天换一次水。蝌蚪饵料(粉料)购于某饲料有限公司(包含鱼粉、豆粕、高筋面粉、鱼油、多种无机盐和多种维生素等)，每培养池每日8:00和18:00各喂一次。
养殖过程中观察蝌蚪健康状况，第0、20、40天分别取蝌蚪样品称量体重。试验结束时，统计蝌蚪患红肚病的数目和死亡数目，计算蝌蚪红肚患病率和死亡率。
3.实验结果
表1牛蛙蝌蚪生长参数指标
注：C组为对照组，L组为低浓度乳酸菌组，H组为高浓度乳酸菌组。同一行上标不同且无相同字母表示差异显著(p<0.05)。
TWG(mg)＝Wi-W0
PTWG(％)＝100×(Wi-W0)/W0
Wi是蝌蚪的最终平均体重，W0是蝌蚪的初始平均体重。
由表1可知，乳酸菌组L和H组的红肚患病率分别为26％、30％，明显低于对照组C组(40％)。同时，L和H组的死亡率分别为21％、23％，也明显低于C组(34％)。在体重增长方面，到第40天时，L和H组蝌蚪体重显著高于C组(p<0.05)。L和H组中蝌蚪的TWG、PTWG指标均显著高于对照组C组(p<0.05)，两乳酸菌组的蝌蚪表现出明显的生长优势。
综上，本发明的唾液乳杆菌GZPH2可有效降低牛蛙蝌蚪红肚患病率和死亡率，提高牛蛙蝌蚪的存活率，同时可促进其体重增长，提高经济效益。
实施例2唾液乳杆菌对牛蛙蝌蚪肠道细菌菌群的影响研究
1.试验过程
在实施例1的基础上，取第0、20、40天的牛蛙蝌蚪肠道内容物进行16SrRNA基因的高通量测序分析。同时，取孵出后20天左右的红肚和正常蝌蚪进行16S rRNA基因的高通量测序分析。高通量测序过程如下：
(1)总DNA提取和检测
参照FastSpin Kit for Soi(lMP Biomedical,USA)说明书提取牛蛙蝌蚪肠道内容物的DNA，利用NanoDrop2000超微量分光光度计进行DNA纯度和浓度检测。
(2)PCR扩增
取适量检测后的样品DNA用无菌水稀释，用作PCR模板，使用带barcode的原核微生物16S rRNA的通用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，再对样品基因组的16SrRNA基因的V3-V4高变区段进行PCR扩增。PCR反应体系为：Template DNA 10ng，上游引物3NDF 0.8μL，下游引物V4_euk_R2 0.8μL，5×TransStart FastPfu 4μL，dNTP(2mM each)2μL，FastPfu Polymerase 0.4μL，BAS0.2μL。PCR具体扩增程序如下：95℃预变性5min，28个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s)，然后72℃稳定延伸10min，最后在4℃进行保存。
(3)产物鉴定、纯化及定量
PCR产物鉴定：每个样本进行3个PCR重复，将3个重复的PCR产物混合，然后使用2％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
PCR产物纯化：PCR产物纯化使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit。
PCR产物定量与均一化：将PCR产物用QuantusTMFluorometer进行检测定量。按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
(4)建库和测序
PCR产物经NEXTFLEX Rapid DNA-Seq试剂盒建库，检测后合格的扩增产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序，测序平台为Illumina Miseq PE300。
(5)序列处理分析
在分析原始测序序列之前，使用Trimmomatic软件进行质控，使用FLASH软件进行拼接。然后使用软件UPARSE(version 7.1http://drive5.com/uparse/)进行OTU聚类：将相似度等于或者高于97％的有效序列归为一个OTU单元，得到OTU代表性序列。
(6)数据分析
通过比对16S rRNA基因数据库Silva138(https://www.arb-silva.de/)，设置比对阈值为70％，对处理后的每条代表性序列进行物种分类注释然后进行相关分析，使用的软件为RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)。采用IBM SPSS 25软件执行单因素方差分析(ANOVA)检验显著性差异，事后多重比较分析采用Tukey检验。
2.实验结果
(1)红肚病蝌蚪属水平上的细菌群落分析
在属水平上对正常蝌蚪组(N组)和红肚病蝌蚪组(R)组的细菌属丰度进行Student’s t-test检验(图1)。N组中Clostridium_sensu_stricto_1、Microbacterium、Mycobacterium、Nocardia、norank_f__norank_o__PeM15、Terrisporobacter、Tyzzerella和unclassified_f__Ruminococcaceae丰度显著高于R组(p＜0.05)，而R组中Comamonas、Lysinibacillus、Morganella和Vagococcus的丰度显著高于N组(p＜0.05)。
其中，摩氏摩根菌(Morganella)属肠杆菌科，为机会性病原体，可引起人类脓毒症、蜂窝组织炎和术后伤口感染等，也可引起鸡、中华鳖和胡子鲶等感染。漫球菌属(Vagococcus)与肉类腐败变质直接相关，在患病海马中显著增加。丛毛单胞菌属(Comamonas)为革兰氏阴性菌，为人类机会致病菌，与阑尾破裂继发腹膜炎相关。这些潜在致病菌在红肚病蝌蚪R组中的相对丰度显著高于正常蝌蚪N组，提示它们可能为引发蝌蚪红肚病的病原体。
(2)唾液乳杆菌对蝌蚪肠道细菌群落影响分析
分析唾液乳杆菌在0～40天对牛蛙蝌蚪肠道菌群的影响，同时将其与红肚实验的N、R组比较，对相对丰度值前50的属做了进一步的分类统计。各样本中益生菌属/功能性菌属(功能不明确的未显示)相对丰度如表2，各样本中潜在致病细菌菌属(功能不明确的未显示)的相对丰度如表3。
表2各样本中益生菌属/功能性菌属相对丰度
注：N、R分别代表正常蝌蚪和红肚病蝌蚪样本；C0、C20、C40分别代表空白对照组第0、20、40天的样本；L0、L20、L40分别代表试验组(低浓度组)第0、20、40天的样本；H0、H20、H40分别代表试验组(高浓度组)第0、20、40天的样本。同一行上标不同且无相同字母表示差异显著(p<0.05)。
严格梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)为有益菌，常分布于人体和动物肠道中，可产生短链脂肪酸(SCFAs)，抑制有害菌生长。Romboutsia也为有益菌，可产生SCFAs，降低肠道通透性与炎症因子水平，增强宿主抗病能力。微杆菌属(Microbacterium)为放线菌门下的革兰氏阳性菌，它增强免疫酶活性，有研究表明它可显著提高南美白对虾幼苗的存活率。这三种有益菌在L和H组中的相对丰度均高于C组。戈登杆菌属(Gordonibacter)存在于人体和动物肠道中，可将膳食多酚(如鞣花单宁)转化为尿石素，提高生物利用率。
统计各样本益生菌属/功能性菌属相对丰度，可以发现，第20和40天时，L和H组的有益菌总相对丰度显著高于C组。
表3各样本中潜在致病细菌菌属的相对丰度
注：N、R分别代表正常蝌蚪和红肚病蝌蚪样本；C0、C20、C40分别代表空白对照组第0、20、40天的样本；L0、L20、L40分别代表试验组(低浓度组)第0、20、40天的样本；H0、H20、H40分别代表试验组(高浓度组)第0、20、40天的样本。同一行上标不同且无相同字母表示差异显著(p<0.05)。
前文提到，潜在致病菌Morganella、Vagococcus、Comamonas在R组中显著高于N组，可能为引发蝌蚪红肚病的病原体，而它们在L和H组中显著低于R组，甚至不存在(表3)，由此表明唾液乳杆菌GPHZ2对牛蛙蝌蚪肠道的红肚病潜在致病菌具有良好的控制效果。
类香味菌属(Myroides)为可引起严重感染的条件致病菌之一，与黄喉拟水龟腐皮病有关。R组中Myroides的相对丰度显著高于N组，而在第20、40天时，L和H组中该菌相对丰度均显著低于N组和R组(P＜0.05)，相对丰度均低于0.2％，说明唾液乳杆菌GZPH2对类香味菌属起到了较好的控制作用。
拟杆菌属(Bacteroides)为阑尾炎和败血症的常见致病菌，在感染鲤疱疹病毒的银鲫肠道显著增加，本研究中R组拟杆菌属高于N组但不显著，而在L和H组中相对丰度极低(≦0.01％)。假单胞菌属(Pseudomonas)为一类生长适应能力较强的革兰氏阴性菌，其中部分菌种不仅为鱼、虾和甲壳类的病原菌，而且可引起人的急性腹泻和败血症。例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起牛蛙的红腿病。R组中Pseudomonas的相对丰度显著高于N组，而在第20、40天时，该菌在L和H组中几乎不存在(相对丰度低于0.01％)，说明唾液乳杆菌GZPH2对假单胞菌属起到了较好的控制作用。
由表3可知，R组潜在致病菌总相对丰度为8.29±2.21％，显著高于N组的1.67±1.35％(P＜0.05)，而L组和H组在第20、40天时潜在致病菌总相对丰度均低于0.3％，显著低于R和N组(P＜0.05)。
综上可知，唾液乳杆菌GPHZ2可提升牛蛙蝌蚪肠道有益菌的相对丰度，抑制潜在致病菌的繁殖，改善肠道健康，从而达到对蝌蚪红肚病的防控作用，促进蝌蚪生长。
实施例3唾液乳杆菌对牛蛙蝌蚪肠道真菌菌群的影响研究
在实施例1的基础上，取第0、20、40天的牛蛙蝌蚪肠道内容物进行真菌的18S rRNA基因的高通量测序分析。同时，取孵出后20天左右的红肚和正常蝌蚪进行18S rRNA基因的高通量测序分析。高通量测序过程如下：
(1)总DNA提取和检测
参照FastSpin Kit for Soi(lMP Biomedical,USA)说明书提取牛蛙蝌蚪肠道内容物的DNA，利用NanoDrop2000超微量分光光度计进行DNA纯度和浓度检测。
(2)PCR扩增
取适量检测后的样品DNA用无菌水稀释至1ng/μL，用作PCR模板，使用带Barcode的真菌18S rRNA特异引物3NDF_V4_euk_R2，进行样品DNA扩增。正向引物3NDF：5’-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3’，反向引物V4_euk_R2：5’-ACGGTATCTRATCRTCTTCG-3’。PCR反应体系为：Template DNA 10ng，正向引物3NDF 0.8μL，反向引物V4_euk_R2 0.8μL，KOD FX NeoBuffer 5μL，dNTP(2mM each)2μL，KOD FX Neo 0.4μL，BAS 0.2μL。PCR具体扩增程序如下：95℃预变性5min，28个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s)，然后72℃稳定延伸10min，最后在4℃进行保存。
(3)产物鉴定、纯化及定量
PCR产物鉴定：每个样本进行3个PCR重复，将3个重复的PCR产物混合，然后使用2％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
PCR产物纯化：PCR产物纯化使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit。
PCR产物定量与均一化：将PCR产物用QuantusTMFluorometer进行检测定量。按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
(4)建库和测序
PCR产物经NEXTFLEX Rapid DNA-Seq试剂盒建库，检测后合格的扩增产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序，测序平台为Illumina Miseq PE300。
(5)序列处理分析
在分析原始测序序列之前，使用Trimmomatic软件进行质控，使用FLASH软件进行拼接。然后使用软件UPARSE(version 7.1http://drive5.com/uparse/)进行OTU聚类：将相似度等于或者高于97％的有效序列归为一个OTU单元，得到OTU代表性序列。
(6)数据分析
通过比对18S rRNA基因的MaarjAM数据库(https://www.maarjam.botany.ut.ee/)，设置比对阈值为70％，对处理后的每条代表性序列进行物种分类注释然后进行相关分析，使用的软件为RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)。采用IBM SPSS 25软件执行单因素方差分析(ANOVA)检验显著性差异，事后多重比较分析采用Tukey检验。
2.实验结果
(1)红肚病蝌蚪属水平上的真菌群落分析
在属水平上对N和R组的细菌属丰度进行Student’s t-test检验(图2)。N组中Talaromyces、Phialemonium相对丰度显著高于R组(p＜0.05)，而R组中unclassified_f__Aspergillaceae、Meyerozyma-Candida_clade、Nakaseomyces-Candida_clade相对丰度显著高于N组(p＜0.05)。
曲霉科(Aspergillaceae)为一类丝状真菌，包含曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)，部分被用于食品、生物技术和制药工业(如Aspergillus oryzae和Penicillium camemberti)，部分则为人类和植物病原菌(如Aspergitllus fumigatus和Penicillium digitatum)。Meyerozyma可导致免疫缺陷、胃肠或心血管手术和肿瘤疾病的患者严重感染。Nakaseomyces clade中最具代表的光滑假丝酵母(Candida glabrata)为一种存在于人胃肠道的常见致病真菌。因此，Meyerozyma-Candida_clade、Nakaseomyces-Candida_clade和unclassified_f__Aspergillaceae推测为引发蝌蚪红肚病的真菌病原体。
(2)唾液乳杆菌对蝌蚪肠道真菌群落影响分析
分析唾液乳杆菌在0-40天对牛蛙蝌蚪肠道真菌菌群的影响，同时将其与红肚实验的N、R组进行比较，对各样本中潜在致病真菌菌属(功能不明确的未显示)的相对丰度进行统计如表4。
表4样本中潜在致病真菌菌属的相对丰度
注：N、R分别代表正常蝌蚪和红肚病蝌蚪样本；C0、C20、C40分别代表空白对照组第0、20、40天的样本；L0、L20、L40分别代表试验组(低浓度组)第0、20、40天的样本；H0、H20、H40分别代表试验组(高浓度组)第0、20、40天的样本。同一行上标不同且无相同字母表示差异显著(p<0.05)。
前文已推测Meyerozyma-Candida_clade、Nakaseomyces-Candida_clade为蝌蚪红肚病的潜在致病真菌属，而在乳酸菌L和H组的第20、40天中，这两种菌属均不存在，说明唾液乳杆菌对它们有抑制作用。茎点霉属(Boeremia)中大多为植物致病菌，如引起西红柿植株的茎腐病和叶腐病症状，秋葵出现斑点病；部分为动物病原体，如Boeremia exigua可引起人类肺部真菌肿块。在第40天时，C组的Boeremia的相对丰度显著上升为11.11±2.27％(p<0.05)，而在乳酸菌L和H组中则以较低的相对丰度存在。统计这三种潜在致病真菌总相对丰度可知，R组的潜在致病真菌总相对丰度为17.54±2.48％，显著高于N组的4.39±2.15％(p<0.05)，而在第20、40天时L和H组潜在致病真菌总相对丰度均低于R组和N组，由此表明唾液乳杆菌GPHZ2可控制牛蛙肠道菌群种潜在致病真菌的繁殖，改善肠道健康，进而达到防控牛蛙蝌蚪红肚病的作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种唾液乳杆菌在制备牛蛙蝌蚪养殖饲料中的应用，其特征在于：所述的唾液乳杆菌为Lactobacillus salivariusGZPH2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期：2014年11月27日，保藏地址：武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号：CCTCCM2014598；
所述的应用是将唾液乳杆菌GZPH2培养液拌喂于牛蛙蝌蚪饲料中实现，拌喂于牛蛙蝌蚪饲料中的唾液乳杆菌GZPH2浓度为106～108 CFU/g。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述的唾液乳杆菌GZPH2培养液的制备方法，包括如下步骤：
（1）将唾液乳杆菌菌株GZPH2接种到MRS液体培养基中培养得到种子液；
（2）接种步骤（1）所述种子液到MRS液体培养基中再次培养，得到浓度为1~5×109 CFU/mL的唾液乳杆菌。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
步骤（1）中，所述的培养的条件为在37℃的条件下培养24h；
步骤（2）中，所述的再次培养的条件为在37℃的条件下培养24h。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述MRS液体培养基通过如下步骤制备得到：称取蛋白胨5g，牛肉浸粉5g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，吐温-80 1g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，七水合硫酸锰0.25g，七水合硫酸镁0.1g，最终pH6.5，在121℃、0.1MPa下灭菌处理20min，保存备用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：从蝌蚪刚孵出开始，到***发育前，每日投加2次含有唾液乳杆菌GZPH2培养液的牛蛙蝌蚪饲料。
6.一种牛蛙蝌蚪饲料，其特征在于，所述牛蛙蝌蚪饲料中含有唾液乳杆菌GZPH2，唾液乳杆菌GZPH2在饲料中的浓度为106～108 CFU/g；
所述的唾液乳杆菌为Lactobacillus salivarius GZPH2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期：2014年11月27日，保藏地址：武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号：CCTCC M2014598。
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