CN104312934A - 一种构建重组酵母生物合成葡萄糖醛酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种构建重组酵母生物合成葡萄糖醛酸的方法，属于代谢工程领域。本发明将不同来源的肌醇加氧酶基因(MIOX)在不同酵母宿主中表达，以葡萄糖或肌醇为底物，实现了葡萄糖醛酸的生物合成。其中，重组毕赤酵母菌株在YPD发酵培养基中生成葡萄糖醛酸20mg/L,在YPD-MI(YPD培养基中加入60mM肌醇)发酵培养基中生成葡萄糖醛酸50mg/L。本发明提出的重组酵母合成葡萄糖醛酸的方法，具有广阔的发展前景，为生物法合成葡萄醛酸提供了新的思路。

Description

一种构建重组酵母生物合成葡萄糖醛酸的方法

技术领域

本发明涉及一种构建重组酵母生物合成葡萄糖醛酸的方法，属于代谢工程领域。

背景技术

葡萄糖醛酸，全称D-(+)-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)，是葡萄糖的伯醇羟基被氧化成羧基形成的化合物，其水溶液不稳定，易转化形成3,6-葡萄糖醛酸内酯，二者在水溶液中处于互变平衡状态。葡萄糖醛酸在加热且有强酸存在时，易发生脱羧而生成CO2、呋喃等产品。

葡萄糖醛酸广泛存在于动植物中，具有重要的生物学功能。它能结合含有羟基、氨基、羧基、巯基等基团的有毒物质，增强毒性物质水溶性，使之快速排出肾脏，起到解毒作用。同时，葡萄糖醛酸能与被结合物分子上活性基团-酚羟基结合，降低相关激素及药物的生物学作用。其衍生物葡萄糖醛酸内酯是也是一种保健药物，它有利于肝脏的解毒，可以预防治疗流行性肝炎、肝硬化、食物及药物中毒，同时还是功能性饮料、保健食品的添加剂。随着人们健康观念的日益增强和对生活质量要求的提高，对于葡萄糖醛酸的需求会越来越大。

目前，葡萄糖醛酸的生产方法主要有：化学氧化法、多糖水解法和生物发酵法。

化学氧化法主要是采用无机氧化或者是催化氧化，目前我国工业生产葡萄糖醛酸及其内酯的主要方法为无机氧化法。无机氧化法选择性差、氧化程度不能有效控制、产物分离回收困难，对环境污染严重。催化氧化主要分为均相催化氧化和非均相催化氧化。

多糖水解法是通过酸或碱水解自然界中存在的多糖醛酸或含糖醛酸的多糖，提取分离获得醛酸。但是由于葡萄糖醛酸间的糖苷键非常稳定，需要强烈的反应条件，如加强酸或强碱，但此种条件下，会对葡萄糖醛酸产生破坏，回收率低。

生物发酵法是利用特定的菌株或生物酶对能形成葡萄糖醛酸或其前体的特定物质进行发酵来制备葡萄糖醛酸。目前对于生物发酵法生产葡萄糖醛酸的研究相对较少，但是生物发酵法具有成本低、环境污染小、特异性高等优点，利用特定的微生物菌株来发酵生产葡萄糖醛酸具有较大的发展前景。

目前葡萄糖醛酸的生产主要是以淀粉为原料，经硝酸氧化，加压水解来生产，这种方法存在这诸多弊端，如环境污染严重、回收困难、选择性差等问题。为了解决上述问题，通过基因工程技术改造微生物细胞的代谢，以改善细胞的性能来发酵生产目的产物，具有广阔的发展前景。

酵母是单细胞低等真核生物，既有原核生物细胞容易培养、生长速度快、操作简单，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能。由于它培养时营养要求低、生长快、培养基廉价、可进行高密度发酵培养，因此是一种可用于生产目标生物产品的优良宿主。

目前尚未发现有通过重组酵母来发酵生产葡萄糖醛酸的报道，原始的酵母菌株并不能生成葡萄糖醛酸，鉴于此，本发明中构建的新型重组工程菌，在微生物发酵生产葡萄糖醛酸方面，提供了新的方法与思路

发明内容

本发明通过在酵母重组菌中表达不同来源的肌醇加氧酶基因(MIOX)，以葡萄糖或肌醇为底物，实现葡萄糖醛酸的生物合成。

本发明提供一种重组酵母菌，是将肌醇加氧酶基因MIOX克隆至出发酵母宿主菌中构建的重组酵母菌。

所述肌醇加氧酶基因MIOX来源于以下任意一种：小鼠(mouse)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、白假丝酵母(Candida albicans)。

所述肌醇加氧酶基因MIOX，在本发明的一种实施方式中是来源于毕赤酵母。

所述肌醇加氧酶基因MIOX，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

所述肌醇加氧酶基因MIOX，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述出发酵母宿主菌是以下任意一种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、毕赤酵母(Pichia pastoris)。

所述出发酵母宿主菌，在本发明的一种实施方式是毕赤酵母。

所述重组酵母菌中，调控表达肌醇加氧酶基因的启动子为GAP、Gal1、AOX1或者TEF1。

本发明还提供一种所述重组酵母菌的构建方法，是将肌醇加氧酶基因MIOX克隆到表达载体上形成重组载体，再将重组载体线性化后转入酵母宿主菌中，得到重组酵母菌。

所述表达载体是以下任意一种：pGAPZA、pGAPZB、pGAPZC、pPICZA、pPICZB、pPICZC及pPIC9K。

本发明还提供一种利用所述重组酵母菌合成葡萄糖醛酸的方法，是将重组酵母菌种子液以5％-10％的接种量接种到发酵培养基中，与25℃-30℃，180rpm-220rpm，培养24h—96h。

所述发酵培养基的碳源为以下任意一种或多种：葡萄糖、肌醇、甘油、蔗糖。

所述发酵培养基，在本发明的一种实施方式中是YPD培养基或YPD-MI培养基(在YPD培养基中添加60mM肌醇)

所述合成葡萄糖酸的方法，在本发明的一种实施方式，具体是：将重组酵母菌在YDP培养基中培养制备种子液，按10％接种量接种到含有发酵培养基中，于温度30℃，摇床转速200rpm，培养60小时。

利用本发明的重组酵母菌合成葡萄糖醛酸，重组毕赤酵母在YPD培养基中产生葡萄糖醛酸20mg/L,在YPD-MI(在YPD培养基中添加60mM肌醇)的培养基中，产生葡萄糖醛酸50mg/L,对照毕赤酵母Pichia pastoris GS115中，没有检测到醛酸。本发明所用的来源于毕赤酵母中的肌醇加氧酶基因与现有报道的来源于小鼠的MIOX氨基酸差异较大，并且目前没有来源于毕赤酵母中MIOX基因能够将肌醇转化为醛酸的相关报道。本发明采用代谢工程的策略，改造微生物菌株来合成目的产物葡萄糖醛酸，为生物法高效生产葡萄糖醛酸打下了坚实的基础。重组酵母表达肌醇加氧酶基因来合成葡萄糖醛酸，还具有培养时营养要求低、生长快、培养基廉价、遗传稳定、表达水平高、可高密度发酵等许多优点。

附图说明

图1：重组毕赤酵母摇瓶发酵产葡萄糖醛酸情况；1为对照菌株Pichia pastoris GS115，2为重组毕赤酵母在YPD培养基中的培养结果，3为重组毕赤酵母在YPD-MI中的培养结果。

图2：LC-MS检测发酵液中葡萄糖醛酸的结果；A为葡萄糖醛酸标样，B为重组毕赤酵母发酵液。

具体实施方式

葡萄糖醛酸的检测：液质联用(LC-MS)，仪器：岛津离子阱飞行时间质谱仪LCMS-IT-TOF分析条件：

流动相：A：1mM甲酸铵+0.01％甲酸+水；B：1mM甲酸铵+乙腈

洗脱程序：0-12min30％B；12-30min30％-65％；30-31min65％-95％；31-35min95％35-36min95％-30％B；36-40min30％

色谱柱：Shim-pack VP-ODS(150L×2.0)

流速：0.15ml/min进样量：5ul

离子化模式：电喷雾负离子模式

雾化气流速：1.5L/min

CDL温度：200℃HB温度：200℃

扫描范围：MS1，m/z150-300

葡萄糖醛酸标样的配制：准确称取10mg葡萄糖醛酸粉末溶于去离子水中，将溶解后的溶液转移至100ml容量瓶中定容，其浓度为100mg/L。再用去离子水分别稀释至50、20、10、5和1mg/L。

实施例1重组酵母菌Pichia pastoris GS115/pGAPZB-MIOX的构建

以毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)基因组为模板，PCR扩增MIOX基因

引物F(序列如SEQ ID NO.3所示)、R(序列如SEQ ID NO.4所示)如下，其中下划线部分为引物酶切位点：

F:CCGCTCGAGATGTCAGTACAAAAAAGCACGAAG

R:TGCTCTAGATCAAAACTTTACCAGCTTTTGAGG

对扩增获得的肌醇加氧酶基因进行XhoI、XbaI双酶切，连接至具有相应切口的表达载体上(载体pGAPZB经XhoI、XbaI双酶切)，转化至E.coil Top10中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒pGAPZB-MIOX，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经BspHI线性化后电转入表达宿主Pichia pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确，验证正确的重组菌命名为Pichia pastoris GS115/pGAPZB-MIOX。

实施例2重组酵母菌Pichia pastoris GS115/pPIC9K-GAP-MIOX的构建

以pGAPZB质粒为模板，PCR扩增GAP启动子，引物为F1(序列如SEQ ID NO.5所示)、R1(序列如SEQ ID NO.6所示)，下划线部分为酶切位点

F1：CGAGCTCAGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTG

R1：CTTCGTGCTTTTTTGTACTGACATCGTTTCGAAATAGTTGTTCAATT

以毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)基因组为模板，扩增MIOX基因，引物为F2(序列如SEQ ID NO.7所示)、R2(序列如SEQ ID NO.8所示)如下，阴影部分为酶切位点

F2：AATTGAACAACTATTTCGAAACGATGTCAGTACAAAAAAGCACGAAG

R2：ATAAGAATGCGGCCGCTCAAAACTTTACCAGCTTTTGAGG

使用融合PCR的方法，将GAP启动子与MIOX基因融合，并在融合片段两端引入酶切位点Sacl，Notl，对融合片段进行双酶切，连接至具有相应切口的表达载体上(pPIC9K经Sac1、Not1双酶切)，将pPIC9K上的AOX启动子置换为GAP启动子，转化E.coli JM109，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒pPIC9K-GAP-MIOX，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经SalI线性化后点转入表达宿主Pichia pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确，验证正确的重组菌命名为Pichia pastoris GS115/pPIC9K-GAP-MIOX。

实施例3重组毕赤酵母发酵生产葡萄糖醛酸

使用重组Pichia pastoris GS115/pPIC9K-GAP-MIOX克隆子进行发酵培养。单克隆接种于25ml的YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30℃、200rpm培养24h。按10％接种量接种至50ml(摇瓶容量为500ml)发酵培养基中发酵，培养60小时。发酵培养基分为YPD培养基及YPD-MI培养基(YPD培养基中加入60mM肌醇)。培养结束后，取1ml发酵液在8000rpm下离心10min，取上清经0.22um滤膜过滤，通过LC-MS检测产物，图2为产物葡萄糖醛酸的LC-MS检测结果，A为葡萄糖醛酸标样，B为重组菌株发酵液，由标样可以看出葡萄糖醛酸的[M-1]⁺为193.03，在重组菌株发酵液中可以检测到具有相同分子量(m/z)的葡萄糖醛酸。

实施例4比较重组毕赤酵母在不同发酵培养基中生成的葡萄醛酸的量

在YPD发酵培养基中与YPD-MI培养基(YPD培养基中加入60mM肌醇)中，发酵重组毕赤酵母，培养48小时后，检测产物，结果如图1、图2所示。由图1可以看出，对照菌株Pichia pastoris GS115不产葡萄糖醛酸，重组菌在YPD培养基中生成葡萄糖醛酸20mg/L，在YPD-MI培养基中生成葡萄糖醛酸50mg/L。在培养基中添加肌醇加氧酶(MIOX)的前体物质肌醇有利于提高葡萄糖醛酸的产量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种重组酵母菌，是将肌醇加氧酶基因MIOX克隆至出发酵母宿主菌中构建的重组酵母菌。

2.根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述肌醇加氧酶基因MIOX来源于以下任意一种：小鼠、毕赤酵母、白假丝酵母。

3.根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述肌醇加氧酶基因的氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

4.根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述肌醇加氧酶基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

5.根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述出发酵母宿主菌是以下任意一种：酿酒酵母、解脂假丝酵母、毕赤酵母。

6.根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述出发酵母宿主菌是毕赤酵母。

7.根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，调控表达所述肌醇加氧酶基因MIOX的启动子为GAP、Gal1、AOX1或者TEF1。

8.一种权利要求1所述重组酵母菌的构建方法，其特征在于，是将肌醇加氧酶基因MIOX克隆到表达载体上形成重组载体，再将重组载体线性化后转入酵母宿主菌中，得到重组酵母菌。

9.一种利用权利要求1所述重组酵母菌合成葡萄糖醛酸的方法，是将种子培养液以5％-10％的接种量接种到发酵培养基中，25℃-30℃，180rpm-220rpm，培养24h-96h。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养基的碳源为以下任意一种或多种：葡萄糖、肌醇、甘油、蔗糖。