CN101157898A - 一种具有纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法。本发明所提供的粟酒裂殖酵母工程菌，是将是将构建的含有纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中得到的。本发明所提供的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，是构建含有纤维素酶基因的粟酒裂殖酵母表达载体，将其导入粟酒裂殖酵母中获得重组酵母转化子，培养重组酵母使纤维素酶基因得到分泌表达。本发明弥补了传统纤维素酶制备方法以及原核表达***、酿酒酵母和毕赤酵母表达***的不足。将发明应用于工业化纤维素酶的生产，则具有纤维素酶活性高，生长周期短，提取成本低的优点。

Description

一种具有纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种具有纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法。

背景技术

纤维素酶的酶学研究开始于1912年，直到1954年才由美国人Reese提出了Cl-CX概念，此后的研究证明：纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它往往不是单种酶，包括多种水解酶成员，构成了一个复杂的纤维素酶家族。目前普遍认为，完全降解纤维素至少需要由三种功能不同但又互补的纤维素酶。

(1)葡聚糖内切酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4，来自真菌简称EG，来自细菌简称Len)，又称为C1酶，这类酶作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。木霉的EG主要包括EGI、EGIII和EGV，EGI是木霉的主要内切葡聚糖酶，葡聚糖内切酶分子量介于23～146kD之间，如EGI为54kD，EGIII约为49.8kD。

(2)葡聚糖外切酶(exo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91，来自真菌简称CBH，来自细菌简称Cex)，又称为Cx酶，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解1，4-β-D糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase简称CBH)，CBH是木霉的主要纤维素酶，已知有两种同功酶CBHI和CBHII，其中CBHII起主要作用。外切酶的分子量介于38～118kD之间，CBHI分子量约为66kD，CBHII约为53kD。

(3)β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC 3.2.1.21，简称BGL)这类酶一般将纤维二糖或纤维寡糖水解成葡萄糖分子，一般不直接作用于纤维素分子，包括BGLI和BGLII两种同功酶，木霉产生的BGL量较少，β-葡萄糖苷酶分子量约为76kD。

纤维素酶的大规模工业化应用在很大程度上受纤维素酶酶活较低以及成本较高的限制，同时纤维素酶是诱导酶，在同时存在葡萄糖等物质存在时，纤维素酶的合成受到阻遏，因此人们把大量的精力投入到选育优良的纤维素酶工程菌上，希望能找到酶的合成不受降解产物阻遏、酶蛋白组成型表达、酶组分比例协调、产酶能力强、酶活性高、无毒性嫌疑的菌种。随着以分子克隆为基础的基因重组技术的快速发展，国内外的研究者已开始应用重组DNA技术对纤维素酶产生菌进行改造或创造新的纤维素酶产生菌。纤维素酶基因克隆为研究纤维素酶的生物合成和作用机制以及了解纤维素酶遗传特性进而构建高效纤维素分解菌开辟了新途径，最有可能使纤维素的分解利用问题取得突破性进展。国内外在这方面展开了大量的研究，研究的领域不断扩大，取得了许多进展。纤维素酶基因克隆研究主要集中在酸性纤维素酶方面，起始于70年代，发展非常迅速。真菌主要产酸性纤维素酶，近十几年来，人们对真菌木霉属纤维素酶基因做了大量的研究。绿色木霉(Trichoderma viride)所产生的纤维素酶的降解作用日益受到重视，国内外对这方面的研究也日益增多。南非科学家Wyk JP.H和Mohulatsi M指出，绿色木霉所产生的纤维素酶可将废报纸中的纤维素转化为可发酵的糖，不仅减少了环境污染，还对废报纸进行了回收利用。但其所产生的纤维酶的生物转化尚未扩展到工业规模，原因是纤维素酶的量和活性都较低。随着转基因技术的不断成熟，绿色木霉纤维素酶基因在基因工程上的应用，逐渐引起人们的关注。

粟酒裂殖酵母(S.pombe)是一种单细胞的、真核生物，拥有同高等生物极其相似的属性：染色体结构和功能、细胞循环的控制以及RNA的拼接，这些属性使S.pombe成为生产真核蛋白的理想***。用粟酒裂殖酵母作为宿主直到最近才引起重视，国外目前利用裂殖酵母成功表达外源蛋白的例子很多，但国内研究报道极少。2002年2月基因组的测序及其各基因功能的取得更有利于研究外源蛋白在粟酒裂殖酵母中的表达。S.pombe被用来通过基因互补来克隆真核基因，意味着在S.pombe中异质基因的表达是活跃的。利用各种表达构建大量的polyoma virusmiddle-T抗原、the human antithrombinIII、the human liver epoxide hydrolase、the human bloodcoagulation factor XIIIa、the human lipocortin I、rat arginase、rat NDP-kinase、humaninterleukin-6(IL-6)、Arabidopsis thaliana sugar transporter STP1等高等真核基因，已在S.pombe被表达和纯化。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法。

本发明所提供的重组粟酒裂殖酵母工程菌，是将构建含有纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中得到的。

本发明所提供的重组粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法是将纤维素酶基因***到粟酒裂殖酵母表达载体的多克隆位点处，将构建的重组粟酒裂殖酵母表达质粒导入粟酒裂殖酵母中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母使纤维素酶基因得到分泌表达。

本发明所述的纤维素酶基因来源于绿色木霉AS3.3711基因组DNA，本发明提供了适用于绿色木霉基因组DNA的提取方法。

本发明所述的三种纤维素酶基因CBHII，其序列如SEQ ID NO.1所述、EGI，其序列如SEQ ID NO.2所述、BGLI，其序列如SEQ ID NO.3所述，核苷酸序列中GC含量大于60％，本发明提供了克隆GC含量高的基因的PCR扩增方法。

本发明所提供的表达纤维素酶基因的***为ESP表达***，采用pESP-2和pESPUC质粒作为表达载体。这两种质粒源自pBluescript II噬菌粒且由如下四部分组成：(1)一个ColE1复制起始点和氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance.Amp⁺)，其允许在大肠杆菌克隆时进行载体的复制和抗生素选择；(2)一个ars1序列可以提供在粟酒裂殖酵母(S.pombe)中使载体自动复制所需要的复制起始点；(3)选择标记基因LEU2-d，源自酿酒酵母(S.scerevisiae)可以作为向粟酒裂殖酵母(S.pombe)细胞中转化表达结构的选择标定物；(4)一个表达盒，包括粟酒裂殖酵母(S.pombe)全长的nmt1启动子(P_nmt1)-终止子(T_nmt1)，其中夹着一个GST(glutathione S-transferase)基因(pESPUC无GST)和一个多克隆位点(multiple cloning site，MCS)。pESP-2的MCS处有一个N端使之与GST相结合。第二种载体pESPUC质粒与第一种载体共有两处不同：(1)无融合蛋白(2)多克隆位点处的酶切位点有所不同。pESP-2、pESPUC物理图谱如图1、2所示。

本发明所述纤维素酶CBHII或EGI基因位于第一种粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的多克隆位点处的NheI和BglII限制性内切酶酶切位点之间。

本发明所述纤维素酶BGLI位于第二种粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC的多克隆位点处的XhoI和NotI限制性内切酶酶切位点之间。

本发明所述筛选标记有两种，一种为氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance Amp⁺)，其允许在大肠杆菌克隆时进行载体的复制和抗生素选择；一种为选择标记基因LEU2-d，源自酿酒酵母可以作为向粟酒裂殖酵母(S.pombe)细胞中转化表达结构的选择标定物。

本发明以pESP-2为出发载体，构建含有CBHII或EGI基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体为pESP-2-CBHII或pESP-2-EGI，获得的重组粟酒裂殖酵母工程菌为SP-Q01/pESP-2-CBHII或SP-Q01/pESP-2-EGI；以pESPUC为出发载体，构建含有BGLI基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体为pESPUC-BGLI，获得的重组粟酒裂殖酵母菌株为SP-Q01/pESPUC-BGLI。

本发明所提供的纤维素酶基因表达的方法，是将构建的含有纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-CBHII、pESP-2-EGI或pESPUC-BGLI采用醋酸锂(LiAc)和电穿孔法导入粟酒裂殖酵母中，且电穿孔法优于醋酸锂法。培养重组粟酒裂殖酵母时，无需加入诱导物，纤维素酶基因前端自带信号肽序列，可以使纤维素酶基因分泌表达，重组酵母表达的时间为2-6天。

本发明具有以下优点：本发明所提供了具有高纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法，弥补了传统纤维素酶制备方法以及原核表达***、酿酒酵母和毕赤酵母表达***的不足。

(1)纤维素酶基因在原核表达***大肠杆菌中可以表达，但表达水平低、酶蛋白不能分泌，而且提取有很大困难，离工业化应用的目标还有一定的距离。

(2)虽然粟酒裂殖酵母属于酵母类，但粟酒裂殖酵母与其它的酵母相比在进化上更高级，其类似的操作技术也能应用于其它的酵母，但很多性质不同于芽殖的酿酒酵母，如本发明所用的是含有内含子的纤维素酶基因转入酿酒酵母中不能表达，但同样的基因在粟酒裂殖酵母中却获得了表达，其产物表达水平高，可直接分泌到培养基中，并具有正常的生物学活性。这样在进行工程菌构建时就不需要提取真菌总RNA在进行反转录来克隆纤维素酶基因，只需要提取其总基因组DNA，成本低、省时省力。

(3)本发明所用的粟酒裂殖酵母表达菌株是SP-Q01，是用于ESP酵母表达和纯化***中的单倍体菌株，含有h交配型的和leu1-32基因型，这个表达菌株包括一个变异的LEU1基因，它编码亮氨酸生物合成必备的3-丙基脱氢酶，LEU1基因突变导致亮氨酸营养缺陷。而选用的表达载体却含有选择标记基因LEU2-d，就可以通过基因互补直接对转化子进行筛选，提高了筛选效率；而毕赤酵母***需要用价格昂贵的抗生素进行筛选。

(4)本发明所获得的工程菌在进行培养使纤维素酶基因获得表达时，无需加入诱导物，纤维素酶基因是否表达被培养基中硫胺(维生素B1)的浓度严格调控，当培养基中含＞0.5μM硫胺时，P_nmt1就被强烈的抑制，纤维素酶基因不表达，而当培养基中不含硫胺时启动子的诱导率约为400倍，纤维素酶基因高度表达。并且纤维素酶基因前端自带信号肽序列，可以使纤维素酶基因分泌表达。结果如图12所示，三种重组酵母转化子在培养84h以内的时间里有纤维素酶酶活性，目的基因表达最高水平出现在36-84h，SP-Q01/pESP-2-CBHII、SP-Q01/pESP-2-EGI在培养0-60h间酶活逐渐升高，在培养60h达到最高，分别为155U/mL、165U/mL，从60h到80h酶活逐渐降低；SP-Q01/pESPUC-BGLI在培养0-72h间酶活逐渐升高，在培养72h达到最高为160U/mL，从72h到84h酶活逐渐降低。

此外，若将发明应用于工业化纤维素酶的生产，则具有生产规模大，纤维素酶活性高，产酶能力强，生长周期短，提取成本低的优点，因此具有高纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的选育对纤维素资源的开发利用具有重要的实际意义和广阔的开发前景！

附图说明

图1为粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的物理图谱。

图2为粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC的物理图谱。

图3a为含有纤维素酶CBHII基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体构建流程图。

图3b为含有纤维素酶EGI基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体构建流程图。

图4为含有纤维素酶BGLI基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体构建流程图。

图5为绿色木霉基因组DNA。

图6a为CBHII基因PCR扩增结果。

图6b为EGI基因PCR扩增结果。

图6c为BGLI基因PCR扩增结果。

图7a为重组克隆载体pMD18-T-CBHII的PCR和酶切鉴定。

图7b为重组克隆载体pMD18-T-EGI的PCR和酶切鉴定。

图7c为重组克隆载体pMD18-T-BGLI的PCR和酶切鉴定。

图8a为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-CBHII的PCR和酶切鉴定。

图8b为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-EGI的PCR和酶切鉴定。

图8c为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-BGLI的PCR和酶切鉴定。

图9a1为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-CBHII的醋酸锂(AcLi)转化子。

图9a2为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-CBHII的电穿孔转化子。

图9b1为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-EGI的醋酸锂(AcLi)转化子。

图9b2为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-EGI的电穿孔转化子。

图9c1为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-BGLI的醋酸锂(AcLi)转化子。

图9c2为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-BGLI的电穿孔转化子。

图10a为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESP-2-CBHII质粒DNA的PCR鉴定。

图10b为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESP-2-EGI质粒DNA的PCR鉴定。

图10c为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESPUC-BGLI质粒DNA的PCR鉴定。

图11为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESP-2-CBHII、SP-Q01/pESP-2-EGI和SP-Q01/pESPUC-BGLI和SP-Q01/pESP-2表达产物的SDS-PAGE分析。

图12a为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESP-2-CBHII、SP-Q01/pESP-2-EGI、SP-Q01/pESPUC-BGLI不同培养时间酶活力测定结果。

图12b为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESP-2-CBHII、SP-Q01/pESP-2-EGI、SP-Q01/pESPUC-BGLI最适培养温度酶活力测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、绿色木霉纤维素酶基因的克隆

1、绿色木霉(T.viride AS3.3711)基因组DNA的提取

YPD培养基(PH＝5.3)：1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂。

(1)菌丝的培养：用YPD固体培养基培养绿色木霉2.5天，然后用YPD液体培养基培养3天，28℃、190r/min。

(2)离心收集菌体，收集的菌体先用蒸馏水洗涤三次，然后真空抽干。

(3)向1.5ml离心管中加入0.3mlCTAB提取液，然后将其置于65℃水浴锅中预热。

(4)取上述干燥后的菌体0.03g，用液氮研磨迅速研磨成粉。

(5)将冻粉迅速转入提取液中，尽快用移液枪混匀，在65℃水浴30min，期间轻轻摇动几次(防止DNA断裂)。

(6)取出离心管，冷至室温，每管加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻颠倒混匀，静止10min，10000rpm、离心10min。

(7)吸取上清夜于另一新离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温放置15min，然后10000rpm、离心10min去上清。

(8)分别用70％、80％酒精洗涤沉淀，将沉淀吹干。

(9)加100μl TE缓冲液回溶DNA沉淀(不要反复吸打，用手指轻弹)，同时加入终浓度50μl/mg RNase，置37℃处理1h。

(10)加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1-3次。

(11)吸取上清，加入1/10体积0.3mol/l的NaAc和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置1h左右，12000rpm、离心10min除去上清夜。

(12)用70％乙醇洗涤沉淀2-3次，自然干燥后，溶于30μl去离子水中形成DNA提取液。

13)抽取2ul进行1％琼脂糖凝胶电泳检测浓度，结果如图5所示(泳道1为DNA分子量标准，泳道2为基因组DNA)。

2、引物设计

根据GenBank已发表的里氏木霉纤维素酶基因CBHII(GenBank的登录号为AF302657)、EGI(GenBank的登录号为E00390)、BGLI(GenBank的登录号为U09580)的DNA序列，应用PrimerPremier5.0引物设计软件分别设计一对特异性引物，为了便于定向克隆和载体构建，在上游引物和下游引物的5端分别加入限制性内切酶位点和保护碱基(画线部分为加入的酶切位点)：

CBHII上游引物：5′-TTT GCTAGC ATG ATT GTC GGC ATT CTC-3’  (NheI)

        下游引物：5′-GGT AGATCT TTA CAG GAA CGA TGG GTT TG-3′  (BglII)

EGI  上游引物：5′-TTT GCTAGC CTT GTC GCC ATC AGA TTG TT-3’(NheI)

     下游引物：5′-GGT AGATCT AGG CAA GTC AAC GCT CTA AA-3’  (BglII)

BGLI 上游引物：5′-TTT GCATGC TTG AGC CCAATC AGAAAT GC-3′  (XhoI)

     下游引物：5′-TTT GCATGC CGC TAC GCTACC GAC AGA GT-3′  (NotI)

3、绿色木霉纤维素酶基因的PCR扩增

以绿色木霉基因组DNA为模板，通过PCR扩增绿色木霉纤维素酶基因的DNA片段，由于目的片段GC含量高，PCR扩整的反应体系使用大连宝生物公司的LA Taq酶(含GCbuffer)。

1)CBHII：

反应体系：25μl

2×GC buffer I(5mM Mg2+Plus)  12.5μl

dNTP Mixture(各2.5mM)         4μl

Upper primer(50pmol/L)        1μl

Lower primer(50pmol/L)        1μl

Template(70ng/μl)            1μl

LA-Taq酶(5u/μl)              0.25μl

灭菌ddH2O                     up to 25μl

反应条件：

94℃预变性5min

72℃延伸8min

2)EGI

反应体系：25μl

2×GC bufier I(5mM Mg2+  Plus)    12.5μL

dNTP Mixture(10mmol/L)            4μL

Upper primer(50pmol/L)            0.5μL

Lower primer(50pmol/L)            0.5μL

Template(70ng/μl)                1μl

LA-Taq酶(5u/μl)                  0.25μL

灭菌ddH2O                         up to 25μl

反应条件：

94℃预变性5min

72℃延伸8min

3)BGLI

反应体系：25μl

2×GC bufier II(5mM Mg2+  Plus)    12.5μL

dNTP Mixture(10mmol/l)             4μL

Upper primer(50pmol/l)             0.5μL

Lower primer(50pmol/l)             0.5μL

Template(70ng/μl)                 1μl

LA-Taq酶(5u/μl)                   0.25μl

灭菌ddH2O                          up to 25μl

反应条件：

94℃预变性3min

72℃延伸10min

PCR反应结束后，全量反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，结果如图6a、6b、6c所示：图6a为CBHII基因电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道2为水样对照，泳道3为DNA分子量标准)泳道1在1611bp处有一条清晰条带，而泳道2无条带，图6b为EGI基因电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道2为DNA分子量标准)泳道1在1580bp处有一条清晰条带，图6c为BGLI基因电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道2为DNA分子量标准)泳道1在2380bp处有一条清晰条带，三个基因的电泳结果与预期结果相符。

4、重组克隆载体pMD18-T-CBHII、pMD18-T-EGI、pMD18-T-BGLI的构建

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，采用V-gene公司的DNA Gel Extraction Kit回收目的片断。将回收的目的片段分别克隆到pMD18-T Vector，进行蓝白斑筛选。在Eppendorf管内配制10μl反应体系，混匀16℃反应16h。反应液直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含50mg/mlAmp⁺的LB抗性平板37℃培养过夜进行筛选。

5、分别对三个基因的阳性菌落进行鉴定

1)重组克隆载体质粒DNA的提取

对于每一个连接，挑取在上述抗生素平板上长出的单菌落接于5ml含50mg/ml Amp⁺的液体LB培养基中，190rpm，37℃过夜培养。次日，取400μl菌液于1.5mlL离心观管中，加80％甘油存于-80℃冰箱。其余菌液用碱裂解法提取质粒DNA。

2)重组克隆载体质粒DNA的PCR和酶切检测

以重组质粒DNA为模板，分别PCR扩增纤维素酶基因，反应体系和反应条件同上；同时对重组质粒DNA做限制性内切酶双酶切(CBHII/EGI：NheI和BglII BGLI：XhoI和NotI)，酶切体系20μl，混合液置于37℃反应3h。反应结束后，对PCR和酶切产物进行1％Agarose凝胶电泳，观察片段的位置和大小。结果如图7a、7b、7c所示：图7a为CBHII基因电泳检测图(泳道1为酶切产物，泳道2为20ul PCR产物，泳道3为5ul PCR产物，泳道4为DNA分子量标准)泳道1在2700bp和1611bp处各有一条清晰条带，泳道2、3在1611bp处有一条清晰条带，图7b为EGI基因电泳检测图(泳道1为酶切产物，泳道2为DNA分子量标准，泳道3为PCR产物)泳道1在2700bp和1580bp处各有一条清晰条带，泳道3在1580bp处有一条清晰条带，图7c为BGLI基因电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道2为DNA分子量标准，泳道3为酶切产物)泳道1在2380bp处有一条清晰条带，泳道3在2700bp和2380bp处各有一条清晰条带，三个基因的电泳结果与预期结果相符，初步证明重组克隆载体构建成功。

将PCR和酶切鉴定都正确的重组克隆载体分别命名为：pMD18-T-CBHII、pMD18-T-EGI、pMD18-T-BGLI，然后将保存的菌液送去测序，测序由北京三博远公司完成。CBHII测序结果与Genebank AF302657里氏木霉CBHII基因同源性达99.86％，EGI与GenebankE00390里氏木霉EGI基因同源性达100％，BGLI与Genebank里氏木霉BGLI基因同源性达100％，表明所克隆的三个纤维素酶基因都正确，达到预期目的。

实施例2、纤维素酶基因重组粟酒裂殖酵母表达载体的构建

含有目的基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-EGI、pESP-2-CBHII、pESPUC-BGLI的构建过程如图3、4所示，具体步骤如下：

1、重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-EGI、pESP-2-CBHII、pESPUC-BGLI的构建

碱裂解法大量提取重组克隆载体pMD18-T-CBHII、pMD18-T-EGI、pMD18-T-BGLI和表达载体pESP-2(购自美国Stratagene公司)和pESPUC(本实验室保存)质粒DNA，然后分别双酶切重组克隆载体pMD18-T-CBHII、pMD18-T-EGI、pMD18-T-BGLI和粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2和pESPUC。酶切体系20μl，pMD18-T-CBHII、pMD18-T-EGI和pESP-2用限制内切酶NheI和BglII双酶切，pMD18-T-BGLI和pESPUC用限制内切酶XhoI和NotI双酶切，37℃酶切3h。反应结束后，全量反应液于1％的琼脂糖凝胶电泳，分别回收DNA。最后分别用T4DNA连接酶连接目的片段和载体，反应体系10μl，混匀，16℃反应16h。反应液直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含50mg/ml Amp⁺的LB抗性平板37℃培养过夜进行筛选。

2、重组粟酒裂殖酵母表达载体的鉴定

1)重组粟酒裂殖酵母表达载体质粒DNA的提取

对于每一个连接，挑取在上述抗生素平板上长出的单菌落接于5ml含50mg/ml Amp⁺的液体LB培养基中，190rpm，37℃过夜培养。次日，取400μl菌液于1.5mlL离心观管中，加80％甘油存于-80℃冰箱。其余菌液用碱裂解法提取质粒DNA。

2)重组粟酒裂殖酵母表达载体PCR和酶切鉴定

以重组表达载体质粒DNA为模板，分别对重组表达载体质粒进行PCR扩增和限制性内切酶双酶切，反应体系和反应条件同重组克隆质粒的PCR检测和酶切检测。反应结束后，对PCR和酶切产物进行1％Agarose凝胶电泳，观察片段的位置和大小。结果如图8a、8b、8c所示：图8a为CBHII基因电泳检测图(泳道1为酶切产物，泳道2为空载体PCR产物，泳道3为重组表达载体PCR产物，泳道4为DNA分子量标准)泳道1在97600bp和1611bp处各有一条清晰条带，泳道2在1611bp处没有条带，泳道3在1611bp处有一条清晰条带；图8b为EGI基因电泳检测图(泳道1为酶切产物，泳道2为空载体PCR产物，泳道3为重组表达载体PCR产物，泳道4为DNA分子量标准)泳道1在97600bp和1580bp处各有一条清晰条带，泳道2在1580bp处没有条带，泳道3在1580bp处有一条清晰条带；图8c为BGLI基因电泳检测图(泳道1为酶切产物，泳道2为DNA分子量标准，泳道3为重组表达载体PCR产物，泳道4为DNA分子量标准)泳道1在89000bp和2380bp处各有一条清晰条带，泳道3在2380bp处有一条清晰条带，三个基因的电泳结果与预期结果相符，证明重组表达载体构建成功，将PCR和酶切鉴定都正确的为阳性菌种命名为pESP-2-EGI、pESP-2-CBHII、pESPUC-BGLI。

实施例3、重组粟酒裂殖酵母表达载体的转化及鉴定

1、碱裂解法大量提取重组粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2-EGI、pESP-2-CBHII、pESPUC-BGLI的质粒DNA

2、醋酸锂(LiAc)转化法

宿主菌：SP-Q01

TE Buffer：10mM Tris·Cl，1mM EDTA(PH＝8.0)。

0.2M LiAc：0.21g LiAc溶于100ml蒸馏水中。

70％PEG4000：35g PEG4000溶于50ml蒸馏水中。

(1)把从-80℃冰箱中取出的SP-Q01菌液30ml涂于YPD固体培养基上，30℃培养2-3天，直到单菌落出现。

(2)将酵母单菌落过夜培养于10mlYPD液体培养基中30℃，240rpm，次日将10ml菌液转入100mlYPD培养基中30℃，240rpm使OD₆₀₀达到0.7～1.0。

(3)收集菌体，4℃、2500rpm、离心5min。

(4)弃上清，用5ml TE悬浮沉淀。

(5)收集菌体，4℃、2500rpm、离心5min。

(6)弃上清，用600μl TE悬浮沉淀，取500μl加入1.5ml离心管中，加入等体积的0.2MLiAc，30℃、140rpm培养1h。

(7)取100μl的细胞悬浮液加入1.5ml离心管中，向其中加入15μl的质粒DNA(300μg/ml)，30℃培养30min。

(8)加入等体积的灭过菌70％PEG-4000，涡旋混合，30℃培养1h。

(9)将离心管立即放入42℃水浴中孵育5min，然后马上冰上放置5min，在室温下用水洗两次，2500rpm、离心5min。

(10)将细胞沉淀悬浮于500μl的水中，取100μl悬浮液涂于选择平板，30℃培养3-7天。

结果如图9a1、9b1、9c1所示：图9a1为pESP-2-CBHII筛选出的酵母转化子，图9b1为pESP-2-EGI筛选出的酵母转化子，图9c1为pESPUC-BGLI筛选出的酵母转化子。

3、电穿孔转化法

宿主菌：SP-Q01

YCD培养基：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，水解酪蛋白2g，山梨醇218.6g溶于1L蒸馏水中

1.2M山梨醇：218.604g山梨醇溶于1L蒸馏水中。

EMM培养基(L)：

邻苯二甲酸氢钠  14.7mM  Na₂HPO₄    15.5mM

NH₄Cl    93.5mM   葡萄糖    111mM

Salts 2％(v/v)50×stock    Vitamins 0.1％(v/v)1000×stock

Minerals 0.01％(v/v)10000×stock

Salts(50×stock)(L)

MgCl₂·6H₂O     0.26M    CaCl₂·2H₂O    4.99mM

KCl             0.67M    Na₂SO₄         14.1mM

Vitamins(1000×stock)

泛酸            4.20mM   烟酸           81.2mM

肌醇            55.5mM   生物素         40.8Um

Minerals(10000×stock)(L)

硼酸            80.9mM   MnSO₄          23.7mM

ZnSO₄·7H₂O     13.9mM   FeCl₃·6H₂O    7.40mM

钼酸            2.47mM   KI             6.02mM

CuSO₄·5H₂O     1.60mM   柠檬酸         47.6mM

1)酵母感受态细胞的准备

(1)将酵母单菌落过夜培养于10mlYCD液体培养基中30℃，140rpm。

(2)次日将10ml菌液转入500mlYCD培养基中过夜培养，30℃、250rpm至浓度为1×10⁷细胞/ml，OD₆₀₀＝0.7。

(3)将细胞放到冰浴上15min，使其停止生长。

(4)轻轻将细胞倒入两个灭过菌的250ml离心管中，4℃、3000rpm、离心15min，收集菌体。

(5)弃上清，将收集细胞的离心管置于冰上。

(6)每管加入50ml灭过菌的冰上预冷的1.2M山梨醇悬浮细胞沉淀，加山梨醇至250ml，4℃、3000rpm、离心5min，收集菌体，弃上清。

(7)重复步骤6。

(8)加入20ml灭过菌的冰上预冷的1.2M山梨醇悬浮沉淀，每管分装200μl，将细胞放到冰上，尽可能快的电击。

2)用BIO-RAD MicroPluser进行电击。

(1)将预转化的质粒DNA(约1μg)加入到200μl感受态细胞中，混均。

(2)将MicroPluser设为“ShS”。

(3)将DNA细胞样品转入0.2cm已预冷的电击杯中，轻轻敲打管底悬浮液，1.5kv、25μF、200Ω、4.48ms电击一次。

(4)将杯拿出，加入冰冷的1.2M山梨醇0.8ml，然后将稀释的细胞转入到灭菌的离心管中。

(5)室温下，将离心管室温放置40-60min，使电击细胞在1.2M山梨醇的微量培养基中培养生长。

(6)将液体平铺于EMM-thiamine筛选培养基平板上，30℃培养4～6天，直到长出单菌落。

结果如图9a2、9b2、9c2所示：图9a2为pESP-2-CBHII筛选出的酵母转化子，图9b2为pESP-2-EGI筛选出的酵母转化子，图9c2为pESPUC-BGLI筛选出的酵母转化子。

4、重组粟酒裂殖酵母转化子的分子鉴定

1)挑取EMM-thiamine筛选培养基平板上的单菌落于EMM-thiamine液体培养基中，30℃培养2天，使用试剂盒提取酵母质粒，将质粒DNA储存于-20℃冰箱。

2)重组粟酒裂殖酵母转化子质粒DNA的PCR鉴定

将上述提取的质粒DNA做PCR鉴定。反应条件和反应体系同重组克隆载体质粒DNA的PCR检测。将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，观察片段的位置和大小。结果如图10a、10b、10c所示：图10a为CBHII基因电泳检测图(泳道1为DNA分子量标准，泳道2、3为PCR产物)泳道2、3在1611bp处有一条清晰条带，图10b为EGI基因电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道2为DNA分子量标准)泳道1在1580bp处有一条清晰条带，图10c为BGLI基因电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道2为DNA分子量标准)泳道1在2380bp处有一条清晰条带，三个基因的电泳结果与预期结果相符，证明得到重组菌株。将鉴定正确的阳性菌株命名为SP-Q01/pESP-2-CBHII、SP-Q01/pESP-2-EGI和SP-Q01/pESPUC-BGLI。

实施例4、纤维素酶基因在粟酒裂殖酵母中表达的检测

1、目的蛋白的诱导表达

YES培养基：酵母浸粉0.5％(w/v) 葡萄糖3.0％(w/v) 腺嘌呤，组氨酸，亮氨酸，尿嘧啶，赖氨酸，氢氧化物50-250mg/l

PBS缓冲液(100ml)：NaCl    0.82g    KCl    0.02g

                  Na₂HPO₄    0.36g  KH₂PO₄    0.025g

ESB缓冲液(可在4℃贮存数天)：

                 80mmol/L Tris-HCl(pH6.8)  10％甘油    2％SDS

                 1.5％二硫基苏糖醇(DTT)     0.1mg/ml溴酚蓝

1)酵母细胞培养的准备

(1)将含有重组质粒的酵母转化子细胞及含有空载体的酵母转化子细胞接种到5mL YES培养基中30℃、250rpm过夜培养。

(2)接种约1mL过夜酵母细胞于10mL YES培养基中过夜培养，直到OD₆₀₀＝0.2-0.4。

(3)30℃、250rpm继续培养约5小时，使OD₆₀₀＝0.7-1.0。

(4)将10mL的细胞分装入两个50mL的离心管中，每个5mL。用“未诱导”标志一试管，另一试管标志“诱导”。

(5)室温、1000rpm、离心5min，收集酵母细胞沉淀。

(6)弃上清，每管中加入50mL的去离子水洗涤酵母细胞沉淀，室温、1000rpm、离心5min，弃上清。

(7)重复一次步骤F。

2)GST蛋白的诱导步骤

(1)将酵母细胞沉淀分别培养于10mL EMM培养基中，加10μL的5mM抽滤的硫铵(VB1)于标记“未诱导”的试管中30℃、250rpm培养酵母细胞18-20个小时。

(2)为判断重组蛋白诱导是否成功，分别吸移1mL的菌液于1.5mL离心管中，4℃、1000rpm离心5min，收集酵母细胞沉淀。

(3)弃上清，保存酵母细胞沉淀于-80℃，在下一步的SDS-PAGE验证中使用。

3)酵母蛋白的提取

(1)向GST蛋白的诱导步骤3中得到的酵母细胞沉淀中加入50mM Tris-HCL

(PH 7.5)和10mM叠氮化钠溶液悬浮沉淀。

(2)4℃、1000rpm、离心5min收集沉淀细胞。

(3)弃上清，用30μL ESB缓冲液悬浮细胞。

(4)100℃保温3min，使蛋白酶失活之后，将样品存放于-20℃。

(5)加入0.3g直径0.2mm的玻璃珠，剧烈振荡混合2min。

(6)加入150μL ESB缓冲液，稍加振荡，置100℃保温1min。

(7)取5-20μL抽提液上样进行SDS凝胶电泳。

3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

将上述所提蛋白进行SDS-PAGE，结果如图11所示：(泳道1，2为BGLI转化子，泳道3为空载转化子，泳道4为CBHII转化子，泳道5为EGI转化子，泳道6为Marker)在约80KD处有一特异蛋白带，与已知的理论分子量一致，说明纤维素酶基因在粟酒裂殖酵母中得到表达。

4、DNS法(3，5-二硝基水杨酸比色定糖法)测定重组酵母转化子纤维素酶酶活

先将生长在EMM+VB1固体培养基上的重组酵母转化子SP-Q01/pESP-2-CBHII、SP-Q01/pESP-2-EGI和SP-Q01/pESPUC-BGLI和SP-Q01/pESP-2分别接种于5mL EMM液体培养基中诱导培养，当重组酵母达到对数生长期时(OD₆₀₀＝0.7-0.8)，分别接入50mL的EMM液体培养基中，重组酵母经扩大诱导培养12小时后，进行纤维酶酶活测定，其中SP-Q01/pESP-2为对照。取培养后的菌液1.5mL，离心后取0.6mL的上清夜，采用DNS法在550nm下测定重组纤维素酶酶活测定，CBHII和EGI以CMC-Na为底物，BGLI以水杨苷为底物。

3)酶活的定义

50℃时每小时产生1微克分子葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。

4)酶活的计算

结果如图12所示，测定了培养0-84h的重组纤维素酶酶活，三种重组酵母转化子在不同培养时间内均有酶活性，目的基因表达最高水平出现在36-84h，SP-Q01/pESP-2-CBHII、SP-Q01/pESP-2-EGI在培养0-60h间酶活逐渐升高，在培养60h达到最高，分别为155U/mL、165U/mL，从60h到80h酶活逐渐降低；SP-Q01/pESPUC-BGLI在培养0-72h间酶活逐渐升高，在培养72h达到最高为160U/mL，从72h到84h酶活逐渐降低，说明绿色木霉纤维素酶基因前部的信号肽能够被粟酒裂殖酵母正确的识别，并借助自身的信号肽序列将绝大部分表达产物分泌到胞外培养液中，并且重组酶在30-70℃均有酶活力，最适温度分别为：CBHII和EGI 50℃、BGLI 60℃。

序列表

<110>吉林农业大学

<120>一种具有纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法

<130>wangpiwu200701-03

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1611

<212>DNA

<213>绿色木霉

<400>1

atgattgtcg gcattctcac cacgctggct acgctggcca cactcgcagc tagtgtgcct    60

ctagaggagc ggcaagcttg ctcaagcgtc tggtaattat gtgaaccctc tcaagagacc    120

caaatactga gatatgtcaa ggggccaatg tggtggccag aattggtcgg gtccgacttg    180

ctgtgcttcc ggaagcacat gcgtctactc caacgactat tactcccagt gtcttcccgg    240

cgctgcaagc tcaagctcgt ccacgcgcgc cgcgtcgacg acttctcgag tatcccccac    300

aacatcccgg tcgagctccg cgacgcctcc acctggttct actactacca gagtacctcc    360

agtcggatcg ggaaccgcta cgtattcagg caaccctttt gttggggtca ctccttgggc    420

caatgcatat tacgcctctg aagttagcag cctcgctatt cctagcttga ctggagccat    480

ggccactgct gcagcagctg tcgcaaaggt tccctctttt atgtggctgt aggtcctccc    540

ggaaccaagg caatctgtta ctgaaggctc atcattcact gcagagatac tcttgacaag    600

acccctctca tggagcaaac cttggccgac atccgcaccg ccaacaagaa tggcggtaac    660

tatgccggac agtttgtggt gtatgacttg ccggatcgcg attgcgctgc ccttgcctcg    720

aatggcgaat actctattgc cgatggtggc gtcgccaaat ataagaacta tatcgacacc    780

attcgtcaaa ttgtcgtgga atattccgat atccggaccc tcctggttat tggtatgagt    840

ttaaacacct gcctcccccc ccccttccct tcctttcccg ccggcatctt gtcgttgtgc    900

taactattgt tccctcttcc agagcctgac tctcttgcca acctggtgac caacctcggt    960

actccaaagt gtgccaatgc tcagtcagcc taccttgagt gcatcaacta cgccgtcaca    1020

cagctgaacc ttccaaatgt tgcgatgtat ttggacgctg gccatgcagg atggcttggc    1080

tggccggcaa accaagaccc ggccgctcag ctatttgcaa atgtttacaa gaatgcatcg    1140

tctccgagag ctcttcgcgg attggcaacc aatgtcgcca actacaacgg gtggaacatt    1200

accagccccc catcgtacac gcaaggcaac gctgtctaca acgagaagct gtacatccac    1260

gctattggac ctcttcttgc caatcacggc tggtccaacg ccttcttcat cactgatcaa    1320

ggtcgatcgg gaaagcagcc taccggacag caacagtggg gagactggtg caatgtgatc    1380

ggcaccggat ttggtattcg cccatccgca aacactgggg actcgttgct ggattcgttt  1440

gtctgggtca agccaggcgg cgagtgtgac ggcaccagcg acagcagtgc gccacgattt  1500

gactcccact gtgcgctccc agatgccttg caaccggcgc ctcaagctgg tgcttggttc  1560

caagcctact ttgtgcagct tctcacaaac gcaaacccat cgttcctgta a           1611

<210>2

<211>1670

<212>DNA

<213>绿色木霉

<400>2

agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac gattagatct aggcaagtca acgctctaaa  60

ggcattgcga gtagtctgta ttttagcggt tagcatctca aaatcactcc cgtcaggcat  120

ggggatacaa acagtcgttg ctatactggc acgtagtgcc cgacgtgcac gtcttgcacc  180

cgctgtaccc aatgcaaccg cactgccccc agtgagtctg cgtgcagctc gggccgctcg  240

aagtcgtcga gctcctccgt gtagtcgaaa acgtcgtgct ggacgctggc gggggcgggg  300

gcgcagtcga gttcgtagta gacccaatgt ctccccagcg gatgttggag aagacgacgt  360

gcgtgttggg gttgttggcc aggatgttgg atgggttgcc ctcggtgctg ctgcaggggc  420

cggcgttgcc gctgtcgagc cagttcatgt actggctgtt gtcgttccaa atgctgaaca  480

cgagcaccat gccgctgctc agggccttgc ccatggtggc gaggccgccg taggctgagg  540

cggacgggca ggacgagatg gtgtcgccgc cgggctgggc gctggggatg tcgacgccgt  600

tttgctggta cttgcgggtg atgctcacaa ggttgcccga gggcgagccg ttgtccgtgt  660

tgaactgggt gatgatggtg aaggtcttgg aggtgtcaac ggtatctccg gggccgtagt  720

agctggaaaa ccatgtcagc atggaaaacc gcgagagcgc caggaaaggg gtagtagtgg  780

catcaggctc accttttgta gccgctgcca taggggttga agccgcaacc ggcagagtcg  840

caggccgtgg ccgtgcaaga gtgaggggtc aaggcattcg ccctcgagtt gccctccagg  900

atatccatct cgttgcagca gaagccctgg tggctagtgt tgagggtgcc gttcctccat  960

gtctggacgg ggcactgagc atcgcagtag ccgctcccgt agttggcacc ggccgtgtta  1020

tactggttgg cgcccccgtt ctcgtccatc tgagacaggt agagcgagcc gttctctcca  1080

cacggcagag cagagaggtc gacgtcgaag ctcagctcct ggccgttgag cttcagcatc  1140

acgtactcac cgtcagagtc caggagatac agccgaggag agacgctgct gtagccgcca  1200

gagctgctgg gcatgtactg gttcatggtg aggctgctgc ccgaggtcgt gacgcccgag  1260

gcggcgtagt cgacgccctc gatgaagcag ttcttgccac aggtcgcctc gtcagggcag  1320

agcgtggtgt cgacgccgcc gttgacggtg cacgagttgt agtttgcgtc gtgcatccag  1380

cggtagttcc agtcaaggac caccgaggtg tcctgggcca cgcacccccc ggactttgta  1440

cacttgtagg ttgtcaactt gggatggacc tcgggggtgc tggtacccgg ttgctgggcg  1500

gcgacgagcc gggcaatggc caggatggcc gtggtcaacg gcagtgtaac tgagggcgcc  1560

attttgggac aacaagaagg actaagatag ggggggggga gggtgcttgg cgaacaatct  1620

gatggcgaca aggctagaat ctctagagga tccccgggta ccgagctcga               1670

<210>3

<211>2468

<212>DNA

<213>绿色木霉

<400>3

attacgaatt cgagctcggt acccggggat cctctagaga ttgcatgccg ctacgctacc    60

gacagagtgc tcgtcagcct gatatcccgg ctgctcgctc ccacgctgat gccaaacgac    120

cccgacggca ccacccattt ctgcgaagcc gtgtcccagt agctgagatc tcgtcgtcgg    180

atgttgaacg ttgctgttcc gctctgacca ggcgtgaggt tcagcttggc aaagcctcgc    240

agctgcttcg gaggggtcct gggtgctgaa gatgggtagg tgatgtacag ctgggctacc    300

tcggcaccag tcacttggcc agagtttgcg atgtcaacgg tgactgtcgc gacattctgg    360

aacagatcac tcgggcctcc cggcacaacg gccccagtcg caggaccaga cttggcggtc    420

gacaagacgg agaggcgtga gtagttgaac ttggtgtaag ctatcattcc acagtcatcc    480

gtcagtcaac ctgtctaata gattgttcag gttagcaaac ttacacagtc catagccgaa    540

ctcgtaccgc ggcgtgatat tggcgtcgtc gaagtgctta tagtcgatga acagtccctc    600

gctgaagctg tcactgccgc cggaaacgat gcgagtgtta tagtcattgg ggctcttcgc    660

aatggtgtac accagcttgc cagaagggct gacatctccc cacagcacgt cgacgagcgc    720

attgccgctc tcctgagaag gaagacccgc ccagacaacg gccttgacct gcggaagagc    780

aagaatctgc tccagaatga tggcgccaac ggagtggaca acaacaatga cgttgctgtt    840

ggcaccggcc accgcctgga ccagggcatt gccgttgtgc cacggatcca ggttgttgcg    900

atcgcccgcg ttgccctcca cggtgatgta gccttcaccc gagtcggcgg tgatgaagac    960

gatggcgacg tcctttcctc ttgctgcaga tgcgcctgag gacgtgttgt cggtgttgct    1020

caaggtaacc tgggtgccct gcgaagacgc tctggtattg atggcatcgt agggcgcgac    1080

gaagtacgga tagttgacgg cgccggaacc ccaacccatg cccaaggccc cgtcgtcgca    1140

gcctttgtcg ttgcacgagg gcgagtttct ggcgtggtta ccaatgattg cggcagatcc    1200

aacgacggca atgctagcgg gcttcttgag cggcaggatg ttggcgtcat tcttgagcag    1260

aacgatgccg tccctggcaa ttgccctgac attggtcttg tggtttcctt gaacatttct    1320

gctgatgttg aacgacggat agcctgcctg gtcctggcct gtcaagtacc atgcggcgag    1380

gatacgagtc accatatcgt cgactctgct cgtggggacc tgattgctat ttaccgcatt    1440

ggtgagagct ggaccccaga gccgattgtt accgttgaag tctgtgccag gcattgacat    1500

gtcaagccca gaattcgcgc tttggacagt cgtgtgctgt gcgttccagt ccgtcatgac    1560

atagcctggg aaccccagct ggtctttcag cacagtctgc agcgtgtact gatcctcgca    1620

ggcccaggtg gtattgacct tgttgtacga gcacatgaca gaagcgacat tggcctgaac    1680

cgcgtcggca aatggccaag tatacagctc atggagagtt cggtcatctg ggttgctcga    1740

aatggtttct cgattgagct cctgctcgtt gaggatatag tgcttcgctg tcgcctgcac    1800

gcctaccgac tggatgccgt tgatggtttg acccatggca atgcccgtga gatatggatc    1860

gacaccgaag ccctcccagt tgcgaccgcc ctgcggagtc tttcccagcg gcccagccac    1920

aggaccaagt atgacatgaa tccccgaggc cttcacctcc tcaccgatga actgtccacg    1980

ttcgcggatc aaattgacat cccacgtcga ggccgcttga acgcccggcg taaaggctgt    2040

gctgcctgtc gagtatcgaa caccgagggg tccgtcttga aggcatagcg atggatagct    2100

gatcttggag gccggagatg tgtttccaac gcaaggaccg ccgttccagc cgacaccgct    2160

cacgatgccg accttatctt ggagattgag ctttgccaat gcggccttcg ccttgtcgta    2220

cgcggttccc catggagtcc ctgcaggagg tacaactgcc tcagccgagg cccccgatgt    2280

tgagctacct tgattcaaga gtcagcatgg tgtctccagg atacatatca catcccagta    2340

tgggaccagc tatactgact gtctgcccta gcaaagggcc cagtggcaag tgccagcgca    2400

gctgctgttc ggtaacgcat ttctgattgg gctcaagcat gcaatcgtcg acctgcaggc    2460

atgcaagc                                                             2468

Claims (8)

1.一种具有纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，是将构建的含有纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中得到的。

2.根据权利要求1所述粟酒裂殖酵母工程菌，其构建方法是将纤维素酶基因***到粟酒裂殖酵母表达载体的多克隆位点处，将构建的重组粟酒裂殖酵母表达质粒导入粟酒裂殖酵母中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母使防御素基因得到分泌表达。

3.根据权利要求1、2所述重组粟酒裂殖酵母表达载体，其特征在于：该载体是含有Pnmt1启动子、纤维素酶基因、Pnmt1终止子序列、以及筛选标志的重组粟酒裂殖酵母表达载体。

4.根据权利要求3所述载体，其特征在于：所述的纤维素酶基因为纤维二糖水解酶基因(CBHII)\葡聚糖内切酶基因(EGI)\β-葡萄糖苷酶(BGLI)。

5.根据权利要求1、2、3和4所述，纤维酶CBHII\EGI基因位于粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的多克隆位点处的NheI和BglII限制性内切酶酶切位点之间，构建的重组粟酒裂殖酵母表达载体为pESP-2-CBHII\pESP-2-EGI，获得的重组粟酒裂殖酵母工程菌为SP-Q01/pESP-2-CBHII\SP-Q01/pESP-2-EGI，所述纤维素酶BGLI基因位于粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC的多克隆位点处的XhoI和NotI限制性酶酶内切位点之间，构建的重组粟酒裂殖酵母表达载体为pESPUC-BGLI，获得的重组粟酒裂殖酵母菌株为SP-Q01/pESPUC-BGLI。

6.根据权利要求1、2、3、4和5所述的载体，其特征在于：所述筛选标志有两种，一种为氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance Amp⁺)，其允许在大肠杆菌(E.coli)克隆时进行载体的复制和抗生素选择；一种为选择标记基因LEU2-d，源自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiea)可以作为向粟酒裂殖酵母(S.pombe)细胞中转化表达结构的选择标定物亮氨酸。

7.根据权利要求2所述的纤维素酶基因表达的方法，其特征在于：是将构建的含有纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体的质粒DNA，采用醋酸锂法和电穿孔法导入粟酒裂殖酵母SP-Q01中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母转化子使纤维素酶基因得到分泌表达。

8.根据权利要求7所述的纤维素酶基因表达的方法，其特征在于：重组粟酒裂殖酵母在表达纤维素酶基因无须加入诱导物，纤维素酶基因前端自带的信号肽序列可使纤维素酶基因获得分泌表达，表达时间为2～6天。

Images