CN109423469A

CN109423469A - 一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌

Info

Publication number: CN109423469A
Application number: CN201710790108.9A
Authority: CN
Inventors: 胡美荣; 王雷; 滕斐; 陶勇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Zhucheng Haotian Pharm Co ltd
Priority date: 2017-09-05
Filing date: 2017-09-05
Publication date: 2019-03-05
Anticipated expiration: 2037-09-05
Also published as: CN109423469B

Abstract

本发明公开了一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌。本发明提供的第一种生产葡萄糖醛酸的方法(方法甲)包括如下步骤：以肌醇为原料，在工程菌的作用下，生产葡萄糖醛酸；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的。本发明提供的第二种生产葡萄糖醛酸的方法(方法乙)包括如下步骤：以肌醇为原料，在功能蛋白的作用下，生产葡萄糖醛酸。所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；(a2)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。本发明对于葡萄糖醛酸生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大推广应用价值。

Description

一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌。

背景技术

葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)是葡萄糖C-6位的羟基被氧化成羧基所形成的糖醛酸，其分子式为C₆H₁₀O₇，分子量为194.14。葡萄糖醛酸是白色针状结晶或粉末，熔点155℃-157℃，其结构示意图见图1。葡萄糖醛酸广泛存在于植物、动物中，很少以游离形式存在于自然界。葡萄糖醛酸不仅是传统的肝脏解毒剂和免疫功能调节剂，而且是合成许多医药的重要中间体，常用作功能性饮料、减肥药、化妆品等的添加剂。

肌醇(myo-inositol)，又称环己六醇(cyclohexanhexol)，分子式为C₆H₁₂O₆，分子量为180，其结构示意图见图2。几乎所有生物都含有游离态或结合态的肌醇。目前肌醇的生产方法有水解法，微生物法、化学合成法以及离子交换法。水解法是生产肌醇最主要的方法，主要以米糠、玉米糠等为原材料提取得到。

目前，葡萄糖醛酸的生产主要主要有以下几种方法：

①生物发酵法：利用相关的生物菌株进行发酵，从而合成葡萄糖醛酸。人类羊膜中存在UDP-葡萄糖脱氢酶，可以催化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸，UDP-葡萄糖醛酸在相关酶的作用下进一步合成葡萄糖醛酸。

②多糖水解法：通过水解含糖醛酸的多糖，从而得到葡萄糖醛酸。主要包括水解太阳花膜的半纤维素，碱法水解棉花和纤维素，热水萃取半纤维素等方法。

③化学氧化法：目前生产葡萄糖醛酸的主要方法，主要包括无机氧化法和催化氧化法两种。该工艺存在能耗高、选择性差、产品收率低、环境污染严重等问题。

综上所述，本领域迫切需要开发一种新的高效生产葡萄糖醛酸的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌。

本发明提供的第一种生产葡萄糖醛酸的方法(方法甲)，包括如下步骤：以肌醇为原料，在工程菌的作用下，生产葡萄糖醛酸；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的。

所述工程菌为胞内表达功能蛋白的重组菌。

所述出发菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BW25113。

所述功能基因具体通过重组质粒导入出发菌。所述重组质粒可为将所述功能基因***出发载体得到的重组质粒。所述出发载体可为载体pBAD/HisB。所述重组质粒具体可为将DNA分子乙(DNA分子乙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列4所示核苷酸组成)***载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间得到的重组质粒。

所述方法甲中，反应温度为30℃-40℃、反应pH为8.0-9.0。

所述方法甲中，反应温度为37℃、反应pH为8.5。

所述方法甲中，反应时间可为8-12小时。

所述方法甲中，反应时间可为10小时。

所述方法甲中的工程菌为进行诱导培养后的工程菌。所述诱导培养为采用L-***糖进行诱导并培养。

所述方法甲包括如下步骤：培养所述工程菌并在培养过程中进行L-***糖诱导，然后离心收集菌体；在缓冲体系中，加入所述菌体和肌醇，进行反应，得到葡萄糖醛酸。菌体和肌醇的质量配比为：10：18。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体10g/L、肌醇18g/L。菌体质量为湿重。所述缓冲体系为50mM的硼酸盐缓冲液。

所述方法甲具体包括如下步骤：在含50μg/mL链霉素的液体LB培养基中培养所述工程菌至OD_600nm＝0.6-0.8，然后加入L-***糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100mL，30℃、200rpm振荡培养12小时，然后离心收集菌体；在缓冲体系中，加入所述菌体、肌醇和TritonX-100，进行反应，得到葡萄糖醛酸。菌体和肌醇的质量配比为：10：18。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体10g/L、肌醇18g/L、TritonX-100 0.1％(体积百分含量)。菌体质量为湿重。所述缓冲体系为50mM的硼酸盐缓冲液。

本发明提供的第二种生产葡萄糖醛酸的方法(方法乙)，包括如下步骤：以肌醇为原料，在功能蛋白的作用下，生产葡萄糖醛酸。

所述方法乙中，反应温度为30℃-40℃、反应pH为8.0-9.0。

所述方法乙中，反应温度为37℃、反应pH为8.0。

所述方法乙中，反应时间可为20-40min。

所述方法乙中，反应时间可为30min。

所述方法乙包括如下步骤：在缓冲体系中加入功能蛋白、L-半胱氨酸、肌醇和二价铁化合物，进行反应，得到葡萄糖醛酸。功能蛋白和肌醇的配比为：1×10⁵μg功能蛋白：20mmol肌醇。功能蛋白、L-半胱氨酸、肌醇和二价铁化合物的配比为：1×10⁵μg功能蛋白：2mmolL-半胱氨酸：20mmol肌醇：1mmol二价铁化合物。反应体系中，各组分的初始浓度如下：功能蛋白100μg/mL，L-半胱氨酸2mmol/L，肌醇20mmol/L，Fe²⁺1mmol/L。所述二价铁化合物具体为硫酸亚铁。所述缓冲体系为pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液。

本发明还保护一种重组菌，是将重组质粒导入出发菌得到的；所述重组质粒为将编码功能蛋白的功能基因导入出发载体得到的；所述出发载体为pBAD/HisB载体；所述出发菌为大肠杆菌BW25113。所述重组质粒具体可为将DNA分子乙(DNA分子乙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列4所示核苷酸组成)***载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间得到的重组质粒。

本发明还保护所述重组菌在制备葡萄糖醛酸中的应用。所述应用中，以肌醇为原料。

本发明还保护功能蛋白在制备葡萄糖醛酸中的应用。所述应用中，以肌醇为原料。

以上任一所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；

(a2)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。

以上任一所述功能基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；

(b2)编码区如序列表中序列8所示的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码具有将肌醇转化为葡萄糖醛酸的能力的蛋白质的DNA分子；

(b4)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有将肌醇转化为葡萄糖醛酸的能力的蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

本发明提供了功能蛋白的新用途，以肌醇为原料生产葡萄糖醛酸。相应的，本发明提供了表达所述功能蛋白的重组菌，该重组菌可以以全细胞的方式，以肌醇为原料生产葡萄糖醛酸。本发明对于葡萄糖醛酸生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大推广应用价值。

附图说明

图1为葡萄糖醛酸的结构示意图。

图2为肌醇的结构示意图。

图3为肌醇标准品和葡萄糖醛酸标准品的HPLC检测图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中的硼酸盐缓冲液均为50mM的硼酸盐缓冲液。对于同一条件参数下的色谱图来说，待测样本中与标准品保留时间相同(±0.1min)，的峰可认定为目标峰。

大肠杆菌BW25113：购自NBRP E.coli strain，产品目录号：ME9062(https:// shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/resource/strainGeneMutant/list)。载体pBAD/HisB：Invitrogen公司，产品目录号V430-01。肌醇标准品：Aladdin公司，产品目录号I108336。葡萄糖醛酸标准品：Aladdin公司，产品目录号G105701。

实施例1、重组菌的构建

1、将DNA分子甲(DNA分子甲为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列2所示核苷酸组成)***载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒甲。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：在载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间***了DNA分子甲。DNA分子甲与载体上的部分核苷酸形成融合基因甲，表达融合蛋白甲。

2、将DNA分子乙(DNA分子乙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列4所示核苷酸组成)***载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：在载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间***了DNA分子乙。DNA分子乙与载体上的部分核苷酸形成融合基因乙，表达融合蛋白乙。融合基因乙如序列表的序列8所示，融合蛋白乙如序列表的序列7所示。

3、将DNA分子丙(DNA分子丙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列6所示核苷酸组成)***载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒丙。根据测序结果，对重组质粒丙进行结构描述如下：在载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间***了DNA分子丙。DNA分子丙与载体上的部分核苷酸形成融合基因丙，表达融合蛋白丙。

4、将步骤1得到的重组质粒甲导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅰ。

5、将步骤2得到的重组质粒乙导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅱ。

6、将步骤3得到的重组质粒丙导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅲ。

实施例2、蛋白的制备

试验菌株分别为：实施例1制备的重组菌Ⅰ、重组菌Ⅱ或重组菌Ⅲ。

1、取试验菌株的单克隆，接种至含50μg/mL链霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD_600nm＝0.6～0.8。

2、完成步骤1后，在培养体系中加入L-***糖并使其浓度为0.2g/100mL，30℃、200rpm振荡培养12小时。

3、完成步骤2后，取整个培养体系，4℃、6000rpm离心15min，收集菌体沉淀。

4、取步骤3得到的菌体沉淀，用缓冲液A重悬并进行超声破碎，然后10000rpm离心30min，收集上清液。

缓冲液A(pH8.0)：含50mmol/L Tris-HCl和100mmol/LNaCl，余量为水。

5、取步骤4得到的上清液，用0.45μm的滤膜过滤，收集滤液，进行Ni-NTA柱纯化。

柱子参数：HisTrap HP柱子(1×5ml)为GE Healthcare公司的产品目录号为17-5248-01的产品。

纯化程序：①用50ml缓冲液A充分平衡柱子；②上样30ml滤液；③用50ml含50mmol/L咪唑的缓冲液A洗涤；④用15ml含300mmol/L咪唑的缓冲液A洗脱并收集过柱后溶液。

6、取步骤5得到的过柱后溶液，进行脱盐并将缓冲体系置换为缓冲液B，得到蛋白溶液。

缓冲液B(pH8.0)：含50mmol/L Tris-HCl，余量为水。

重组菌Ⅰ进行上述步骤得到的蛋白溶液，命名为蛋白溶液Ⅰ(含有融合蛋白甲)。

重组菌Ⅱ进行上述步骤得到的蛋白溶液，命名为蛋白溶液Ⅱ(含有融合蛋白乙)。

重组菌Ⅲ进行上述步骤得到的蛋白溶液，命名为蛋白溶液Ⅲ(含有融合蛋白丙)。

实施例3、蛋白的酶活测定

待测蛋白溶液为实施例2制备的蛋白溶液Ⅰ、蛋白溶液Ⅱ或蛋白溶液Ⅲ。

1、检测待测蛋白溶液的蛋白浓度。

2、检测待测蛋白溶液的酶活

反应体系由待测蛋白溶液、L-半胱氨酸、肌醇、硫酸亚铁(提供Fe²⁺)和缓冲液组成。缓冲液为pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液。反应体系中，蛋白浓度为100μg/mL(蛋白的唯一来源为待测蛋白溶液)，L-半胱氨酸的浓度为2mmol/L，Fe²⁺的浓度为1mmol/L，肌醇的浓度为20mmol/L。

反应条件：37℃静置反应30min。

反应结束后，取样，用蒸馏水稀释至10倍体积，然后通过HPLC检测葡萄糖醛酸的含量。

HPLC***：Agilent 1260；色谱柱：Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm)；

流动相：硫酸水溶液(5mmol/L)。

流速：0.5mL/min；

温度：30℃；

检测器：RID。

将肌醇标准品和葡萄糖醛酸标准品进行上述HPLC检测，图谱见图3。葡萄糖醛酸的保留时间为9.193min，肌醇的保留时间为10.163min。葡萄糖醛酸的标准曲线为：y＝20192x+817.7，R²＝0.998(其中x为峰面积，y为葡萄糖醛酸的含量，单位为mmol/L)。

酶活定义：1个酶活单位(U)定义为每小时反应生成1μmol产物葡萄糖醛酸所需的酶量。

3、根据蛋白浓度与酶活计算待测蛋白的比活力，结果见表1。

表1

	反应结束后，反应体系中的葡萄糖醛酸浓度(mmol/L)	比活力(U/mg)
			融合蛋白甲	4.34±0.38	1.45±0.13
融合蛋白乙	10.88±1.15	4.42±0.40
			融合蛋白丙	2.20±0.30	0.74±0.10

实施例4、应用重组菌制备葡萄糖醛酸

4、制备葡萄糖醛酸

反应体系的组成：步骤3得到的菌体沉淀、肌醇、TritonX-100和硼酸盐缓冲液。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体浓度10g(湿重)/L、肌醇18g/L、TritonX-1000.1％(体积百分含量)。

反应条件：37℃静置反应10小时。

反应过程中采用5M NaOH水溶液控制反应体系的pH为8.5。

反应结束后，取样，用蒸馏水稀释10倍，然后通过HPLC检测葡萄糖醛酸的含量。

HPLC检测方法见实施例3的步骤2。

结果见表2。

表2

	反应结束后，反应体系中的葡萄糖醛酸浓度	转化率
			重组菌Ⅰ	9.7g/L	49.9％
重组菌Ⅱ	17.7g/L	91.1％
			重组菌Ⅲ	11.8g/L	60.7％

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌

<130> GNCYX171493

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> Chaetomium thermophilum

<400> 1

Met Ser Ser Ala Ser Val Asp Ala Met Pro Val Cys Arg Asp Gly Leu

1 5 10 15

Ala Leu Glu Ala Ile Ser Asp Ala Val Asp Thr Val Asn Ile Leu Lys

20 25 30

Gly Ile Ser Ala Lys Asn Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Ala Glu Ser Arg

35 40 45

Phe Asp Ala Gly Lys Asp Lys Ser Thr Phe Arg Arg Tyr Asn Glu Ala

50 55 60

Cys Glu Arg Val Lys Asn Phe Tyr Ala Glu Gln His Ala Lys Gln Thr

65 70 75 80

Leu Ala His Asn Leu Asn Ala Arg Glu Arg Phe Tyr Ser Pro Ser Arg

85 90 95

Lys Arg Pro Glu Met Ser Val Trp Glu Ala Ile Glu Met Leu Asn Ala

100 105 110

Leu Thr Asp Asn Ser Asp Pro Asp Thr Glu Met Thr Gln Ile Gln His

115 120 125

Ala Leu Gln Thr Ala Glu Ala Ile Arg Arg Asp Gly Lys Pro Arg Trp

130 135 140

Met Gln Leu Thr Gly Leu Ile His Asp Leu Gly Lys Leu Met Leu Phe

145 150 155 160

Leu Asp Gly Cys Ser Glu Gly Gln Trp Asp Val Val Gly Asp Thr Phe

165 170 175

Pro Val Gly Cys Arg Phe Asp Glu Arg Cys Ile Tyr Pro Glu Leu Phe

180 185 190

Lys Ala Asn Pro Asp Ser Gln His Pro Val Tyr Ser Thr Lys Tyr Gly

195 200 205

Ile Tyr Glu Pro Gly Cys Gly Leu Asp Lys Leu Ile Met Ser Trp Gly

210 215 220

His Asp Glu Tyr Leu Tyr Leu Val Val Lys Asp Gln Ser Thr Leu Pro

225 230 235 240

Arg Glu Ala Leu Ala Met Ile Arg Phe His Ser Phe Tyr Pro Trp His

245 250 255

Arg Glu Gly Ala Tyr Arg Glu Phe Met Ala Glu Gly Asp Glu Glu Leu

260 265 270

Leu Arg Ala Val Arg Ala Phe Asn Pro Tyr Asp Leu Tyr Ser Lys Thr

275 280 285

Asp Asp Val Lys Asn Val Glu Glu Leu Lys Pro Tyr Tyr Leu Glu Leu

290 295 300

Ile Asp Glu Phe Phe Pro Gln Lys Ile Ile Lys Trp Phe Ile Ser Pro

305 310 315 320

Asp Gln Ser Pro Asn Pro Leu Lys Phe Arg

325 330

<210> 2

<211> 993

<212> DNA

<213> Chaetomium thermophilum

<400> 2

atgtctagcg cgagcgtcga cgcaatgccg gtctgtcgcg atggcctggc tctcgaagcc 60

atttccgatg cggttgatac cgtcaacatc ctgaaaggta ttagcgcaaa gaacgaagaa 120

atcgactacg atgctgaatc tcgtttcgac gcaggcaaag acaaatccac tttccgtcgt 180

tataatgaag cgtgtgaacg tgtaaaaaac ttttacgcag aacagcacgc gaaacagacc 240

ctggcacaca acctgaatgc acgtgaacgt ttctacagcc cgtcccgtaa acgtccggag 300

atgtcagtat gggaagcaat cgaaatgctc aacgcgctga cggataacag cgacccggac 360

accgaaatga cccagatcca gcatgcactt cagactgctg aggctatccg ccgtgatggt 420

aagccgcgtt ggatgcagct gaccggcctg attcacgatc tgggcaagct gatgttgttc 480

ctggatggct gctccgaagg tcagtgggat gttgtcggtg ataccttccc ggttggctgc 540

cgcttcgacg aacgttgtat ctatccggaa ctgtttaaag ctaacccgga ctcacagcac 600

ccggtctatt ctaccaagta cggtatctat gaaccgggct gtggtctgga taagctgatc 660

atgtcctggg gccacgacga atacctgtat ctggttgtga aagatcagtc taccttgccg 720

cgtgaagcac tcgcgatgat ccgttttcat agcttttacc cgtggcaccg cgaaggtgct 780

taccgtgagt tcatggcaga gggtgacgaa gagcttctcc gtgcggttcg cgctttcaat 840

ccatacgacc tgtactccaa gacggacgat gtgaagaacg tggaagaact caaaccgtac 900

tacctggaac tgatcgatga attcttccct caaaagatca tcaaatggtt catctctccg 960

gaccaatcgc cgaacccgct gaaattccgt taa 993

<210> 3

<211> 313

<212> PRT

<213> Thermothelomyces thermophila

<400> 3

Met Ala Ala Val Asp Ile Arg Pro Ala Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu

1 5 10 15

Glu Ala Ile Thr Asp Ala Val Ala Met Val Asn Ile Leu Arg Gly Met

20 25 30

Ala Thr Ser Glu Thr Thr Ala Phe Asp Ala Glu Ser Arg Phe Asp Ser

35 40 45

Asp Lys Asp Lys Ser Ala Phe Arg Lys Tyr Asp Glu Ala Cys Asp Arg

50 55 60

Val Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gln His Ala Lys Gln Thr Val Ala His

65 70 75 80

Asn Leu Ala Ala Arg Gln Arg Phe Tyr Ser Pro Thr Arg Lys Arg Pro

85 90 95

Glu Met Thr Val Trp Glu Ala Ile Glu Lys Leu Asn Ala Leu Ile Asp

100 105 110

Asn Ser Asp Pro Asp Thr Glu Leu Ser Gln Ile His His Leu Leu Gln

115 120 125

Ser Ala Glu Ala Ile Arg Arg Asp Gly Lys Pro Arg Trp Met Gln Leu

130 135 140

Val Gly Leu Ile His Asp Leu Gly Lys Leu Met Leu Phe Phe Asp Gly

145 150 155 160

Cys Ala Glu Gly Gln Trp Glu Val Val Gly Asp Thr Phe Pro Val Gly

165 170 175

Cys Gln Phe Asp Glu Arg Cys Ile Tyr Pro Glu Thr Phe Lys Ala Asn

180 185 190

Pro Asp Ser Ser His Glu Val Tyr Gly Thr Arg Tyr Gly Ile Tyr Gln

195 200 205

Pro Gly Cys Gly Ile Asn Asn Leu Met Met Cys Trp Gly His Asp Glu

210 215 220

Tyr Leu Tyr Leu Val Ile Lys Asp Gln Ser Thr Leu Pro Pro Glu Ala

225 230 235 240

Leu Ala Met Val Arg Phe His Ser Phe Tyr Pro Trp His Arg Glu Gly

245 250 255

Ala Tyr Met Asp Phe Met Ala Glu Gly Asp Glu Ala Leu Leu His Ala

260 265 270

Val Arg Ala Phe Asn Pro Tyr Asp Leu Tyr Ser Lys Ser Asp Glu Val

275 280 285

Pro Lys Val Glu Glu Leu Lys Pro Tyr Tyr Leu Glu Leu Ile Asp Glu

290 295 300

Phe Phe Pro Gln Lys Val Ile Lys Trp

305 310

<210> 4

<211> 942

<212> DNA

<213> Thermothelomyces thermophila

<400> 4

atggcagcgg tagacattcg ccctgcacag cgtgatggtc cggctctgga ggcgatcact 60

gacgccgttg caatggttaa tatcctgcgt ggcatggcta ccagcgagac aacggcgttc 120

gatgctgagt cgcgtttcga ctcagacaaa gataaatccg cgttccgtaa atatgacgag 180

gcctgcgacc gtgtaaaggg tttctacgcg gagcagcacg ccaaacagac cgtggcgcat 240

aacctggctg cccgccagcg tttttattcg ccgacccgca aacgtccaga gatgaccgta 300

tgggaagcta tcgaaaaact gaacgcatta atcgacaaca gcgatccgga taccgagctg 360

tcccagatcc accacctgct gcaatctgcg gaagcgatcc gtcgtgacgg taaaccgcgc 420

tggatgcagt tagtaggcct gatccacgac ctggggaaac tgatgctgtt ctttgacggc 480

tgtgccgagg gccagtggga agtggtgggt gacactttcc cggtaggctg ccagttcgac 540

gagcgttgca tctacccgga aacgtttaaa gcgaacccgg attcaagcca tgaagtatac 600

gggactcgct acggcatcta tcagccgggt tgcggcatta acaacctgat gatgtgctgg 660

ggccacgatg agtacctgta ccttgtcatt aaagaccagt caaccctgcc gccggaagcc 720

ttggcgatgg tccgcttcca cagcttttac ccgtggcatc gtgagggtgc gtacatggac 780

ttcatggccg aaggggatga agcgcttctg cacgccgttc gtgcgttcaa cccgtacgac 840

ctgtactcta aaagcgacga ggtgccgaaa gttgaagaac ttaaaccgta ctacctggaa 900

ctgattgacg agttcttccc gcagaaagta attaagtggt aa 942

<210> 5

<211> 315

<212> PRT

<213> Cryptococcus neoformans

<400> 5

Met His Ala Pro Glu Val Asn Asp Tyr Ile Lys His Lys Ala Val Lys

1 5 10 15

Leu Asp Gln Val Ser Asp Glu Ile Asp Glu Val Asn Val Leu Lys Leu

20 25 30

Lys Gln Lys Asp Ala Val Glu Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asp Tyr Asp

35 40 45

Leu Ala Ser Lys Phe Asp Gln Glu Lys Asp Lys Ala Ala Phe Arg Gln

50 55 60

Tyr Glu Glu Ala Cys Asp Arg Val Lys Asn Phe Tyr Ala Glu Gln His

65 70 75 80

Leu Lys Gln Thr Tyr Glu Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gln Glu Phe Arg

85 90 95

Asn Thr Val Arg Ala Arg Met Ser Ile Trp Glu Ala Met Glu Leu Leu

100 105 110

Asp Asn Leu Val Asp Glu Ser Asp Pro Asp Thr Ser Val Gly Gln Ile

115 120 125

Glu His Leu Leu Gln Thr Ala Glu Ala Ile Arg Arg Asp Gly Lys Pro

130 135 140

Glu Trp Met Gln Val Thr Gly Leu Ile His Asp Leu Gly Lys Leu Leu

145 150 155 160

Cys Phe Phe Gly Ala Asp Gly Gln Trp Asp Val Val Gly Asp Thr Phe

165 170 175

Val Val Gly Cys Lys Phe Ser Asp Lys Ile Ile Tyr Pro Asp Thr Phe

180 185 190

Lys Ser Asn Pro Asp Tyr Asn Asn Pro Lys Leu Asn Thr Lys Tyr Gly

195 200 205

Val Tyr Glu Pro Asn Cys Gly Leu Asp Asn Val Leu Leu Ser Trp Gly

210 215 220

His Asp Glu Tyr Met Tyr Glu Ile Cys Lys Asn Gln Ser Thr Leu Pro

225 230 235 240

Gln Glu Ala Leu Ala Met Ile Arg Tyr His Ser Phe Tyr Pro Trp His

245 250 255

Arg Glu Gly Ala Tyr Glu His Leu Met Asn Glu Lys Asp Tyr Ser Gln

260 265 270

Leu Lys Ala Val Lys Ala Phe Asn Pro Tyr Asp Leu Tyr Ser Lys Ser

275 280 285

Asp Asp Pro Pro Lys Lys Glu Glu Leu Lys Pro Tyr Tyr Gln Ser Leu

290 295 300

Ile Ser Lys Phe Phe Pro Glu Glu Val Gln Trp

305 310 315

<210> 6

<211> 948

<212> DNA

<213> Cryptococcus neoformans

<400> 6

atgcatgctc cggaagttaa cgactacata aaacataaag ctgtcaagct ggatcaggtt 60

agcgatgaaa ttgatgaggt gaacgtatta aaactgaagc agaaagacgc agtagaaaag 120

acccaggccg aaatcgacta tgacctggcg agcaaattcg accaggagaa agacaaggcc 180

gccttccgtc aatacgaaga agcgtgcgat cgtgtgaaaa atttttacgc tgaacagcac 240

cttaagcaga cttatgagta taacgtaaaa atccgccagg agttccgcaa cacggtgcgc 300

gctcgtatgt ccatctggga agcaatggag ctgctagata acctggtgga cgaatccgat 360

ccggacacca gtgtaggcca aatcgaacac ttactgcaaa ccgcggaagc tatccgtcgt 420

gatggtaaac ctgagtggat gcaggttact ggtttaattc acgacctggg caaactgctg 480

tgcttcttcg gtgcggatgg tcagtgggat gttgtgggcg ataccttcgt agttggctgt 540

aaattttccg acaaaatcat ttaccctgac acgttcaaat ccaacccgga ctacaacaac 600

ccgaaactga acacgaagta tggtgtgtac gaaccgaact gcggcttaga taacgtactg 660

ctctcttggg gccatgatga gtacatgtat gagatttgta aaaaccagag cacgctgccg 720

caggaagcac tggccatgat ccgttaccat tctttttatc cgtggcatcg tgaaggggcc 780

tacgagcacc tgatgaacga gaaggattat agccagctta aagccgttaa agccttcaac 840

ccgtatgatc tgtacagcaa atccgatgat ccgccgaaga aagaggaact gaaaccgtac 900

tatcaatccc tgatctctaa attcttcccg gaggaggttc agtggtaa 948

<210> 7

<211> 349

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 7

Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr

1 5 10 15

Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp

20 25 30

Pro Ser Ser Ser Met Ala Ala Val Asp Ile Arg Pro Ala Gln Arg Asp

35 40 45

Gly Pro Ala Leu Glu Ala Ile Thr Asp Ala Val Ala Met Val Asn Ile

50 55 60

Leu Arg Gly Met Ala Thr Ser Glu Thr Thr Ala Phe Asp Ala Glu Ser

65 70 75 80

Arg Phe Asp Ser Asp Lys Asp Lys Ser Ala Phe Arg Lys Tyr Asp Glu

85 90 95

Ala Cys Asp Arg Val Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gln His Ala Lys Gln

100 105 110

Thr Val Ala His Asn Leu Ala Ala Arg Gln Arg Phe Tyr Ser Pro Thr

115 120 125

Arg Lys Arg Pro Glu Met Thr Val Trp Glu Ala Ile Glu Lys Leu Asn

130 135 140

Ala Leu Ile Asp Asn Ser Asp Pro Asp Thr Glu Leu Ser Gln Ile His

145 150 155 160

His Leu Leu Gln Ser Ala Glu Ala Ile Arg Arg Asp Gly Lys Pro Arg

165 170 175

Trp Met Gln Leu Val Gly Leu Ile His Asp Leu Gly Lys Leu Met Leu

180 185 190

Phe Phe Asp Gly Cys Ala Glu Gly Gln Trp Glu Val Val Gly Asp Thr

195 200 205

Phe Pro Val Gly Cys Gln Phe Asp Glu Arg Cys Ile Tyr Pro Glu Thr

210 215 220

Phe Lys Ala Asn Pro Asp Ser Ser His Glu Val Tyr Gly Thr Arg Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Tyr Gln Pro Gly Cys Gly Ile Asn Asn Leu Met Met Cys Trp

245 250 255

Gly His Asp Glu Tyr Leu Tyr Leu Val Ile Lys Asp Gln Ser Thr Leu

260 265 270

Pro Pro Glu Ala Leu Ala Met Val Arg Phe His Ser Phe Tyr Pro Trp

275 280 285

His Arg Glu Gly Ala Tyr Met Asp Phe Met Ala Glu Gly Asp Glu Ala

290 295 300

Leu Leu His Ala Val Arg Ala Phe Asn Pro Tyr Asp Leu Tyr Ser Lys

305 310 315 320

Ser Asp Glu Val Pro Lys Val Glu Glu Leu Lys Pro Tyr Tyr Leu Glu

325 330 335

Leu Ile Asp Glu Phe Phe Pro Gln Lys Val Ile Lys Trp

340 345

<210> 8

<211> 1050

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

atggggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60

atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatccga gctcgagcat ggcagcggta 120

gacattcgcc ctgcacagcg tgatggtccg gctctggagg cgatcactga cgccgttgca 180

atggttaata tcctgcgtgg catggctacc agcgagacaa cggcgttcga tgctgagtcg 240

cgtttcgact cagacaaaga taaatccgcg ttccgtaaat atgacgaggc ctgcgaccgt 300

gtaaagggtt tctacgcgga gcagcacgcc aaacagaccg tggcgcataa cctggctgcc 360

cgccagcgtt tttattcgcc gacccgcaaa cgtccagaga tgaccgtatg ggaagctatc 420

gaaaaactga acgcattaat cgacaacagc gatccggata ccgagctgtc ccagatccac 480

cacctgctgc aatctgcgga agcgatccgt cgtgacggta aaccgcgctg gatgcagtta 540

gtaggcctga tccacgacct ggggaaactg atgctgttct ttgacggctg tgccgagggc 600

cagtgggaag tggtgggtga cactttcccg gtaggctgcc agttcgacga gcgttgcatc 660

tacccggaaa cgtttaaagc gaacccggat tcaagccatg aagtatacgg gactcgctac 720

ggcatctatc agccgggttg cggcattaac aacctgatga tgtgctgggg ccacgatgag 780

tacctgtacc ttgtcattaa agaccagtca accctgccgc cggaagcctt ggcgatggtc 840

cgcttccaca gcttttaccc gtggcatcgt gagggtgcgt acatggactt catggccgaa 900

ggggatgaag cgcttctgca cgccgttcgt gcgttcaacc cgtacgacct gtactctaaa 960

agcgacgagg tgccgaaagt tgaagaactt aaaccgtact acctggaact gattgacgag 1020

ttcttcccgc agaaagtaat taagtggtaa 1050

Claims

1.一种生产葡萄糖醛酸的方法，包括如下步骤：以肌醇为原料，在工程菌的作用下，生产葡萄糖醛酸；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；

所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；

(a2)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，反应温度为30℃-40℃、反应pH为8.0-9.0。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中的工程菌为进行诱导培养后的工程菌；所述诱导培养为采用L-***糖进行诱导并培养。

4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述出发菌为大肠杆菌。

5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述功能基因通过重组质粒导入出发菌；所述重组质粒是将所述功能基因***出发载体得到的。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述出发载体为pBAD/HisB载体。

7.一种生产葡萄糖醛酸的方法，包括如下步骤：以肌醇为原料，在功能蛋白的作用下，生产葡萄糖醛酸；所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；

(a2)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。

8.一种重组菌，是将重组质粒导入出发菌得到的；所述重组质粒为将编码功能蛋白的功能基因导入出发载体得到的；所述出发载体为pBAD/HisB载体；所述出发菌为大肠杆菌BW25113；所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；

(a2)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。

9.权利要求8所述重组菌在制备葡萄糖醛酸中的应用。

10.功能蛋白在制备葡萄糖醛酸中的应用；所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；

(a2)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。