CN106148255A - 产有机酸途径缺失的工程菌及其在联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产有机酸途径缺失的工程菌及其在联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇中的应用。本发明将克雷伯氏菌的乳酸合成途径的乳酸脱氢酶基因，乙酸合成途径的乙酸激酶基因和丙酮酸氧化酶基因，以及琥珀酸合成途径的富马酸还原酶基因和异柠檬酸裂解酶基因进行失活，从而减少了克雷伯氏菌代谢甘油时有机酸的生产，提高了醇类如1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇的产量和转化率，实现了1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇的联产。有机酸产量的大幅降低，可以简化醇类的提取工艺。本发明可提高微生物转化甘油生产高值产品的生产效率，降低生产成本，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一株产有机酸途径缺失的工程菌及其在联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇中的应用。
背景技术
1,3-丙二醇是一种重要的化工原料，可用于溶剂、润滑剂、抗冻剂等行业。目前，1,3-丙二醇主要用于合成聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，后者是一种性能优异的生物可降解的聚酯材料，具有良好的延展性和水洗性，在纺织、塑料等方面具有广阔的应用前景。生物法发酵糖类或甘油生产1,3-丙二醇，是一种高效、环保的1,3-丙二醇生产方法，受到越来越多的关注。克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸菌属(Citrobacter)和梭菌属(Clostridium)等细菌已经被用于发酵甘油生产1,3-丙二醇(Saxena et al.,Biotechnol.Adv.,2009,27,895–913)。
2,3-丁二醇是一种用途广泛的平台化合物，在燃料、化工、食品等多个领域具有重要的用途。2,3-丁二醇具有较高的热值，可用作燃料添加剂；可代替1,4-丁二醇，用于聚酯和聚亚氨酯的合成；其脱水产物甲乙酮是一种广泛应用于涂料、润滑剂、燃料、香料等行业的溶剂；其脱水产物1,3-丁二烯可用来合成橡胶单体，是一种重要的石油化工基础有机原料；其高值衍生物3-羟基丁酮和丁二酮广泛应用于食品、化妆品、香料等行业。微生物发酵法生产2,3-丁二醇已得到广泛的研究，自然界中具有2,3-丁二醇生产能力的细菌主要包括：克雷伯氏菌属(Klebsiella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)和肠杆菌属(Enterobacter)等(Jietal.,Biotechnol.Adv.,2011,29,351–364.)。
乙醇是目前研究最为广泛的生物燃料之一，利用酵母、大肠杆菌等微生物发酵生产生物乙醇，已成为可再生生物能源领域的热点。传统的利用淀粉糖发酵生产乙醇的工艺，成本高，且与人争粮。因此，越来越多的研究关注于开发利用非粮原料如纤维素水解液、甘油生产乙醇。
目前，1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇各自的生物法生产工艺已经得到广泛的研究，但是还没有联产这三种重要化学品的报道。克雷伯氏菌在代谢甘油时会生产1,3-丙二醇2,3-丁二醇和乙醇等醇类，同时还会生产乳酸、乙酸和琥珀酸等有机酸。缺失克雷伯氏菌中有机酸的合成途径，有望减少克雷伯氏菌发酵甘油时有机酸的生产，从而提高醇类的生产效率和转化率，实现发酵甘油联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一株产有机酸途径缺失的工程菌及其在联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇中的应用方法。
本发明的一株产有机酸途径缺失的工程菌，其特征在于，克雷伯氏菌野生型菌株的产乳酸途径、产乙酸途径和产琥珀酸途径缺失，该菌命名为克雷伯氏菌XP-5Klebsiella sp.XP-5，已于2015年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，其保藏号为：CCTCC NO M 2015092。
所述产乳酸途径缺失是失活乳酸脱氢酶基因；所述产乙酸途径缺失是失活乙酸激酶基因和丙酮酸氧化酶基因；所述产琥珀酸途径缺失是失活富马酸还原酶基因和异柠檬酸裂解酶基因。
所述乳酸脱氢酶基因序列如SEQ ID NO.1；所述乙酸激酶基因序列如SEQ ID NO.2；所述丙酮酸氧化酶基因序列如SEQ ID NO.3；所述富马酸还原酶基因序列如SEQ ID NO.4；所述异柠檬酸裂解酶基因序列如SEQ ID NO.5。
所述失活克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因、乙酸激酶基因、丙酮酸氧化酶基因、富马酸还原酶基因和异柠檬酸裂解酶基因，是通过基因敲除实现的，优选通过以下方法进行基因敲除：
(1)PCR扩增克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因在基因组中上游和下游的部分同源序列，将其与***载体相连，然后再导入杂交供体菌中；
(2)将步骤(1)获得的携带有乳酸脱氢酶基因上游和下游部分同源序列的***载体的供体菌与克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组敲除乳酸脱氢酶基因，经筛选后获得乳酸脱氢酶基因被敲除的克雷伯氏菌；
(3)PCR扩增克雷伯氏菌的乙酸激酶基因在基因组中上游和下游的部分同源序列，将其与***载体相连，然后再导入杂交供体菌中；
(4)将步骤(3)获得的携带有乙酸激酶基因上游和下游部分同源序列的***载体的供体菌与步骤(2)获得的乳酸脱氢酶基因被敲除的克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组敲除乙酸激酶基因，经筛选后获得乳酸脱氢酶基因和乙酸激酶基因都被敲除的克雷伯氏菌；
(5)PCR扩增克雷伯氏菌的丙酮酸氧化酶基因在基因组中上游和下游的部分同源序列，将其与***载体相连，然后再导入杂交供体菌中；
(6)将步骤(5)获得的携带有丙酮酸氧化酶基因上游和下游部分同源序列的***载体的供体菌与步骤(4)获得的乳酸脱氢酶基因和乙酸激酶基因被敲除的克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组敲除丙酮酸氧化酶基因，经筛选后获得乳酸脱氢酶基因、乙酸激酶基因和丙酮酸氧化酶基因都被敲除的克雷伯氏菌；
(7)PCR扩增克雷伯氏菌的富马酸还原酶基因在基因组中上游和下游的部分同源序列，将其与***载体相连，然后再导入杂交供体菌中；
(8)将步骤(7)获得的携带有富马酸还原酶基因上游和下游部分同源序列的***载体的供体菌与步骤(6)获得的乳酸脱氢酶基因、乙酸激酶基因和丙酮酸氧化酶基因被敲除的克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组敲除富马酸还原酶基因，经筛选后获得乳酸脱氢酶基因、乙酸激酶基因、丙酮酸氧化酶基因和富马酸还原酶基因都被敲除的克雷伯氏菌；
(9)PCR扩增克雷伯氏菌的异柠檬酸裂解酶基因在基因组中上游和下游的部分同源序列，将其与***载体相连，然后再导入杂交供体菌中；
(10)将步骤(9)获得的携带有异柠檬酸裂解酶基因上游和下游部分同源序列的***载体的供体菌与步骤(8)获得的乳酸脱氢酶基因、乙酸激酶基因、丙酮酸氧化酶基因和富马酸还原酶基因被敲除的克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组敲除异柠檬酸裂解酶基因， 经筛选后获得乳酸脱氢酶基因、乙酸激酶基因、丙酮酸氧化酶基因、富马酸还原酶基因和异柠檬酸裂解酶基因都被敲除的克雷伯氏菌。
所述的步骤(1)的PCR扩增克雷伯氏菌乳酸脱氢酶基因上游部分同源序列，是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物ldhA-1：ATCGGAATTCAGGGTATTGAGCTGGGCGTC与引物ldhA-2：ATTCAAGCTTCGAAACCTGTCCGAACGCCA组成的引物进行PCR扩增后得到上游序列；以引物ldhA-3：ATTAAAGCTTCCGTTGGCGGTTTTGGCAGT与引物ldhA-4：TCTACCCGGGTTTTCAGCCGCTTTCTCTCT组成的引物进行PCR扩增后得到下游序列。
所述步骤(3)的PCR扩增克雷伯氏菌乙酸激酶基因上游和下游部分同源序列，是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物ackA-1：ATCGGAATTCTAGCGGGTGGCACGAATAAT与引物ackA-2：ATTAGGATCCGCTACCGCAGTTCAGAACCA组成的引物进行PCR扩增后得到上游序列；以引物ackA-3：GCAAGGATCCCTATACCATCGCACTGACCG与引物ackA-4：TCCCCCCGGGCGAGACAAAAGACTTTCATC组成的引物进行PCR扩增后得到下游序列。
所述步骤(5)的PCR扩增克雷伯氏菌丙酮酸氧化酶基因上游和下游部分同源序列，是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物poxB-1：GCATGAATTCTTTCGCTGCCACTTTATCCA与引物poxB-2：ATTAGGATCCGGCGAAAACCAACTGGCTCA组成的引物进行PCR扩增后得到上游序列；以引物poxB-3：ATGCGGATCCACGGTCTGCTTCATGATCTC与引物poxB-4：CGTACTGCAGATCTAAGCCGACCATCAGCC组成的引物进行PCR扩增后得到下游序列。
所述步骤(7)的PCR扩增克雷伯氏菌富马酸还原酶基因上游和下游部分同源序列，是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物frdA-1：ATTCGAATTCGGTCTGCTTGTTTGGCCCCT与引物frdA-2：CATGCATATGCCGTCTGGAATATGGCGATG组成的引物进行PCR扩增后得到上游序列；以引物frdA-3：ATTCCATATGCGTATGGCTGCGCATCGGAT与引物frdA-4：TAACCTGCAGCGGTAAAGAAACGGCGGATT组成的引物进行PCR扩增后得到下游序列。
所述步骤(9)的PCR扩增克雷伯氏菌异柠檬酸裂解酶基因上游和下游部分同源序列，是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物aceA-1：ATGCGAATTCGAACGCACGGAAGCCGGAAT与引物aceA-2：ATCGAAGCTTGCGGGTTCGTCCATTCTTTG组成的引物进行PCR扩增后得到上游序列；以引物aceA-3：ATCGAAGCTTTTGAGAAAGTGCAGCAGCCG与引物aceA-4：ATGGCTGCAGAGGCCCACGTGGTGATCGTA组成的引物进行PCR扩增后得到下游序列。
所述的***载体为***载体pKR6K(如图1，Wang et al.,J.Biol.Chem.2014,289:6080-6090)。所述的***载体的衍生载体导入杂交供体菌株中，可以通过热激法、电转化法、接合转化法等常规方法转化杂交供体菌。
所述的杂交供体菌为大肠杆菌S17-1(λpir)。
本发明还提供了产有机酸途径缺失的工程菌在联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇中的应用方法，该方法的步骤如下：
(1)种子培养：选用克雷伯氏菌XP-5CCTCC M 2015092，在无菌条件下接种至装有甘油发酵培养基的500mL三角瓶中，30-37℃，100-200rpm摇床中培养8-15小时，得到种子培养液。
(2)发酵培养：将步骤(1)中制得的种子培养液接种至装有甘油发酵培养基的5L发酵罐中，进行分批补料发酵，接种量为0.5-5％(v/v)，通气量为0.5-2.0vvm，搅拌转速为100-300rpm，发酵温度为30-37℃，发酵过程中，使用碱溶液调节发酵液pH为6.0-7.0。当甘油发酵培养基中的甘油耗尽时，通过向发酵罐中补加500-700g/L的甘油溶液，控制发酵液中甘油浓度为5-30g/L。当发酵液中1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇的浓度不再升高时，停止发酵。
所述甘油发酵培养基中含有甘油作为碳源。
本发明将克雷伯氏菌的有机酸合成途径包括乳酸合成途径、乙酸合成途径和琥珀酸合成途径的关键基因进行基因敲除，从而减少了克雷伯氏菌代谢甘油时有机酸的生产，提高了醇类如1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇的产量和转化率，实现了1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇的联产。有机酸产量的大幅降低，可以简化醇类的提取工艺。本发明可提高微生物转化甘油生产高值产品的生产效率，降低生产成本，具有重要的应用价值。
附图说明
图1***载体pKR6K的物理图谱。
图2产乳酸、乙酸和琥珀酸途径缺失的工程菌XP-5发酵甘油联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇的过程曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一：克雷伯氏菌中乳酸脱氢酶基因ldhA的敲除
(1)乳酸脱氢酶基因ldhA上游和下游部分同源序列的克隆
根据克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组序列设计引物，PCR乳酸脱氢酶基因ldhA上游和下游部分同源序列。以克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组DNA为模板，以引物ldhA-1：ATCGGAATTCAGGGTATTGAGCTGGGCGTC与引物ldhA-2：ATTCAAGCTTCGAAACCTGTCCGAACGCCA组成的引物进行PCR扩增，得到ldhA上游的部分同源序列；以引物ldhA-3：ATTAAAGCTTCCGTTGGCGGTTTTGGCAGT与引物ldhA-4：TCTACCCGGGTTTTCAGCCGCTTTCTCTCT组成的引物进行PCR扩增，得到ldhA下游的部分同源序列。PCR扩增条件为：95℃5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，共 30个循环；72℃5分钟。PCR反应结束后，将PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化，得到目的片段。
(2)***载体的构建
使用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切ldhA基因上游的同源片段，使用HindIII和XmaI酶切ldhA基因下游的同源片段，使用EcoRI和XmaI酶切pKR6K载体，将酶切产物和pKR6K载体进行回收并纯化，使用T4连接酶，将ldhA基因上游的同源片段、下游的同源片段和pKR6K载体连接，将连接产物转入大肠杆菌S17-1(λpir)，筛选阳性转化子，得到携带有ldhA基因上游和下游部分同源片段的***载体
(3)乳酸脱氢酶基因ldhA敲除的克雷伯氏菌的构建
将步骤(2)中获得的携带有的大肠杆菌S17-1(λpir)(供体菌)与克雷伯氏菌ATCC25955(受体菌)进行双亲本杂交，使上的ldhA基因上游和下游的部分同源序列与克雷伯氏菌基因组发生同源重组，从而使克雷伯氏菌中的ldhA基因缺失失活，从而获得ldhA基因敲除的克雷伯氏菌。具体方法为：
a.分别接种活化后的供体菌和受体菌至5mLLB培养基中，37℃摇床中，200rpm培养2-3小时，当供体菌和受体菌同时生长到OD620nm为0.5-0.8；将5mL供体菌菌液离心，无菌生理盐水洗两遍；将1mL受体菌菌液离心，无菌生理盐水洗两遍；将上述供体菌和受体菌的菌体一共用100μL无菌生理盐水重悬，将重悬液全部滴在LB固体培养基平板中间，平板正面放置，37℃培养12-18小时。
b.将步骤a中LB固体培养基平板上的菌落用无菌生理盐水和刮刀刮下，无菌生理盐水洗两遍，进行适当稀释，涂布于加入了50μg/mL卡那霉素的M9固体培养基平板，37℃培养24-36小时。
c.挑取步骤b中M9固体培养基平板上生长的单菌落至加入50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中，37℃，200rpm培养12小时。转接菌液至新鲜的5mL LB培养基中(不添加卡那霉素)，37℃，200rpm培养12小时。
d.将上述菌液适当稀释，涂布于LAS固体培养基平板，25℃培养24小时。
e.挑取步骤d中LAS固体培养基平板上生长的单菌落至5mLLB培养基中，37℃，200rpm培养12小时，提取基因组DNA，使用引物ldhA-1：ATCGGAATTCAGGGTATTGAGCTGGGCGTC与引物ldhA-4：TCTACCCGGGTTTTCAGCCGCTTTCTCTCT组成的引物进行PCR扩增，经电泳验证得到正确的克隆，即为ldhA基因敲除的克雷伯氏菌。
LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，固体培养基中加入琼脂粉15g/L，121℃灭菌20分钟。
M9固体培养基：Na2HPO4·12H2O 1.7g/L、KH2PO40.3g/L、NaCl 0.05g/L、NH4Cl 0.1g/L、柠檬酸三钠0.5g/L、琼脂粉15g/L，121℃灭菌20分钟。
LAS固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、蔗糖150g/L，琼脂粉15g/L，115℃ 灭菌20分钟。
实施例二：克雷伯氏菌中乙酸激酶基因ackA的敲除
(1)乙酸激酶基因ackA上游和下游部分同源序列的克隆
根据实施例1步骤(1)的方法，设计引物，以克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组DNA为模板，以引物ackA-1：ATCGGAATTCTAGCGGGTGGCACGAATAAT与引物ackA-2：ATTAGGATCCGCTACCGCAGTTCAGAACCA组成的引物进行PCR扩增后得到ackA基因的上游序列；以引物ackA-3：GCAAGGATCCCTATACCATCGCACTGACCG与引物ackA-4：TCCCCCCGGGCGAGACAAAAGACTTTCATC组成的引物进行PCR扩增后得到ackA基因的下游序列。对PCR产物进行回收和纯化，得到目的片段。
(2)***载体的构建
使用限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切ackA基因上游的同源片段，使用BamHI和XmaI酶切ackA基因下游的同源片段，使用EcoRI和XmaI酶切pKR6K载体，将酶切产物和pKR6K载体进行回收并纯化，使用T4连接酶，将ackA基因上游的同源片段、下游的同源片段和pKR6K载体连接，将连接产物转入大肠杆菌S17-1(λpir)，筛选阳性转化子，得到携带有ackA基因上游和下游部分同源片段的***载体
(3)乙酸激酶基因ackA敲除的克雷伯氏菌的构建
将步骤(2)中获得的携带有的大肠杆菌S17-1(λpir)(供体菌)与实施例1中获得的ldhA基因敲除的克雷伯氏菌(受体菌)进行双亲本杂交，使上的ackA基因上游和下游的部分同源序列与克雷伯氏菌基因组发生同源重组，从而使克雷伯氏菌中的ackA基因缺失失活，从而获得ldhA基因和ackA基因敲除的克雷伯氏菌。具体方法与实施例1相同，只是PCR验证时，使用引物ackA-1：ATCGGAATTCTAGCGGGTGGCACGAATAAT与引物ackA-4：TCCCCCCGGGCGAGACAAAAGACTTTCATC组成的引物进行PCR验证。
实施例三：克雷伯氏菌中丙酮酸氧化酶基因poxB的敲除
(1)丙酮酸氧化酶基因poxB上游和下游部分同源序列的克隆
根据实施例1步骤(1)的方法，设计引物，以克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组DNA为模板，以引物poxB-1：GCATGAATTCTTTCGCTGCCACTTTATCCA与引物poxB-2：ATTAGGATCCGGCGAAAACCAACTGGCTCA组成的引物进行PCR扩增后得到poxB基因的上游序列；以引物poxB-3：ATGCGGATCCACGGTCTGCTTCATGATCTC与引物poxB-4：CGTACTGCAGATCTAAGCCGACCATCAGCC组成的引物进行PCR扩增后得到poxB基因的下游序列。对PCR产物进行回收和纯化，得到目的片段。
(2)***载体的构建
使用限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切poxB基因上游的同源片段，使用BamHI和PstI酶切poxB基因下游的同源片段，使用EcoRI和PstI酶切pKR6K载体，将酶切产物和pKR6K载体进行回收并纯化，使用T4连接酶，将poxB基因上游的同源片段、下游的同源片段和 pKR6K载体连接，将连接产物转入大肠杆菌S17-1(λpir)，筛选阳性转化子，得到携带有poxB基因上游和下游部分同源片段的***载体
(3)丙酮酸氧化酶基因poxB敲除的克雷伯氏菌的构建
将步骤(2)中获得的携带有的大肠杆菌S17-1(λpir)(供体菌)与实施例2中获得的ldhA基因和ackA基因敲除的克雷伯氏菌(受体菌)进行双亲本杂交，使 上的poxB基因上游和下游的部分同源序列与克雷伯氏菌基因组发生同源重组，从而使克雷伯氏菌中的poxB基因缺失失活，从而获得ldhA基因、ackA基因和poxB基因敲除的克雷伯氏菌。具体方法与实施例1相同，只是PCR验证时，使用引物poxB-1：GCATGAATTCTTTCGCTGCCACTTTATCCA与引物poxB-4：CGTACTGCAGATCTAAGCCGACCATCAGCC组成的引物进行PCR验证。
实施例四：克雷伯氏菌中富马酸还原酶基因frdA的敲除
(1)富马酸还原酶基因frdA上游和下游部分同源序列的克隆
根据实施例1步骤(1)的方法，设计引物，以克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组DNA为模板，以引物frdA-1：ATTCGAATTCGGTCTGCTTGTTTGGCCCCT与引物frdA-2：CATGCATATGCCGTCTGGAATATGGCGATG组成的引物进行PCR扩增后得到frdA基因的上游序列；以引物frdA-3：ATTCCATATGCGTATGGCTGCGCATCGGAT与引物frdA-4：TAACCTGCAGCGGTAAAGAAACGGCGGATT组成的引物进行PCR扩增后得到frdA基因的下游序列。对PCR产物进行回收和纯化，得到目的片段。
(2)***载体的构建
使用限制性内切酶EcoRI和NdeI酶切frdA基因上游的同源片段，使用NdeI和PstI酶切frdA基因下游的同源片段，使用EcoRI和PstI酶切pKR6K载体，将酶切产物和pKR6K载体进行回收并纯化，使用T4连接酶，将frdA基因上游的同源片段、下游的同源片段和pKR6K载体连接，将连接产物转入大肠杆菌S17-1(λpir)，筛选阳性转化子，得到携带有frdA基因上游和下游部分同源片段的***载体
(3)富马酸还原酶基因frdA敲除的克雷伯氏菌的构建
将步骤(2)中获得的携带有的大肠杆菌S17-1(λpir)(供体菌)与实施例3中获得的ldhA基因、ackA基因和poxB基因敲除的克雷伯氏菌(受体菌)进行双亲本杂交，使上的frdA基因上游和下游的部分同源序列与克雷伯氏菌基因组发生同源重组，从而使克雷伯氏菌中的frdA基因缺失失活，从而获得ldhA基因、ackA基因、poxB基因和frdA基因敲除的克雷伯氏菌。具体方法与实施例1相同，只是PCR验证时，使用引物frdA-1：ATTCGAATTCGGTCTGCTTGTTTGGCCCCT与引物frdA-4：TAACCTGCAGCGGTAAAGAAACGGCGGATT组成的引物进行PCR验证。
实施例五：克雷伯氏菌中异柠檬酸裂解酶基因aceA的敲除
(1)异柠檬酸裂解酶基因aceA上游和下游部分同源序列的克隆
根据实施例1步骤(1)的方法，设计引物，以克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组DNA 为模板，以引物aceA-1：ATGCGAATTCGAACGCACGGAAGCCGGAAT与引物aceA-2：ATCGAAGCTTGCGGGTTCGTCCATTCTTTG组成的引物进行PCR扩增后得到aceA基因的上游序列；以引物aceA-3：ATCGAAGCTTTTGAGAAAGTGCAGCAGCCG与引物aceA-4：ATGGCTGCAGAGGCCCACGTGGTGATCGTA组成的引物进行PCR扩增后得到aceA基因的下游序列。对PCR产物进行回收和纯化，得到目的片段。
(2)***载体的构建
使用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切aceA基因上游的同源片段，使用HindIII和PstI酶切aceA基因下游的同源片段，使用EcoRI和PstI酶切pKR6K载体，将酶切产物和pKR6K载体进行回收并纯化，使用T4连接酶，将aceA基因上游的同源片段、下游的同源片段和pKR6K载体连接，将连接产物转入大肠杆菌S17-1(λpir)，筛选阳性转化子，得到携带有aceA基因上游和下游部分同源片段的***载体
(3)异柠檬酸裂解酶基因aceA敲除的克雷伯氏菌的构建
将步骤(2)中获得的携带有的大肠杆菌S17-1(λpir)(供体菌)与实施例4中获得的ldhA基因、ackA基因、poxB基因和frdA基因敲除的克雷伯氏菌(受体菌)进行双亲本杂交，使上的aceA基因上游和下游的部分同源序列与克雷伯氏菌基因组发生同源重组，从而使克雷伯氏菌中的aceA基因缺失失活，从而获得ldhA基因、ackA基因、poxB基因、frdA基因和aceA基因敲除的克雷伯氏菌工程菌，命名为克雷伯氏菌XP-5。具体方法与实施例1相同，只是PCR验证时，使用引物aceA-1：ATGCGAATTCGAACGCACGGAAGCCGGAAT与引物aceA-4：ATGGCTGCAGAGGCCCACGTGGTGATCGTA组成的引物进行PCR验证。
实施例六：产乳酸、乙酸和琥珀酸途径缺失的工程菌XP-5发酵甘油联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇
(1)甘油发酵培养基
酵母粉5g/L、K2HPO4·3H2O 10g/L、KH2PO42g/L、NH4Cl 1g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、FeCl3·6H2O 30mg/L、CoCl2·6H2O 5mg/L和甘油20g/L。培养基121℃灭菌20分钟。
(2)种子培养
选用克雷伯氏菌XP-5，在无菌条件下接种至装有甘油发酵培养基的500mL三角瓶中，30-37℃，100-200rpm摇床中培养12小时，得到种子培养液。
(3)发酵培养
将步骤(2)中制得的种子培养液接种至装有甘油发酵培养基的5L发酵罐中，进行分批补料发酵，接种量为0.5-5％(v/v)，本实施例为1％(v/v)，通气量为0.5-2.0vvm，本实施例为1.0vvm，搅拌转速为100-300rpm，本实施例为250rpm，发酵温度为30-37℃，本实施例为37℃，发酵过程中，使用2M NaOH溶液调节发酵液pH为6.0-7.0，本实施例为6.6。当甘油发酵培养基中的20g/L甘油耗尽时，通过向发酵罐中补加500-700g/L甘油溶液，本实施例为向发酵罐中补加700g/L的甘油溶液，控制发酵液中甘油浓度为5-30g/L。当发酵液 中1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇的浓度不再升高时，停止发酵。
(4)发酵结果
以实施例5中获得的产乳酸、乙酸和琥珀酸途径缺失的工程菌XP-5为实验组，以克雷伯氏菌野生菌为对照组，进行分批补料发酵。工程菌XP-5的发酵进行34小时，发酵结果如图2和表1所示。产乳酸、乙酸和琥珀酸途径缺失的工程菌XP-5细胞生长速度和甘油代谢速度较野生菌减慢，但是有机酸(乳酸、乙酸和琥珀酸)的产量较野生菌降低了85.4％；同时，总醇(1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇)的产量提高了31.7％。其中，1,3-丙二醇的产量从64.3g/L提高至74.5g/L，提高了15.9％；2,3-丁二醇的产量从10.2g/L提高至20.8g/L，提高了104.9％；乙醇的产量从5.2g/L提高至9.7g/L，提高了86.5％；三种醇对甘油的总转化率达到0.72g/g，提高了41.2％，实现了1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇的联产。
表1：克雷伯氏菌工程菌XP-5和野生菌发酵甘油的产物对比
Claims (5)
1.一株产有机酸途径缺失的工程菌，其特征在于，克雷伯氏菌野生型菌株的产乳酸途径、产乙酸途径和产琥珀酸途径缺失，该工程菌命名为克雷伯氏菌XP-5，已于2015年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC M 2015092。
2.根据权利要求1所述的产有机酸途径缺失的工程菌，其特征在于，所述产乳酸途径缺失是失活乳酸脱氢酶基因；所述产乙酸途径缺失是失活乙酸激酶基因和丙酮酸氧化酶基因；所述产琥珀酸途径缺失是失活富马酸还原酶基因和异柠檬酸裂解酶基因。
3.根据权利要求2所述的产有机酸途径缺失的工程菌，其特征在于，所述乳酸脱氢酶基因序列如SEQ ID NO.1，所述乙酸激酶基因序列如SEQ ID NO.2，所述丙酮酸氧化酶基因序列如SEQ ID NO.3，所述富马酸还原酶基因序列如SEQ ID NO.4，所述异柠檬酸裂解酶基因序列如SEQ ID NO.5。
4.权利要求1的产有机酸途径缺失的工程菌在联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇中的应用方法，其步骤如下：
(1)种子培养：选用克雷伯氏菌XP-5CCTCC M 2015092，在无菌条件下接种至装有甘油发酵培养基的500mL三角瓶中，30-37℃，100-200rpm摇床中培养8-15小时，得到种子培养液。
(2)发酵培养：将步骤(1)中制得的种子培养液接种至装有甘油发酵培养基的5L发酵罐中，进行分批补料发酵，接种量为0.5-5％(v/v)，通气量为0.5-2.0vvm，搅拌转速为100-300rpm，发酵温度为30-37℃，发酵过程中，使用碱溶液调节发酵液pH为6.0-7.0。当甘油发酵培养基中的甘油耗尽时，通过向发酵罐中补加500-700g/L的甘油溶液，控制发酵液中甘油浓度为5-30g/L。当发酵液中1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇的浓度不再升高时，停止发酵。
5.根据权利要求4所述的产有机酸途径缺失的工程菌在联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇中的应用，其特征在于，所述甘油发酵培养基中含有甘油作为碳源。
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