CN104312987B - 一种生物合成葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物合成葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸的方法，属于代谢工程领域。通过在大肠杆菌中表达来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)的肌醇加氧酶(MIOX)，将肌醇转化为葡萄糖醛酸，再通过表达来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脱氢酶(Udh)，将生成的葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸，成功构建了从肌醇到葡萄糖二酸的合成途径。本发明构建的重组大肠杆菌，具有非常大的应用前景，为生物法转化生成葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸提供了新的思路。

Description

一种生物合成葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的方法

技术领域

本发明涉及一种生物合成葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的方法，属于代谢工程领域。

背景技术

葡萄糖醛酸，全称D-(+)-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)，葡萄糖醛酸广泛存在于动植物中，具有重要的生物学功能。它能结合含有羟基、氨基、羧基、巯基等基团的有毒物质，增强毒性物质水溶性，使之快速排出肾脏，起到解毒作用。同时，葡萄糖醛酸能与被结合物分子上活性基团-酚羟基结合，降低相关激素及药物的生物学作用。其衍生物葡萄糖醛酸内酯是也是一种保健药物，它有利于肝脏的解毒，可以预防治疗流行性肝炎、肝硬化、食物及药物中毒，同时还是功能性饮料、保健食品的添加剂。随着人们健康观念的日益增强和对生活质量要求的提高，对于葡萄糖醛酸的需求会越来越大。

葡萄糖二酸(glucuric acid，saccharic acid)又名葡萄糖质酸，是葡萄糖的醛基及C-6上羟基均被氧化成羧酸(如硝酸作用)而形成的糖酸。葡萄糖二酸及其衍生物在一些植物及哺乳动物中均有发现，特别是在一些十字花科蔬菜、草莓和柑橘类水果中含量丰富。葡萄糖二酸具有重要的生物功能，被美国能源部确定为“最有价值的生物炼制产品”。它可以降低胆固醇、用于癌症的治疗，同时其钙盐也是一种食品添加剂。葡萄糖二酸在水溶液中不稳定，易转变为葡萄糖二酸内酯的形式，二者在水溶液处于互变平衡状态。葡萄糖二酸1,4内酯也是一种重要的功能产品，它可使肝素、透明质酸、硫酸粘多糖以及葡萄糖醛酸的破坏大大减少，帮助身体有效的排除毒素，并能够缓解关节炎、痛风、气喘和相关组织功能下降所引起的其他不适。

目前，葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸的生产方法主要为化学氧化法，化学法生产存在诸多弊端，如生成的产物较多，副产物复杂，同时产生大量气体，其反应废液对环境产生污染等，通过生物法来制备葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸越来越受到研究者的关注。

葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸存在于哺乳动物的代谢途径中，葡萄糖二酸与抗坏血酸是葡萄糖醛酸代谢途径的终产物。然而，从D-葡萄糖或D-半乳糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反应。

目前，来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)中的肌醇加氧酶基因(MIOX)鲜有报道。本发明通过重组大肠杆菌，表达来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)中的肌醇加氧酶(MIOX)基因，实现了生物转化肌醇，生成葡萄糖醛酸，同时，共表达来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脱氢酶基因(Udh)，实现了葡萄糖二酸的生成。

本发明中构建的重组工程菌实现了葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸的生物合成，为生物法探索生成目标代谢产物提供了新思路。

发明内容

本发明通过构建一株表达来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)的肌醇加氧酶基因(MIOX)的重组大肠杆菌，实现了从肌醇到葡萄糖醛酸的转化。同时，该重组大肠杆菌再表达来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脱氢酶基因(Udh)，能够实现葡萄糖二酸的生物合成。

本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌A，是将氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列的肌醇加氧酶基因MIOX克隆至大肠杆菌中构建的重组菌。

所述肌醇加氧酶基因MIOX来源于毕赤酵母，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供一种重组大肠杆菌B，该重组大肠杆菌B同时表达了氨基酸如SEQ ID NO.1所示的肌醇加氧酶基因MIOX和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的醛酸脱氢酶基因Udh。

所述醛酸脱氢酶基因Udh来源于恶臭假单胞菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第三个目的是提供一种重组大肠杆菌B的构建方法，是将肌醇加氧酶基因和醛酸脱氢酶基因与表达载体相连，构建重组质粒，转化大肠杆菌宿主菌，即得到重组大肠杆菌B。

所述表达载体在本发明的一种实施方式中是pRSFDuet-1。

所述重组大肠杆菌B的构建方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：分别以毕赤酵母(Pichia pastoris)及恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因组为模板，扩增氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的肌醇加氧酶(MIOX)及氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的醛酸脱氢酶(Udh)基因，选用pRSFDuet-1为表达载体，通过酶切连接，将肌醇加氧酶(MIOX)基因与表达载体相连，构建重组质粒pRSFD-MIOX。然后再通过酶切位点连接，将Udh基因与pRSFD-MIOX相连，构建重组质粒pRSFD-MIOX-Udh，将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，即得到重组大肠杆菌B。

所述大肠杆菌B能够实现葡萄糖醛酸到葡萄糖二酸的生物合成。

本发明的第三个目的是提供利用所述重组大肠杆菌A生产葡萄糖醛酸或者重组大肠杆菌B生产葡萄糖二酸的方法，是将重组大肠杆菌种子液接种至发酵培养基中，35℃至37℃，180rpm至220rpm下，培养至OD₆₀₀0.4至0.8，加入IPTG诱导，调节温度25℃至32℃，继续培养24h至72h。

所述发酵培养基的碳源，在本发明的一种实施方式中为肌醇。

所述生产葡萄糖醛酸或葡萄糖二酸的方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：用重组大肠杆菌A或B制备成种子液，以1％的接种量，转接到装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，于37℃、200rmin^-1培养。菌体生长到OD600＝0.6，加入0.1mM IPTG进行诱导，同时将温度调整为30℃，继续培养至60h。

本发明还提供一种肌醇加氧酶，所述肌醇加氧酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列；所述肌醇加氧酶能够以肌醇为底物合成葡萄糖醛酸。

本发明提供了一种通过重组大肠杆菌生物合成葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的方法，所用来源于毕赤酵母中的肌醇加氧酶基因(MIOX)与现有报道的来源于小鼠的MIOX氨基酸差异较大，并且目前没有来源于毕赤酵母中MIOX基因能够将肌醇转化为醛酸的相关报道。本发明采用代谢工程的策略，改造微生物菌株来合成目的产物葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸，实现葡萄糖醛酸产量20mg/L,葡萄糖二酸50mg/L为生物法高效生产葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸打下了坚实的基础。

附图说明

图1：LC-MS检测葡萄糖醛酸标样；

图2：LC-MS检测葡萄糖二酸的标样；

图3：LC-MS检测重组菌株E.coli BL21(DE3)/pRSFD-MIOX发酵液；

图4：LC-MS检测重组菌株E.coli BL21(DE3)/pRSFD-MIOX-Udh发酵液。

具体实施方式

实施例1重组大肠杆菌的构建

分别以毕赤酵母(Pichia pastorisGS115)及恶臭假单胞菌(Pseudomonas putidaKT2440)基因组为模板，获取MIOX及Udh，扩增MIOX基因的引物为F1(核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示)、R1(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，扩增Udh基因的引物为F2(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)、R2(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)。引物如下(下划线部分为引物酶切位点)：

MIOX

F1：CGCGGATCCGTAAAAGGAGAAAAAAATGTCAGTACAAAAAAGCACGAAG

R1：CCGGAATTCTCAAAACTTTACCAGCTTTTGAGG

Udh

F2：GGAATTCCATATGACCACTACCCCCTTCAATC

R2：CCGCTCGAGTTAGTTGAACGGGCCGGCCACGGC

将含有MIOX基因的片段用相应的限制性内切酶酶切后，与表达载体pRSFDuet-1相连，得到重组质粒pRSFD-MIOX，转化到E.coliBL21(DE3)中即得到重组大肠杆菌A，命名为E.coliBL21(DE3)/pRSFD-MIOX。

使用设计的引物进行MIOX及Udh目的基因扩增后，用相应的限制性内切酶酶切后，与表达载体pRSFDuet-1相连，连接产物转化宿主菌E.coli JM109，在涂布平板上，挑选阳性克隆子提取质粒，用酶切及PCR方法验证，验证正确，送去上海生工测序，选取成功构建重组表达载体pRSFD-MIOX-Udh，转化E.coliBL21(DE3)即得到重组大肠杆菌B，命名为E.coliBL21(DE3)/pRSFD-MIOX-Udh。

实施例2重组大肠杆菌发酵生产葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸

从含卡纳抗生素抗性LB平板上挑取单菌落接种至三角瓶中培养，装液量为25mL/250mL，37℃，200r/min培养10-14h。将培养好的种子培养液按1％的接种量，转接到装有50mL的含有肌醇的发酵培养基的500mL三角瓶中，于37℃、200rmin-1培养。菌体生长到OD600＝0.6，加入0.1mM IPTG进行诱导，同时将温度调整为30℃，继续培养48h。培养结束后，取1ml发酵液在8000rpm下离心10min，取上清经0.22um滤膜过滤，通过LC-MS检测产物。如图1-4所示，图1、图2分别为葡萄糖醛酸或葡萄糖二酸标样的LC-MS检测图，由标样看出葡萄糖醛酸的[M-1]⁺为193.03，葡萄糖二酸的[M-1]⁺为209.02。从图3、图4可以看出，重组菌株E.coli BL21(DE3)/pRSFD-MIOX及E.coli BL21(DE3)/pRSFD-MIOX-Udh的发酵液中分别可以检测到具有相同分子量(m/z)的葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸，证明途径构建成功。经测定，葡萄糖醛酸含量为20mg/L，葡萄糖二酸含量为50mg/L。

实施例3重组大肠杆菌发酵生产葡萄糖醛酸或葡萄糖二酸的方法

1、菌株：E.coli BL21(DE3)/pRSFD-MIOX(用于合成葡萄糖醛酸)及E.coli BL21(DE3)/pRSFD-MIOX-Udh(用于合成葡糖糖二酸)

2、培养基：

种子培养基：LB培养基(蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L酵母粉5g/L)

发酵培养基：LB-MI培养基(在LB培养基中添加60mM肌醇)。

必要时在培养基中添加卡纳抗生素Kan50mg/L。

3、培养条件：

(1)种子培养：从含卡纳抗生素抗性LB平板上挑取单菌落接种至三角瓶中培养，装液量为25mL/250mL，37℃，200r/min培养10-14h。

(2)摇瓶发酵培养：将培养好的种子培养液按1％的接种量，转接到装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，于37℃、200rmin^-1培养。菌体生长到OD600＝0.6，加入0.1mM IPTG进行诱导，同时将温度调整为30℃，继续培养至60h。

4、葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸的检测：液质联用(LC-MS)

仪器：岛津离子阱飞行时间质谱仪LCMS-IT-TOF

分析条件：

流动相：A：1mM甲酸铵+0.01％甲酸+水；B：1mM甲酸铵+乙腈

洗脱程序：0-12min 30％B；12-30min 30％-65％；30-31min 65％-95％；31-35min95％35-36min 95％-30％B；36-40min 30％

色谱柱：Shim-pack VP-ODS(150L×2.0)

流速：0.15ml/min进样量：5ul

离子化模式：电喷雾负离子模式

雾化气流速：1.5L/min

CDL温度：200℃ HB温度：200℃

扫描范围：MS1，m/z150-300

葡萄糖二酸标样的配制：准确称取10mg葡萄糖二酸钙粉末溶于20％甲酸中，将溶解后的溶液转移至100ml容量瓶中定容，其浓度为100mg/L。再用去离子水分别稀释至50、20、10、5和1mg/L。

葡萄糖醛酸标样的配制：准确称取10mg葡萄糖醛酸粉末溶于去离子水中，将溶解后的溶液转移至100ml容量瓶中定容，其浓度为100mg/L。再用去离子水分别稀释至50、20、10、5和1mg/L

样品制备：1ml发酵液在8000rpm下离心10min，取上清经0.22um滤膜过滤，滤液供液相质谱分析。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达了编码氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列的肌醇加氧酶基因MIOX和编码氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列的醛酸脱氢酶基因Udh；表达载体是pRSFDuet-1；宿主为E.coli BL21(DE3)。

2.一种权利要求1所述重组大肠杆菌的构建方法，是将编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1的肌醇加氧酶基因和编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2的醛酸脱氢酶基因与表达载体相连，构建重组质粒，转化大肠杆菌宿主菌，即得到重组大肠杆菌B。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表达载体是pRSFDuet-1。

4.一种应用权利要求1所述的重组大肠杆菌生产葡萄糖二酸的方法，是将重组大肠杆菌种子液接种至发酵培养基中，35℃至37℃，180rpm至220rpm下，培养至OD₆₀₀0.4至0.8，加入IPTG诱导，调节温度25℃至32℃，继续培养24h至72h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的碳源为肌醇。

6.权利要求1所述重组大肠杆菌在合成葡萄糖醛酸方面的应用。

7.权利要求1所述重组大肠杆菌在合成葡萄糖二酸方面的应用。