CN103710274B - 一种胞外丙酮酸产量提高的基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胞外丙酮酸产量提高的基因工程菌及其应用，在光滑球拟酵母(Torulopsis？glabrata)CCTCC？M202019中过量异源表达编码抗逆性蛋白CutA的基因，所述编码抗逆性蛋白CutA的基因核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明通过异源过量表达抗逆性蛋白CutA,提高了光滑球拟酵母对温度的抗逆性，并提高了基因重组菌株生产丙酮酸过程中最适生产温度，使得该基因重组菌株发酵液中丙酮酸含量，具有广阔的应用前景。

Description

一种胞外丙酮酸产量提高的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种提高光滑球拟酵母产丙酮酸的方法，属于代谢工程领域。
背景技术
丙酮酸(Pyruvicacid)，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体，它在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途。作为一种重要的化工产品，传统化学法和生物发酵法生产丙酮酸都已实现工业化，传统化学法生产丙酮酸大规模推广受制于高昂的原材料成本和低生产率，而生物发酵法生产该有机酸过程中，由于生产过程中的复杂性，能高产丙酮酸的微生物细胞容易受到环境因素如金属离子和温度胁迫，这些因素都限制了细胞的正常生长和代谢，因此，如能提高微生物细胞对这些不利环境因素抗逆性对生物发酵法生产丙酮酸起重要作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种胞外丙酮酸产量提高的基因工程菌，是在光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)CCTCCM202019中过量异源表达编码抗逆性蛋白CutA的基因。
所述编码抗逆性蛋白CutA的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2。
SEQIDNO.2序列如下：
ATGATCATCGTTTACACTACTTTCCCAGACTGGGAATCTGCTGAAAAGGTTGTTAAGACT60
TTGTTGAAGGAAAGATTGATCGCTTGTGCTAACTTGAGAGAACACAGAGCTTTCTACTGG120
TGGGAAGGTAAGATCGAAGAAGACAAGGAAGTTGGTGCTATCTTGAAGACTAGAGAAGAC180
TTGTGGGAAGAATTGAAGGAAAGAATCAAGGAATTGCACCCATACGACGTTCCAGCTATC240
ATCAGAATCGACGTTGACGACGTTAACGAAGACTACTTGAAGTGGTTGATCGAAGAAACT300
AAGAAGTAAG310
本发明要要解决的另一个技术问题是提供两种构建上述基因工程菌的方法，
方法1为：
(1)获得外源目的基因：对已知的掘越氏热球菌(Pyrococcushorikoshii)抗逆性蛋白CutA核苷酸序列（SEQIDNO.1），进行优化获得SEQIDNO.2所示序列；
SEQIDNO.1序列如下：
ATGATAATAGTTTACACGACTTTTCCGGACTGGGAGAGTGCTGAGAAAGTTGTGAAAACT60
CTTTTAAAAGAGAGGTTGATTGCATGCGCAAATTTAAGGGAGCACAGGGCCTTTTACTGG120
TGGGAAGGTAAGATCGAGGAAGATAAAGAAGTTGGAGCTATCCTTAAAACTAGGGAAGAT180
CTGTGGGAAGAACTTAAGGAAAGGATAAAGGAGCTTCATCCTTACGATGTTCCGGCCATA240
ATCAGGATTGACGTTGATGATGTTAACGAGGATTACCTCAAATGGTTAATTGAAGAGACG300
AAAAAATGAG310
(2)构建重组表达质粒：全化学合成步骤1）中的SEQIDNO.2序列，并克隆至多拷贝表达载体pRS306TEF1中的BamHI-EcoRI***位点，获得重组表达质粒pRS306TEF1-CutA；
(3)获得基因工程菌：利用电穿孔转化方法将被分离纯化的重组质粒pRS306TEF1-CutA转化T.glabrataCCTCCM202019△ura3，在YNB培养基平板中筛选原养型细胞，T.glabrataQ1。
方法2为：
（1）获得外源目的基因：对已知的掘越氏热球菌(Pyrococcushorikoshii)抗逆性蛋白CutA核苷酸序列（SEQIDNO.1），进行优化获得SEQIDNO.2所示序列；
（2）构建重组表达质粒：全化学合成步骤1）中的SEQIDNO.2序列，并克隆至多拷贝表达载体pRS306TEF1中的BamHI-EcoRI***位点，获得重组表达质粒pRS306TEF1-CutA；化学合成酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)热击蛋白HSP150编码基因的启动子序列，克隆至pRS306TEF1-CutA质粒上的SacI-XhoI***位点，替换pRS306TEF1-CutA质粒上的组成型启动子TEF1为温度诱导型启动子，并获得pRS306HSP150-CutA质粒；
(3)获得基因工程菌：利用电穿孔转化方法将被分离纯化的重组质粒pRS306HSP150-CutA质粒转化T.glabrataCCTCCM202019△ura3，在YNB培养基平板中筛选原养型细胞，获得的基因工程菌命名为T.glabrataQ2。
本发明还提供一种以所述基因工程菌发酵生产丙酮酸的方法，将获得的新鲜基因工程菌斜面培养物接种至含有25mL种子培养基的250mL三角摇瓶中，30℃、200rpmin，培养24小时；按10%(v/v)的接种量接入3L发酵罐中，发酵培养基装液量为1.5L，发酵罐培养条件为通气量4vvm，搅拌转速400r/min，温度30℃，pH值和溶氧通过自动流加泵流加浓度为8mol·L-1NaOH和2mol·L-1HCl浓度的溶液维持培养基pH控制在稳定范围内。
与对照菌相比：33℃和36℃对异源表达CutA的重组菌株T.glabrataQ1都有具有促进作用，此时最大生物量分别是30℃条件下的112.4%和120.7%；并且在36℃、200rpm条件下，所述的T.glabrata菌株Q1细胞外丙酮酸含量从56.8g·L-1上升至74.2g·L-1。
本发明的有益之处：本发明通过异源过量表达抗逆性蛋白CutA,提高了光滑球拟酵母对温度的抗逆性，并提高了基因重组菌株生产丙酮酸过程中最适生产温度，使得该基因重组菌株发酵液中丙酮酸含量。
附图说明
图1CutA提高T.glabrata对温度抗逆性。A：不同温度条件对出发菌株T.glabrataC的影响，■:30℃;●:33℃;▲:36℃;◆:39℃。B：不同温度条件对重组菌株T.glabrataQ1的影响，■:30℃;●:33℃;▲:36℃;◆:39℃。
图2温度诱导调控异源CutA表达。
图3高温促进重组T.glabrata菌株的合成丙酮酸，■:T.glabrataC;●:T.glabrataQ1。
具体实施方式
材料与方法
YPD培养基(g·L-1)：蛋白胨10，酵母浸膏5，葡萄糖20，固体培养基另加20g·L-1琼脂。
YNB培养基(g·L-1)：葡萄糖20，YeastNitrogenBase1.7，(NH4)2SO45,用2mol·L-1NaOH调节pH至5.0,固体培养基另加20g·L-1琼脂。
种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，蛋白胨10，MgSO4·7H2O0.5g·L-1，KH2PO41。用稀盐酸调pH至5.5，115℃维持15min灭菌。固体斜面另添加20g·L-1琼脂粉。
发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖100，NH4Cl7，KH2PO45，MgSO4·7H2O0.8，乙酸钠6，烟酸4×10-3，盐酸硫胺素30×10-6，烟酸吡哆醇100×10-6，生物素10×10-6，核黄素50×10-6。培养基初始pH5.0。维生素液过滤除菌后加入。
光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)从中国典型培养物保藏中心CCTCC获得，菌种编号为CCTCCNO：M202019。
酮酸含量测定：将发酵液在12000g离心5min后，取上清液，用超纯水稀释50倍，HPLC检测。细胞内酮酸含量测定：离心收集细胞，用0.9%生理盐水洗涤，用10mL0.1mol·L-1KH2PO4-K2HPO4，1mmol·L-1EDTA，0.01mmol·L-1DTTpH7.5缓冲液悬浮细胞，加入石英砂研磨5min，13000×g离心10min，去除沉淀，取5ml上清液过0.22μm滤膜，用于HPLC分析。
HPLC条件：AminexHPX-87Hionexchangecolumn；流动相：5mmol·L-1硫酸溶(550μL浓硫酸定容到2L),用0.22μm孔径的微滤膜抽滤并脱气；柱温：35℃；进样量：10μL；流速：0.6mL·min-1。紫外检测器检测：波长210nm。
光滑球拟酵母转化方法：将在YPD培养基上新鲜长出的T.glabrataCCTCCM202019△ura3(Zhou,J.W.,Dong,Z.Y.,Liu,L.M.,Du,G.C.,Chen,J.,2009a.Areusablemethodforconstructionofnon-markerlargefragmentdeletionyeastauxotrophstrains:ApracticeinTorulopsisglabrata.J.Microbiol.Methods76,70–74.)单菌落转接至液体YPD培养基中，28C，200rpm，过夜培养。按10%接种量转接至新鲜的液体YPD培养基中28℃，200rpm培养至OD600=1.2左右，离心收集细胞，于30℃用8mL100mmol·L-1LiAc,10mmol·L-1DTT,0.6mol·L-1sorbitol10mmol·L-1Tris-HCL，pH=7.5缓冲液处理8×108细胞。离心收集细胞，用5mL预冷的1mol·L-1的sorbitol洗涤细胞三次，并用1mol·L-1的sorbitol悬浮细胞至1010细胞·mL-1。加入1μg预先纯化重组表达质粒pRS306TEF1-CutA至细胞悬浮液中，置于冰上温孕5分钟，将该混合物转移至预冷的0.2cm电转杯中，电击，电击条件为2.5KV，25μF，200Ω，立即加入1mL预冷的1mol·L-1sorbitol,室温静置1小时，将0.2mL电击产物涂布于含有YNB培养基的选择平板中，28℃培养96-144小时。以原养型细胞的基因组为模板，利用验证引物对P1/P2(表1)，利用PCR对外源基因的表达验证。将成功表达外源基因的光滑球拟酵母命名为T.glabrataQ1，转化带有不含外源基因的pRS306TEF1的对照菌株命名为T.glabrataC。
全化学合成酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)热击蛋白HSP150(NCBI登录号：YJL159W)编码基因的启动子序列，克隆至pRS306TEF1-CutA质粒上的SacI-XhoI***位点，替换pRS306TEF1-CutA质粒上的组成型启动子TEF1为温度诱导型启动子，并获得pRS306HSP150-CutA质粒，按上述电穿孔方法转化T.glabrataCCTCCM202019△ura3菌株，在含有YNB培养基的选择平板中选择原养型细胞，并以原养型细胞的基因组为模板，利用验证引物对P1/P2(表1)，利用PCR对外源基因的表达验证。将成功表达外源基因的光滑球拟酵母命名为T.glabrataQ2。
表1
实施例1不同温度条件对重组菌株T.glabrataQ1的影响。
将新鲜培养的T.glabrata菌株Q1的单菌落细胞与对照菌株T.glabrataC的单菌落细胞分别接种至含有25mLYPD培养的250mL三角瓶中，分别放置于30℃、33℃、36℃和39℃，200rpm条件下培养，每4h测定细胞生长情况(图1)。
如图1所示，在30℃条件下，与对照菌株相比，异源表达CutA并未对菌株生产造成明显差异，提高培养温度至33℃会加快菌株T.glabrataC生长，但是当温度提高至36℃和39℃时，菌株T.glabrataC的生长受到明显的抑制作用，此时最大生物量分别是30℃培养条件下的，87.4%和63.6%；然而提高培养温度至33℃和36℃对异源表达CutA的重组菌株T.glabrataQ1的生长都有具有促进作用，此时最大生物量分别是30℃条件下的112.4%和120.7%，然而，在39℃条件下该促进作用才消失，菌体生长受到抑制，此时菌株T.glabrataQ1的最大生物量分别是30℃培养条件下的96.2%。
实施例2温度诱导调控异源CutA表达
为进一步验证过量表达CutA能提高T.glabrata菌株对温度的抗逆性，将新鲜培养的T.glabrata菌株Q2的单菌落细胞与对照菌株T.glabrataC的单菌落细胞分别接种至含有25mLYPD培养的250mL三角瓶中，放置于30℃，200rpm条件下培养8h后，然后放置在37℃，诱导CutA酶表达，200rpm条件下继续培养16h，观察生长情况(图2)。
在30℃条件下，T.glabrataQ2与对照菌株T.glabrataC的生长没有明显差异，但变换培养温度后，高温诱导CutA蛋白的表达，对环境温度变化不敏感，在此条件下，与T.glabrataQ1类似，高温加快细胞生长，对照菌株C在此温度下生长受到抑制。
实施例3高温促进重组T.glabrata菌株的合成丙酮酸。
将获得到T.glabrata菌株Q1分布至固体斜面种子培养基中，将新鲜的斜面培养物接种至含有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，温度为30℃，转速200rpmin，培养24小时。按10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，36℃、200rpm条件下培养72小时，对照菌株T.glabrataC发酵培养条件为30℃、200rpm条件下培养60小时。与对照菌相比：所述的T.glabrata菌株Q1细胞外丙酮酸含量从56.8g·L-1上升至74.2g·L-1(图3)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种胞外丙酮酸产量提高的基因工程菌，其特征在于，在光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)CCTCCM202019中过量异源表达编码抗逆性蛋白CutA的基因；所述编码抗逆性蛋白CutA的基因核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.一种构建权利要求1所述的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1)获得外源目的基因：对已知的掘越氏热球菌(Pyrococcushorikoshii)抗逆性蛋白CutA的序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列，进行优化获得SEQIDNO.2所示序列；
(2)构建重组表达质粒：全化学合成步骤1)中的SEQIDNO.2，并克隆至多拷贝表达载体pRS306TEF1中的BamHI-EcoRI***位点，获得重组表达质粒pRS306TEF1-CutA；
(3)获得基因工程菌：利用电穿孔转化方法将被分离纯化的重组质粒pRS306TEF1-CutA转化T.glabrataCCTCCM202019△ura3，在YNB培养基平板中筛选原养型细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，具体包括以下步骤：
(1)获得外源目的基因：对已知的掘越氏热球菌(Pyrococcushorikoshii)抗逆性蛋白CutA核苷酸序列进行优化获得SEQIDNO.2所示序列；
(2)构建重组表达质粒：全化学合成步骤1)中的SEQIDNO.2所示序列，并克隆至多拷贝表达载体pRS306TEF1中的BamHI-EcoRI***位点，并获得重组表达质粒pRS306TEF1-CutA；化学合成酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)热击蛋白HSP150编码基因的启动子序列，克隆至pRS306TEF1-CutA质粒上的SacI-XhoI***位点，替换pRS306TEF1-CutA质粒上的组成型启动子TEF1为温度诱导型启动子，并获得pRS306HSP150-CutA质粒；
(3)获得基因工程菌：利用电穿孔转化方法将被分离纯化的重组质粒pRS306HSP150-CutA质粒转化T.glabrataCCTCCM202019△ura3，在YNB培养基平板中筛选原养型细胞。
4.应用权利要求1所述的基因工程菌发酵生产丙酮酸的方法，其特征在于，将所得基因工程菌分布至含有种子培养基的斜面培养基上，并将新鲜培养的斜面培养物接种至含有25mL种子培养基的250mL三角摇瓶中，28℃、200rpmin，培养24小时；按10％(v/v)的接种量接入3L发酵罐中，发酵培养基装液量为1.5L，发酵罐培养条件为通气量4vvm，搅拌转速400r/min，温度30℃，pH值和溶氧通过自动流加泵流加浓度为8mol·L-1NaOH和2mol·L-1HCl浓度的溶液维持培养基pH控制在稳定范围内。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子培养基成分为：葡萄糖20g·L-1，蛋白胨10g·L-1，MgSO4·7H2O0.5g·L-1，KH2PO41g·L-1，调pH为5.5；所述发酵培养基成分为：葡萄糖100g·L-1，NH4Cl7g·L-1，KH2PO45g·L-1，MgSO4·7H2O0.8g·L-1，乙酸钠6g·L-1，烟酸4mg·L-1，盐酸硫胺素30μg·L-1，烟酸吡哆醇100μg·L-1，生物素10μg·L-1，核黄素50μg·L-1，培养基初始pH5.0，维生素液过滤除菌后加入。
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