CN104080918A

CN104080918A - 葡萄糖二酸的制造方法

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Publication number: CN104080918A
Application number: CN201380006973.XA
Authority: CN
Inventors: 小西一诚; 今津晋一
Original assignee: Asahi Kasei Chemicals Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2013-02-19
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2033-02-19
Also published as: TWI488970B; TW201339306A; EP2818552A1; JPWO2013125509A1; CN104080918B; US9506091B2; JP6012703B2; JP2016163587A; JP6144804B2; US20150010969A1; EP2818552A4; EP2818552B1; WO2013125509A1

Abstract

本发明的课题在于提供具有显著改善的葡萄糖二酸生产能力的转化体的制作方法和利用该转化体有效生产葡萄糖二酸的方法。在本发明的葡萄糖二酸的制造方法中，向保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因的转化体中导入对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。

Description

葡萄糖二酸的制造方法

技术领域

本发明涉及基因重组技术在葡萄糖二酸的制造中的应用。

背景技术

葡萄糖二酸(四羟基己二酸)是在植物和哺乳动物中早已发现的化合物。

近年来，在美国国家再生能源研究所关于需要由生物物质制作的高附加值化学品的报告(非专利文献1)中举出了葡萄糖二酸作为前12名以内的化合物。在该报告中作为可以以葡萄糖二酸为原料制备出的葡萄糖二酸衍生物还示例出了葡糖二酸-γ-内酯、葡糖二酸-δ-内酯或葡糖二酸二内酯等内酯类(可期待其作为溶剂的用途)；多羟基聚酰胺类(可期待其作为新型尼龙的用途)等。此外，该报告中还推测可利用淀粉的硝酸氧化反应或碱性漂白剂存在下的催化氧化反应作为已知的葡萄糖二酸制造方法。

进一步地，最近在专利文献1中公开了可进行葡萄糖二酸的生物合成的转化体。即，在该专利文献中，分别编码肌肉肌醇-1-磷酸合成酶(Ino1)、肌肉肌醇加氧酶(MIOX)和糖醛酸脱氢酶(udh)的3个基因被转染至大肠杆菌宿主中。这样得到的转化体在培养基内以0.72g/L～1.13g/L的浓度生产出了葡萄糖二酸。但是，据专利文献1的发明人推测，在该专利文献的转化体中无需导入肌醇单磷酸酶(suhB)基因。

即，在以葡萄糖为底物进行葡萄糖二酸的生物合成的通路中，理论上需要下述5种活性：

活性1：由适当的碳源生成葡萄糖-6-磷酸的活性；

活性2：将葡萄糖-6-磷酸转换为肌肉肌醇-1-磷酸的活性、即肌醇-1-磷酸合成酶活性；

活性3：将肌肉肌醇-1-磷酸转换为肌肉肌醇的活性、即以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的磷酸酶活性；

活性4：将肌肉肌醇转换为葡萄糖醛酸的活性、即肌肉肌醇加氧酶活性；和

活性5：将葡萄糖醛酸转换为葡萄糖二酸的活性、即糖醛酸脱氢酶活性。

但是，实际上，由于活性1的产物葡萄糖-6-磷酸为原核微生物普遍生成的代谢中间体，因而无需对原核微生物赋予该活性。

此外，关于活性3，已知也有不少微生物株表达内源性肌醇单磷酸酶、或者具有能够以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的通用单磷酸酶活性。因而，在专利文献1的转化体中没有导入肌醇单磷酸酶基因。

并且，在专利文献1中，基于所制作的转化体的代谢分析，得出在用于进行葡萄糖二酸的生物合成的转化体中无需导入肌醇单磷酸酶基因的结论。即，在专利文献1中记载了下述内容：“应当注意的是，我们并没有过量表达suhB基因或同源磷酸酶。但是，培养产物中未检测到肌肉肌醇-1-磷酸，而另一方面，却有肌肉肌醇的积聚。因此，我们得出结论：磷酸酶活性并不限制通过该通路的代谢的流量(flux)。”(第33页、第2～5行)。

因而并不存在将肌醇单磷酸酶基因导入到用于葡萄糖二酸的生物合成的转化体中的明确动机。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2009/145838号小册子

非专利文献

非专利文献1：Top Value Added Chemicals from Biomass Volume I-Results ofScreening for Potential Candidates from Sugars and Synthesis Gas””、http://www1.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf、T.Werpy和G.Peterson编、2004年8月发行

发明内容

发明所要解决的课题

本发明所要解决的课题在于具有显著改善的葡萄糖二酸生产能力的转化体的制造及其应用。

解决课题的手段

如上所述，即使是在公开了能够生物合成葡萄糖二酸的转化体的专利文献1中，也并未向该转化体中导入肌醇单磷酸酶基因，并且该活性也并未引起特别的关注。

但是，与专利文献1的预想相反，本发明人发现，肌醇单磷酸酶活性在用于葡萄糖二酸生物合成的转化体中具有重要作用。特别值得吃惊的是，通过增强肌醇单磷酸酶活性，这样的转化体的葡萄糖二酸生产能力提高了数十～百倍。

因而，本发明的第一方面在于：

(1)一种葡萄糖二酸的制造方法，其包括下述工序：

1)准备转化体的工序，该转化体保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因，并具有对该转化体内的功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异；

2)在适于上述转化体的生长和/或维持的条件下，使该转化体与能够由该转化体转换为葡萄糖二酸的碳源进行接触的工序；以及

3)从在上述2)中得到的培养物中分离出葡萄糖二酸或者葡萄糖二酸盐的工序。

更特定地说，上述制造方法为使用转化体的葡萄糖二酸的制造方法，该转化体保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因，其特征在于，上述转化体具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。

本发明葡萄糖二酸的发酵生产中，使用下述碳源作为培养基材是适宜的，该基材含有适于生成作为肌醇-1-磷酸合成酶(上述活性2)的底物的葡萄糖-6-磷酸的化合物。因而，本发明的适宜方式为：

(2)如上述(1)所述的制造方法，其中，上述碳源包括可在上述转化体内转换为葡萄糖-6-磷酸的化合物；和

(3)如上述(2)所述的制造方法，其中，上述碳源为选自由D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、淀粉、纤维素、米糠、废糖蜜以及含有D-葡萄糖的生物物质组成的组中的1种以上。

对于以大肠杆菌为代表的原核微生物来说，由于其迅速的生长能力以及发酵管理的容易性，因而从工业发酵生产的方面考虑是极富魅力的，同时从应用基因重组技术时的实际成绩、可靠的安全性的方面考虑也具有优点。此外，对于不具有从葡萄糖经肌肉肌醇来生物合成葡萄糖二酸的通路的多数原核微生物来说，通过使用与基因重组技术联合的合成生物学方法，具有容易调节葡萄糖二酸生产率的优点。特别是大肠杆菌等原核微生物宿主不具有对作为葡萄糖二酸生物合成通路中间体的肌肉肌醇的同化能力(分解能力)，因而更容易应用合成生物学的方法。因而，本发明的适宜方式包括：

(4)如上述(1)至(3)的任一项所述的制造方法，其特征在于，上述转化体来源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物；和

(5)如上述(1)至(4)的任一项所述的制造方法，其中，上述转化体来源于选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌。

无论宿主微生物是否具有内源性肌醇单磷酸酶活性，均可通过肌醇单磷酸酶在该细胞内的过剩生产来增强该细胞的肌醇单磷酸酶活性。可应用各种公知的技术使肌醇单磷酸酶在细胞中过剩生产。因而，本发明包括下述方式：

(6)如上述(1)至(5)的任一项所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化体进行以下操作而被诱导的：

a)导入外来肌醇单磷酸酶基因、

b)增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数、

c)在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异、

d)利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域、或者

e)使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失；和

(7)如上述(6)所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化体导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的。

此外，在宿主细胞具有内源性肌醇单磷酸酶基因的情况下，也可利用下述方式来增强该细胞的肌醇单磷酸酶活性。

(8)如上述(1)至(5)的任一项所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的活化是通过对上述转化体进行以下操作而被诱导的：

f)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异、

g)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部、

h)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失、

i)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少、

j)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。

此外，本发明还谋求用于上述葡萄糖二酸的制造方法的转化体。因而，本发明的第二方面在于：

(9)一种转化体，该转化体保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因，其中，该转化体具有对该转化体内的功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。

更特定地说，上述转化体为保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因的转化体，其特征在于，其具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。

此外，本发明第一方面中记载的方式也适用于本发明的第二方面。这些方式为：

(10)如上述(9)所述的转化体，其特征在于，上述转化体来源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物；

(11)如上述(9)或(10)所述的转化体，其中，上述转化体来源于选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌；

(12)如上述(9)至(11)的任一项所述的转化体，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化体进行以下操作而被诱导的：

a)导入外来肌醇单磷酸酶基因、

b)增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数、

c)在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异、

e)使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失；

(13)如上述(12)所述的转化体，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化体导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的；和

(14)如上述(9)至(11)的任一项所述的转化体，其中，上述肌醇单磷酸酶的活化是通过对上述转化体进行以下操作而被诱导的：

f)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异、

g)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部、

h)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失、

i)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少、

j)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。

发明的效果

根据本发明，能够利用微生物培养技术实现葡萄糖二酸工业生产的效率化。

附图说明

图1示出了INO1基因的编码区域(序列编号1)。

图2示出了suhB基因的编码区域(序列编号3)。

图3示出了miox基因的编码区域(序列编号5)。

图4示出了udh基因的编码区域(序列编号7)。

具体实施方式

本发明的课题通过增强保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因的转化体中的肌醇单磷酸酶活性而得到解决。

本发明的转化体可使用各种宿主微生物细胞来制作。特别是在以原核微生物为宿主时，由于能够在该宿主细胞内新构建葡萄糖二酸生物合成通路(即，无现有的内源性通路的影响)，因而在合成生物学方法的应用中是极富魅力的。所示例出的原核微生物为埃希氏菌、假单胞菌、芽胞杆菌、地芽胞杆菌、甲烷单胞菌、甲基芽孢杆菌、嗜甲基菌、精朊杆菌、甲基球菌、棒状杆菌、短杆菌、发酵单胞菌和李斯特氏菌属的细菌。在工业发酵生产中适宜的原核微生物的非限定性示例包括大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌。大肠杆菌由于其迅速的生长能力和发酵管理的容易性的原因，为特别优选的本发明的宿主微生物的示例。

此外，能够作为本发明的宿主细胞使用的细胞株可以为通常含义下的野生型，或者也可以为营养要求性变异株、抗生素耐性变异株。进一步地，能够作为本发明的宿主细胞使用的细胞株可以已经被转化从而使之具有与上述变异相关的各种标记基因。这些变异或基因能够提供对于本发明转化体的制作·维持·管理有益的性质。优选可通过使用对于氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素等抗生素显示出耐性的菌株来简便地进行本发明葡萄糖二酸的生产。

在面向合成生物学的本发明中，为了在宿主细胞中构建新的葡萄糖二酸生物合成通路，在宿主细胞不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的情况下，导入外来肌醇-1-磷酸合成酶基因。需要说明的是，在本说明书中，使用“外来”或“外来性”这一术语所表示的含义是，在转化前的宿主微生物不具有要由本发明导入的基因的情况下；在实质上不表达由该基因编码的酶的情况下；以及在该酶的氨基酸序列由不同的基因编码、但在转化后不表达相匹配的内源性酶活性的情况下，向宿主中导入基于本发明的基因或核酸序列。

肌醇-1-磷酸合成酶基因是已知的(例如，基因库登录号Nos.AB032073、AF056325、AF071103、AF078915、AF120146、AF207640、AF284065、BC111160、L23520、U32511)，它们均可用于本发明的目的。特别是具有序列编号1所表示的编码区域核苷酸序列的肌醇-1-磷酸合成酶基因能够在本发明中适当地使用。但是，能够在本发明中使用的肌醇-1-磷酸合成酶基因并不限于上述基因，其可来源于其它生物、或者也可人工合成，只要在上述宿主微生物细胞内能够实质性地表达肌醇-1-磷酸合成酶活性即可。

从而，对于能够用于本发明目的的肌醇-1-磷酸合成酶基因，只要在上述宿主微生物细胞内能够实质性地表达肌醇-1-磷酸合成酶活性，可以具有能够在自然界发生的全部变异、或者具有人工导入的变异和修饰。例如，已知在编码特定氨基酸的各种密码子中存在冗余密码子(redundancy)。因此，在本发明中也可利用最终可翻译成相同氨基酸的代替密码子。即，由于基因编码的简并，因而编码某一特定氨基酸时可使用2个以上的密码子，因此氨基酸序列可利用任意的1组类似的DNA低聚核苷酸进行编码得到。虽然该组中仅唯一的成员与天然型酶的基因序列相同，但即使是有错配的DNA低聚核苷酸，在适当的严谨条件下(例如，3xSSC、68℃杂交、2xSSC、0.1％SDS和68℃清洗)也能够与天然型序列杂交，能够对编码天然型序列的DNA进行鉴定、分离，进一步还可将这样的基因用于本发明中。特别是已知大部分生物优选使用特定密码子(最佳密码子)的子集(Gene,Vol.105,pp.61-72,1991等)，因而根据宿主微生物进行“密码子最佳化”也是有用的。

并且，在本发明中，也可通过将肌醇-1-磷酸合成酶基因以“表达盒”的形式导入到宿主微生物细胞内来更稳定地得到高水平的肌醇-1-磷酸合成酶活性，这对本领域技术人员来说是可以理解的。在本说明书中，“表达盒”是指含有与表达对象的核酸或表达对象的基因功能性结合的对于转录和翻译进行调节的核酸序列的核苷酸。代表性地，本发明的表达盒以功能性结合的状态在编码序列的5’上游含有启动子序列、在3’下游含有终止子序列、根据情况进一步含有通常的调节元件，在这样的情况下，表达对象的核酸或表达对象的基因被“可表达地导入”到宿主微生物中。

关于启动子，不论是结构性启动子还是调节启动子，均被定义为使RNA聚合酶与DNA结合、引发RNA合成的DNA序列。强启动子是指高频引发mRNA合成的启动子，也适于用于本发明中。可根据该宿主细胞的性质等使用lac系、trp系、TAC或TRC系、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd包覆蛋白质的调节区域、针对糖酵解系酶(例如，3-磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、谷氨酸脱羧酶A、丝氨酸羟甲基转移酶的启动子等。除了启动子和终止子序列以外，可作为其它调节元件的示例举出的序列为选择标记、扩增信号、复制起点等。适宜的调节序列例如记载于“Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185”,Academic Press(1990)中。

上述说明的表达盒嵌入到例如由质粒、噬菌体、转座子、IS元件、噬粒、粘粒、或者线状或环状DNA等构成的载体中而被***到宿主微生物中。优选质粒和噬菌体。这些载体在宿主微生物中可自体复制，也可通过染色体复制。适宜的质粒例如为：大肠杆菌的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI；杆菌的pUB110、pC194或pBD214；棒状杆菌属的pSA77或pAJ667等。除它们以外，能够使用的质粒等还记载于“Cloning Vectors”,Elsevier,1985中。表达盒向载体中的导入可通过包括利用适当的限制酶切割、克隆化以及连接的惯用方法进行。

在如上所述构建出本发明的具有表达盒的载体后，作为将该载体导入到宿主微生物中时能够适用的方法，例如使用共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等惯用的克隆化法和转染法。它们的示例记载于“分子生物学的最新实验计划(CurrentProtocols in Molecular Biology)”，F.Ausubel等，Publ.Wiley Interscience，New York，1997；或Sambrook等，“分子克隆：实验室手册”，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中。

本发明人令人吃惊地发现，在不具有内源性葡萄糖二酸生物合成通路的宿主微生物内导入葡萄糖二酸生物合成通路而得到的转化体中，肌醇单磷酸酶活性具有重大作用。如上所述，在迄今为止的研究中，均未对肌醇单磷酸酶活性予以特别关注。但是，出人意料地，通过增强肌醇单磷酸酶活性，这样的转化体的葡萄糖二酸生产能力大幅提高。

因而，本发明的一个方式包括：在保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因的转化体中进行肌醇单磷酸酶的过剩生产。

对于本发明中谋求的肌醇单磷酸酶，除了对肌醇-1-磷酸显示出高底物特异性外，还显示出了可作用于广泛的底物的磷酸单酯水解酶活性，从而包括实质上能够水解肌醇-1-磷酸的蛋白质。作为代表性的肌醇单磷酸酶，例如已知有肌醇-1-单磷酸酶，大量生物来源的该基因(suhB基因)在基因库登录号Nos.ZP＿04619988、YP＿001451848等中公布。特别是大肠杆菌来源的suhB基因(序列编号3：AAC75586(MG1655))的使用在以大肠杆菌为宿主细胞的情况下较为方便。

本发明的转化微生物所应具有的下述生物活性为肌肉肌醇加氧酶活性。该酶代表性地通过下述反应将肌肉肌醇转换为葡萄糖醛酸。

[化1]

各种肌肉肌醇加氧酶基因是已知的，且可加以利用。例如，在WO2002/074926号小册子中公开了隐球菌和人来源的肌肉肌醇加氧酶基因及其异源表达。此外，专利文献1所公开的肌肉肌醇加氧酶基因也可用于本发明中。进一步地，例如已知有被赋予了下述基因库登录号的来源于多种生物的肌肉肌醇加氧酶基因，它们可用于本发明中。

ACCESSION No.AY738258(智人肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

ACCESSION No.NM101319(拟南芥肌醇加氧酶1(MIOX1))

ACCESSION No.NM001101065(牛肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

ACCESSION No.NM001030266(斑马鱼肌肉肌醇加氧酶(miox))

ACCESSION No.NM214102(野猪肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

ACCESSION No.AY064416(智人肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

ACCESSION No.NM001247664(番茄肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

ACCESSION No.XM630762(盘基网柄菌AX4肌醇加氧酶(miox))

ACCESSION No.NM145771(褐鼠肌肉肌醇加氧酶(Miox))

ACCESSION No.NM017584(智人肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

ACCESSION No.NM001131282(苏门答腊猩猩肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

具有序列编号5所表示的编码区域核苷酸序列的miox基因的使用是特别方便的。

本发明的转化微生物所应具有的最后一种生物活性为糖醛酸脱氢酶活性。该酶代表性地在NAD⁺的存在下通过下述反应将葡萄糖醛酸转换为葡萄糖二酸。

[化2]

各种糖醛酸脱氢酶基因是已知的且可加以利用。例如，专利文献1所记载的绿脓杆菌或农杆菌属细菌的糖醛酸脱氢酶也可在本发明中进行使用。进一步地，例如已知有被赋予了下述基因库登录号的udh基因，它们可用于本发明中。

ACCESSION No.BK006462(根癌农杆菌str.C58糖醛酸脱氢酶(udh)基因)

ACCESSION No.EU377538(丁香假单胞菌番茄致病变种str.DC3000糖醛酸脱氢酶(udh)基因)

具有序列编号7所表示的编码区域核苷酸序列的udh基因的使用是特别方便的。

本领域技术人员容易理解，在肌醇-1-磷酸合成酶基因中记载的变异、修饰和密码子最佳化以及表达盒、启动子等调节序列和质粒等以及基于此的转化的说明对于本发明的肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因也是全部适用的。因而，本发明的转化体可以保有包含编码肌醇-1-磷酸合成酶的核酸的表达盒、包含编码肌醇单磷酸酶基因的核酸的表达盒、包含编码肌肉肌醇加氧酶的核酸的表达盒和包含编码糖醛酸脱氢酶的核酸的表达盒这4个表达盒。本发明的适宜的转化体保有包含具有序列编号1所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒、包含具有序列编号3所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒、包含具有序列编号5所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒以及包含具有序列编号7所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒。

上述4个表达盒可配置在1个载体上被转染至宿主微生物中。或者可以将配置有其中任意2个以上的表达盒的载体与配置有剩下的表达盒的载体共转染至宿主微生物中，还可以将配置有各个表达盒的4个载体共转染至宿主微生物中。进一步地，也可以将上述4个表达盒中的任意一个以上嵌入到宿主微生物的基因组中，剩下的表达盒以质粒的形式存在于该转化微生物内。例如，也可将配置有包含编码肌肉肌醇加氧酶的核酸的表达盒和包含编码糖醛酸脱氢酶的核酸的表达盒的质粒转染到大肠杆菌AKC-018株(于2011年10月25日以FERM P-22181保藏于独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心。国际保藏编号：FERM BP-11514)中，该大肠杆菌AKC-018株在染色体上具有包含编码肌醇-1-磷酸合成酶的核酸(INO1)的表达盒和包含编码肌醇单磷酸酶的核酸(suhB)的表达盒这两种表达盒。

此外还认为有多种微生物细胞表达本发明中谋求的肌醇单磷酸酶活性(即具有编码肌醇单磷酸酶活性的内源性基因)。因而，本发明中的肌醇单磷酸酶的过剩生产可通过下述操作进行诱导：增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异；利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域；和使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失。具体地说，为了实现肌醇单磷酸酶的过剩表达，可通过进行下述操作来实现：利用含有内源性肌醇单磷酸酶基因、或者含有在该内源性基因的编码区域添加了适宜的调整区域的表达盒的构建体对上述宿主微生物进行转化，使该转化体内该肌醇单磷酸酶基因的拷贝数与原来的宿主细胞相比有实质性的增加；或者利用公知的基因重组技术对于具有内源性肌醇单磷酸酶基因的原来的宿主细胞实施染色体的变异、添加和缺失；或者使用诱变剂等在染色体中随机导入变异。可使用公知的SDS-PAGE分析法等对肌醇单磷酸酶的过剩生产进行确认。

进一步地，用于增强肌醇单磷酸酶活性的本发明的其它方式包括在宿主微生物细胞中诱导肌醇单磷酸酶的活化。为了完成该目的，可示例出下述这样的方法：1)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；2)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；3)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失；4)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少；和/或5)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。

关于上述用于增强肌醇单磷酸酶活性的1)～5)的方法，具体地说，可在对肌醇单磷酸酶的基因实施变异、添加或者缺失后对该基因所编码的肌醇单磷酸酶的活性进行评价，从而得到肌醇单磷酸酶活性得到增强的肌醇单磷酸酶。

对于上述得到的转化体，为了进行本发明的葡萄糖二酸的生产，可在适于上述转化体的生长和/或维持的条件下进行培养和维持。来源于各种宿主微生物细胞的转化体所用的适宜的培养基组成、培养条件、培养时间对于本领域技术人员为已知的。

培养基可以为含有1种以上的碳源、氮源、无机盐、维生素以及必要时的微量元素或维生素等微量成分的天然、半合成、合成培养基。但是，不消说所使用的培养基必须适当满足所要培养的转化体的营养要求。进一步地，为了使上述转化体与能够由该转化体转换为葡萄糖二酸的碳源接触，本发明的培养基需要含有最终能够用作葡萄糖二酸生产的底物的碳源、即需要含有可在转化体内转换为葡萄糖-6-磷酸的化合物。碳源可以为D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、淀粉、纤维素、米糠、废糖蜜，进一步可为含有D-葡萄糖的生物物质。作为适宜的生物物质，可示例出玉米分解液或纤维素分解液。此外，在转化体表达有用的附加性状的情况下、例如在具有针对抗生素的耐性标记的情况下，培养基也可以含有相应的抗生素。由此使发酵中的杂菌所致的污染风险降低。

在宿主微生物无法同化上述纤维素或多糖类等碳源的情况下，可通过实施在该宿主微生物中导入外来基因等公知的基因工程方法使其适应于使用这些碳源的葡萄糖二酸的生产中。作为外来基因，例如可以举出纤维酶基因或淀粉酶基因等。

培养可以为分批式也可以为连续式。并且，在任一情况下，均可为在适当的培养时刻补给所追加的上述碳源等的形式。进一步地，培养应该在维持适宜的温度、氧浓度、pH等的条件下继续进行。来源于一般的微生物宿主细胞的转化体的适宜培养温度通常为15℃～45℃、优选为25℃～37℃的范围。宿主微生物为好氧性的情况下，为了确保发酵中的适当的氧浓度，需要进行振荡(烧瓶培养等)、搅拌/通气(发酵罐培养等)。这些培养条件可由本领域技术人员容易地设定。

本领域技术人员可通过公知方法的组合由上述培养物中精制出葡萄糖二酸。例如，在专利文献1中具体记载了对于该目的有用的葡萄糖二酸的检测和定量方法。

被提供了上述说明的本领域技术人员可充分实施本发明。下面出于进一步说明的目的提供实施例，因而本发明并不限于该实施例。需要说明的是，在本说明书中，只要不特别声明，核苷酸序列被记载为从5’向3’方向。

实施例

实施例1：质粒的构建

1-a)肌醇单磷酸酶表达盒

在LB培养基中(2ml)中于37℃对大肠杆菌株W3110(NBRC 12713)进行振荡培养。培养终止后，从培养液中回收菌体，使用Nucleo Spin Tissue(产品名、MACHEREY-NAGEL社制造)提取基因组DNA。将所提取的基因组DNA用于模板，利用下述引物进行PCR扩增(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(产品名、Taraka-Bio制造)反应条件：98℃10sec，55℃5sec，72℃20sec，28循环)，克隆suhB基因的编码区域(序列编号3)。

[化3]

正向：atgcatccgatgctgaac(序列编号9)

反向：ttaacgcttcagagcgtcg(序列编号10)

所得到的suhB编码区域可转录地***到下述序列的启动子的下游。

[化4]

启动子：gtcgtttttctgcttaggattttgttatttaaattaagcctgtaatgccttgcttccattgcggataaatcctacttttttattgccttcaaataaatttaaggagttc(序列编号11)

即，在质粒pNFP-A51(于2011年10月25日以FERM P-22182保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心。国际保藏编号：FERM BP-11515)的多克隆位点***终止子序列和上述启动子序列。在所导入的启动子序列的下游连接上述克隆的suhB编码区域，构建pNFP-A54。将所构建的pNFP-A54利用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート(基因工程实验笔记)上田村隆明著)转染到大肠杆菌AKC-016株(于2011年4月20日以FERM P-22104保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心。国际保藏编号：FERM BP-11512)中。通过SDS-PAGE确认到肌醇单磷酸酶在该大肠杆菌的可溶性级分中的高表达。

1-b)肌醇-1-磷酸合成酶表达盒

从酿酒酵母的培养液中回收菌体，使用Nucleo Spin Tissue(产品名、MACHEREY-NAGEL社制造)提取基因组DNA。将所提取的基因组DNA用于模板，利用下述引物进行PCR扩增(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(产品名、Taraka-Bio制造)反应条件：98℃10sec，55℃5sec，72℃20sec，28循环)，克隆INO1基因的编码区域(序列编号1)。

[化5]

正向：atgacagaagataatattgct(序列编号12)

反向：ttacaacaatctctcttcg(序列编号13)

所得到的ino1编码区域可转录地***到下述序列的启动子的下游。

[化6]

启动子：ctcaagcccaaaggaagagtgaggcgagtcagtcgcgtaatgcttaggcacaggattgatttgtcgcaatgattgacacgattccgcttgacgctgcgtaaggtttttgtaattttacaggcaaccttttattcactaacaaatagctggtggaa(序列编号14)

即，在上述质粒pNFP-A51的多克隆位点***终止子序列和上述启动子序列。在所导入的启动子序列的下游连接上述克隆的ino1编码区域，构建pNFP-D78。将所构建的pNFP-D78利用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート上田村隆明著)转染到大肠杆菌AKC-016株(于2011年4月20日以FERM P-22104保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心。国际保藏编号：FERM BP-11512)中。通过SDS-PAGE确认到肌醇-1-磷酸合成酶在该大肠杆菌的可溶性级分中的高表达。

1-c)肌肉肌醇加氧酶表达盒

肌肉肌醇加氧酶(miox)基因如下得到：通过人工合成制作具有序列编号5的核苷酸序列的DNA，以该DNA为模板，利用下述引物进行PCR(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(产品名、Taraka-Bio制造)反应条件：98℃10sec，55℃5sec，72℃20sec，28循环)，从而得到该肌肉肌醇加氧酶(miox)基因。

[化7]

正向：atgaaagttgatgttggtcct(序列编号15)

反向：ttaccaggacagggtgcc(序列编号16)

将所得到的miox编码区域可转录地***到序列编号11的启动子的下游。即，在上述pNFP-A51的多克隆位点***终止子序列和上述启动子序列。在所导入的启动子序列的下游连接上述克隆的miox编码区域，构建pNFP-H26。将所构建的pNFP-H26利用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート上田村隆明著)转染到大肠杆菌株FERM P-22104中。通过SDS-PAGE确认到肌肉肌醇加氧酶在该大肠杆菌的可溶性级分中的高表达。

1-d)糖醛酸脱氢酶表达盒

糖醛酸脱氢酶(udh)基因如下得到：通过人工合成制作具有序列编号7的核苷酸序列的DNA，以该DNA为模板，利用下述引物进行PCR(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(产品名、Taraka-Bio制造)反应条件：98℃10sec，55℃5sec，72℃20sec，28循环)，从而得到该糖醛酸脱氢酶(udh)基因。

[化8]

正向：atgaccactacccccttcaat(序列编号17)

反向：tcagttgaacgggccgg(序列编号18)

将所得到的udh编码区域可转录地***到序列编号11的启动子的下游。即，在上述pNFP-A51的多克隆位点***终止子序列和上述启动子序列。在所导入的启动子序列的下游连接上述克隆的udh编码区域，构建pNFP-H45。将所构建的pNFP-H45利用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート上田村隆明著)转染至大肠杆菌株FERM P-22104中。通过SDS-PAGE确认到糖醛酸脱氢酶在该大肠杆菌的可溶性级分中的高表达。

1-e)用于转化的质粒的构建

将上述制作的pNFP-D78利用SalI消化，进行末端平滑化和5’末端脱磷酸化。将pNFP-A54中的suhB表达盒克隆化，与pNFP-D78连接。得到了与pNFP-D78中的INO1表达盒顺方向地连接有suhB表达盒的pNFP-G22。接下来，将pNFP-G22利用SalI消化，进行末端平滑化和5’末端脱磷酸化。将实施例1中制作的pNFP-H26中的miox表达盒和pNFP-H45中的udh表达盒克隆化，将两个表达盒与pNFP-G22连接。得到了与pNFP-G22中的INO1表达盒和suhB表达盒顺方向地连接有miox表达盒和udh表达盒的本发明的质粒。

实施例2：

2-a)利用经含有表达盒的质粒转染而得到的转化体、使用罐状培养槽所进行的葡萄糖二酸的生产

使用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート上田村隆明著)，将按照上述步骤构建的本发明的质粒转染至大肠杆菌AKC-016株(于2011年4月20日以FERM P-22104保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心。国际保藏编号：FERM BP-11512)中。

将所得到的转化体在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB微板上于37℃培养一天，形成菌落。将含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基30mL装入150mL容量的烧瓶中，利用白金耳从上述微板进行菌落的植菌，在37℃以180rpm进行3～5小时的培养，直至OD(600nm)为0.5左右，将其作为主培养所用的前培养液。

在1000mL容量的罐状培养装置(丸菱生物工程社制造)中加入300mL含有10g/L的葡萄糖与100mg/L氨苄青霉素的合成培养基(表1)，添加6mL的前培养液进行主培养(使用罐状培养装置的葡萄糖二酸生产试验)。培养条件如下：培养温度32℃；培养pH 6.0[下限]；碱添加28％(重量/容量)氨水；搅拌850rpm；通气1vvm。适当添加作为原料的葡萄糖添料溶液(表2)，使培养液中的葡萄糖浓度为0g/L～5g/L。

[表1]

合成培养基组成

使用8N KOH，将pH调整为6.3

[表2]

葡萄糖添料溶液

将上述培养液在4℃进行10,000g×10分钟的离心分离，回收上清，测定培养上清的葡萄糖二酸浓度。具体地说，将Shim-Pak SCR-H(保护柱)和Shim-Pak SCR-101H(均为商品名、岛津GLC社制造)联结，进行HPLC分析(检测器：RI、柱温度：40℃、流速：1mL/min、移动层：0.1％甲酸)，从而对培养上清中的葡萄糖二酸浓度进行定量。

其结果，在基于本发明的保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因的转化体中，通过增强肌醇单磷酸酶活性，在该转化体的培养上清中生产了约73g/L(培养时间68小时)的葡萄糖二酸。

参考例：

制作不过剩生产肌醇单磷酸酶的转化体，使用该肌醇单磷酸酶非增强株，除此以外，按照上述实施例2进行葡萄糖二酸生产试验，结果在培养时间68小时仅生产了0.26g/L的葡萄糖二酸。

关于本说明书中提及的质粒和微生物，在它们被记载为保藏的情况下，均保藏于(保藏机关的名称)“IPOD独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(IPOD，NITE)”；(保藏机关的地址)“日本邮政编码305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6”。

工业实用性

本发明可用于葡萄糖二酸的工业发酵生产。

Claims

1.一种葡萄糖二酸的制造方法，其包括下述工序：

2)在适于所述转化体的生长和/或维持的条件下，使该转化体与能够由该转化体转换为葡萄糖二酸的碳源进行接触的工序；以及

3)从在所述2)中得到的培养物中分离出葡萄糖二酸或者葡萄糖二酸盐的工序。

2.如权利要求1所述的制造方法，其中，所述碳源包括可在所述转化体内转换为葡萄糖-6-磷酸的化合物。

3.如权利要求2所述的制造方法，其中，所述碳源为选自由D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、淀粉、纤维素、米糠、废糖蜜以及含有D-葡萄糖的生物物质组成的组中的1种以上。

4.如权利要求1～3的任一项所述的制造方法，其特征在于，所述转化体来源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物。

5.如权利要求1～4的任一项所述的制造方法，其中，所述转化体来源于选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌。

6.如权利要求1～5的任一项所述的制造方法，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对所述转化体进行以下操作而被诱导的：

a)导入外来肌醇单磷酸酶基因；

b)增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；

c)在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异；

d)利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域；或者

e)使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失。

7.如权利要求6所述的制造方法，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对所述转化体导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的。

8.如权利要求1～5的任一项所述的制造方法，其中，所述肌醇单磷酸酶的活化是通过对所述转化体进行以下操作而被诱导的：

f)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；

g)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；

h)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失；

i)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少；

j)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。

9.一种转化体，该转化体保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因，并且具有对该转化体内的功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。

10.如权利要求9所述的转化体，其特征在于，所述转化体来源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物。

11.如权利要求9或10所述的转化体，其中，所述转化体来源于选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌。

12.如权利要求9～11的任一项所述的转化体，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对所述转化体进行以下操作而被诱导的：

a)导入外来肌醇单磷酸酶基因；

b)增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；

c)在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异；

e)使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失。

13.如权利要求12所述的转化体，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对所述转化体导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的。

14.如权利要求9～11的任一项所述的转化体，其中，所述肌醇单磷酸酶的活化是通过对所述转化体进行以下操作而被诱导的：

f)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；

g)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；

h)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失；

i)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少；

j)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。