CN106148321A - 一株产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用。本发明利用同源重组、基因缺失失活的方法使产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌野生型菌株中乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因沉默，从而得到产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌。用本发明的工程菌进行1,3-丙二醇的发酵生产，副产物乳酸和乙醇产量大幅度降低，目标产物1,3-丙二醇的终浓度、生产强度和转化率都得到明显提升。另外，由于副产物产量的大幅降低，也可以简化后提取的工艺。本发明可提高微生物发酵法生产1,3-丙二醇的生产效率，降低生产成本，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一株产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用。
背景技术
1,3-丙二醇(1,3-propanediol)是一种重要的化工原料，可用于溶剂、润滑剂、抗冻剂等行业。1,3-丙二醇还可用于合成聚酯和聚氨酯，特别是用于合成聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。PTT是一种性能优异的新型聚酯材料，兼具聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)的优点，并具有生物降解性，在纺织、塑料等方面具有广阔的应用前景。随着1,3-丙二醇市场需求的日益扩大，开发高效、低成本的1,3-丙二醇生产方法，已成为当前的研究热点。
1,3-丙二醇的生产方法主要为化学法和生物法。与化学法相比，生物法具有条件温和、操作简单、副产物少、环境有好等优点，是一种绿色环保的生产方法。目前生产1,3-丙二醇的生物法主要分为两类：第一类，利用基因工程大肠杆菌转化糖类生产1,3-丙二醇(CN201110093628；ZL200710104008)；第二类，利用肠道细菌歧化甘油生产1,3-丙二醇(ZL200410100479；CN201180064621)。使用糖类作为底物经济性差；最近，由于生物柴油产业的发展，甘油作为其副产物，价格逐渐下降，是1,3-丙二醇生产的理想底物。
可发酵甘油生产1,3-丙二醇的菌株主要包括克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸菌属(Citrobacter)和梭菌属(Clostridium)等。克雷伯氏菌具有较高的甘油耐受能力，以及较高的1,3-丙二醇产量和转化率，因此受到更多关注。克雷伯氏菌在代谢甘油生产1,3-丙二醇的过程中，还会生产乳酸、乙酸、琥珀酸、2,3-丁二醇和乙醇等副产物。副产物的生产，不仅会降低甘油生产1,3-丙二醇的转化率，还会增加1,3-丙二醇提取的难度。构建基因工程菌，减少副产物的生产，是提高1,3-丙二醇生物法生产效率和降低生产成本的有效手段。目前，已有通过基因敲除的方法使产乳酸和乙酸等途径失活，从而减少1,3-丙二醇生产过程中副产物的生产的报道(ZL200510127744；ZL201310071754)。
已有研究表明，副产物乳酸和乙醇的生成，会与1,3-丙二醇的生成竞争细胞内的还原力NADH，极大地降低了1,3-丙二醇的转化率(Xu et al.,Biotechnol.Bioeng.,2009,104:965-972；Zhang et al.,Metab.Eng.,2009,11:101-106)。对产乳酸和乙醇途径的失活，有望大幅减少副产物的生产，从而提高1,3-丙二醇的生产效率。但是，目前还没有同时在克雷伯氏菌中使产乳酸和乙醇途径失活的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一株产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌及其及其构建方法以及该产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌在1,3-丙二醇生产中的应用。
本发明的产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌，是将产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌野生型菌株的乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因敲除后获得的工程菌。该工程菌已于2015年3月6 日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC NO M 2015091。命名为克雷伯氏菌XP-4 Klebsiella sp.XP-4。
本发明提供了产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌的构建方法，将克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因(序列如SEQ ID NO.1)和乙醇脱氢酶基因(序列如SEQ ID NO.2)敲除，通过以下方法敲除：
(1)PCR扩增克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因在基因组中上游和下游的部分同源序列，将其与***载体相连，然后再导入杂交供体菌中；
(2)将步骤(1)获得的携带有乳酸脱氢酶基因上游和下游部分同源序列的***载体的供体菌与克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组使乳酸脱氢酶基因缺失失活，经筛选后获得乳酸脱氢酶基因被敲除的克雷伯氏菌。
(3)PCR扩增克雷伯氏菌的乙醇脱氢酶基因在基因组中上游和下游的部分同源序列，将其与***载体相连，然后再导入杂交供体菌中；
(4)将步骤(3)获得的携带有乙醇脱氢酶基因上游和下游部分同源序列的***载体的供体菌与步骤(2)获得的乳酸脱氢酶基因被敲除的克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组使乙醇脱氢酶基因缺失失活，经筛选后获得乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因都被敲除的克雷伯氏菌。
所述的步骤(1)的PCR扩增克雷伯氏菌乳酸脱氢酶基因上游部分同源序列是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物ldhA-1：ATCGGAATTCAGGGTATTGAGCTGGGCGTC与引物ldhA-2：ATTCAAGCTTCGAAACCTGTCCGAACGCCA组成的引物进行PCR扩增后的序列。所述步骤(1)的PCR扩增克雷伯氏菌乳酸脱氢酶基因下游部分同源序列是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物ldhA-3：ATTAAAGCTTCCGTTGGCGGTTTTGGCAGT与引物ldhA-4：TCTACCCGGGTTTTCAGCCGCTTTCTCTCT组成的引物进行PCR扩增后的序列。
所述步骤(3)的PCR扩增克雷伯氏菌乙醇脱氢酶基因上游部分同源序列是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物adhE-1：CACGGAATTCATGGCTGTTACTAATATCGC与引物adhE-2：ATTCGGATCCAGAGAAAATGATGGCGTTAC组成的引物进行PCR扩增后的序列。所述步骤(3)的PCR扩增克雷伯氏菌乙醇脱氢酶基因下游部分同源序列是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物adhE-3：ATCTGGATCCGCTATAACGCGAATGACAAC与引物adhE-4：ATGCCTGCAGTTTTTTCTCAGCCTTTACCG组成的引物进行PCR扩增后的序列。
所述的***载体为***载体pKR6K(如图1，Wang et al.,J.Biol.Chem.2014,289:6080-6090)。所述的将携带有乳酸脱氢酶基因或乙醇脱氢酶基因上游和下游部分同源序列的***载体导入杂交供体菌株中，可以通过热激法、电转化法、接合转化法等常规方法转化杂交供体菌。
所述的杂交供体菌为大肠杆菌S17-1(λpir)。通过双亲本杂交，使乳酸脱氢酶基因上游 和下游的部分同源序列与克雷伯氏菌基因组发生同源重组，从而使克雷伯氏菌中的乳酸脱氢酶基因缺失失活，从而获得产乳酸途径缺失的工程菌。通过双亲本杂交，使乙醇脱氢酶基因上游和下游的部分同源序列与产乳酸途径缺失的工程菌的基因组发生同源重组，从而使产乳酸途径缺失的工程菌中的乙醇脱氢酶基因缺失失活，从而获得产乳酸和乙醇途径都缺失的工程菌。
本发明还提供了产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用。
本发明利用同源重组、基因缺失失活的方法使产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因敲除，从而得到产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌。用本发明的工程菌发酵甘油生产1,3-丙二醇，副产物乳酸和乙醇产量大幅度降低，目标产物1,3-丙二醇的终浓度、生产强度和转化率都得到明显提升。另外，由于副产物产量的大幅降低，也可以简化后提取的工艺。本发明可提高微生物发酵法生产1,3-丙二醇的生产效率，降低生产成本，具有重要的应用价值。
附图说明
图1***载体pKR6K的物理图谱。
图2菌落PCR验证乳酸脱氢酶基因敲除的电泳图，M，DNA Marker；1，克雷伯氏菌野生菌；2，乳酸脱氢酶基因敲除的克雷伯氏菌工程菌。
图3菌落PCR验证乙醇脱氢酶基因敲除的电泳图，M，DNA Marker；1，克雷伯氏菌野生菌；2，乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因敲除的克雷伯氏菌工程菌。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一：
产乳酸和乙醇途径缺失的克雷伯氏菌工程菌XP-4的构建(1)乳酸脱氢酶基因ldhA上游和下游部分同源序列的克隆
根据克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组序列设计引物，PCR乳酸脱氢酶基因ldhA上游和下游部分同源序列。以克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组DNA为模板，以引物ldhA-1：ATCGGAATTCAGGGTATTGAGCTGGGCGTC与引物ldhA-2：ATTCAAGCTTCGAAACCTGTCCGAACGCCA组成的引物进行PCR扩增，得到ldhA上游的部分同源序列。以克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组DNA为模板，以引物ldhA-3：ATTAAAGCTTCCGTTGGCGGTTTTGGCAGT与引物ldhA-4：TCTACCCGGGTTTTCAGCCGCTTTCTCTCT组成的引物进行PCR扩增，得到ldhA下游的部分同源序列。PCR扩增条件为：95℃5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，共30个循环；72℃5分钟。PCR反应结束后，将PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳， 回收并纯化，得到目的片段。
(2)乳酸脱氢酶基因***载体的构建
使用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切ldhA上游的同源片段，使用HindIII和XmaI酶切ldhA下游的同源片段，使用EcoRI和XmaI酶切pKR6K载体，将酶切产物进行回收并纯化，使用T4连接酶，将ldhA上游的同源片段、下游的同源片段和pKR6K载体连接，将连接产物转入大肠杆菌S17-1(λpir)，筛选阳性转化子，得到携带有乳酸脱氢酶基因ldhA上游和下游部分同源片段的***载体
(3)乳酸脱氢酶基因敲除的克雷伯氏菌工程菌的构建
将步骤(2)中获得的携带有的大肠杆菌S17-1(λpir)(供体菌)与克雷伯氏菌ATCC 25955(受体菌)进行双亲本杂交，使上的乳酸脱氢酶基因ldhA上游和下游的部分同源序列与克雷伯氏菌基因组发生同源重组，从而使克雷伯氏菌中的乳酸脱氢酶基因缺失失活，从而获得产乳酸途径缺失的工程菌。具体方法为：
a.分别接种活化后的供体菌和受体菌至5mL LB培养基中，37℃摇床中，200rpm培养2-3小时，当供体菌和受体菌同时生长到OD620nm为0.5-0.8；将5mL供体菌菌液离心，无菌生理盐水洗两遍；将1mL受体菌菌液离心，无菌生理盐水洗两遍；将上述供体菌和受体菌的菌体一共用100μL无菌生理盐水重悬，将重悬液全部滴在LB固体培养基平板中间，平板正面放置，37℃培养12-18小时。
b.将步骤a中LB固体培养基平板上的菌落用无菌生理盐水和刮刀刮下，无菌生理盐水洗两遍，进行适当稀释，涂布于加入了50μg/mL卡那霉素的M9固体培养基平板，37℃培养24-36小时。
c.挑取步骤b中M9固体培养基平板上生长的单菌落至加入50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中，37℃，200rpm培养12小时。转接菌液至新鲜的5mL LB培养基中(不添加卡那霉素)，37℃，200rpm培养12小时。
d.将上述菌液适当稀释，涂布于LAS固体培养基平板，25℃培养24小时。
e.挑取步骤d中LAS固体培养基平板上生长的单菌落至5mL LB培养基中，37℃，200rpm培养12小时，提取基因组DNA，使用引物ldhA-1：ATCGGAATTCAGGGTATTGAGCTGGGCGTC与引物ldhA-4：TCTACCCGGGTTTTCAGCCGCTTTCTCTCT组成的引物进行PCR扩增，经电泳验证得到正确的克隆，即为乳酸脱氢酶基因敲除的工程菌(图2)。
LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，固体培养基中加入琼脂粉15g/L，121℃灭菌20分钟。
M9固体培养基：Na2HPO4·12H2O 1.7g/L、KH2PO40.3g/L、NaCl 0.05g/L、NH4Cl 0.1g/L、柠檬酸三钠0.5g/L、琼脂粉15g/L，121℃灭菌20分钟。
LAS固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、蔗糖150g/L，琼脂粉15g/L，115℃灭菌20分钟。
(4)乙醇脱氢酶基因adhE上游和下游部分同源序列的克隆
根据克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组序列设计引物，PCR乙醇脱氢酶基因adhE上游和下游部分同源序列。以克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组DNA为模板，以引物adhE-1：CACGGAATTCATGGCTGTTACTAATATCGC与引物adhE-2：ATTCGGATCCAGAGAAAATGATGGCGTTAC组成的引物进行PCR扩增，得到adhE上游的部分同源序列。以克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组DNA为模板，以引物adhE-3：ATCTGGATCCGCTATAACGCGAATGACAAC与引物adhE-4：ATGCCTGCAGTTTTTTCTCAGCCTTTACCG组成的引物进行PCR扩增，得到adhE下游的部分同源序列。PCR扩增条件与步骤(1)相同。PCR反应结束后，将PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化，得到目的片段。
(5)乙醇脱氢酶基因***载体的构建
使用限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切adhE上游的同源片段，使用BamHI和PstI酶切adhE下游的同源片段，使用EcoRI和PstI酶切pKR6K载体，将酶切产物进行回收并纯化，使用T4连接酶，将adhE上游的同源片段、下游的同源片段和pKR6K载体连接，将连接产物转入大肠杆菌S17-1(λpir)，筛选阳性转化子，得到携带有乙醇脱氢酶基因adhE上游和下游部分同源片段的***载体
(6)乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因都敲除的克雷伯氏菌工程菌的构建
将步骤(5)中获得的携带有的大肠杆菌S17-1(λpir)(供体菌)与产乳酸途径缺失的克雷伯氏菌(受体菌)进行双亲本杂交，使上的乙醇脱氢酶基因adhE上游和下游的部分同源序列与克雷伯氏菌基因组发生同源重组，从而使克雷伯氏菌中的乙醇脱氢酶基因缺失失活(图3)，从而获得产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌。具体方法与步骤(3)相同，只是PCR验证时，使用引物adhE-1：CACGGAATTCATGGCTGTTACTAATATCGC与引物adhE-4：ATGCCTGCAGTTTTTTCTCAGCCTTTACCG组成的引物进行PCR扩增，验证得到乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因都敲除的克雷伯氏菌工程菌，命名为克雷伯氏菌XP-4。
实施例二：
产乳酸和乙醇途径缺失的克雷伯氏菌工程菌在发酵生产1,3-丙二醇中的应用
(1)发酵培养基
酵母粉5g/L、K2HPO4·3H2O 10g/L、KH2PO42g/L、NH4Cl 1g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、FeCl3·6H2O 30mg/L、CoCl2·6H2O 5mg/L和甘油20g/L。培养基121℃灭菌20分钟。
(2)发酵方法
a.种子活化
从甘油管保藏的克雷伯氏菌接种至5mL发酵培养基中，37℃，200rpm摇床中培养12小时活化种子。
b.种子培养
将步骤a中的5mL种子液，接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，9层纱布封口，装液量100mL种子培养基，37℃，200rpm摇床中培养12小时，得到种子培养液。
c.发酵培养
为了考察产乳酸和乙醇途径缺失对克雷伯氏菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的影响，以实施例1中获得的产乳酸和乙醇途径缺失的克雷伯氏菌工程菌XP-4为实验组，以克雷伯氏菌野生菌为对照组，进行分批补料发酵。分批补料发酵在5L发酵罐中进行，初始装液量为2.5L，接种量为1％，通气为1.0vvm，搅拌转速为250rpm，发酵温度为37℃，发酵过程中，使用2M NaOH溶液调节发酵液pH为6.6。当发酵培养基中初始的20g/L甘油耗尽时，通过向发酵罐中补加700g/L的甘油溶液，控制发酵液中甘油浓度为5-30g/L。
d.产物检测
每隔2小时取样，使用气相色谱检测1,3-丙二醇、乙醇和2,3-丁二醇的浓度，使用高效液相色谱检测乳酸、乙酸和琥珀酸的浓度，当发酵液中1,3-丙二醇浓度不再上升时，停止发酵。
(3)发酵结果
发酵进行30小时，1,3-丙二醇和副产物的生产情况详见表1。
表1：产乳酸和乙醇途径的缺失对克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇的影响
如表1所示，乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因敲除后的克雷伯氏菌XP-4，其乳酸和乙醇合成代谢途径缺失，相比于克雷伯氏菌野生菌，工程菌XP-4的乳酸和乙醇的产量大幅度降低，分别降低了96.6％和94.6％。同时，目的产物1,3-丙二醇的产量从65.1g/L提高至81.3g/L，提高了24.9％，1,3-丙二醇对甘油的转化率从0.43g/g提高至0.57g/g，提高了32.6％，生产强度提高了22.7％。
Claims (6)
1.一株产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌的构建方法，将克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因敲除后获得的工程菌，其特征在于，将SEQ ID NO.1的克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因和SEQ ID NO.2的乙醇脱氢酶基因敲除，具体敲除方法如下：
(1)PCR扩增克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因在基因组中上游和下游的部分同源序列，将其与***载体相连，然后再导入杂交供体菌中；
(2)将步骤(1)获得的携带有乳酸脱氢酶基因上游和下游部分同源序列的***载体的供体菌与克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组使乳酸脱氢酶基因缺失失活，经筛选后获得乳酸脱氢酶基因被敲除的克雷伯氏菌。
(3)PCR扩增克雷伯氏菌的乙醇脱氢酶基因在基因组中上游和下游的部分同源序列，将其与***载体相连，然后再导入杂交供体菌中；
(4)将步骤(3)获得的携带有乙醇脱氢酶基因上游和下游部分同源序列的***载体的供体菌与步骤(2)获得的乳酸脱氢酶基因被敲除的克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组使乙醇脱氢酶基因缺失失活，经筛选后获得乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因都被敲除的克雷伯氏菌。
2.根据权利要求1所述的产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)的PCR扩增克雷伯氏菌乳酸脱氢酶基因上游部分同源序列是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物ldhA-1：ATCGGAATTCAGGGTATTGAGCTGGGCGTC与引物ldhA-2：ATTCAAGCTTCGAAACCTGTCCGAACGCCA组成的引物进行PCR扩增后的序列；所述步骤(1)的PCR扩增克雷伯氏菌乳酸脱氢酶基因下游部分同源序列是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物ldhA-3：ATTAAAGCTTCCGTTGGCGGTTTTGGCAGT与引物ldhA-4：TCTACCCGGGTTTTCAGCCGCTTTCTCTCT组成的引物进行PCR扩增后的序列。
3.根据权利要求1所述的产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)的PCR扩增克雷伯氏菌乙醇脱氢酶基因上游部分同源序列是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物adhE-1：CACGGAATTCATGGCTGTTACTAATATCGC与引物adhE-2：ATTCGGATCCAGAGAAAATGATGGCGTTAC组成的引物进行PCR扩增后的序列；所述步骤(3)的PCR扩增克雷伯氏菌乙醇脱氢酶基因下游部分同源序列是以克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以引物adhE-3：ATCTGGATCCGCTATAACGCGAATGACAAC与引物adhE-4：ATGCCTGCAGTTTTTTCTCAGCCTTTACCG组成的引物进行PCR扩增后的序列。
4.根据权利要求1所述的产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的***载体为***载体pKR6K，所述的杂交供体菌为大肠杆菌S17-1(λpir)。
5.一种按照权利要求1所述的构建方法构建得到的产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌，是将克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因敲除后获得的工程菌，该工程菌已于2015年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC M 2015091。
6.权利要求5所述的产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌的应用，在生产1,3-丙二醇中应用。
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