CN103981210A - 一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法及其重组菌和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物医药工程技术领域，提供了一种真核表达载体，由含有牛β-防御素4成熟肽基因与真核表达载体pPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD4，牛β-防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；还提供了一种重组菌株；还提供了一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法，包括1)牛β-防御素4成熟肽基因的制备；2)上述真核表达载体的构建；3)上述重组菌株的制备；4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。本发明所表达的重组牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽具有抗菌活性，且有一定的抗结核活性，适合于在畜牧生产及疾病治疗中使用，而且生产成本低、生产效率高。

Description

一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法及其重组菌和应用

技术领域

本发明属于动物医药工程技术领域，具体涉及一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法，还涉及一种表达牛β-防御素4成熟肽的重组菌，同时还涉及一种牛β-防御素4成熟肽在畜牧生产和药物治疗中抗菌作用的应用。

背景技术

防御素(defensin)属于内源性抗菌肽(endogenousantibioticpeptidees)家族，具备广谱抗微生物和细胞毒活性，对机体免疫至关重要。1991年，人们在牛气管黏膜上皮细胞中首次发现β-防御素-2这一阳离子多肽抗生素，命名为TAP(Trachea Antiniobial Peptide)，而后在牛的粒细胞中又发现了13种不同于α-防御素，却与TAP序列高度同源的防御素，故命名为β-防御素。由于β-防御素的结构特点为基因序列中含有两个exon，其中第二个exon编码成熟的β-防御素，即发挥活性的部分，而且成熟β-防御素中含有6个半胱氨酸，可形成3对二硫键，是β-防御素能够发挥生物活性的必要结构。但是动物体内天然防御素的含量较低，直接提取远不能满足需要，化学合成方法可行但成本太高，因此，通过基因重组技术生产防御素多肽，以满足研究和生产的需要成为一种可能。

另外，有研究已证实牛巨噬细胞有牛嗜中性粒细胞β-防御素(BNBD)4的表达，且分支杆菌主要感染巨噬细胞，并在巨噬细胞内生存，因此，我们推测BNBD4可能在对抗分支杆菌感染中发挥着重要的作用，并可作为一种分支杆菌的新型治疗药物而广泛使用，因此基于防御素的这一重要特点，我们进行了一种真核表达牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽的生产方法的研究。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法及其重组菌和应用。

为实现上述目的，本发明提供一种真核表达载体，由含有牛β-防御素4成熟肽基因与真核表达载体pPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD4，所述牛β-防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

一种编码牛β-防御素4成熟肽的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了一种重组菌株，由上述真核表达载体pPIC9K-mBNBD4转化毕赤酵母GS115构建制成的重组菌株。

优选的，所述菌株为毕赤酵母阳性转化子菌株巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris(pPIC9K-mBNBD4)，该菌株已于2014年3月20日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.8938。

本发明提供了一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法，包括以下步骤：

1)牛β-防御素4成熟肽基因的制备：根据GenBank上公布的BNBD4的CDS区域核苷酸序列人工合成mBNBD4基因，并设计PCR引物，

mBNBD4的上游引物：

5′-GCCGAATTCCAAAGAGTAAGAAATCCTC-3′；

mBNBD4的下游引物：

5′-GCCGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGCCTCCTGCAGCATGGT-3′。

2)上述真核表达载体的构建：双酶切mBNBD4基因和真核表达载体pPIC9K，胶回收mBNBD4基因片段和开环的真核表达载体pPIC9K，16℃连接处理16h，将连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，即完成重组质粒pPIC9K-mBNBD4的构建；

3)上述重组菌株的制备：将重组质粒pPIC9K-mBNBD4转化到感受态GS115中，筛选阳性转化子，所得阳性克隆即为能够表达mBNBD4的毕赤酵母阳性转化子菌株；

4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。

优选的，步骤3)中所述筛选依次为His⁺多拷贝转化子的筛选和Mut⁺转化子的筛选。

优选的，所述步骤4)包括以下步骤：

a、挑取PCR鉴定后证实已***目的片段的His⁺、Mut⁺酵母转化子接种至YPD液体培养基中，28℃培养16-18h，离心弃上清；

b、重悬菌体接种至诱导表达前培养基BMGY中，28℃培养18-24h，至OD600nm达到2-6时离心弃上清；

c、重悬菌体接种至诱导表达培养基BMMY中，28℃连续培养72h，培养72h后收集表达培养液，离心取上清，进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析，结果显示，与空载体对照相比，含有目的片段的酵母表达上清在7kD处有一特异性条带，说明有目的蛋白表达。

优选的，诱导表达前培养基BMGY的配方为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、K₂HPO₄ 3g/L、KH₂PO₄ 11.8g/L、超纯水800mL/L、10×YNB100mL/L、0.02％生物素的500×B1mL/L、10％甘油100mL/L。

优选的，诱导表达培养基BMMY的配方为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、K₂HPO₄ 3g/L、KH₂PO₄ 11.8g/L、超纯水800mL/L、10×YNB100mL/L、0.02％生物素的500×B1mL/L、5％甲醇100mL/L。

优选的，所述步骤c中，培养过程中每隔24h补充甲醇使其终浓度为1％。

本发明提供了一种牛β-防御素4成熟肽在抗微生物感染中的应用。

本发明的有益效果：对重组牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)进行体外生产表达研究，仅对牛嗜中性粒细胞β-防御素4具有生物学活性的成熟肽进行表达，同时为了方便纯化，添加了不影响蛋白生物学活性的6-His·tag，从而有利于重组蛋白的纯化，提高重组蛋白产量。毕赤酵母表达***属于真核表达***，表达出来的蛋白更接近于天然蛋白，有利于保持重组蛋白的天然结构，对于牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)有助于3对二硫键的形成，从而保持重组蛋白的活性。活性检测结果发现所表达的重组牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)具有抗菌活性，且有一定的抗结核活性，适合于在畜牧生产及疾病治疗中使用，而且生产成本低、生产效率高。

附图说明

图1牛β-防御素4成熟肽的PCR结果；

图2mBNBD4基因的测序比对结果；

图3重组质粒pPIC9K-mBNBD4构建模式图；

图4重组菌株基因组PCR鉴定-通用引物鉴定结果，其中，1-2为空质粒对照pPIC9K，3-8为pPIC9K-mBNBD4；

图5重组菌株基因组PCR鉴定-mBNBD4特异性引物鉴定结果，其中，1-2为空质粒对照pPIC9K，3-8为pPIC9K-mBNBD4；

图6重组蛋白mBNBD4的鉴定结果：Tricine-SDS-PAGE鉴定结果，其中，1：诱导48h；2：诱导60h；3：诱导72h；4：诱导84h；箭头所指为最优表达时间(72h)；

图7重组蛋白mBNBD4的鉴定结果：Western Blotting鉴定结果，1为空质粒对照pPIC9K表达产物，2为重组蛋白mBNBD4；

图8重组蛋白mBNBD4对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制效果；

图9重组蛋白mBNBD4对耻垢分支杆菌的抑制效果；

图10重组蛋白mBNBD4对牛分枝杆菌的抑制效果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明所使用的限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ均购自Takara大连宝生物；真核表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司；FastPfu DNA聚合酶，T4连接酶等购自北京全式金生物技术有限公司；毕赤酵母宿主菌GS115菌株购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；遗传霉素G418购自北京拜尔迪生物技术有限公司，生产厂家为美国INALCO公司。

实施例1嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽基因的制备

1、设计人工合成牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)基因的引物

根据GenBank上公布的BNBD4的CDS区域核苷酸序列(序列号：AF008307.1)，以及真核表达载体pPIC9K的酶切位点，上游引物设计在基因起始端，加入了EcoR Ⅰ酶切位点(下划线处)，在EcoR Ⅰ酶切位点前加有3个保护性碱基GCC；下游引物设计在基因末端，并加入了Not Ⅰ酶切位点(下划线处)，同时为了方便以后蛋白纯化，在下游引物C-端终止密码子前加了一个6-His·tag(波浪下划线处)，Not Ⅰ酶切位点前加有3个保护性碱基GCC，委托Genewiz(金唯智)生物科技有限公司合成，分别为：

mBNBD4的上游引物：

5′-GCCGAATTCCAAAGAGTAAGAAATCCTC-3′；

mBNBD4的下游引物：

5′-GCCGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGCCTCCTGCAGCATGGT-3′。

2、mBNBD4的PCR扩增

从正常牛肺脏组织提取RNA，反转录后获得cDNA，以此DNA为模板，加入TransStart FastPfu DNA聚合酶、牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)基因上游引物/下游引物、2.5mM dNTPs进行扩增反应，PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu buffer(10μL)，2.5mM dNTPs(5μL)，浓度为10μM的牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)基因上游引物和下游引物(各1μL)，模板为牛肺脏组织cDNA(2μL)，高压灭菌ddH₂O(30μL)，TransStart FastPfu DNA聚合酶(1μL)，PCR反应条件依次为：95℃，1min；95℃，20sec，62℃，20sec，72℃，30sec，35cycles；72℃，5min。反应完成后即获得牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)的PCR产物，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，可见一条158bp左右的条带，如图1所示，与预期结果一致。

实施例2重组质粒pPIC9K-mBNBD4的构建

将获得的牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)的PCR产物用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化及回收，回收产物用内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切处理，胶回收大小约为150bp的条带；以同样的方法对真核表达载体pPIC9K进行双酶切处理，胶回收约为9kb大小的DNA片段，分别取3μL双酶切后胶回收的牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)基因片段和2μL双酶切后胶回收的真核表达载体pPIC9K，加入2μL的5×T4DNA连接buffer，1μL的T4DNA连接酶，补充高压灭菌ddH₂O至10μL，在16℃条件下连接处理16h，将连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布200μL于LB/Amp⁺固体培养基上，37℃培养14-16h，即完成重组质粒pPIC9K-mBNBD4的构建。LB/Amp⁺固体培养板上长出的白色菌落即为含有重组质粒pPIC9K-mBNBD4的阳性菌。真核表达载体pPIC9K为Invitrogen公司的产品。

挑选LB/Amp⁺固体培养板上长出的白色菌落加入LB/Amp⁺液体培养基中扩大培养后，送至北京三博远志公司进行测序，测序结果与GenBank中公布的BNBD4的CDS区域核苷酸序列完全一致，如图2所示，说明mBNBD4基因序列成功***质粒内，重组质粒pPIC9K-mBNBD4已经构建成功，如图3所示。

实施例3毕赤酵母基因工程菌株的制备

1、重组质粒的制备和线性化

挑选转化入重组质粒pPIC9K-mBNBD4的TOP10阳性菌接种于100mL的LB/Amp⁺液体培养基中，37℃培养12-14h，将菌液于4℃，5000rpm离心30min，收集沉淀的菌体，然后用无内毒素质粒DNA抽提试剂盒提取质粒，同时提取了空质粒pPIC9K的质粒DNA用作空白对照。用内切酶Sac Ⅰ将提取的重组质粒pPIC9K-mBNBD4和空质粒pPIC9K线性化。为了便于电转化，将线性化的重组质粒pPIC9K-mBNBD4和空质粒pPIC9K经酚/氯仿抽提纯化，加入无水乙醇(-20℃预冷)沉淀DNA，将沉淀物自然干燥后，加入高压灭菌ddH₂O溶解沉淀。

2、毕赤酵母电转化感受态细胞的制备

接种纯化后的毕赤酵母宿主菌GS115单菌落至5mL的YPD(含有酵母提取物，10g/L；蛋白胨，20g/L；10×葡萄糖，100mL/L)液体培养基中，28℃，250rpm条件下过夜培养。然后取0.1mL的过夜培养物，接种于100mL新鲜配制的YPD液体培养基(250mL锥形瓶)中，28℃，250rpm条件下过夜培养，使OD600nm值达到1.3-1.5。取该培养液分装入两个无菌的50mL离心管中于4℃，1500g条件下离心5min，弃上清液，扣干离心管壁；依次加入25mL、15mL冰预冷的灭菌水及10mL冰预冷的1M无菌山梨醇溶液，振荡重悬菌体，4℃，1500g条件下离心5min，弃上清液，吸干管壁残余液体；再次加入5mL冰预冷的1M无菌山梨醇溶液，重悬菌体，4℃，1500g条件下离心5min，弃上清液，吸干管壁残余液体；最后将细胞重悬于1mL冰预冷的1M无菌山梨醇溶液中，振荡混匀后终体积达到约1.5mL，此时得到的即为毕赤酵母GS115感受态细胞。将制备的感受态细胞按100μL/管分装入1.5mL无菌EP管中，-70℃冰冻保存，保存时间不宜超过两周，时间过长转化效率会变低，最好现用现做。

3、毕赤酵母的电击转化

电转化前取两管100μL新鲜制备的(或者-70℃冰冻保存的)GS115感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻，分别与5-20μg线性化的质粒(重组质粒pPIC9K-mBNBD4和空质粒pPIC9K)混合，轻弹混匀，尽数吸出转移至0.2cm的电穿孔转化杯(冰上预冷)中，冰浴5-10min，保持低温状态，使用电穿孔仪(BioRad)进行点击转化，电穿孔转化条件为：电压1500V，电阻300Ω，电容25μF，脉冲时间6-7ms，一次电击；电击后，立即往电击杯中加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀后，吸出转移至1.5mL灭菌EP管中，放入28℃温箱中静置培养1h；此时取出已经在28℃温箱中烘至表面半干的MD培养基平板(含有琼脂粉，15g/L，10×YNB，100mL/L；500×生物素，2mL/L；10×葡萄糖，100mL/L)，在超净工作台内将转化液按300μL/板涂于培养基表面；将涂布好的MD平板置于29℃温箱中正面放置烘至表面半干，然后倒置培养，2天以后观察转化子的生长情况，生长出的单克隆即为含有牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)的His⁺重组转化子。

实施例4含有mBNBD4基因的毕赤酵母阳性转化子的筛选

1、G418抗性筛选(多拷贝转化子筛选)

首先配置含有不同浓度(0.5、1、1.5、2.0、3.0、4.0mg/mL)G418(遗传霉素)的YPD-G418固体培养基平板，然后进行多拷贝转化子筛选，具体步骤如下：

a：吸取1-2mL灭菌水至含有His⁺转化子的平板上(即MD平板上)；

b：用灭菌刮子重悬His⁺转化子，注意不要划破琼脂板；

c：将细胞悬液集中转移至灭菌的50mL离心管中，涡旋(5-10s)混匀细胞；

d：分光光度计测定细胞浓度(1OD＝5×10⁷细胞/mL)；

e：在每块含有不同浓度G418的YPD平板上涂布约10⁵个细胞，同时为了确定所得到的多拷贝转化子是否占平板转化子的1-10％，需要涂布不含G418的YPD平板作为对照；

f：28℃温箱培养平板，每天检查转化子生长情况。其中G418抗性克隆生长较慢，一般5天左右出现，而不含G418的YPD平板上2天就会有克隆出现。在G418抗性YPD平板上生长的单克隆即为His⁺多拷贝转化子，且G418浓度越高，拷贝数也越多。(注意：如果此步骤中重悬下来的His⁺转化子还有剩余，可加15％灭菌甘油，存于-70℃，可在以后继续做G418抗性筛选。)

2、Mut⁺转化子的筛选

为了确定His⁺多拷贝转化子的甲醇诱导型，需进行Mut筛选，具体操作如下：将上一步所得的His⁺多拷贝转化子(G418抗性YPD板上的单克隆)编号后用灭菌牙签挑取，放入20μL灭菌水中混匀，然后以点种方式分别接种于MM平板(含有琼脂粉，15g/L，10×YNB，100mL/L；500×生物素，2mL/L；5％甲醇，100mL/L)及MD平板(含有琼脂粉，15g/L，10×YNB，100mL/L；500×生物素，2mL/L；10×葡萄糖，100mL/L)上，此时确保先在MM平板上点，每个克隆需要换一次牙签，每块平板上点20-30个单克隆，28℃温箱中培养平板2天。两天后，计数平板，并比较单菌落在MM平板及MD平板上的生长情况，其中在MD平板上和MM平板上生长速度一致，大小也一致的单克隆即为Mut⁺转化子。

3、毕赤酵母阳性转化子(His⁺Mut⁺多拷贝转化子)的PCR鉴定

抽提含有牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)的毕赤酵母阳性转化子的基因组，并以其为模板，加入TransStart FastPfuDNA聚合酶、真核表达载体pPIC9K的通用引物5’AOX1和3’AOX1、以及5′AOX1和牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)基因的下游引物、2.5mM dNTPs进行扩增反应，PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu buffer(10μL)，2.5mM dNTPs(5μL)，浓度为10μM的真核表达载体pPIC9K的通用引物5’AOX1和3’AOX1、牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)基因下游引物(各1μL)，模板为毕赤酵母阳性转化子的基因组DNA(2μL)，高压灭菌ddH₂O(30μL)，TransStart FastPfu DNA聚合酶(1μL)，PCR反应条件依次为：95℃，1min；95℃，20sec，62℃，20sec，72℃，30sec，35cycles；72℃，5min。加入真核表达载体pPIC9K的通用引物扩增出的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，可见两条条带(500bp，2Kbp)，且含有重组质粒pPIC9K-mBNBD4的酵母基因组扩增条带大于含有空质粒pPIC9K的酵母基因组扩增条带(图4)，说明***重组质粒的完整性良好，且重组质粒pPIC9K-mBNBD4已完全导入酵母基因组。加入真核表达载体pPIC9K通用引物的上游引物和牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)基因的下游引物扩增出的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，结果发现***真核表达载体pPIC9K的酵母基因组并未扩增出条带，而***重组质粒pPIC9K-mBNBD4的酵母基因组却可见一条特异性条带，且大小与预期一致(图5)，说明筛选出的酵母菌株即为毕赤酵母阳性转化子(His⁺Mut⁺多拷贝转化子)菌株。

实施例5含有mBNBD4基因的毕赤酵母阳性转化子的体外诱导表达

1.阳性酵母转化子的体外诱导表达

挑取PCR鉴定后证实已***目的片段的His⁺Mut⁺酵母转化子接种至5mL的YPD液体培养基中，28℃培养16-18h，离心弃上清，重悬菌体接种至25mL BMGY诱导表达前培养基中，BMGY中包含酵母提取物(10g/L)、蛋白胨(20g/L)、K₂HPO₄(3g/L)、KH₂PO₄(11.8g/L)、超纯水(800mL/L)、10×YNB(100mL/L)、500×B(0.02％生物素)(1mL/L)、10％甘油(100mL/L)，28℃培养18-24h，至OD600nm达到2-6时离心弃上清，重悬菌体接种至200mL的BMGY诱导表达培养基中，BMMY中包含酵母提取物(10g/L)、蛋白胨(20g/L)、K₂HPO₄(3g/L)、KH₂PO₄(11.8g/L)、超纯水(800mL/L)、10×YNB(100mL/L)、500×B(0.02％生物素)(1mL/L)、5％甲醇(100mL/L)，28℃连续培养72h，培养过程中，每隔24h需补充甲醇使其终浓度为1％，培养72h后收集表达培养液，离心取上清，进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析。同时进行空载体pPIC9K阳性酵母转化子的诱导表达，离心收集表达上清做为空白对照。结果显示，与空载体对照相比，含有目的片段的酵母表达上清在7kD处有一特异性条带，说明有目的蛋白表达，如图6所示。

2、重组蛋白的纯化及鉴定

重组蛋白通过镍柱(GE)进行纯化，经过双蒸水透析除盐后，真空冷冻干燥浓缩，PBS溶解后进行Western Blotting鉴定，结果发现只有一条单一条带，如图7所示，说明重组蛋白得到表达，即牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽蛋白。

实施例6初步抑菌活性试验

研究重组牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，同时以GS115上清液，空质粒诱导表达上清液作为对照，结果发现0.5μg/mL、1μg/mL和2μg/mL的重组牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)体外诱导表达发酵液对大肠杆菌和葡萄球菌均有较强的抑菌作用，且有剂量依赖性，如图8所示。而对照组则并未观察到抑菌圈，说明抑菌活性主要归功于重组蛋白mBNBD4。

抗分枝杆菌试验(CFU)研究重组牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)对耻垢分支杆菌和牛分枝杆菌的抗菌活性，同时以不加蛋白孔作为对照，分别用不同浓度的重组牛嗜中性粒细胞β-防御素4成熟肽(mBNBD4)与耻垢分支杆菌和牛分枝杆菌共培养，培养3h、6h、9h、12h后涂板检测耻垢分支杆菌的存活情况；培养3h、24h、48h、72h后涂板检测牛分支杆菌的存活情况。结果发现纯化后的重组蛋白mBNBD4对耻垢分支杆菌(图9)和牛分枝杆菌(图10)均有杀菌作用，且有剂量依赖性和时间依赖性。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种真核表达载体，其特征在于，由含有牛β-防御素4成熟肽基因与真核表达载体pPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD4，所述牛β-防御素4成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种重组菌株，其特征在于，由权利要求1所述的真核表达载体pPIC9K-mBNBD4转化毕赤酵母GS115构建制成的重组菌株。

3.根据权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，保藏编号为CGMCC No.8938。

4.一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)牛β-防御素4成熟肽基因的制备：根据GenBank上公布的BNBD4的CDS区域核苷酸序列人工合成mBNBD4基因，并设计PCR引物，

mBNBD4的上游引物：

5′-GCCGAATTCCAAAGAGTAAGAAATCCTC-3′；

mBNBD4的下游引物：

5′-GCCGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGCCTCCTGCAGCATGGT-3′。

2)权利要求1所述的真核表达载体的构建：双酶切mBNBD4基因和真核表达载体pPIC9K，胶回收mBNBD4基因片段和开环的真核表达载体pPIC9K，16℃连接处理16h，将连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，即完成重组质粒pPIC9K-mBNBD4的构建；

3)权利要求3所述重组菌株的制备：将重组质粒pPIC9K-mBNBD4转化到感受态GS115中，筛选阳性转化子，所得阳性克隆即为能够表达mBNBD4的毕赤酵母阳性转化子菌株；

4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述筛选依次为His⁺多拷贝转化子的筛选和Mut⁺转化子的筛选。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)包括以下步骤：

a、挑取PCR鉴定后证实已***目的片段的His⁺、Mut⁺酵母转化子接种至YPD液体培养基中，28℃培养16-18h，离心弃上清；

b、重悬菌体接种至诱导表达前培养基BMGY中，28℃培养18-24h，至OD600nm达到2-6时离心弃上清；

c、重悬菌体接种至诱导表达培养基BMMY中，28℃连续培养72h，培养72h后收集表达培养液，离心取上清，进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析，结果显示，与空载体对照相比，含有目的片段的酵母表达上清在7kD处有一特异性条带，说明有目的蛋白表达。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，诱导表达前培养基BMGY的配方为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、K₂HPO₄ 3g/L、KH₂PO₄ 11.8g/L、超纯水800mL/L、10×YNB100mL/L、0.02％生物素的500×B1mL/L、10％甘油100mL/L。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，诱导表达培养基BMMY的配方为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、K₂HPO₄3g/L、KH₂PO₄ 11.8g/L、超纯水800mL/L、10×YNB100mL/L、0.02％生物素的500×B1mL/L、5％甲醇100mL/L。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c中，培养过程中每隔24h补充甲醇使其终浓度为1％。

10.一种由权利要求4-9所述制备方法制得的牛β-防御素4成熟肽在抗微生物感染中的应用。