CN103993031A - 制备高分子量透明质酸的方法及工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备高分子量透明质酸的方法及工程菌，通过敲除兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)ATCC39920基因组中编码透明质酸裂解酶基因(hylb)，本发明构建了透明质酸裂解酶基因(hylb)敲除载体pSET4s::hylb::cmr。本发明将敲除hylb基因的重组菌进行发酵分析，利用特性黏度法测定HA的分子量，得到分子量为3.9×10⁶Da的HA。

Description

制备高分子量透明质酸的方法及工程菌

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及兽疫链球菌基因组中透明质酸裂解酶基因的敲除，尤其是一种制备高分子量透明质酸的方法及工程菌。

背景技术

高分子量透明质酸在化妆品和医药等领域占有重要的地位，其制备方法也是当前生物技术的难点和热点，用于制备高分子量透明质酸的方法主要为动物提取法。

动物组织提取法，透明质酸（HA）几乎存在于所有的动物组织中，能够用于生产的原料主要为人脐带、动物眼球和鸡冠。主要的工艺过程包括提取、除杂、酶解、沉淀和分离。此方法主要存在：原料来源局限性大，产品提取率极低，工艺程序复杂，生产成本居高不下，可能产生病毒种间交叉感染等缺点。

微生物发酵法，链球菌属的多种细菌都有以HA为主要成分的荚膜，在生长繁殖过程中，向胞外分泌以HA为主要成分的荚膜，经分离纯化即可得高纯度HA产品。与动物组织提取法相比，微生物发酵法具有成本低，生产规模不受动物原料限制，发酵液中HA以游离状态存在，易于分离纯化和形成规模化工业生产，无动物来源的致病菌污染等优势。随着微生物基因组内与HA相关重要酶基因的克隆,构建基因工程菌成为提高分子量的研发热点。

基因***失活是一种遗传工程技术，是基因敲除(knockout)技术的一种。针对某个序列已知但功能未知的序列，在基因内部***一段抗性基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。

透明质酸酶，在透明质酸（HA）分子酶解过程中发挥主要左右，它能够在HA分子内部随机对HA分子进行切割，生成HA小分子片段，降低HA分子间的相互作用，释放被束缚的水分子，能降解β-1,3糖苷键及β-1,4糖苷键的酶再作用于HA小分子片段。敲除透明质酸裂解酶可以有效的抑制透明质酸的酶解，从而得到高分子量的HA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备高分子量透明质酸的方法及工程菌，通过构建一种透明质酸裂解酶基因hylb敲除载体，将敲除载体转入宿主菌，通过同源重组使hylb基因失活，利用抗性筛选标记获得hylb基因功能缺失的工程菌，将工程菌发酵获得分子量为3.9×10⁶Da的透明质酸。

本发明实现目的的技术方案如下：

本发明首先以Streptococcus zooepidemicusATCC39920菌株基因组为模板克隆透明质酸裂解酶基因hylb内部1683bp基因片段，以温度敏感型质粒pSET4s(NCBI gene Bank:AB055650.1)为出发载体，***透明质酸裂解酶基因hylb内部1683bp基因片段，构建中间载体pSET4s::hylb，以pSET1(NCBI geneBank:AB042426.1)质粒为模板扩增包含cmr基因长度为1056bp的基因片段，将此片段***到中间载体pSET4s::hylb中hylb基因内部的DraIII位点，构建敲除载体pSET4s::hylb::cmr。将敲除载体pSET4s::hylb::cmr电转入Streptococcuszooepidemicus ATCC39920感受态细胞，利用同源序列DNA分子之间的重新组合，将包含cmr基因长度为1056bp的基因片段将***到hylb基因内部，使hylb基因失活，从而得到hylb基因敲除菌株。将敲除菌株在5L发酵罐中培养24h，取适量不同时间点的发酵液，处理后，利用特性黏度法测定HA的分子量，获得分子量为3.9×10⁶Da的透明质酸。

一种含有透明质酸裂解酶基因的载体，所述的载体将hylb基因内部1683bp基因片段***初始载体pSET4s中，构建了中间载体pSET4s::hylb，再将一段包含氯霉素抗性基因cmr长度为1056bp的基因片段***到hylb基因片段中的DraIII位点，形成载体pSET4s::hylb::cmr。

而且，所述hylb基因内部1683bp基因片段始于hylb基因起始密码子ATG下游202bp，结束于hylb基因终止密码子TAG上游1310bp，基因序列见序列1。

而且，所述一段包含氯霉素抗性基因cmr长度为1056bp的基因序列见序列2。

一种载体pSET4s::hylb::cmr转入宿主菌,特异性敲除透明质酸裂解酶基因hylb,获得hylb基因功能缺失的工程菌。

而且，所述工程菌的宿主菌为兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC39920。

一种制备高分子量透明质酸的方法，使用上述工程菌发酵获得。

而且，所述发酵获得透明质酸的分子量为3.9×10⁶Da。

而且，所述工程菌的发酵培养基：蔗糖50g/L，酵母提取物3.5g/L，酪蛋白胨10g/L，NaCl1.5g/L,K2HPO42g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L。

而且，所述工程菌的发酵条件：5L发酵罐，装液量3L，接种量8%，37℃，pH7.0，通气量3vvm，发酵20-30小时。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明从基因敲除的角度出发，准确定位，直接敲除与透明质酸分子量相关的透明质酸裂解酶基因获得产分子量为3.9×10⁶Da透明质酸的工程菌。

2、本发明只敲除透明质酸裂解酶基因，不影响其他基因的功能。

附图说明

图1为本发明敲除载体pSET4s::hylb::cmr质粒构建图谱。

图2为本发明本发明hylb基因敲除菌株筛选的同源重组原理图。

图3为本发明把敲除载体pSET4s::hylb::cmr电转入Streptococcuszooepidemicus ATCC39920菌株的转化子筛选图。

图4为hylb基因敲除菌株PCR验证图，M：DNAmarker；1：Streptococcuszooepidemicus ATCC39920；2～3：hylb基因敲除菌株。

图5为hylb基因敲除菌株在不同时间点发酵合成HA的分子量测定图。

具体实施方式

下面结合实施例，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一种含有透明质酸裂解酶基因的载体，所述的载体将hylb基因内部1683bp基因片段（此片段起始于hylb基因起始密码子ATG下游202bp，结束于hylb基因终止密码子TAG上游1310bp）***初始载体pSET4s(NCBI geneBank:AB055650.1)中，构建了中间载体pSET4s::hylb，再将一段包含氯霉素抗性基因cmr长度为1056bp的基因片段***到hylb基因片段中的DraIII位点，形成载体pSET4s::hylb::cmr。

本发明的内容包括：以温度敏感型质粒pSET4s为出发载体，***目的基因hylb基因内部1683bp基因片段、包含cmr基因长度为1056bp的基因片段构建的敲除质粒pSET4s::hylb::cmr，产高分子量透明质酸的hylb基因敲除菌株，所述hylb基因敲除菌株的构建方法。

本发明所述的hylb基因内部1683bp基因序列来源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus），菌株保藏编号为ATCC39920，其核苷酸序列如序列1所示。一段包含氯霉素抗性基因cmr长度为1056bp的基因序列来源于质粒pSET1(NCBI gene Bank:AB042426.1)，其核苷酸序列如序列2所示。所述的敲除质粒分别将hylb基因内部1683bp基因片段***初始载体pSET4s中，构建了中间载体pSET4s::hylb，再将一段包含氯霉素抗性基因cmr长度为1056bp的基因序列***到hylb基因片段中的DraIII位点，构建成最终的敲除载体pSET4s::hylb::cmr，并将它导入兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC39920中，获得含有敲除载体pSET4s::hylb::cmr的Streptococcus zooepidemicus ATCC39920菌株Streptococcus zooepidemicus/pSET4s::hylb::cmr。上述菌株经基因重组后，得到hylb基因敲除菌株。该敲除菌株在5L发酵罐培养后获得分子量为3.9×10⁶Da的透明质酸。

hylb基因敲除菌株发酵产HA分子量最高为3.9×10⁶Da，其发酵合成透明质酸的方法是：将菌株接种到TSB液体培养基中，经发酵培养，收集发酵液，经分离纯化得到分子量为3.9×10⁶Da的透明质酸；所述的培养温度为37℃；培养时间24h，PH值为7.0。

具体的pSET4s::hylb::cmr的构建过程如下：

一、透明质酸裂解酶基因敲除载体的构建

以兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus ATCC39920）的基因组为模板，在hylb基因起始密码子ATG下游202bp处设计引物hylb-F，在hylb基因终止密码子TAG上游1310bp处设计引物hylb-R，引物序列如表1所示，进行PCR扩增hylb基因内部1683bp基因片段。

PCR反应体系为：2×PCR Buffer（含Mg²⁺）25μl，dNTP（25mM）5μl，上游引物hylb-F和下游引物hylb-R（10μM）各1μl，模板(兽疫链球菌全基因组DNA)1μl，KOD FxDNA聚合酶（TOYOBO，KFX-101)0.5μl，加无菌水至终体积为50μl。

PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸2.5min，反应35个循环，68℃后延伸10min。

PCR结束后获得完整的目的片段核苷酸序列，其序列见序列1。

表1所用引物序列

将已获得的DNA片段用PstI和BamHI进行双酶切，回收后与经同样内切酶处理过的质粒片段pSET4s进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有壮观霉素抗性（50μg/ml）的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，获得载体pSET4s::hylb。

以pSET1(NCBI gene Bank:AB042426.1)质粒为模板，在氯霉素抗性基因终止密码子TAA下游189bp处设计引物cmr-R,在氯霉素抗性基因起始密码子ATG上游216bp处设计引物cmr-F，进行PCR扩增一段包含cmr基因长度为1056bp的基因片段。

PCR反应体系为：2×PCRBuffer（含Mg²⁺）25μl，dNTP（25mM）5μl，上游引物cmr-F和下游引物cmr-R（10μM）各1μl，模板（质粒pSET1)0.1μl，KODFx DNA聚合酶0.5μl，加无菌水至终体积为50μl。

PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸1min，反应35个循环，68℃后延伸10min。

PCR结束后获得完整的目的片段核苷酸序列，其序列见序列2

表2所用引物序列

将已获得的包含cmr基因的基因片段用DraIII进行单酶切，回收后与经同样内切酶处理过的质粒片段pSET4s::hylb进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有氯霉素抗性（20μg/ml）的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，获得敲除载体pSET4s::hylb::cmr。

LB培养基：

胰蛋白胨：10.0g，酵母浸出物：5.0g，NaCl：10.0g，去离子水溶解后，定容至1.0L，pH调至7.0-7.2，固体培养基加1.5%的琼脂粉。121℃灭菌20min。

二、敲除菌株的构建

2.1兽疫链球菌感受态细胞的制备

（1）从-80℃保藏的兽疫链球菌甘油管中吸取50uL菌液接入5mL THY的液体培养基中37℃200rpm条件下活化24h，稀释10⁵-10⁶倍。涂布在THY的平板上，37℃培养24h。

（2）挑取上述培养24h的单菌落接入THY液体培养基的中，37℃200rpm条件下培养12h。

（3）将上述培养12h的菌液按1%的接种量接种到新鲜的100mL的THY的液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养至OD530值约为0.37，加入的透明质酸酶（上海生工生物工程有限公司，37326-33-3）12.5ku，继续培养30min，培养结束时OD530值约为0.58。

（4）培养结束后，将菌液冰浴10min。

（5）用50ml无菌离心管将上述预冷的菌液12000rpm4℃离心10min。

（6）待离心后去除上清，加入冰浴的0.5M的蔗糖溶溶液液20ml重悬菌体。

（7）将重悬液12000rpm4℃离心10min。

（8）待离心后弃去上清，用5ml冰冷的0.5M蔗糖溶液重悬菌体。

（9）将重悬液12000rpm4℃度离心10min。

（10）待离心后弃去上清，加入500μL含15%的甘油的0.5M的蔗糖溶液重悬菌体后，每管50μL重悬液分装到1.5mL无菌EP管中，立即电转或者放入-80℃冰箱中冻存。

2.2兽疫链球菌感受态细胞的电转化

（1）取4ul敲除质粒pSET4s::hylb::cmr，加入到50ul上述制备的兽疫链球菌感受态细胞中，充分混匀。

（2）将上述含敲除质粒的感受态细胞转移到2mm预冷的电转杯中，按如下电转仪参数进行电转化：

（3）电击后立即在电转杯中加入1mL预冷的复苏液THY培养基，充分混匀后，将其转移到无菌EP管中。

（4）待其于30℃复苏3h后8000rpm离心3min收集菌体。

（5）将菌体涂布于在相应抗性平板上，30℃培养48-76h，待长出转化子，将转化子点接进行单双抗二次验证。

（6）将验证正确的克隆接种到含氯霉素（20μg/mL）的THY液体培养基中，在37℃200rpm条件下培养12h，将其再次划线接种到含氯霉素（20μg/mL）和壮观霉素（100μg/mL）的平板上，验证对壮观霉素的敏感性。

THY培养基：

牛肉浸粉：10.0g，胰蛋白胨：20.0g，葡萄糖：2.0g，酵母浸出物：2.0g，NaHCO₃：2.0g，NaCl：2.0g，Na2HPO4：0.4g，去离子水溶解后，定容至1.0L，pH调至6.8，固体培养基加1.5%的琼脂粉，121℃灭菌20min。

2.3hylb基因敲除菌株筛选

（1）挑取验证正确的转化子，接种到含有壮观霉素（100μg/mL）和氯霉素（20μg/mL）的THY液体培养基内，30℃培养12h。

（2）将上述培养12h的菌液按1%的接种量接种至不含抗性的THY培养基中，30℃培养12h。

（3）将上述培养12h的菌液按1%的接种量接种至不含抗性的THY培养基中，37℃培养6～8h。

（4）将上述培养液按十倍稀释法稀释10⁵-10⁶倍，涂布在含有氯霉素（20μg/mL）的THY平板上，37℃培养24h。

（5）挑取上一步中获得的单克隆分别点接到单抗THY平板（含氯霉素）和双抗THY平板（含壮观霉素和氯霉素）上，37℃培养24h。

（6）重复（3）-（5）步骤，直至挑选出hylb基因敲除菌株，即在单抗平板上生长而双抗平板上不生长的菌株。

2.4hylb基因敲除菌株的验证

2.4.1hylb基因敲除菌株的PCR验证

提取上述重组菌的基因组，利用表3中的验证引物p1（位于左臂引物hylb-F上游275bp）、p2(位于右臂引物hylb-R下游250bp）进行PCR验证，如成功发生双交换，氯霉素抗性基因会***到目的基因内部，这样就能扩增出3273bp的片段，如未发生双交换，则能扩增出2208bp的片段，如图3所示。

PCR反应体系为：10×PCR Buffer2μl，dNTP（10mM）0.4μl，引物P1、P2（10μM）各0.4μl，模板1μl，Taq DNA聚合酶（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，PER001-1)0.4μl，加无菌水至终体积为20μl。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min30s，反应35个循环，72℃后延伸10min。

表3所用引物序列

三、hylb基因敲除菌株的代谢产物分析

hylb基因敲除菌株在5L发酵罐中进行发酵。所用发酵培养基：蔗糖50g/L，酵母提取物3.5g/L，酪蛋白胨10g/L，NaCl1.5g/L,K₂HPO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O0.4g/L。发酵条件：5L发酵罐，装液量3L，接种量8%，37℃，pH7.0，通气量3vvm，发酵24h，用5MNaOH调节pH。每4h取样一次。

HA分子量的检测：取适量不同时间点的发酵液，加入等体积的0.1%SDS处理10min，将处理液12000r/min离心15min，取上清用3倍体积的无水乙醇室温沉淀30min。12000r/min离心10min，弃上清，将沉淀用乙醇盐溶液洗涤一次，室温条件下充分干燥，然后用适量0.2MNaCl溶液充分溶解，用0.45μm的滤膜过滤，过滤后，用乌氏粘度计测出其特性粘度，用改良咔唑法测出HA含量，根据下述公式计算出HA的分子量，注意事项如下：

（1）0.2M氯化钠溶液流出乌氏粘度计的时间t₀应不小于1.67mim。

（2）不同时间点的样品流出乌氏粘度计的时间t₁应介于t₀的1.3-1.5倍之间。

（3）测定出不同时间点的样品的HA含量c。

（4）根据如下公式算出特性粘度η，根据特性粘度计算出分子量Mη：

$\left[\mathrm{\η}\right]=\frac{1}{c}\×\sqrt{2[(\frac{t_1}{t_0}-1)-\ln \frac{t_1}{t_0}]}$

$\mathrm{M\η}=0.78\sqrt{\frac{\left[\mathrm{\η}\right]}{3.6\×{10}^{-4}}}$

。

Claims (9)

1.一种含有透明质酸裂解酶基因的载体，其特征在于：所述的载体将hylb基因内部1683bp基因片段***初始载体pSET4s中，构建了中间载体pSET4s::hylb，再将一段包含氯霉素抗性基因cmr长度为1056bp的基因片段***到hylb基因片段中的DraIII位点，形成载体pSET4s::hylb::cmr。

2.根据权利要求1所述的含有透明质酸裂解酶基因的载体，其特征在于：所述hylb基因内部1683bp基因片段始于hylb基因起始密码子ATG下游202bp，结束于hylb基因终止密码子TAG上游1310bp，基因序列见序列1。

3.根据权利要求1所述的含有透明质酸裂解酶基因的载体，其特征在于：所述一段包含氯霉素抗性基因cmr长度为1056bp的基因序列见序列2。

4.一种将权利1要求所述载体pSET4s::hylb::cmr转入宿主菌,特异性敲除透明质酸裂解酶基因hylb,获得hylb基因功能缺失的工程菌。

5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌的宿主菌为兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC39920。

6.一种制备高分子量透明质酸的方法，其特征在于：使用权利要求4或5所述的工程菌发酵获得。

7.根据权利要求6所述的制备高分子量透明质酸的方法，其特征在于：所述发酵获得透明质酸的分子量为3.9×10⁶Da。

8.根据权利要求6所述的制备高分子量透明质酸的方法，其特征在于：所述工程菌的发酵培养基：蔗糖50g/L，酵母提取物3.5g/L，酪蛋白胨10g/L，NaCl1.5g/L,K2HPO42g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L。

9.根据权利要求6、7、8之一所述的制备高分子量透明质酸的方法，其特征在于：所述工程菌的发酵条件：5L发酵罐，装液量3L，接种量8%，37℃，pH7.0，通气量3vvm，发酵20-30小时。