CN104152515A - 一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基及发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基及发酵方法，属于发酵工程技术领域；该方法包括重组菌种子液培养；种子液接种入发酵培养基中；发酵期间补加补料培养基；发酵结束得到发酵液；发酵培养基和补料培养基中均含有诱导剂乳糖；发酵培养基的组成为(g/L)：胰蛋白胨15-20、酵母提取物10-20、氯化钠10-20、乳糖1-5和水；补料培养基的组成为(g/L)：胰蛋白胨50-100、酵母提取物25-50、甘油300-500、乳糖2-6和水。本发明简化了工艺，成本低，安全无毒，提高了菌体得率和蛋白表达量，有利于实现工业化生产。

Description

一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基及发酵方法

技术领域

本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基以及发酵方法。

背景技术

人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte colony-stimulating factors,hG-CSF)是一种特异的作用于粒系祖细胞，促进其向成熟中性粒细胞增殖、分化并维持其功能、存活所必须的糖蛋白造血生长因子。1986年，由Nagata等从人鳞状细胞癌细胞系CHU-II中分离了hG-CSF基因，首次确定了其核苷酸序列并在COS细胞中表达(Nagata S et al，Nature，1986，319：415-418)。人类有两种不同的G-CSF cDNA，分别编码含207和204个氨基酸的前体蛋白，均有30个氨基酸的信号肽，成熟蛋白分子为177和174个氨基酸，前者除了在成熟分子N端35位处插了3个氨基酸外，其余的序列与174氨基酸分子相同。人G-CSF分子量为19.6kD，PI为6.1，O-糖基化，对酸碱(pH2～10)、热以及变性剂等相对较稳定。hG-CSF有5个半胱氨酸残基，其中4个半胱氨酸残基在Cys36与Cys42，Cys74与Cys64之间形成两对二硫键；Cys17为不配对半胱氨酸，二硫键的形成对于维持G-CSF生物学功能非常重要。

G-CSF在临床应用上具有重要意义，骨髓移植时可促进中性白细胞的恢复；改善再生障碍性贫血伴随的中性白细胞缺乏症；明显改善癌症化疗时引起的严重的中性粒细胞缺乏，加大肿瘤治疗的力度，增强治疗效果；广泛应用于其他伴有中性粒细胞减少的疾病及抗感染等的治疗。G-CSF天然产物来源非常有限，远远不能满足临床上的需要，而基因工程的重组G-CSF的生物学活性与天然的相似，且可大规模生产G-CSF。

1985年，Welte K从人膀胱癌细胞株5637的培养上清液中成功纯化并精制出hG-CSF，之后Welte K与Souza L M又进一步确定这种hG-CSF的N段氨基酸排列顺序，将来源于5637细胞株的hG-CSF基因克隆化，采用基因工程技术将该基因***大肠杆菌成功制得hG-CSF，从而开发出重组人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF，商品名为Filgratin(惠尔血)。该药于1991年获美国FDA批准上市。1993年，瞿成奎等人在国内首先克隆了人G-CSF cDNA，并在大肠杆菌中获得表达。此后，许多研发人员也致力于这方面的研究，由于G-CSF在原核生物中具有表达量低、生物学活性不如天然产物的缺点，不断优化发酵工艺，提高产品质量，降低生产成本显得十分重要。

目前对重组粒细胞集落刺激因子发酵生产工艺的研究主要集中在工程菌株、高密度发酵培养以及包涵体复性、纯化等方面。诱导表达是目前在大肠杆菌中克隆表达重组蛋白最常用和有效的策略。诱导的方式主要有三种：IPTG(异丙基-β-D-巯基半乳糖苷)、热诱导和乳糖诱导。重组粒细胞集落刺激因子发酵工艺目前主要采用IPTG诱导或者热诱导(如，42℃)。IPTG是一种非常高效的乳糖启动子诱导剂，IPTG诱导条件简单，效果持久稳定，但IPTG具有潜在的毒性，各国药典均不提倡使用，而且价格昂贵，因而不适宜在发酵罐中进行基因工程产品的规模化生产。此外，热诱导容易导致包涵体复性困难，复性率降低。乳糖是一种二糖，没有毒性，天然具有诱导乳糖操纵子的作用，且价廉易得，因而可能成为替代IPTG的诱导剂，对于各种利用原核表达***进行重组蛋白的大规模生产，具有十分重要的现实意义和应用价值。但由于乳糖在作诱导剂的同时，也可以被细胞作为碳源代谢利用，其浓度是动态变化的，而且转运及转化涉及多个酶的参与，诱导机制比IPTG更为复杂，诱导条件不易掌握，需要对菌体生长及诱导条件进行更为精细的研究及优化才能稳定高效诱导重组菌体发酵表达hG-CSF。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的高效表达培养基，它包含乳糖作为诱导剂和碳源，通过对培养基中碳源、氮源、诱导剂及其它营养成分种类及含量、各培养基的配比的研究突破，解决了现有技术中乳糖作为碳源和诱导剂的工艺复杂、重组蛋白表达量低的难题；本发明的另一个目的在于提供一种采用上述高效表达培养基制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，所述发酵方法将诱导剂包含在培养基中，省去了IPTG诱导和热诱导常用步骤，精简了工艺，此外，乳糖无毒性，且价格低廉，适于重组医用蛋白的大规模工业生产，有极其重要的价值。

本发明的技术方案为：一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基，包括种子培养基、发酵培养基和补料培养基，所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨15～20g/L，酵母提取物10～20g/L，氯化钠10～20g/L，乳糖1～5g/L，余量为水；所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨50～100g/L、酵母提取物25～50g/L，甘油300～500g/L，乳糖2～6g/L，余量为水；所述补料培养基按体积计算为所述发酵培养基体积的20％～30％。

进一步地，所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨18～20g/L，酵母提取物10～20g/L，氯化钠10～20g/L，乳糖1～5g/L，余量为水；所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨70～100g/L、酵母提取物40～50g/L，甘油360～500g/L，乳糖2～6g/L，余量为水。

优选地，所述种子培养基的成分及其含量为胰蛋白胨15～25g/L，优选20～25g/L，酵母粉7～14g/L，优选10～14g/L，氯化钠6～15g/L，优选10～15g/L，余量为水，pH值调节为7.0～7.2；所述种子培养基按体积计算为所述发酵培养基体积的1％～3％。

本发明还提供了利用上述的培养基制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，其具体步骤如下：

①.将已转化利用pET-9a载体和人G-CSF基因构建得到的重组载体质粒的宿主菌接种于种子培养基培养至OD₆₀₀为0.8～1.2，得到发酵种子液，所述人G-CSF基因序列如SEQ IDNo.1所示；

②.将发酵种子液按发酵培养基体积的1％～3％的比例接种到灭菌的发酵培养基中，培养3～6小时；

③.按发酵培养基体积的20％～30％的比例向发酵体系中补加灭菌的补料培养基继续发酵，18～22小时后结束发酵得到重组菌发酵液，所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨15～20g/L，酵母提取物10～20g/L，氯化钠10～20g/L，乳糖1～5g/L，余量为水；所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨50～100g/L、酵母提取物25～50g/L，甘油300～500g/L，乳糖2～6g/L，余量为水。

进一步地，所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨18～20g/L，酵母提取物10～20g/L，氯化钠10～20g/L，乳糖1～5g/L，余量为水；所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨70～100g/L、酵母提取物40～50g/L，甘油360～500g/L，乳糖2～6g/L，余量为水。

优选地，所述已转化重组载体质粒的宿主菌接种于种子培养基培养得到发酵种子液为从甘油管菌种挑取已转化重组载体质粒的宿主菌并接种到含有种子培养基的培养瓶中，接种量为0.1％，在35～39℃、160～180rpm的条件下培养8～10小时，即为发酵种子液。

优选地，所述种子培养基的成分及其含量为胰蛋白胨15～25g/L，优选20～25g/L，酵母粉7～14g/L，优选10～14g/L，氯化钠6～15g/L，优选10～15g/L，余量为水，pH值调节为7.0～7.2。

温度是工程菌发酵生长的重要因素，它会影响菌体的生长速率、生化反应速率、酶系的活性与基质的吸收利用等。pH对于细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响。用于控制pH值的常用酸和碱有HCl、H₃PO₄、H₂SO₄、NaOH、KOH、NH₃·H₂O等。摇床转速也是控制工程菌发酵生长的重要因素。在发酵生长的过程中，需要根据工程菌的生长和代谢情况，对摇床转速进行调整，以使重组蛋白表达量达最佳。

优选地，在发酵过程中，所述发酵的培养温度为35～39℃，通过反应器自动流加酸和碱溶液控制发酵体系pH在6.0～7.5；发酵0至8小时，发酵罐转速为300～400rpm，8小时后，转速调整为200～400rpm；在发酵种子液接种到发酵培养基后调节好转速、空气流量及罐压以校正溶氧初始值为100％，发酵过程中不再控制溶氧值。

进一步地，所述控制发酵体系pH所使用的酸和碱溶液为盐酸和氢氧化钠溶液，优选25％盐酸和16％氢氧化钠溶液。

基因工程菌的培养方式有：分批培养、补料分批培养、连续培养、透析培养和固定化培养等。分批培养和补料分批培养是最常用的培养方法之一。分批培养是将所有营养物质一次性加入到发酵罐中，发酵结束后产物一次性地得到。补料分批培养是将种子接入发酵罐中进行培养，经过一段时间后，分批或连续的补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。补料分批培养方法又叫流加培养，它是以分批培养为基础，补加碳源、氮源、无机盐等，以解决碳源、氮源的抑制，消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可弥补低浓度底物不利于细胞生长的缺陷，从而有效的控制了菌体的生长过程，延长了菌体的对数生长期，提高了细胞密度。常用的补料策略有：恒速、逐步增加和指数性加料等方法。

优选地，所述灭菌的补料培养基以流加的方式补加到所述发酵体系中，补料时间为10小时，补料速率设定为补料体积除以补料时间所得数值。在本发明的一个优选实施例中，补料总体积为2L，补料速率为2L/10h＝200mL/h。在本发明的另一个优选实施例中，补料总体积为5L，补料速率为5L/10h＝500mL/h。

优选地，所述的宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。

如本领域技术人员所熟知，以上所涉及的种子培养基、发酵培养基和补料培养基在使用前都经过115～121℃灭菌15～20min。

本发明的优点在于：

(1)成功运用乳糖在高密度发酵中替代IPTG诱导基于乳糖操纵子机理构建的表达***稳定高效表达重组人粒细胞集落刺激因子；

(2)在本发明方法中，作为诱导剂的乳糖包含在培养基中，在整个发酵过程中进行培养和诱导，不像热诱导或者IPTG诱导需要额外步骤，精简了工艺，且菌体生长快，可重复性好，大幅缩短发酵周期。此外，无IPTG存在，后处理也简单。

(3)与IPTG相比，乳糖价格低廉得多，且乳糖没有毒性，其在产品中的少量残留对人体影响极小。本发明方法有利于建立重组粒细胞集落刺激因子低成本、安全无毒的制备工艺。

(4)本发明对重组粒细胞集落刺激因子工程菌发酵工艺进行了深入研究和优化，通过本发明所述的技术方案，大肠杆菌BL21(DE3)菌体得率高，菌体湿重达20～40g/L，目的蛋白表达量高，hG-CSF占菌体总蛋白的水平可达40～70％，与IPTG诱导水平相当。

附图说明

图1为实施例一制备的pET-9a-G-CSF的质粒图谱；

图2为工程菌在10L发酵罐中的生长曲线图；

图3为工程菌在50L发酵罐中的生长曲线图。

具体实施方式

本发明提供一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基及利用所述培养基制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，下面列举实施例予以进一步说明。

实施例一

1.pET-9a-G-CSF原核表达菌株的构建

人G-CSF基因序列如SEQ ID No.1所示。按照常规分子克隆方法合成序列如SEQ ID No.1所示的人G-CSF基因并引入终止子TAA及目的基因两端NdeI和BamHI酶切位点；用NdeI和BamHI对原核表达质粒载体pET-9a和人G-CSF基因片段分别双酶切，将双酶切后的pET-9a和人G-CSF基因片段连接，得到pET-9a-G-CSF重组质粒(图1)后转化入E.coli DH5α菌株中。以上工作均由南京金斯瑞完成。

将含有pET-9a-G-CSF重组质粒的E.coli DH5α菌株以1％的接种量接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃下摇床(180rpm)培养过夜，使用质粒无内毒素中提试剂盒(购自Biomega公司)提取纯化质粒，纯化后的质粒按照《分子克隆》中的转化方法导入E.coli BL21(DE3)(购自Invitrogen公司)，再使用含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板筛选阳性克隆。选择10个阳性克隆单菌落，标记后分别接种于SuperBroth培养基(含有50μg/mL卡那霉素，4.1％SuperBroth，1g/L乳糖)中，在37℃下摇床(180rpm)培养20～24小时。取500μl菌液于3500rpm离心弃上清后收集菌泥，用1mL PBS重悬菌泥，取重悬后的菌悬液15μl，加入15μl2×上样缓冲液(Loading Buffer)，置沸水浴5min，于10000rpm离心5min，取上清15μl进行SDS-PAGE整菌电泳，电泳条件为：4.5％浓缩胶100v电泳10min，15％分离胶120v电泳至溴酚蓝到凝胶底部，停止电泳。结束后，用考马斯亮蓝染色30min，再脱色3h，上BIO-RAD凝胶成像***检测G-CSF表达量。选择表达量最大为40％的菌种进行PCR及测序鉴定，并将其命名为E.coliBL21(DE3)-pET-9a-G-CSF。

2.保种

将筛选鉴定后的E.coliBL21(DE3)-pET-9a-G-CSF单菌落接种于SuperBroth培养基(含有50μg/mL卡那霉素，4.1％SuperBroth)中，在37℃下摇床(180rpm)培养6～8小时，待OD₆₀₀达到1，停止培养，加入灭菌甘油，使甘油浓度达到15％，分装于灭菌冻存管中，-80℃保藏备用。

实施例二(以10L发酵罐为例)

1.种子的培养：在500mL三角瓶中装有种子培养基210mL，121℃湿热灭菌15min，冷却到室温。取实施例一制备的E.coliBL21(DE3)-pET-9a-G-CSF甘油管菌种，接种于种子培养基中，接种量为0.1％，在温度35℃、转速为160rpm的摇床中振荡培养8小时，测定OD₆₀₀为0.8，得到发酵种子培养液。其中种子培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨15g/L，酵母粉7g/L，氯化钠6g/L，用去离子水配制而成，灭菌后将其pH调节为7.0。经检查，本次培养的菌种未见染菌、菌体形态较好。

2.接种前准备：首先将发酵罐清洗干净，将发酵培养基溶于纯化水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，121℃蒸汽湿热离线灭菌20min，冷却至35℃备用。其中发酵培养基的组成为：胰蛋白胨15g/L，酵母提取物14g/L，NaCl15g/L，乳糖3g/L。

将补料培养基溶于纯化水中，搅拌均匀，121℃蒸汽湿热离线灭菌20min，冷却后备用。其中补料培养基的组成为：胰蛋白胨50g/L，酵母提取物25g/L，甘油300g/L，乳糖4g/L。

3.接种：在火焰保护下，按发酵培养基体积的1％的接种量将70mL检验合格的发酵种子培养液接种于10L发酵罐中，装液量7L，培养温度35℃，搅拌转速为300rpm，开始发酵培养。溶氧初始值在发酵种子液接种到发酵培养基后通过调节转速、空气流量及罐压校正为100％，发酵过程中不再控制溶氧值。

4.发酵：发酵过程中采用以下中间控制方法：

4.1发酵至3h开始流加步骤2中配制的补料培养基，补料速率140mL/h，补料培养基体积1.4L；

4.2发酵至8h，转速由300rpm调整为200rpm；

4.3本实施例发酵过程中总补料量为1.4L；

4.4本实施例发酵过程中pH＝6.1±0.1，通过反应器自动流加16.0％NaOH溶液，25％HCl溶液调节；

4.5发酵于18h后结束，得到发酵菌液。

5.实验结果：经检测，发酵菌液OD₆₀₀达到16.1，采用管式离心机收集菌体，获得湿菌泥169g，目的蛋白G-CSF占菌体总蛋白40.2％，湿菌泥经细胞破碎后获得包涵体25.6g。

实施例三(以10L发酵罐为例)

1.种子的培养：在500mL三角瓶中装有种子培养基210mL，121℃湿热灭菌15min，冷却到室温。取实施例一制备的E.coliBL21(DE3)-pET-9a-G-CSF甘油管菌种，接种于种子培养基中，接种量为0.1％，在温度37℃、转速为180rpm的摇床中振荡培养9小时，测定OD₆₀₀为1.2，得到发酵种子培养液。其中种子培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，氯化钠10g/L，用去离子水配制而成，灭菌后将其pH调节为7.1。经检查，本次培养的菌种未见染菌、菌体形态较好。

2.接种前准备：首先将发酵罐清洗干净，将发酵培养基溶于纯化水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，121℃蒸汽湿热离线灭菌20min，冷却至37℃备用。其中发酵培养基的组成为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，NaCl10g/L，乳糖1g/L。

将补料培养基溶于纯化水中，搅拌均匀，121℃蒸汽湿热离线灭菌20min，冷却后备用。其中补料培养基的组成为：胰蛋白胨100g/L，酵母提取物50g/L，甘油360g/L，乳糖2g/L。

3.接种：在火焰保护下，按发酵培养基体积的3％的接种量将210mL检验合格的发酵种子培养液接种于10L发酵罐中，装液量7L，培养温度37℃，搅拌转速为375rpm，开始发酵培养。溶氧初始值在发酵种子液接种到发酵培养基后通过调节转速、空气流量及罐压校正为100％，发酵过程中不再控制溶氧值。

4.发酵：发酵过程中采用以下中间控制方法：

4.1发酵至5h开始流加步骤2中配制的补料培养基，补料速率200mL/h，补料培养基体积2L；

4.2发酵至8h，转速由375rpm调整为250rpm；

4.3本实施例发酵过程中总补料量为2L；

4.4本实施例发酵过程中pH＝7.0±0.1，通过反应器自动流加16.0％NaOH溶液，25％HCl溶液调节；

4.5发酵于20h后结束，得到发酵菌液。

5.实验结果：经检测，发酵菌液OD₆₀₀达到22.4，采用管式离心机收集菌体，获得湿菌泥270.2g，目的蛋白G-CSF占菌体总蛋白71％，湿菌泥经细胞破碎后获得包涵体45.6g。

实施例四(以10L发酵罐为例)

1.种子的培养：在500mL三角瓶中装有种子培养基210mL，121℃湿热灭菌15min，冷却到室温。取实施例一制备的E.coliBL21(DE3)-pET-9a-G-CSF甘油管菌种，接种于种子培养基中，接种量为0.1％，在温度39℃、转速为170rpm的摇床中振荡培养10小时，测定OD₆₀₀为1.0，得到发酵种子培养液。其中种子培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨25g/L，酵母粉14g/L，氯化钠15g/L，用去离子水配制而成，灭菌后将其pH调节为7.2。经检查，本次培养的菌种未见染菌、菌体形态较好。

2.接种前准备：首先将发酵罐清洗干净，将发酵培养基溶于纯化水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，121℃蒸汽湿热离线灭菌20min，冷却至39℃备用。其中发酵培养基的组成为：胰蛋白胨18g/L，酵母提取物20g/L，NaCl20g/L，乳糖5g/L。

将补料培养基溶于纯化水中，搅拌均匀，121℃蒸汽湿热离线灭菌20min，冷却后备用。其中补料培养基的组成为：胰蛋白胨70g/L，酵母提取物40g/L，甘油500g/L，乳糖6g/L。

3.接种：在火焰保护下，按发酵培养基体积的1.6％的接种量将110mL检验合格的发酵种子培养液接种于10L发酵罐中，装液量7L，培养温度39℃，搅拌转速为400rpm，开始发酵培养。溶氧初始值在发酵种子液接种到发酵培养基后通过调节转速、空气流量及罐压校正为100％，发酵过程中不再控制溶氧值。

4.发酵：发酵过程中采用以下中间控制方法：

4.1发酵至6h开始流加步骤2中配制的补料培养基，补料速率210mL/h，补料培养基体积2.1L；

4.2发酵过程中，搅拌转速保持为400rpm；

4.3本实施例发酵过程中总补料量为2.1L；

4.4本实施例发酵过程中pH＝7.4±0.1，通过反应器自动流加16.0％NaOH溶液，25％HCl溶液调节；

4.5发酵于22h后结束，得到发酵菌液。

5.实验结果：经检测，发酵菌液OD₆₀₀达到18.6，采用管式离心机收集菌体，获得湿菌泥227.5g，目的蛋白G-CSF占菌体总蛋白64％，湿菌泥经细胞破碎后获得包涵体36.4g。工程菌生长曲线见图2。

实施例五(以50L发酵罐为例)

1.种子的培养：本实施例种子的培养与实施例二相同。

2.接种前准备：本实施例接种前准备与实施例二相同。

3.接种：在火焰保护下，按发酵培养基体积的1％的接种量将250mL检验合格的发酵种子培养液接种于50L发酵罐中，装液量25L，培养温度35℃，搅拌转速为300rpm，开始发酵培养。溶氧初始值在发酵种子液接种到发酵培养基后通过调节转速、空气流量及罐压校正为100％，发酵过程中不再控制溶氧值。

4.发酵：发酵过程中采用以下中间控制方法：

4.1发酵至3h开始流加步骤2中配制的补料培养基，补料速率625mL/h，补料培养基体积6.25L；

4.2发酵至8h，转速由300rpm调整为200rpm；

4.3本实施例发酵过程中总补料量为6.25L；

4.4本实施例发酵过程中pH＝6.1±0.1，通过反应器自动流加16.0％NaOH溶液，25％HCl溶液调节；

4.5发酵于18h后结束，得到发酵菌液。

5.实验结果：经检测，发酵菌液OD₆₀₀达到22.3，采用管式离心机收集菌体，获得湿菌泥937.6g，目的蛋白G-CSF占菌体总蛋白42％，湿菌泥经细胞破碎后获得包涵体93.8g。

实施例六(以50L发酵罐为例)

1.种子的培养：本实施例种子的培养与实施例三相同。

2.接种前准备：本实施例接种前准备与实施例三相同。

3.接种：在火焰保护下，按发酵培养基体积的1.6％的接种量将400mL检验合格的发酵种子培养液接种于50L发酵罐中，装液量25L，培养温度37℃，搅拌转速为375rpm，开始发酵培养。溶氧初始值在发酵种子液接种到发酵培养基后通过调节转速、空气流量及罐压校正为100％，发酵过程中不再控制溶氧值。

4.发酵：发酵过程中采用以下中间控制方法：

4.1发酵至5h开始流加步骤2中配制的补料培养基，补料速率500mL/h，补料培养基体积5L；

4.2发酵至8h，转速由375rpm调整为250rpm；

4.3本实施例发酵过程中总补料量为5L；

4.4本实施例发酵过程中pH＝7.0±0.1，通过反应器自动流加16.0％NaOH溶液，25％HCl溶液调节；

4.5发酵于20h后结束，得到发酵菌液。

5.实验结果：经检测，发酵菌液OD₆₀₀达到31.5，采用管式离心机收集菌体，获得湿菌泥1203g，目的蛋白G-CSF占菌体总蛋白71.3％，湿菌泥经细胞破碎后获得包涵体152g。工程菌生长曲线见图3。

实施例七(以50L发酵罐为例)

1.种子的培养：本实施例种子的培养与实施例四相同。

2.接种前准备：本实施例接种前准备与实施例四相同。

3.接种：在火焰保护下，按发酵培养基体积的3％的接种量将750mL检验合格的发酵种子培养液接种于50L发酵罐中，装液量25L，培养温度39℃，搅拌转速为400rpm，开始发酵培养。溶氧初始值在发酵种子液接种到发酵培养基后通过调节转速、空气流量及罐压校正为100％，发酵过程中不再控制溶氧值。

4.发酵：发酵过程中采用以下中间控制方法：

4.1发酵至6h开始流加步骤2中配制的补料培养基，补料速率750mL/h，补料培养基体积7.5L；

4.2发酵过程中，搅拌转速保持为400rpm；

4.3本实施例发酵过程中总补料量为7.5L；

4.4本实施例发酵过程中pH＝7.4±0.1，通过反应器自动流加16.0％NaOH溶液，25％HCl溶液调节；

4.5发酵于22h后结束，得到发酵菌液。

5.实验结果：经检测，发酵菌液OD₆₀₀达到27，采用管式离心机收集菌体，获得湿菌泥1137.2g，目的蛋白G-CSF占菌体总蛋白65.5％，湿菌泥经细胞破碎后获得包涵体130.2g。

本发明用于重组人粒细胞集落刺激因子生产，具有广阔的应用前景。通过研究开发重组人粒细胞集落刺激因子工程菌乳糖诱导发酵生产工艺，使得操作更为简单，并且降低了生产成本，实现了安全无毒，提高了菌体得率和目标蛋白表达量，有利于实现工业化生产。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基，包括种子培养基、发酵培养基和补料培养基，其特征在于所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨15～20g/L，酵母提取物10～20g/L，氯化钠10～20g/L，乳糖1～5g/L，余量为水；所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨50～100g/L、酵母提取物25～50g/L，甘油300～500g/L，乳糖2～6g/L，余量为水；所述补料培养基按体积计算为所述发酵培养基体积的20％～30％。

2.根据权利要求1所述的制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基，其特征在于所述种子培养基的成分及其含量为胰蛋白胨15～25g/L，优选20～25g/L，酵母粉7～14g/L，优选10～14g/L，氯化钠6～15g/L，优选10～15g/L，余量为水，pH值调节为7.0～7.2；所述种子培养基按体积计算为所述发酵培养基体积的1％～3％。

3.一种利用权利要求1或2所述的培养基制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，其具体步骤如下：

①.将已转化利用pET-9a载体和人G-CSF基因构建得到的重组载体质粒的宿主菌接种于种子培养基培养至OD₆₀₀为0.8～1.2，得到发酵种子液，所述人G-CSF基因序列如SEQ ID No.1所示；

②.将发酵种子液按发酵培养基体积的1％～3％的比例接种到灭菌的发酵培养基中，培养3～6小时；

③.按发酵培养基体积的20％～30％的比例向发酵体系中补加灭菌的补料培养基继续发酵，18～22小时后结束发酵得到重组菌发酵液，

其特征在于，所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨15～20g/L，酵母提取物10～20g/L，氯化钠10～20g/L，乳糖1～5g/L，余量为水；所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨50～100g/L、酵母提取物25～50g/L，甘油300～500g/L，乳糖2～6g/L，余量为水。

4.根据权利要求3所述的制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，其特征在于所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨18～20g/L，酵母提取物10～20g/L，氯化钠10～20g/L，乳糖1～5g/L，余量为水；所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨70～100g/L、酵母提取物40～50g/L，甘油360～500g/L，乳糖2～6g/L，余量为水。

5.根据权利要求3或4所述的制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，其特征在于所述已转化重组载体质粒的宿主菌接种于种子培养基培养得到发酵种子液为从甘油管菌种挑取已转化重组载体质粒的宿主菌并接种到含有种子培养基的培养瓶中，接种量为0.1％，在35～39℃、160～180rpm的条件下培养8～10小时，即为发酵种子液。

6.根据权利要求5所述的制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，其特征在于所述种子培养基的成分及其含量为胰蛋白胨15～25g/L，优选20～25g/L，酵母粉7～14g/L，优选10～14g/L，氯化钠6～15g/L，优选10～15g/L，余量为水，pH值调节为7.0～7.2。

7.根据权利要求3所述的制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，其特征在于在发酵过程中，所述发酵的培养温度为35～39℃，通过加酸和碱溶液控制发酵体系pH在6.0～7.5；发酵0至8小时，发酵罐转速为300～400rpm，8小时后，转速调整为200～400rpm。

8.根据权利要求7所述的制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，其特征在于所述控制发酵体系pH所使用的酸和碱溶液为盐酸和氢氧化钠溶液。

9.根据权利要求3所述的制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，其特征在于所述灭菌的补料培养基以流加的方式补加到所述发酵体系中，补料时间为10小时，补料速率设定为补料体积除以补料时间所得数值。

10.根据权利要求3所述的制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，其特征在于所述的宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。