CN101864372A - 一种抗菌肽基因工程菌株的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗菌肽基因工程菌株的制备方法。本发明首先根据抗菌肽Cecropin A氨基酸序列的特点，设计了新的抗菌肽基因，在序列的5’端加入了组氨酸标记序列，两端分别加入了Xho I和Not I酶切位点序列，合成其序列；其次将获得产物克隆至T载体；第三是将目的基因构建于酵母表达载体pPIC9k，构建成含目的基因的重组载体pPIC-CEC；第四是将其转化于毕赤酵母GS115中表达，形成了抗菌肽基因转化毕赤酵母工程菌GS115(pPIC-CEC)。该菌株可以表达产生基因工程抗菌肽Cecropin A，该菌成本低，大规模发酵生产方便，易于实现产业化，本发明操作方法简单，易于观察，重复性好，表达产物将来可应用于水果采后生物防治，可以带来一定的经济效益。

Description

一种抗菌肽基因工程菌株的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种抗菌肽基因工程菌株的制备方法。

背景技术

抗菌肽，顾名思义就是一类对细菌、真菌、等微生物及某些昆虫和动植物细胞具有抑制或杀灭作用的小分子多肽，其通常分子量在10KD以下。他们具有分子量小、水溶性好、热稳定性强、抗菌谱广等特点(Rao et.al，1995)。此外，抗菌肽还有分子量小，热稳定，水溶性好，对人无毒副作用等优点，在医药、农业、食品工业等领域具有广泛的应用前景。在食品工业中，抗菌肽主要是用作食品保鲜防腐剂。目前，食品加工使用的防腐剂多是化学合成的，对人体会产生一定毒副作用，使用对人体安全无毒副作用的天然抗菌肽对于提高食品的安全性具有重要意义。果蔬采后病害的生物防治是20世纪80年代中后期逐步发展起来的一项果蔬采后病害防治的新技术。

从昆虫等生物体内分离纯化获得的抗菌肽，数量很少，生产成本高，不能满足应用的需要。随着基因工程技术的迅速发展，依据抗菌肽分子结构及生物学功能，人工合成抗菌肽基因，或对原有抗菌肽基因进行改造，再将其导入大肠杆菌或酵母菌等工程菌内，获得能产生重组抗菌肽的工程菌，为工业化生产抗菌肽提供了全新的途径。

本发明以转基因酵母菌进行生产抗菌肽Cecropin A，并且用收集所得的沉淀超生破碎后今后可作为一种有效的生物保鲜剂用于采后水果的生物保鲜。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗菌肽基因工程菌株的制备方法。

抗菌肽基因工程菌株的制备方法包括如下步骤：

1)根据注册号为AAA29185的抗菌肽Cecropin A基因序列，进行全序列合成，同时分别引入组氨酸标记序列及限制性酶切位点NotI和XhoI，得到抗菌肽Cecropin A基因合成产物；

2)将抗菌肽Cecropin A基因合成产物克隆于pGEM-T载体，得到重组载体pGEM-T-CEC，将重组载体pGEM-T-CEC转入大肠杆菌DH5α中，得到DH5α(pGEM-T-CEC)菌株；

3)从DH5α(pGEM-T-CEC)菌株中提取重组载体pGEM-T-CEC质粒，用NotI和XhoI双酶切质粒pGEM-T-CEC得到目的片段Cecropin A；同样酶切酵母穿梭载体pPIC9k使其线性化，将线性化后的pPIC9k载体与双酶切后得到的CecropinA在T4DNA连接酶的作用下4℃过夜，以得到重组表达载体pPIC-CEC，将该重组载体转入大肠杆菌心DH5α中得到DH5α(pPIC-CEC)菌株，并对其进行PCR及酶切鉴定；

4)从DH5α(pPIC-CEC)菌株中提取重组质粒pPIC-CEC，用Sal I酶切成线性，利用生化方法将线性化的重组质粒pPIC-CEC转化毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞中，涂于MD平板上。在30℃孵育平板2-3d，克隆长出，得到酵母基因工程菌株GS115/CEC，对酵母基因工程菌株GS115/CEC进行表型和拷贝数鉴定；

5)用灭菌牙签挑取单克隆，在MM和MD平板上对应位置点转化子，确保先在MM平板上点。寻找在MD平板正常生长而在MM平板上生长很小或不长的菌株，即为Mut^s表型，而生长无差异即为Mut⁺表型；

6)挑取约500个转化子在浓度由低到高的G418浓度的YPD平板上点样鉴定。

所述的表达载体pPIC9k上的克隆位点设计引物为，上游引物：

CTCGAGAAGTGGAAGTTG TTTA，下游引物：

GCGGCCGCCTTAGCAATTTGA。

抗菌肽基因工程菌株用于水果采后生物防治。

本发明操作简单，表达产物将来可应用于水果采后生物防治。

附图说明

图1重组质粒pPIC-CEC中抗菌肽Cecropin A基因的酶切及PCR鉴定结果泳道1为pPIC-CEC质粒；泳道2为Cecropin A基因扩增产物；泳道3为重组质粒pPIC-CEC用XhoI单酶切鉴定结果。

具体实施方式

抗菌肽基因工程菌株的制备方法包括如下步骤：

1)根据注册号为AAA29185的抗菌肽Cecropin A基因序列，进行全序列合成，同时分别引入组氨酸标记序列及限制性酶切位点NotI和XhoI，得到抗菌肽Cecropin A基因合成产物；

2)将抗菌肽Cecropin A基因合成产物克隆于pGEM-T载体，得到重组载体pGEM-T-CEC，将重组载体pGEM-T-CEC转入大肠杆菌DH5α中，得到DH5α(pGEM-T-CEC)菌株；

3)从DH5α(pGEM-T-CEC)菌株中提取重组载体pGEM-T-CEC质粒，用NotI和XhoI双酶切质粒pGEM-T-CEC得到目的片段Cecropin A；同样酶切酵母穿梭载体pPIC9k使其线性化，将线性化后的pPIC9k载体与双酶切后得到的CecropinA在T4DNA连接酶的作用下4℃过夜，以得到重组表达载体pPIC-CEC，将该重组载体转入大肠杆菌心DH5α中得到DH5α(pPIC-CEC)菌株，并对其进行PCR及酶切鉴定；

4)从DH5α(pPIC-CEC)菌株中提取重组质粒pPIC-CEC，用Sal I酶切成线性，利用生化方法将线性化的重组质粒pPIC-CEC转化毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞中，涂于MD平板上。在30℃孵育平板2-3d，克隆长出，得到酵母基因工程菌株GS115/CEC，对酵母基因工程菌株GS115/CEC进行表型和拷贝数鉴定；

5)用灭菌牙签挑取单克隆，在MM和MD平板上对应位置点转化子，确保先在MM平板上点。寻找在MD平板正常生长而在MM平板上生长很小或不长的菌株，即为Mut^s表型，而生长无差异即为Mut⁺表型；

6)挑取约500个转化子在浓度由低到高的G418浓度的YPD平板上点样鉴定。

所述的表达载体pPIC9k上的克隆位点设计引物为，上游引物：

CTCGAGAAGTGGAAGTTG TTTA，下游引物：

GCGGCCGCCTTAGCAATTTGA。

本发明的技术要点之一是表达抗菌肽Cecropin A基因的毕赤酵母工程菌株的构建及诱导表达。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达***(Sreekrishna K，1997)。其优点为(彭毅，2000)：(1)具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；(2)稳定性好，由于该***的表达载体在酵母中不是以自主复制的质粒存在，而是通过同源重组稳定的整合在酵母染色体上，所以构建的工程菌株十分稳定；(3)活性高，作为真核表达***，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；(4)营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产；(5)可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L以上；(6)表达量高，因为毕赤酵母生长速度快，而且表达载体使用的是强启动子-乙醇氧化酶启动子，许多蛋白可达到g/L以上水平；(7)在P.pastoris中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；不仅如此，在进行实验时，其操作与大肠杆菌一样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达***更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达***。

实施例1

1.抗菌肽Cecropin A基因序列合成，设计时引入酶切位点NotI和XhoI：

ctcgagaagtggaagttgtttaagaaaattgaaaaggttggtcaaaacattagagatggtattattAaggctggtccagctgttgctgtttgttggtcaagctactcaaattgctaaggcggccgc

(a)序列特征：

长度：125个碱基对

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

(b)分子类型：双链DNA

实施例2

抗菌肽Cecropin A基因序列与pGEM-T中间载体的连接

(1)合成产物克隆于pGEM-T载体：取1μg实施例1制得的抗菌肽Cecropin A按以下体系连接T载体(采用Takara克隆试剂盒)

10×ligation Buffer 1μL

Cecropin A          5μL

pGEM-T载体          1μL

T4DNA连接酶         1μL

ddH2O               Up to 10μL

(2)将该重组载体pGEM-T-CEC转入大肠杆菌DH5α中：

a)将冷冻保藏的大肠杆菌DH5α感受态细胞取出后立即置于冰浴中，然后在100μL感受态细胞中加入15μL连接产物，冰浴30分钟，然后迅速置于42℃水浴中热激90秒，在立即置于冰浴中2分钟，然后将其加入800μL的SOC培养基，在37℃下170rpm培养50分钟，然后将培养物离心，弃去部分上清，约留100μL上清悬浮沉淀，并将悬浮物在无菌条件下均匀涂在含有30μg/ml的Amp的LB/X-gal/IPTG平板固体培养基上，在37℃培养箱倒置培养12小时以上，至蓝斑微现，将平皿放入4℃冰箱继续显色至蓝白斑明显，进行蓝白斑筛选鉴定。

其中，SOC培养基成分：2％蛋白胨，0.5％酵母提取物(购自OXOID公司)，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl₂，10mM MgSO₄，20mM葡萄糖；LB培养基配方：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl。固体培养集中加入1.7％的琼脂；

感受态细胞溶解在0.10mol/L的CaCl₂溶液中，并加入占总体积10％的灭菌甘油，-70摄氏度保藏。感受态细胞浓度为：1-3万个细胞/ml。

b)白斑菌落进行PCR鉴定：给含有Amp/X-gal/IPTG的LB平板上单个白色菌落做好标记，分别沾取少许作标记的单个菌落为模板进行PCR扩增，琼脂糖电泳观察。

其中，PCR体系：模板：0.5-1μL，P1：10pmol，P2：10pmol，10×pfu DNA聚合酶buffer：2μL，dNTP(2.5mM)：1.2μl，Tag DNA聚合酶：1u，用无菌水补足至20μl。

PCR反应条件：将上述PCR体系混匀，第一阶段95℃预变性5min，第二阶段94℃，30S；55℃，30S；72℃，40S，共进行30个循环；第三阶段72℃延伸7min。

引物为：P1：CTCGAGAAGTGGAAGTTG TTTA

P2：GCGGCCGCCTTAGCAATTTGA

c)阳性菌落质粒的提取：用牙签挑取经鉴定为阳性的单菌落接种到含有30μg/ml的Amp的LB液体培养基中，37℃200rpm培养12小时，进行质粒提取，方法如下：

1)挑取单个白色菌落，分别接种于含有Amp的10mlLB液体培养基中37℃摇菌过夜；

2)将培养物分装于1.5ml离心管，以12000rpm离心3min，弃上清液；

3)加0.1ml溶液Ⅰ充分混合，0.2ml溶液Ⅱ，轻轻翻转混匀，置于冰浴5min，加入0.15ml预***液Ⅲ，轻轻翻转混匀，置于冰浴5min；

4)以12000rpm离心5min，取上清液于另一新Ep管，加入等体积的酚/氯仿，混匀，12000rpm离心2min；

5)加入等体积的氯仿，混匀后，12000rpm离心2min。

6)12000rpm离心2min，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后于室温静置5min，12000rpm离心5min弃上清；

7)用70％乙醇0.5ml洗涤两次，室温晾干；

8)待沉淀干燥后，用适量含RNase(20μg/ml)的TE溶液(10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解质粒，37℃温育30～60min，去除RNA。1％琼脂糖电泳，置紫外灯下观察。

实施例3

抗菌肽Cecropin A序列与酵母表达载体pPIC9k的连接：

(1)pGEM-T-CEC质粒及表达载体pPIC9k的双酶切及其回收：取1μg实施例2制得pGEM-T-CEC质粒与pPIC9K用NotI和XhoI进行酶切。将cecropinA基因片段，与经同样双酶切的pPIC9K线性分子相连接，酶切体系如下：

成分             体积(μl)

质粒             5.0

10×酶切缓冲液   2.0

去离子水         11.0

NotI             1.0

XhoI             1.0

反应体系         20μl

限制性内切酶NotI和XhoI及其缓冲液购自Takara公司。酶切产物按北京天为时代公司的琼脂糖凝胶DNA回收Kit说明书进行。

(2)cecropin A片段与pPIc9K线性载体的连接

将回收的目的基因片段与将同样酶消化的pPIC9K线性化片段按以下体系连接，连接产物命名为：pPIC-CEC，反应体系如下：

成分            体积(μl)

载体             2.0

目的基因片段     6.0

连接10xbuffer    1.0

T4DNA连接酶      1.0

         总体积：10.0μL

反应条件：16℃过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。连接产物按实施例2中的方法转化DH5α感受态细胞，培养于含有30μg/ml的Amp平板。将阳性克隆进行摇菌并按照实施例2的方法进行质粒提取并进行鉴定。

(3)重组载体pPIC-CEC的PCR及酶切鉴定(鉴定结果见图1)

a.PCR鉴定

给含有Amp的LB平板上单个白色菌落做好标记，分别沾取少许作标记的单个菌落为模板进行PCR扩增，琼脂糖电泳观察(方法参考实施例2)。

b.重组质粒的酶切鉴定

将重组质粒pPIC-CEC进行XhoI单酶切鉴定，反应体系为20μl，体系如下：

成分             体积(μl)

质粒DNA          5.0

10×酶切缓冲液   2.0

去离子水         12.0

XhoI             1.0

              反应体系20μl

37℃水浴过夜。取10μl反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外透射仪下观察，以判断***的目的片段。酶切鉴定正确的质粒于-20℃保存备用。

实施例4

(1)重组质粒pPIC/CEC向毕赤酵母GS115的转化

a.质粒线性化：取15μg的pPIC-CEC质粒，进行SalI酶切，反应体系如下：

质粒            15μg

SalI             6μl

10×M Buffer    15μl    

ddH₂O    补齐至150μl

37℃反应4h后，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)沉淀线性化片段，乙醇沉淀DNA，离心晾干，加10μlTE缓冲液溶解，贮存于-20度直至转化。

b.毕赤酵母GS115感受态细胞制备

1).挑取毕赤酵母GS115单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml培养瓶中，30℃、200rpm培养过夜。

2).取0.5ml的培养物接种至含有100ml新鲜培养基的1L三角摇瓶中，30℃、200rpm培养过夜，至OD₆₀₀达到1.2-1.5。

3).将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用100ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。

4).4℃，1500g离心5min，用50ml冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。

5).4℃，1500g离心5min，用4ml冰预冷的1M山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。

6).4℃，1500g离心5min，用200μl冰预冷的1M山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为320μl。

7).80μl/管分装，直接用于电转化，剩下的可-80℃冷冻短期保存。

c.电转染

1).取80μl上述感受态细胞与10μg线性化重组质粒(溶于5-10μlTE)混合，转入冰预冷的0.2cm电转杯中，冰上放置5min。

2).根据Bio-Rad电转仪毕赤酵母转化参数电击。

3).电击后立即加入1ml冰预冷的1M山梨醇至电转杯中，然后转移至灭菌离心管中，30℃静置1h。

4).分成200μl等份，涂布于MD平板上。

5).在30℃孵育平板2-3d，克隆长出，进行重组子表型和拷贝数鉴定，重组子命名为GS115/CEC。

(2)重组子GS115/CEC表型鉴定及拷贝数鉴定

a.重组子表型鉴定

1).用灭菌牙签挑取单克隆，在MM和MD平板上对应位置点转化子，确保先在MM平板上点。

2).每个克隆换一次牙签，大约点500个转化子(约5板)，30℃孵育2-3天

3).计数平板，寻找在MD平板正常生长而在MM平板上生长很小或不长的菌株，即为Mut^s表型，而生长无差异即为Mut⁺表型。

b.重组子拷贝数鉴定

取约500个转化子点样鉴定，操作如下：

1)用灭菌牙签挑取单克隆，对应点转化子于0.25mg/ml，0.5mg/ml G418浓度的YPD平板上，30℃孵育2-3天。

2)取0.25mg/ml和0.5mg/ml G418浓度的YPD平板上正常生长的克隆点样于0.75mg/ml G418浓度的YPD平板上，30℃孵育2-3天。

3)取0.75mg/ml G418浓度的YPD平板上正常生长的克隆点样于1.5mg/mlG418浓度的YPD平板上，30℃孵育2-3天。所筛选到的菌落即为高拷贝数的重组子GS115/CEC菌株进行保存。

其中，YPD培养基成分：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，固体培养基1.5％琼脂)，115℃20min；选择培养基MD配制方法(100mL)：向80mL水中加入琼脂糖2g(20g/L)，121℃灭菌20分然后待温度降至60℃在超镜台上加入10*YNB10mL(13.4g/L)，10*葡萄糖10mL(20g/L)，500*生物素0.2mL；选择培养基MM(配100mL)，向90mL水中加入琼脂糖2g(20g/L)，121℃灭菌20分然后待温度降至60℃在超镜台上加入10*YNB10mL(13.4g/L)，500*生物素0.2mL，0.5mL甲醇(0.5％)。

各种母液配制方法如下：

1)10*YNB(13.4％无氨基酸酵母氮源)，134gYNB固体溶于1L蒸馏水，灭过菌，4℃保存

2)500*B(0.02％生物素)，生物素20mg/100mL水，过滤灭菌，4℃保存

3)10*D(20％葡萄糖)，200gD-葡萄糖溶于1L水中，过滤灭菌，4℃保存

4)10*GY(10％的甘油)，100mL甘油溶于900mL水，过滤灭菌，4℃保存

(3)重组酵母GS115/CEC的诱导表达方法

挑取重组菌的单菌落到20mlYPD液体培养基，30℃、200rpm培养进行活化：16个小时后取10ml活化后的菌液转接500ml BMGY液体培养基30℃、200rpm培养增浓；增浓24小时后的菌液经离心收集菌体(1500g、10分钟、4℃)；将收集到的菌体重悬于1000mlBMMY液体培养基进行诱导表达，每24h添加甲醇至终浓度为0.5-1％；诱导96h后离心收集菌体(30000g、10分钟、4℃)，菌体采用玻璃珠法破碎后可以用于今后的采后生防实验。

其中，BMGY培养基(1L)配方组成如下：10g酵母提取物，20g蛋白胨，3g磷酸氢二钾(K₂HPO₄)，11.8g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，加水至890mL，121℃灭菌20分然后待温度降至60℃在超镜台上加入10*YNB100mL(13.4g/L)，500*生物素1mL，甘油10mL。

诱导表达培养基BMMY培养基(1L)配方组成如下：10g酵母提取物，20g蛋白胨，3g磷酸氢二钾(K₂HPO₄)，11.8g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，加水至895mL，121℃灭菌20分然后待温度降至60℃在超镜台上加入10*YNB100mL(13.4g/L)，500*生物素1mL，甲醇5mL。

Claims (2)

1.一种抗菌肽基因工程菌株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)根据注册号为AAA29185的抗菌肽CecropinA基因序列，进行全序列合成，同时分别引入组氨酸标记序列及限制性酶切位点NotI和XhoI，得到抗菌肽Cecropin A基因合成产物；

2)将抗菌肽Cecropin A基因合成产物克隆于pGEM-T载体，得到重组载体pGEM-T-CEC，将重组载体pGEM-T-CEC转入大肠杆菌DH5α中，得到DH5α(pGEM-T-CEC)菌株；

3)从DH5α(pGEM-T-CEC)菌株中提取重组载体pGEM-T-CEC质粒，用NotI和XhoI双酶切质粒pGEM-T-CEC得到目的片段Cecropin A；同样酶切酵母穿梭载体pPIC9k使其线性化，将线性化后的pPIC9k载体与双酶切后得到的CecropinA在T4DNA连接酶的作用下4℃过夜，以得到重组表达载体pPIC-CEC，将该重组载体转入大肠杆菌心DH5α中得到DH5α(pPIC-CEC)菌株，并对其进行PCR及酶切鉴定；

4)从DH5α(pPIC-CEC)菌株中提取重组质粒pPIC-CEC，用SalI酶切成线性，利用生化方法将线性化的重组质粒pPIC-CEC转化毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞中，涂于MD平板上。在30℃孵育平板2-3d，克隆长出，得到酵母基因工程菌株GS115/CEC，对酵母基因工程菌株GS115/CEC进行表型和拷贝数鉴定；

5)用灭菌牙签挑取单克隆，在MM和MD平板上对应位置点转化子，确保先在MM平板上点。寻找在MD平板正常生长而在MM平板上生长很小或不长的菌株，即为Mut^s表型，而生长无差异即为Mut⁺表型；

6)挑取约500个转化子在浓度由低到高的G418浓度的YPD平板上点样鉴定。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌株的制备方法，其特征在于：所述的表达载体pPIC9k上的克隆位点设计引物为，上游引物：

CTCGAGAAGTGGAAGTTG TTTA，下游引物：

GCGGCCGCCTTAGCAATTTGA。

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