CN102220369B - 里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体、重组菌及在重组菌中的表达 - Google Patents

Abstract

本发明公开了里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体、重组菌及在重组菌中的表达，构建含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体：(1)PCR扩增里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1，连接至TA载体；(2)里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1构建至巴斯德毕赤酵母表达载体；本发明重组菌能有效地表达目的蛋白里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1。克服了现有技术从里氏木霉中无法大量纯化出β-葡萄糖苷酶的不足。自然界中有诸多废弃木质纤维素，本发明的方法能提高β-葡萄糖苷酶的产量，对提高纤维素的降解效率、高效的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有极其重要意义。

Description

里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体、重组菌及在重组菌中的表达

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地涉及一种含里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1基因的重组载体、含里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1基因的重组巴斯德毕赤酵母菌及里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1基因在重组巴斯德毕赤酵母菌中的诱导表达。 

背景技术

纤维素是植物细胞壁的主要成份，是地球上最大量的可再生碳源物质。利用其进行生物转化生产燃料乙醇等化学品，对于当前人类解决能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有极其重要的意义。 

降解纤维素的纤维素酶是一个多酶体系，包含内切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，这三种酶协同作用将纤维素降解成葡萄糖：内切葡聚糖酶切断纤维素长链，产生自由的末端，外切葡聚糖酶可以结合到这些末端进一步水解；另一方面，外切葡聚糖酶的水解作用使纤维素结晶区结构变得松散，有利于内切葡聚糖酶的作用；β-葡萄糖苷酶降解寡糖和纤维二糖成葡萄糖^[1，2]。 

在纤维素酶水解纤维素的过程中，目前主要有以下几种问题：(1)在产纤维素酶的菌株中，β-葡萄糖苷酶含量都很低，远达不到实际应用的水平；(2)在反应过程中，由于热抑制作用，β-葡萄糖苷酶的大部分活性会丧失。因此，β-葡萄糖苷酶的活力一般比内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶低一个数量级以上，是纤维素降解的限速酶^[3]。 

里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种嗜温型腐生丝状真菌，在学术研究或工业生产中，都引起人们的广泛关注。它能分泌产生内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，包含了完整的纤维素水解酶系^[4]。在天然的里氏木霉中，有BGL1和BGL2两种β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶的活性低至0.0967U/mL^[5]。其中BGL1相对BGL2有更强的β-葡萄糖苷酶活性。 

由于天然里氏木霉菌株中的β-葡萄糖苷酶产量很低，从而限制了纤维素的水解过程。β-葡萄糖苷酶作为纤维素水解的限速酶，在纤维素的水解过程中起着关键的作用。如果通过构建重组菌株，提高β-葡萄糖苷酶的产量，将是实现纤维素高效降解的可行途径。 

参考文献： 

[1]赵雪娜，β-葡萄糖苷酶基因过量表达提高Trichoderma reesei纤维素降解活性[D]，山东大学，2007. 

[2]Tomme P，Warren RA，Gilkes NR.Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi.Adv Microbiol Physiol，1995.37：1～81. 

[3]王振宇，鱼红闪，金风燮.高温厌氧菌产纤维素内切酶和争葡萄糖苷酶的活性.大连轻工业学院学报，2005，24(2)，110～114. 

[4]Penttila ME，Andre L，Saloheimo M，Lehtovaara P.1987.Expression of two Trichoderma reesei Endoglucanase in the Yeast Saccharomyces cereviae.Yeast[J].3：75-85. 

[5]Wen ZY，Liao W，Chen SL.Production of cellulase by Trichoderma reesei from dairy manure.Bioresource Technology 96(2005)491-499. 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体。 

本发明的第二个目的是提供含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组巴斯德毕赤酵母菌。 

本发明的第三个目的是提供里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1在重组巴斯德毕赤酵母菌中的诱导表达。 

本发明的技术方案概述如下： 

里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体，用下述方法构建： 

(1)提取里氏木霉(Trichoderma reesei)CICC 13052的总RNA，反转录成cDNA，以该cDNA为模板，用序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR，扩增出序列表中SEQ ID NO.3所示2235bp的里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1，连接至TA载体pGEM-T，获得含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的质粒pGEM-BGL1； 

(2)里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1构建至巴斯德毕赤酵母表达载体：以所述质粒pGEM-BGL1为模板，以序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR扩增，获得序列表中SEQ ID NO.6所示的2198bp片段，将所述2198bp片段连接至TA载体pGEM-T，命名为pTBGL1；提取质粒pTBGL1和巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZalpha C质粒，用Cla I和XbaI同时酶切pTBGL1和pPICZalpha C质粒，经琼脂糖凝胶电泳后回收酶切pTBGL1得到SEQ ID NO.7所示的2183bp片段和酶切pPICZalpha C得到的SEQ ID NO.8所示的3530bp片段；回收产物连接后转化到大肠杆菌TOP10F′的感受态细胞中，涂含Zeocin 25μg/mL的LB平板，培养12-16h，得到含pPICZalpha C-BGL1质粒的大肠杆菌，提取大肠杆菌中pPICZalpha C-BGL1质粒，即得到含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体。 

一种含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)R1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.4606。 

一种含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组巴斯德毕赤酵母菌，用下述方法获得：将10-15μg的权利要求1所述pPICZalpha C-BGL1质粒，用PmeI酶切成SEQ ID NO.9所示的5713bp片段，乙醇沉淀SEQ ID NO.9所示的DNA片段，干燥SEQ ID NO.9所示的DNA片段后溶于无菌水，制成浓度为0.5-1μg/μL DNA的溶液；将80μL巴斯德毕赤酵母宿主菌X33的感受态细胞与10μL的所述0.5-1μg/μL的DNA溶液混合均匀后转移到0-4℃预冷的电极杯中，冰浴5min，1500V电击5ms，电击后加入1mL 0-4℃预冷的1M山梨醇水溶液到 电极杯中，混匀，将混合液转移到离心管中，28-30℃静置培养1-2h，在含100μg/mL Zeocin的YPD平板上涂50μL-200μL培养后的混合液，28-30℃倒置培养至菌落出现，PCR鉴定菌落，PCR结果为阳性的菌落，为含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组巴斯德毕赤酵母菌，选取重组巴斯德毕赤酵母菌R1，R2，R3，R4，R8，R12进行诱导表达试验，都能有效地分泌表达β-葡萄糖苷酶，其中将分泌β-葡萄糖苷酶最高的R1进行保藏。 

里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1在重组巴斯德毕赤酵母菌中的诱导表达，包括下述步骤： 

①用权利要求3所述的方法获得的含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组巴斯德毕赤酵母菌R1，R2，R3，R4，R8，R12和对照巴斯德毕赤酵母宿主菌X33分别接种在2-3ml pH＝5.5的YPD培养基中预培养，200-250转/分钟，28-30℃培养至OD₆₀₀＝2-6； 

②按1∶100的体积比分别将步骤①的经预培养的菌液转接至25ml BMGY培养基中，200-250转/分钟，28-30℃培养至OD₆₀₀＝2-6； 

③将步骤②培养的菌液分别转接至50ml pH＝5.5、甲醇的体积浓度为0.5％-1％的BMMY培养基中，使菌液的浓度OD₆₀₀＝0.8-1.5；在200-250转/分钟，28-30℃摇床中培养，每24h补甲醇，甲醇的加入体积为培养基体积的0.5％-1％，诱导重组巴斯德毕赤酵母菌表达里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1。 

本发明的优点：本发明的重组菌能有效地表达目的蛋白里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1。克服了现有技术从里氏木霉中无法大量纯化出β-葡萄糖苷酶的不足。自然界中有诸多的废弃的木质纤维素，本发明的方法能提高β-葡萄糖苷酶的产量，对提高纤维素的降解效率、高效的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有极其重要意义。 

附图说明

图1为里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的PCR产物凝胶电泳图。 

泳道1为DNA标准分子量Marker；泳道2所示的为里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的PCR产物凝胶电泳结果。 

图2为含有里氏木霉的BGL1基因的质粒pGEM-BGL1的构建策略图。 

图3为ClaI和XbaI酶切质粒pTBGL1和pPICZalpha C的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1为DNA标准分子量Marker；泳道2为Xba I酶切质粒pTBGL1的产物；3号泳道为Cla I和Xba I酶切质粒pTBGL1产生的2183bp片段；4号泳道为Xba I酶切pPICZalpha C质粒；5号泳道为Cla I和Xba I双酶切pPICZalpha C质粒的产生的3530bp片段。 

图4为含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体构建策略图。 

图5为含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组巴斯德毕赤酵母转化子PCR鉴定电泳图谱。泳道M为DNA标准分子量Marker；1为23号泳道分别为R1-R23号转化子的PCR的产物电泳图谱。 

图6为各个转化子在不同诱导时间时β-葡萄糖苷酶的酶活。转化子为R1，R2，R3，R4，R8，R12和对照菌株X33，测定酶活的时间分别为转化子培养后的48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h，216h，240h，264h。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 

实施例1里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡萄糖苷酶基因的克隆 

用Trizol试剂按照试剂盒说明提取里氏木霉(Trichoderma reesei)CICC 13052的总RNA。 

取2ug总RNA，用反转录试剂盒将其反转录成cDNA(Promega公司)，以该cDNA为模板，用序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为上游引物和下游引物进行PCR，扩增出序列表中SEQ ID NO.3所示的2235bp的里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1基因(见图1)。回收PCR产物，连接至TA载体pGEM-T(Promega公司)得到新的质粒，经测序证实该质粒含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1，质粒命名为pGEM-BGL1，即获得含有里氏木霉的BGL1基因的质粒pGEM-BGL1。构建策略见图2 

实施例2里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1构建至巴斯德毕赤酵母表达载体 

以质粒pGEM-BGL1为模板，以序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为上游引物，以序列表中SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为下游引物进行PCR扩增，获得序列表中SEQ ID NO.6所示的2198bp片段，将所述2198bp片段与TA载体pGEM-T用T4连接酶连接，转化大肠杆菌TOP10F′得到的转化子，经测序证实转化子中的质粒是由里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1与pGEM-T连接而成，将转化获得的新质粒命名为pTBGL1，并从上述转化子中提取质粒pTBGL1，再从含有巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZalpha C质粒的大肠杆菌中提取pPICZalpha C质粒，用ClaI和XbaI同时酶切质粒pTBGL1和pPICZalpha C；琼脂糖凝胶电泳酶切产物(图3)，经琼脂糖凝胶电泳后回收酶切pTBGL1质粒得到SEQ ID NO.7所示的2183bp片段(图3)和酶切pPICZalpha C质粒得到的SEQ ID NO.8所示的3530bp片段(图3)。将回收的酶切产物连接后转化到大肠杆菌TOP10F′的感受态细胞中，涂含Zeocin(购自Invitrogen公司)25μg/mL的LB平板，37℃倒置培养12-16h，菌落长至直径为1-2mm；挑选平板上的单克隆，通过菌裂解PCR筛选阳性克隆，经测序证实后，命名为pPICZalpha C-BGL1，即得到含pPICZalpha C-BGL1质粒的大肠杆菌。提取大肠杆菌中pPICZalpha C-BGL1质粒，即得到含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体。构建策略见图4。 

实施例3里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1整合至巴斯德毕赤酵母染色体： 

取10μg(也可以选15μg)的pPICZalpha C-BGL1质粒，用PmeI酶切成线性的SEQ ID NO.9所示的5713bp片段，经酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀线性SEQ ID NO.9所示的DNA片段，干燥后溶于无菌水，制成DNA浓度为1μg/μL(也可以选0.5μg/μL)DNA溶液； 

参照精编分子生物学实验指南(第四版)(P512-513)中的电穿孔转化制备酵母感受态细胞方法制备巴斯德毕赤酵母宿主菌X-33的感受态细胞，将80μL巴斯德毕赤酵母宿主菌X33的感受态细胞与10μL的1μg/μL(也可以选0.5μg/μL)线形DNA溶液混匀后，转移到4℃(也可以是0-4℃中的任意一值)预冷的电极杯中，冰浴5min，电压1500V，用eppendorf公司的电转仪进行电击，电击5ms，电击后立即加入1mL的0-4℃预冷的1M山梨醇水溶液到电极杯中，混匀，将混合液转移到15mL离心管中，28-30℃静置培养1h(可以是1-2h中的任意-值)，在含100μg/mL的Zeocin(Invitrogen公司出售)的YPD平板上涂100μL (也可以是在50μL-200μL中任一数值)培养后的混合液，28-30℃倒置培养直至重组菌出现。 

YPD培养基为酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18g/L。 

实施例4含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的巴斯德毕赤酵母转化子的PCR鉴定 

提取实施例3中所获得的编号为R1至R23的23个转化子的基因组DNA，以转化子的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR，以检测外源DNA的***，以水为模板的PCR作为阴性对照。PCR扩增条件为95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸3min。PCR能扩增出1188bp DNA条带。PCR产物电泳，如图5所示1-23号为编号R1-R23的PCR电泳产物。以一些转化子的基因组为模板能扩增出1188bp的DNA片段，说明这些转化子的里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1已经成功整合到巴斯德毕赤酵母X-33菌株染色体上。 

实施例5甲醇诱导巴斯德毕赤酵母转化子的里氏木霉BGL1基因表达 

①接种经实施例4鉴定的含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组巴斯德毕赤酵母菌R1，R2，R3，R4，R8，R12，以及巴斯德毕赤酵母宿主菌X33分别转接至2ml，pH＝5.5的YPD培养基预培养，220转/分钟，29℃培养至OD₆₀₀＝4； 

②按1∶100的体积比分别将步骤①的经预培养的菌液转接至25ml BMGY培养基中，220转/分钟，29℃培养至OD₆₀₀＝4； 

③将步骤②培养的菌液分别转接至50ml pH＝5.5、甲醇的体积浓度为1％的BMMY培养基中，使菌液的浓度OD₆₀₀＝1，在220转/分钟，29℃摇床中培养，每24h补甲醇，甲醇的加入体积为培养基体积的0.5％，诱导重组菌分泌表达里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1。为检测里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1能有效地表达且将目的蛋白分泌到重组巴斯德毕赤酵母菌的细胞外，从诱导后第1天至8天取重组菌生长的培养基进行β-葡萄糖苷酶的酶活测定。取样方式如下：取500μl培养基，离心后，取上清测定酶活。如图6所示，随着诱导时间的增加，β-葡萄糖苷酶的酶活越高，即目的蛋白里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1分泌的越多，而对照菌株巴斯德毕赤酵母宿主菌X33则没有目的蛋白里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1的分泌(图6)，各个菌株分泌表达的里氏木霉BGL1也有所差异，其中重组菌R1、R4和R8等菌株分泌的重组蛋白里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1的量较大，因此，将编号为R1的重组巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)CGMCC No.4606进行保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2011年2月23日，(见保藏存活证明)。 

步骤①和②中培养的转速也可以是200-250转/分钟中的任意一值；培养温度也可以是28℃-30℃中的任意一值；培养菌的浓度OD₆₀₀也可以是2-6中的任意一值。步骤③中BMMY培养基中甲醇的体积浓度为0.5％-1％中任意一值；菌体的浓度OD₆₀₀也可以是0.8-1.5范围中任意一值；转速也可以是200-250转/分钟中的任意一值；培养温度也可以是28℃-30℃中的任意一值，每24h补甲醇，甲醇的加入体积为培养基体积的0.5％-1％中的任意一值。通过酶活测定证明这些条件下也可以完成诱导巴斯德毕赤酵母转化子的里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1的分泌表达。 

BMGY培养基为10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，13.4g/L酵母氮基，100mM磷酸钾，4x10^-4g/L生物素，10g/L甘油，余量为水。 

BMMY培养基为10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，13.4g/L酵母氮基，100mM磷酸钾，4x10^-4g/L生物素，甲醇的体积浓度为0.5％-1％，余量为水。 

Claims (3)

1.里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体，其特征是用下述方法构建：

(1)提取里氏木霉(Trichoderma reesei)CICC 13052的总RNA，反转录成cDNA，以该cDNA为模板，用序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR，扩增出序列表中SEQ ID NO.3所示2235bp的里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1，连接至TA载体pGEM-T，获得含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的质粒pGEM-BGL1；

(2)里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1构建至巴斯德毕赤酵母表达载体：以所述质粒pGEM-BGL1为模板，以序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR扩增，获得序列表中SEQ ID NO.6所示的2198bp片段，将所述2198bp片段连接至TA载体pGEM-T，命名为pTBGL1；提取质粒pTBGL1和巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZalpha C质粒，用Cla I和XbaI同时酶切pTBGL1和pPICZalpha C质粒，经琼脂糖凝胶电泳后回收酶切pTBGL1得到SEQ ID NO.7所示的2183bp片段和酶切pPICZalpha C得到的SEQ ID NO.8所示的3530bp片段；回收产物连接后转化到大肠杆菌TOP10F′的感受态细胞中，涂含Zeocin 25μg/mL的LB平板，培养12-16h，得到含pPICZalpha C-BGL1质粒的大肠杆菌，提取大肠杆菌中pPICZalpha C-BGL1质粒，即得到含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体。

2.一种含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)R1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.4606。

3.在重组巴斯德毕赤酵母菌中诱导表达来制备里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1的方法，其特征是包括下述步骤：

①用权利要求2的含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组巴斯德毕赤酵母菌R1和对照巴斯德毕赤酵母宿主菌X33分别接种在2-3ml pH＝5.5的YPD培养基中预培养，200-250转/分钟，28-30℃培养至OD₆₀₀＝2-6；

②按1∶100的体积比分别将步骤①的经预培养的菌液转接至25ml BMGY培养基中，200-250转/分钟，28-30℃培养至OD₆₀₀＝2-6；

③将步骤②培养的菌液分别转接至50ml pH＝5.5、甲醇的体积浓度为0.5％-1％的BMMY培养基中，使菌液的浓度OD₆₀₀＝0.8-1.5；在200-250转/分钟，28-30℃摇床中培养，每24h补甲醇，甲醇的加入体积为培养基体积的0.5％-1％，诱导重组巴斯德毕赤酵母菌表达里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1。

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