CN102533628A

CN102533628A - 一株枯草芽孢杆菌工程菌及其在生产肝素酶ⅰ中的应用

Info

Publication number: CN102533628A
Application number: CN201210042866XA
Authority: CN
Inventors: 王凤山; 李潇; 孙永福; 李娜; 周帅
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-02-24
Also published as: CN102533628B

Abstract

本发明公开了一种表达重组肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的枯草芽孢杆菌工程菌，分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5757，其构建方法是：将肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的编码基因转入枯草芽孢杆菌WB600中，得到能够分泌表达肝素酶Ⅰ的工程菌。本发明的枯草芽孢杆菌工程菌能够稳定高效地表达重组肝素酶Ⅰ，所述肝素酶Ⅰ能够特异性降解肝素和类肝素糖苷键，可用于工业化生产低分子肝素、肝素的研究和临床用药。

Description

一株枯草芽孢杆菌工程菌及其在生产肝素酶Ⅰ中的应用

技术领域

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌工程菌，其构建方法，以及其在生产肝素酶Ⅰ中的应用。

背景技术

肝素是一类长链糖胺聚糖，由硫酸化葡糖胺和己糖醛酸以β-1，4糖苷键连接组合而成，临床上主要用来预防血栓或作为体外抗凝血药物使用。低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)是从普通肝素中分离得到或裂解肝素产生的低分子量片段，其分子量约在4000Da～6000Da。与普通肝素相比，LMWH具有更多优势，比如生物利用度高、血浆半衰期长、口服易吸收、抗血栓作用显著增强以及诱发出血的作用显著减弱等，从而被广泛应用于血栓栓塞性疾病的预防及治疗。虽然LMWH有诸多优点，但其价格远远高于普通肝素，给患者带来了沉重的经济负担。目前工业生产LMWH的方法多为化学降解和酶降解法，其中酶法具有反应条件温和、专一性高、不引起肝素结构的破坏和不易带入杂质等优点。

肝素酶(heparinase)是一类能够特异性降解肝素和类肝素糖苷键的酶，在清除血液中的肝素抗凝剂、测定肝素的结构以及抗肿瘤等方面都有重要的应用价值。***患者的血液透析和心脏手术中体外血液循环中残留的肝素用肝素酶来消除，避免了用鱼精蛋白引起的各种毒性反应。由于肝素酶能特异性降解肝素产生特定片段，分析这些片段的结构与功能，可了解肝素的构效关系，促进应用。肝素酶还能作用于胞外基质中的类肝素，产生具有活性的肝素小分子，这些小分子可抑制毛细血管上皮细胞的增殖，从而阻止新血管形成而起到抗肿瘤作用。另外，肝素酶还有促进伤口愈合的作用(Sasisekharan R，Moses MA，Nugent MA，et al.Heparinase inhibits neovascularization[J].Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(4)：1524-1528.)(Karthik R，Balagurunathan K.Differential effects of heparitinase Ⅰ and heparitinase Ⅲ onendothelial tube formation in vitro[J]Biochem Biophys Res Commun，2010，398：191-193.)。肝素酶最初是由Payza等(Payza AN，Korn ED.Bacterial degradation of heparin[J]Nature，1956，177(4498)：88-89.)从肝素黄杆菌中发现并由Bohmer等(Bohmer LH，Pitout MJ，Steyn PL，et al.Purification and characterization of a novel heparinase[J].J Biol Chem，1990，265(23)：13609-13617.)分离出来的，目前已经从肝素黄杆菌中分离纯化得到3种肝素酶Heparinase Ⅰ、Heparinase Ⅱ和Heparinase Ⅲ。本发明所述肝素酶Ⅰ分子量43.8kD，等电点8.5，主要降解肝素分子中的2SIdoA(1→4)6SGlcNS糖苷键(Desai UR，Wang HM，Linhardt RJ.Specificity studieson the heparin lyases from Flavobacterium heparinum[J].Biochemistry，1993，32(32)：8140-8145.)，对其催化区域的考察发现，肝素酶Ⅰ有三个底物结合位点、两个钙离子激活位点和一个糖基化位点，而糖基化对肝素酶Ⅰ的酶活没有影响(Sasisekharan R，Ganesh V，Godavarti R，et al.Heparinase Ⅰ from Flavobacterium heparinum：mapping and characterizationof the heparin binding domain[J].J Biol Chem，1996，271：3214-3131.)(Liu D，Shriver Z，Godavarti R，et al.The calcium-binding sites of heparinase Ⅰ from Flavobacterium heparinum areessential for enzymatic activity[J].J Biol Chem，1999，274(7)：4089-4095.)。

枯草芽孢杆菌已广泛用于工业酶制剂的生产中，该***具有诸多独特的优势，比如生物安全性好，是FDA和农业部批准使用的安全菌株；属革兰氏阳性菌，无内毒素；生长迅速，培养简便；可直接将表达产物分泌到培养基中；没有明显的密码子偏爱性，遗传背景清楚，是分泌表达外源基因的良好受体菌。自Spizizen于1958年发现枯草芽孢杆菌168菌株为可转化菌株以来，已经在枯草芽孢杆菌及其近缘种中克隆和表达了大量的原核和真核基因。而针对枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶活性强的缺点构建的多种蛋白酶缺失菌株，以WB600、WB700、WB800等应用最广，已基本成为较完善的外源基因表达***。已有大量的蛋白质类药物在枯草芽孢杆菌表达***中成功表达，但至今还未见肝素酶Ⅰ在该***中成功表达的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一株能够高效分泌表达重组肝素酶Ⅰ的枯草芽孢杆菌工程菌，其构建方法，以及其在生产肝素酶Ⅰ中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株枯草芽孢杆菌工程菌，菌株名为WB600(pBE2-S-H)，分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5757。

一种枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法为：是通过将肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的编码基因转入枯草芽孢杆菌中，筛选得到的能够分泌表达肝素酶Ⅰ的菌株。所述肝素酶Ⅰ的编码基因如SEQID NO.1或2所示，是公知技术，GenBank号分别为L12534.1或EU541216.1。

所述肝素酶Ⅰ的编码基因5′-端连接有6×His标签。

具体构建步骤如下：

(1)利用HindⅢ和BamH Ⅰ分别双酶切重组质粒SacB/pGEM

-T Easy和质粒pBE2，回收SacB(H/B)和pBE2(H/B)，将二者用T4 DNA连接酶连接；

(2)连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及质粒双酶切鉴定重组质粒pBE2-S，获得重组质粒pBE2-S；

(3)利用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ分别双酶切重组质粒HepA/pGEM

-T Easy和质粒pBE2-S，回收HepA(B/E)和质粒pBE2-S(B/E)，将二者用T4DNA连接酶连接；

(4)连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及质粒双酶切鉴定重组表达质粒pBE2-S-H，最终获得重组表达质粒pBE2-S-H；

(5)以空质粒pBE2-S为阴性对照，利用电转化法将测序正确的重组表达质粒pBE2-S-H转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞，在卡那霉素抗性的LB平板上培养24h，挑取阳性转化子单菌落扩增，提取重组质粒，进行质粒PCR验证，获得含pBE2-S-H的转化子WB600；

(6)发酵上述所得到的含pBE2-S-H的转化子WB600，鉴定产物并进行活性测定，得到一株能够高分泌表达肝素酶Ⅰ的枯草芽孢杆菌工程菌，其肝素酶Ⅰ活性达13000U/L发酵液，申请人对其进行了保藏，于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5757。

优选的，所述步骤(5)中，电转化法的条件是：电压2kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间4～5ms。

优选的，所述步骤(6)中，发酵的条件是：37℃，200～220r/min培养24h。

优选的，所述步骤(6)中，鉴定产物的方法是通过SDS-PAGE进行的。

本发明述的枯草芽孢杆菌工程菌，能够高分泌表达重组肝素酶Ⅰ，分泌表达的重组肝素酶Ⅰ具有较高的活性和产量，能够用于工业化生产低分子肝素、肝素的研究和临床用药。

附图说明

枯草芽孢杆菌工程菌，菌株名为WB600(pBE2-S-H)，分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5757，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

图1为重组表达质粒pBE2-S-H的构建过程示意图。

图2为目的基因HepA PCR产物的电泳图，其中，泳道M为1kb DNA ladder(10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp)，泳道1为HepAPCR产物。

图3为SacB启动子和信号肽基因PCR产物的电泳图，其中，泳道M为DNAMarker Ⅰ(700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1为SacB启动子和信号肽基因PCR产物。

图4为载体pBE2-S的PCR验证的电泳图，其中，泳道M为DNA Marker Ⅰ(700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1～3为阳性转化子的PCR产物，泳道4为空质粒转化子的PCR产物。

图5为重组表达载体pBE2-S-H的PCR及双酶切验证的电泳图，其中，泳道M为1kb DNAladder(10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp)，泳道1～4为阳性转化子的PCR产物，泳道5为空质粒转化子的PCR产物，泳道6～9为阳性转化子的双酶切产物。

图6为工程菌中表达载体pBE2-S-H的PCR验证的电泳图，其中，泳道M为1kb DNA ladder(10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp)，泳道1～4为阳性转化子的PCR产物，泳道5为空质粒转化子的PCR产物。

图7为工程菌WB600(pBE2-S-H)发酵液上清的SDS-PAGE图，其中，泳道M为低分子量蛋白质Marker(94.0kD、66.2kD、45.0kD、33.0kD、26.0kD、20.0kD、14.4kD)，泳道1为空白对照菌WB600(pBE2-S)的发酵液上清，泳道2、3分别为工程菌WB600(pBE2-S-H)诱导12h、24h的发酵液上清。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1 构建表达重组肝素酶Ⅰ的枯草芽孢杆菌工程菌——枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600(pBE2-S-H)。

一、肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ基因的获得

提取肝素黄杆菌DSMZ 2366基因组DNA，根据肝素酶Ⅰ基因序列，设计一对引物H1和H2，进行常规聚合酶链式反应，扩增肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ基因序列，得到1100bp的DNA片段(见图2)，产物扩增纯化后克隆到pGEM

-T Easy载体上，构建成重组质粒HepA/pGEM

-T Easy，序列测定结果表明，获得的肝素酶Ⅰ基因序列与GenBank号为EU541216.1的5′-端第1-1089位碱基的核苷酸序列(SEQ ID NO.2所示)完全一致。两条引物分别为：

H1：5′CGGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3′

H2：5′CGGAATTC

TCTGGCAGTTTCGCTGT 3′

其中，L1的5′-端加入限制性内切酶位点BamH Ⅰ，L2的5′-端加入限制性内切酶位点EcoR Ⅰ。

二、含有肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ编码基因的表达载体pBE2-S-H的构建

含有肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ编码基因的表达载体pBE2-S-H的构建过程参见图1描述。

1、SacB启动子和信号肽序列的获得

以枯草芽孢杆菌WB600基因组DNA为模板扩增SacB启动子和信号肽基因序列，SacB基因编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶，得到550bp的DNA片段(见图3)，产物扩增纯化后克隆到pGEM-T Easy载体上，构建成重组质粒SacB/pGEM-T Easy，序列测定结果表明，获得的SacB启动子和信号肽基因序列与GenBank号为X02730.1的5′-端第1-550位碱基的核苷酸序列完全一致。两条引物分别为：

S1：5′CGAAGCTTGATCCTTTTTAACCCATC 3′

S2：5′CGGGATCCCGCAAACGCTTGAGTTGC 3′

其中，S1的5′-端加入限制性内切酶位点HindⅢ，S2的5′-端加入限制性内切酶位点BamH Ⅰ。

2、载体pBE2-S的构建

将重组质粒SacB/pGEM

-T Easy和质粒pBE2(郭兴华，熊占，周民，等.枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建[J].生物工程学报，1991，7(3)：224-229.)均利用HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切，回收纯化SacB(H/B)和pBE2(H/B)，将二者用T4 DNA连接酶连接，4℃反应过夜。

感受态细胞的制备：挑取单个大肠杆菌TG1(购自Sigma公司)菌落，接种于LB培养基3mL中，37℃培养12h，按1∶100二次接种于LB培养基50mL中，37℃培养3h，待菌液OD₆₀₀＝0.35时，4℃、5000r/min离心10min，弃上清，沉淀用0.1mol/L CaCl₂悬浮，再以5000r/min离心10min，弃上清，沉淀以适量0.1mol/L CaCl₂悬浮，分装后于-80℃备用。

连接产物的转化：取上述连接产物加入大肠杆菌TG1感受态细胞50μL冰浴30min，42℃热击90s，迅速置冰浴2min，加入LB培养基1mL，37℃培养1.5h，取菌液涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的固体LB平板上培养，筛选得到具有氨苄青霉素抗性的转化子，提取转化子质粒后以S1和S2为引物进行PCR验证。

结果如图4所示，泳道M为DNAMarker Ⅰ(700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1～3为阳性转化子的PCR产物，泳道4为空质粒转化子的PCR产物。经PCR扩增鉴定，挑取的阳性转化子可扩增得到一条约550bp的单一条带，与SacB启动子和信号肽基因的大小一致，而空质粒转化子经PCR后没有这一特异条带。这表明SacB启动子和信号肽基因已经***到质粒pBE2中。

3、表达载体pBE2-S-H的构建

将重组质粒HepA/pGEM

-TEasy和载体pBE2-S均利用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，回收纯化HepA(B/E)与pBE2-S(B/E)，将二者用T4DNA连接酶连接，4℃反应过夜。

取上述连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，筛选得到具有氨苄青霉素抗性的转化子，提取转化子质粒后以S1和H2为引物进行PCR验证和BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切验证。

结果如图5所示，泳道M为1kb DNA ladder(10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp)，泳道1～4为阳性转化子的PCR产物，泳道5为空质粒转化子的PCR产物，泳道6～9为阳性转化子的双酶切产物。经PCR扩增鉴定，挑取的阳性转化子可扩增得到一条约1650bp的单一条带，与SacB启动子和信号肽基因加HepA基因的大小一致，而空质粒转化子经PCR后没有这一特异条带。而且阳性转化子的双酶切产物得到两个条带，分别是约1100bp的HepA(B/E)和约6.7kb的pBE2-S(B/E)。这表明HepA基因已经***到质粒pBE2-S中。

三、表达重组肝素酶Ⅰ的枯草芽孢杆菌工程菌——枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600(pBE2-S-H)的构建

1、工程菌WB600(pBE2-S-H)的构建

将E.coli TG1(pBE2-S-H)培养扩增，按照质粒小提试剂盒说明书，提取重组质粒pBE2-S-H，最后用去离子水溶解质粒。将其电转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞，在含硫酸卡那霉素(10μg/mL)的固体LB平板上培养，筛选阳性转化子。与此同时，以空载体pBE2-S为阴性对照。

具体方法是：

枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞的制备：挑WB600单菌落于LB培养基3mL中，37℃振荡培养12h；取过夜培养物2.6mL于电转培养基(LB培养基+0.5mol/L D-山梨醇)40mL中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.85～0.95；收获菌液，冰浴10min，4℃、5000r/min离心5min收集细胞；用预冷的电转缓冲液(0.5mol/LD-山梨醇，0.5mol/LD-甘露醇，10％甘油)50mL重悬细胞，4℃、5000r/min离心5min，弃上清，如此漂洗4次；用1/40初始培养物体积的预冷电转培养基重悬细胞，使细胞终浓度为1～1.3×10¹⁰cfu/mL，分装后于-80℃备用。

将感受态细胞置于冰上直至融化，轻轻振动EP管使之混匀，取WB600感受态细胞60μL与重组载体DNA溶液1～8μL(50ng～100ng)混合，加入预冷的电转杯(1mm)中，冰浴2min后用电穿孔仪进行电转化，条件为：电压2000V，电容25μF，电阻200Ω，电击时间4～5ms。

电击后立即加入复苏液(LB+0.5mol/LD-山梨醇+0.38mol/LD-甘露醇)1mL，混匀后转入无菌EP管中，37℃、100r/min，复苏3h。然后以12000r/min离心5min，弃上清，用复苏液200μL重悬细胞，涂布于含硫酸卡那霉素(10μg/mL)的固体LB平板上，37℃培养16～24h。

挑取数个具有Kan抗性的转化子菌落，培养扩增后提取质粒(用溶液P1重悬菌体后，加溶菌酶溶液使其终浓度为18mg/mL，37℃水浴1h，后续步骤按质粒小提试剂盒说明书)，以S1和H2为引物进行质粒PCR验证。扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其大小是否正确。结果如图6所示，泳道M为1kb DNA ladder(10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp)，泳道1～4为阳性转化子的PCR产物，泳道5为空质粒转化子的PCR产物。挑取的阳性转化子可扩增得到一条约1650bp的单一条带，与SacB启动子和信号肽基因加HepA基因的大小一致，而空质粒转化子经PCR后没有这一特异条带，说明重组表达载体pBE2-S-H已经转化成功。

将工程菌WB600(pBE2-S-H)和空白对照菌WB600(pBE2-S)分别取50μL冻存菌种至LK(Kan终浓度为10μg/mL)3mL中，37℃、220r/min，振荡培养过夜。然后将菌液按5∶100转接至LK中进行扩大培养，约6h后OD₆₀₀＝0.6～0.8时加入蔗糖，使其终浓度为2％，继续培养24h。

以8000r/min离心收集发酵液，取2mL加入2倍冰冷无水乙醇中，于-20℃放置1h或更久，4℃、12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用适量样品缓冲液溶解，沸水浴10min，放冷后进行SDS-PAGE分析，检测重组蛋白的分泌表达情况。电泳条件：恒压90V，约0.5h后进入分离胶，调整电压至130V继续电泳，约2h，待前沿迁移至胶板下沿1cm时结束电泳。电泳结果如图7所示，泳道M为低分子量蛋白质Marker(94.0kD、66.2kD、45.0kD、33.0kD、26.0kD、20.0kD、14.4kD)，泳道1为空白对照菌WB600(pBE2-S)的发酵液上清，泳道2、3分别为工程菌WB600(pBE2-S-H)诱导12h、24h的发酵液上清。工程菌WB600(pBE2-S-H)的发酵液上清在43.8kD有肝素酶Ⅰ的特异条带，说明肝素酶Ⅰ在WB600中实现了分泌表达。

2、工程菌WB600(pBE2-S-H)表达重组肝素酶Ⅰ的活性测定

重组工程菌WB600(pBE2-S-H)的发酵液经8000r/min离心10min，收集上清，以备活性检测。活性测定采用A₂₃₂法：在2mL EP管中加入反应缓冲液500μL和待测液100μL，置30℃水浴30min(以双蒸水100μL作为空白对照)，然后加入测定缓冲液900μL，立即测定A₂₃₂，计算反应前后体系A₂₃₂的变化值，即可计算肝素酶Ⅰ的活性。酶活定义是：以1min内产生1μmol产物所需的酶量为一个单位。其中涉及的溶液配方是：反应缓冲液(以mmol/L计)：Tris-HCl(pH7.4)20mmol，NaCl 44mmol，CaCl₂ 3.5mmol，肝素25g。测定缓冲液(以mmol/L计)：Tris-HCl(pH7.4)20mmol，NaCl 200mmol。

结果测得重组工程菌WB600(pBE2-S-H)发酵液中肝素酶Ⅰ的活性为13000U/L，远远高于文献报道(S.Ernst，G.Venkataraman，S.Winkler，et al.Expression in Escherichia coli，purificationand characterization of heparinase Ⅰ from Flavobacterium heparinum[J].Biochem.J，1996，315：589-597.)的在大肠杆菌BL21(DE3)中以可溶形式表达的3898U/L。申请人将该重组工程菌进行了保藏，分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5757。

本实验室也曾试图在乳酸菌表达***中来表达肝素酶Ⅰ，构建了含有肝素酶Ⅰ的重组质粒pNZ8148-H，后转化乳酸乳球菌，使用NISIN进行诱导表达，但未见重组蛋白表达。本发明通过枯草芽孢杆菌WB600不但成功实现了肝素酶Ⅰ的重组表达，而且将发酵液酶活提高到了13000U/L，取得了预料不到的酶活效果。需要注意的是，本发明的枯草芽孢工程菌的构建方法是有成功率的，也就是说，利用本发明的枯草芽孢工程菌的构建方法所得到的重组工程菌，并非都能够高效分泌表达肝素酶Ⅰ，本发明的保藏的菌株，是发明人通过多次实验所得到的效果最好的重组工程菌，其发酵液酶活提高到了13000U/L，远远高于其它通过同样的方法构建得到的工程菌。