CN102242092A - 一种家蚕肠道益生菌的分离鉴定及其酶基因的克隆与表达 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种家蚕肠道益生菌的分离鉴定及其酶基因的克隆与表达方法，对家蚕肠道中蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定及酶基因的克隆与表达，对改善家蚕肠道环境，提高桑叶、饲料淀粉消化率及叶丝转化率有着重要的意义。本发明过程中筛选出的家蚕肠道产酶菌，属于饲料级微生物添加剂范围，具有较好的应用前景。

Description

一种家蚕肠道益生菌的分离鉴定及其酶基因的克隆与表达

技术领域

本发明涉及一种家蚕肠道益生菌的分离鉴定及其酶基因的克隆与表达方法，属生物技术领域。

背景技术

动物肠道是多种微生物生长繁殖的理想场所。正常肠道微生物对宿主具有营养、免疫、生长刺激、生物拮抗等作用，是机体的生理组成部分。蚕是有着巨大经济效益和社会效益的重要经济昆虫。但是蚕业生产过程中一直存在着叶丝转化率低(10％左右)，桑叶成本占蚕茧生产成本的50％以上。同时，蚕病发生率高，我国每年因蚕病损失的茧量达10％以上。因此，通过多种渠道提高蚕对桑叶的利用率，提高叶丝转化率，减少蚕病的发生，是蚕业生产上长期面临的重要课题。微生态制剂的应用与发展为解决这些问题提供了良好的途径。在动物疾病的防治中，抗生素应用弊端日益显现，微生态制剂具有促动物生长、防治疾病，无副作用等特点，也因此成为抗生素理想的替代品之一。

家蚕作为一种重要的经济动物与鳞翅目昆虫研究模型，具有生长快、周期短的特点。在幼虫期20多天时，家蚕除了本身具有消化食物的能力之外，肠道中种类繁多、数量巨大的微生物群体也对其食物的消化和营养的吸收起重要作用。同时，由于长期驯化的结果，家蚕防病能力极其脆弱；肠道内有益菌群的存在，能够有效地帮助家蚕抵制内源性细菌病害的侵袭。因此，肠道里的微生物对家蚕具有重要意义，将产酶益生菌添加到家蚕人工饲料中或涂抹于桑叶表面喂食家蚕，将有利于蚕充分消化吸收营养物质，提高饲料效率。

家蚕的中肠是消化桑叶的主要场所，聚集着大量各种各样的微生物，这些微生物在家蚕饲料消化、疾病发生等方面起着重要作用，因而它们是作为家蚕微生态制剂的很好材料。肠道益生菌可通过其所分泌的酶起到益生作用。研究蚕肠道菌及其产酶并对产酶基因进行原核表达分析，在改善蚕肠微生态环境及蚕人工饲料开发上有一定意义。

目前国内关于家蚕肠道益生菌的研究主要集中于其抗病与助消化方面，尚处于起始阶段。易发平等对不同蚕期、不同龄期间肠道好氧微生物种群构成及其变化进行了***的研究(西南农业大学学报，2001，23(2)：117-119)，但没有对益生菌群进行研究。高绘菊等对家蚕肠道产蛋白酶菌株进行了分离与筛选(家蚕肠道产酶菌的分离与筛选，蚕业科学，2007，33(2)：228～233.)，从家蚕肠道中分离得到30株菌株，研究了它们的胞外淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶的产酶能力，家蚕肠道中的各种产酶菌高达60％，表明了肠道菌在家蚕食物消化过程中的重要性，但未对产酶微生物作出鉴定。孙雪奇等从家蚕肠道内筛选出多株好氧及兼性厌氧微生物(家蚕肠道好氧和部分兼性厌氧微生物及蚕用微生态制剂的研究[J].四川蚕业，1996，24(1)：13-15.)，选用其中5个属的5株菌，加上另一种菌配成4种混合菌液，在家蚕4龄最后一天进行添食试验，其结果是发病率明显降低，全茧量和茧层量也有较大提高。其它关于家蚕基因和人类互作效应方面的研究较多。目前尚未见关于家蚕肠道产酶益生菌的定向选育与作用机理研究的报道。

目前关于α-淀粉酶的研究，主要集中在分子改良及工业生产应用方面。包括对该酶基因的启动子功能、编码区序列的克隆及在不同表达体系中进行原核及真核表达等，以及对其基因突变、基因表达调控、将基因转入植物中的表达研究和基因功能的机理研究，如耐热性的作用机制，极端环境下其酶学性质等，对含该基因的重组质粒在传代过程中的保持率等问题也引起了较多关注。工业生产应用方面也有较多的研究报导。目前，暂未见肠源性蜡样芽孢杆菌及其所产酶类在蚕业微生态制剂方面的应用，且关于肠源性α-淀粉酶产生菌的研究报导也不多。

发明内容

本发明的目的在于提供一种家蚕肠道益生菌的分离鉴定及其酶基因的克隆与表达方法，对家蚕肠道中蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定及酶基因的克隆与表达，对改善家蚕肠道环境，提高桑叶、饲料淀粉消化率及叶丝转化率有着重要的意义。

本发明的目的在于提供一种家蚕肠道益生菌酶，它是肠道微生物源α-淀粉酶，具有SEQID NO 3所述的氨基酸序列。

本发明的目的还在于：

提供一种家蚕肠道益生菌酶的基因，具有SEQ NO ID 1或SEQ NO ID 2所述碱基序列。

提供一种含上述基因的表达载体及由表达载体转化的宿主细胞。

本发明的另一目的在于：提供一种家蚕肠道益生菌酶菌株的分离方法，包括以下步骤：

1)随机取家蚕大造品种五龄幼虫，饥饿24h后待用；

2)将步骤1)中的蚕体浸入体积浓度75％乙醇中体表消毒后，移入无菌水中漂洗2次，无菌操作取出肠道，捣碎后分别移入NA液体培养基中，进行富集培养；培养条件：150r/min，28℃，48h，培养2次。将第2次富集液按10倍稀释法稀释后分别取0.2mL涂布于NA固体培养基上上，于28℃培养箱中培养；

3)将经步骤2)培养出的菌落用划线法分离成单个菌落，将所得的菌种进行平板接种，于28℃培养箱中培养48h；

4)用接种针取纯化后的菌种点接在预先准备好的NA淀粉筛选培养基平板上，28℃培养箱中培养48h，加碘液染色观察，有水解现象，并且在对照NA培养基上未水解的菌株，即为筛选所得产淀粉酶菌株。

与已有技术相比，本发明的有益效果具体体现在：

本发明通过对家蚕肠道中蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定及克隆与表达基因来获得淀粉酶酶基因，对改善家蚕肠道环境，提高桑叶、饲料淀粉消化率及叶丝转化率有着重要的意义。

本发明过程中筛选出的家蚕肠道产酶菌，属于饲料级微生物添加剂范围，具有较好的应用前景。

附图说明

图1是本发明产淀粉酶菌株的筛选结果。

图2a是本发明DZ-a号菌显微镜观察结果。

图2b是本发明DZ-h号菌显微镜观察结果。

图3是本发明基因扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测的结果。

图3中M为MarkerD，1，2，3，4，5，6分别代表引物Primer3004-4081扩增DZ-a片段、Primer3004-4081扩增DZ-h片段、Primer512-1751扩增DZ-a片段、Primer512-1751扩增DZ-h片段、Primer666-2041扩增DZ-a片段、Primer666-2041扩增DZ-h片段。

图4是本发明基因胶回收，1％琼脂糖凝胶电泳检测的结果。

图4中M为MarkerD，1，2，3，4，5，6分别代表引物Primer3004-4081扩增DZ-a片段、Primer3004-4081扩增DZ-h片段、Primer512-1751扩增DZ-a片段、Primer512-1751扩增DZ-h片段、Primer666-2041扩增DZ-a片段、Primer666-2041扩增DZ-h片段。

图5是pET28a-DZamy表达产物SDS-PAGE分析。

图5中：1：Transetta(DE3)菌体蛋白；2：未经IPTG诱导的蛋白样品；3-8：IPTG诱导浓度分别是0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，1.0mM和1.2mM时的重组蛋白的表达；M：蛋白分子量标准。

以下结合附图通过具体实施方式对本发明做进一步说明

具体实施方式

1.材料的选择及培养基的制备

11.家蚕肠道样品家蚕Bombyx mori大造品种由安徽农业大学蚕学教研室提供，由人工饲料喂养至五龄蚕作为供试材料。

1.2试验用培养基NA培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、NaCl5.0g、琼脂18.0g、水1L，pH为7.2～7.4。NA淀粉筛选培养基：NA培养基添加1.0％的可溶性淀粉。LB培养基：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、水1L，pH 7.0，固体培养基添加1.5％的琼脂粉，高压灭菌后备用。液体培养基不加琼脂。

1.3主要试剂及质粒K1201型UNIQ-10柱式细菌基因组DNA提取试剂盒，DNA分子量标记，PCR扩增试剂等购自上海生工生物工程有限公司；dNTPs、感受态细胞Trans5α、pEASYT1、Transetta等购自TransGen公司；质粒抽提试剂盒和凝胶回收试剂盒AP-GX-50，购自Axygen公司；PET-28(a+)Vector购自Novagen公司；BamHI和XhoI限制性内切酶，T4连接酶，PMD19-T Simple Vector等购自Takara公司，重组质粒pET28a-DZamy为本研究中构建。其它试剂均为国产分析纯试剂。

2.蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及其酶基因的克隆与表达过程

2.1家蚕肠道菌产淀粉酶菌株的筛选：

2.1.1随机取家蚕大造品种五龄幼虫10条，饥饿24h后待用.

2.1.2家蚕肠道菌的培养

将蚕体浸入体积浓度75％乙醇中体表消毒后，移入无菌水中漂洗2次，无菌操作取出肠道，捣碎后分别移入NA液体培养基中，进行富集培养。培养条件：150r/min，28℃，48h，培养2次。将第2次富集液按10倍稀释法稀释后分别取0.2mL涂布于NA固体培养基上，于28℃培养箱中培养。

2.1.3家蚕肠道菌的分离纯化

将培养出的菌落用划线法分离成单个菌落，直至经显微镜观察为单一菌体，保存备用。

2.1.4家蚕肠道菌的形态观察

将分离纯化的菌种进行平板接种，于28℃培养箱中培养48h。

2.1.5产淀粉酶菌株的筛选

用接种针取纯化后的菌种点接在预先准备好的NA淀粉筛选培养基平板上，在28℃培养箱中培养48h加碘液染色观察，对于有水解现象并且在其对照NA平板上未见水解的菌株，即为筛选所得的产酶分离菌。筛选结果如下：

产淀粉酶菌在NA淀粉培养基上出现产酶透明圈，如图1所示。从中挑选形态较典型的两株菌，编号为DZ-a号、DZ-h号，NA液体培养基富集培养后，DNS法测定酶活，见表1。酶活定义：在pH7.0，40℃条件下，每分钟降解可溶性淀粉释放1微摩尔还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位，以U·mL-1表示。

表1酶活测定结果

2.1.6镜检及观察

观察菌落形态、菌落颜色、菌落大小及菌落生长速度特征。

产酶菌DZ-a、DZ-h号菌镜检均为革兰氏阳性菌，单个菌体为杆状，菌体两端较平整，多数链状排列，均处于对数生长期，芽孢不明显，如图2a和图2b所示，菌落形态特征见表2。表2家蚕肠道分离菌菌落特征

2.2淀粉酶活性的测定用DNS法，反应底物为1％可溶性淀粉溶液。

2.3产淀粉酶细菌基因组DNA的提取分别制作分离菌的生长曲线，找出对数生长期，用柱式细菌基因组DNA提取试剂盒，提取对数生长期细菌的总DNA。

2.4  16SrDNA序列的PCR扩增及克隆测序用引物27f-1492r扩增分离菌DZ-a号、DZ-h号的16SrDNA序列。PCR反应条件为：94℃，10min；94℃，35s，54℃，40s，72℃，90s，35个循环；72℃，10min，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物经凝胶电泳分离后，利用胶回收试剂盒进行产物的回收和纯化。然后将目的基因片段与PMD-19T载体连接，转入DH5a感受态细胞中培养。筛选出阳性克隆，送上海Initrogen公司测序。

2.5 16SrDNA序列分析及数据处理利用Primer5.0、DNAStar软件包设计引物和分析序列；NCBI数据库中的BLAST，ClustalW及Interproscan等工具用于序列比对和同源性分析；采用MEGA4.0软件中的Neighbor-joining方法构建***进化树。

2.6蜡样芽孢杆菌产α-淀粉酶基因片段的克隆根据α-淀粉酶基因在蜡样芽孢杆菌基因组序列CP001283.1中的位置，设计3对引物分段扩增蜡样芽孢杆菌产α-淀粉酶基因：Primer666：5‘-CATAGCCACCCATACCT-3’，Primer2041：5‘-ATCTCCATTAGCGAACC-3’；Primer512：5‘-CCATCAGCAGCAGGTCC-3’，Primer1751：5‘-TCCACTTCCCGTCTTTC-3’；Primer3004：5‘-TTGTCGCAAATGTATGG-3’，Primer4081：5‘-CTCGCGTTGTATCTCGT-3’，3对引物均由英骏生物公司合成。分别以DZ-a、DZ-h号菌基因组DNA为模板进行扩增，PCR反应条件：94℃，10min；94℃，35s，57℃，40s，72℃，90s，35个循环；72℃，10min，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。胶回收、目的基因克隆过程同2.4，阳性克隆菌液送上海Initrogen公司测序，扩增产物电泳检测，如图3、图4所示。

2.7产酶基因克隆测序结果分析及***发育树绘制将2株蜡样芽孢杆菌各自的三段α-淀粉酶基因克隆测序结果拼接后得到的完整淀粉酶基因编码区序列，***发育树绘制方法同2.5。

2.8原核表达载体的构建以前述的细菌基因组DNA为模板，设计引物PrimerB、PrimerX扩增蜡样芽孢杆菌淀粉酶基因的ORF片段。其中PrimerB：5’CA

ATGCTTAAAGAAGCCATTTA 3’，PrimerX：5’GAC

TTACCATTTTAATATGGAGAA 3’(斜体下划线部分为分别BamHI和XhoI酶切位点)，PCR反应条件：94℃，10min；94℃，35s，57℃，40s，72℃，120s，35个循环；72℃，10min。PCR产物经纯化后连入pEASY T1载体，转化大肠杆菌TransT1。选取阳性克隆进行扩大培养并提取质粒，后与pET-28(a+)载体均以BamHI和XhoI限制性内切酶分别进行酶切反应。在线分析该酶基因编码区序列所含稀有密码子http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/。酶切产物连接后转化大肠杆菌Transetta(DE3)，经酶切鉴定后获重组表达质粒。

2.9重组蛋白的表达与鉴定将重组质粒pET28a-DZamy转化宿主菌Transetta(DE3)，涂布选择性平板筛选阳性克隆。准备6个离心管，每管取相同量200μL的阳性克隆菌液，然后向培养的阳性克隆菌液中分别加入浓度为0mmol/L，0.2mmol/L，0.4mmol/L，0.6mmol/L，0.8mmol/L，1.0mmol/L，1.2mmol/L的IPTG加入体积分别为：0mmol/L不加，0.2mmol/L加24μL，0.4mmol/L加48μL，0.6mmol/L72μL，0.8mmol/L96μL，1.0mmol/L120μL，1.2mmol/L的IPTG144μL，诱导4h后离心收集菌体。菌体经PBS悬浮后，用超声波进行细胞破碎(300W，20min，超声3s，间隔2s)，提取大肠杆菌总蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，如图5所示。

3.蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及其酶基因的克隆与表达结果

本发明从家蚕肠道中筛选出2株产α-淀粉酶的细菌菌株DZ-a号和DZ-h号，鉴定为芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌，DNS法测其产酶活分别为20.5U·mL^-1和24.2U·mL^-1。对产酶基因进行克隆后测序分别得到3414、3378个碱基的2个序列，均包含完整ORF框，并将其中DZ-a号菌α-淀粉酶基因在大肠杆菌表达***中进行原核表达，SDS-PAGE分析得到大小约66kD的目的蛋白DZamy，为该酶的进一步的功能研究及该产酶菌在微生态制剂方面的应用奠定基础。该发明过程中筛选出的家蚕肠道产酶菌，属于饲料级微生物添加剂范围，具有较好的应用前景。

Claims (6)

1.一种家蚕肠道益生菌酶，其特征在于，具有SEQ ID NO 3所述的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述家蚕肠道益生菌酶的基因，其特征在于，具有SEQ NO ID 1或SEQ NO ID 2所述碱基序列。

3.含权利要求2所述基因的表达载体。

4.由权利要求4所述表达载体转化的的宿主细胞。

5.一种家蚕肠道益生菌酶的分离方法，其特征在于，包括以下步骤，

1)随机取家蚕大造品种五龄幼虫，饥饿24h后待用；

2)将步骤1)中的蚕体浸入体积浓度75％乙醇中体表消毒后，移入无菌水中漂洗2次，无菌操作取出肠道，捣碎后移入NA液体培养基中，进行富集培养；培养条件：150r/min，28℃，48h，培养2次，将第2次富集液按10倍稀释法稀释后分别取0.2mL涂布于NA固体培养基上，于28℃培养箱中培养；

3)将经步骤2)培养出的菌落用划线法分离成单个菌落，将所得的菌种进行平板接种，于28℃培养箱中培养48h；

4)用接种针取纯化后的菌种点接在预先准备好的NA淀粉筛选培养基平板上，28℃培养箱中培养48h，加碘液染色观察，有水解现象，并且在对照NA培养基上未水解的菌株，即为筛选所得产淀粉酶菌株。

6.根据权利要求5所述的一种家蚕肠道益生菌酶的分离方法，其特征在于，所述NA培养基按如下配比：每升水中含有蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、NaCl5.0g、琼脂18.0g，pH为7.2～7.4；所述NA淀粉筛选培养基是以NA培养基为基础添加质量分数1.0％的可溶性淀粉；所述LB培养基按如下配比：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、水1L，pH 7.0。

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