CN103923846B - 一种巴斯德毕赤酵母培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种巴斯德毕赤酵母培养基。该培养基中不含KOH和H₃PO₄，从而降低了对环境的破坏程度，便于发酵设备维护，而且使用本发明所提供的培养基大规模培养巴斯德毕赤酵母菌株，细胞密度及重组蛋白表达量均能达到较高水平，降低了发酵的生产成本，利于工业化规模的发酵和生产。

Description

一种巴斯德毕赤酵母培养基

技术领域

本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种用于培养巴斯德毕赤酵母的培养基。

背景技术

巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris），是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。巴斯德毕赤酵母是单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传学操作；巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶1（AlcoholOxidase1，AOX1）基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达；目的基因整合在染色体上具有高稳定性；可高水平分泌表达重组蛋白，纯化方便；具有真核细胞的翻译后修饰功能。以上优势使得巴斯德毕赤酵母表达***成为目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一。

发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌体浓度，又要使长好的菌体能迅速合成产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。在巴斯德毕赤酵母高密度发酵培养基方面，人们多采用Invitrogen公司提供的标准配方：小规模发酵采用BMGY/BMMY培养基；大规模发酵采用BMGY/BSM培养基。

巴斯德毕赤酵母BMGY/BMMY培养基中，主要成分是酵母提取物（YeastExtract）、蛋白胨（Peptone）和无氨基酵母氮源（YeastNitrogenBase）等。酵母提取物是酵母经破壁后将其中蛋白质、核酸、维生素等抽提，再经生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分的物质，其中氨基酸含量30%以上、总蛋白50%以上、核苷酸10%以上。蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。BMGY/BMMY培养基只适用于巴斯德毕赤酵母的小规模培养；放大培养时，由于有机氮源单位体积的成本过高，而且上述有机、动物来源的成分存在着外源污染的可能，给下游纯化工艺带来多重困难，所以巴斯德毕赤酵母的大规模培养多采用BSM无机培养基。

巴斯德毕赤酵母大规模发酵BSM无机培养基中，应用了大量的磷酸和氢氧化钾。磷酸（H₃PO₄）是一种中强酸，在空气中易潮解，对人体的健康危害较大。发酵生产中，由于其酸的腐蚀性，在设备的材料和制造上均需要考虑其影响。氢氧化钾（KOH），在空气中极易吸湿而潮解，高温时挥发而不分解，有强烈腐蚀性，吸入后强烈刺激呼吸道或造成灼伤；皮肤和眼直接接触可引起灼伤；长期接触会带来肺损害、视觉损害、嗅觉损害等诸多不良后果。

因此，有必要提供一种更加环保经济的巴斯德毕赤酵母培养基，降低对环境的破坏程度，便于发酵设备的维护，同时能够得到较高的细胞密度及重组蛋白表达量，降低发酵的生产成本，从而利于巴斯德毕赤酵母工业化规模的发酵和生产。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种巴斯德毕赤酵母培养基，以弥补现有技术的不足。

本发明提供的巴斯德毕赤酵母培养基不含KOH和H₃PO₄，含有NH₄H₂PO₄与KH₂PO₄。

本发明提供的巴斯德毕赤酵母培养基不含KOH和H₃PO₄，含有1.575～31.5g/L的NH₄H₂PO₄与1.155～23.1g/L的KH₂PO₄。

本发明提供的巴斯德毕赤酵母的培养基，按培养基的总体积计，所述培养基含有以下成分：

根据本发明的一个优选实施例，按培养基的总体积计，所述培养基含有以下成分：

本发明前述提供的培养基，用于培养巴斯德毕赤酵母。

根据本发明的一个优选实施例，前述提供的培养基在培养巴斯德毕赤酵母的过程中作为发酵培养基使用。

根据本发明的一个优选实施例，前述提供的培养基在培养巴斯德毕赤酵母的过程中作为种子培养基使用。

本发明所述的巴斯德毕赤酵母是野生型、经过改造的含有外源基因的重组工程菌株中的一种。

本发明提供的培养基避免了酸、碱对环境、人员和发酵设备的危害，降低了发酵的生产成本，同时也能够得到较高的细胞密度及重组蛋白表达量。本发明提供的培养基，在利用巴斯德毕赤酵母表达***表达重组蛋白的生产中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1采用本发明的培养基作为摇瓶水平的发酵培养基，整个发酵周期的菌体生长曲线。

图2采用本发明的培养基作为30L发酵罐的发酵培养基，整个发酵周期的菌体生长曲线。

图3采用本发明的改良Ⅳ培养基作为30L发酵罐的种子培养基与发酵培养基，整个发酵周期的菌体生长和蛋白表达曲线。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明，下述实施例不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因***到载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和纯化的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiais，T.(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，2ndedition，ColdspringHarborLaboratoryPress.

在本发明的下述实施例中，使用的巴斯德毕赤酵母为菌种保藏号为CGMCCNo.1360的菌株，以下称为HSA75-10，该菌含有人血白蛋白的重组基因，经诱导可分泌表达重组人血白蛋白（HSA）。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)HSA75-10已于2005年04月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，登记入册编号为CGMCCNo.1360，CGMCC位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例中作为对照的培养基及溶液，所有试剂及原料均购自Sigma公司：

1）BMGY培养基：

2）BSM培养基：

3）PTM1溶液：

4）100mM磷酸钾缓冲液：

K₂HPO₄61.5g/L

KH₂PO₄8.5g/L

调pH至7.0，灭菌，4℃保存。

5）补料培养基：50%甘油；含1%PTM1的甲醇。

实施例1培养基的制备

在本发明的下述实施例中，使用的培养基按培养基的总体积计，含有以下成分：

在上述培养基的基础上，按表1的配方分别制备培养基，获得四种不同的改良型培养基，分别命名为改良Ⅰ、改良Ⅱ、改良Ⅲ和改良Ⅳ。

表1

配制过程如下，以80％～90％终体积的注射用水将表中成分溶解，充分搅拌后，测定pH，以氨水调pH之后，用注射用水定容至终体积。

实施例2、摇瓶水平菌株培养与检测

1）挑取YPD平板上HSA75-10单菌落接种于装有40mlBMGY的250ml摇瓶中，于200rpm、30℃摇床培养24h，制备得一级种子；

2）按5%的接种量将一级种子分别接入装有100mlBMGY、BSM、改良Ⅰ、改良Ⅱ、改良Ⅲ、改良Ⅳ的1L摇瓶中，于200rpm、30℃摇床继续培养；

3）每24小时向培养基中添加含1%PTM1的甲醇至培养基终浓度为0.5%；

4）按时间点0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h分别取菌液样品，分析菌体湿重；

5）菌体生长比较结果如图1所示。可以看出，HSA75-10在各种培养基条件下的生长趋势一致，且菌体湿重区别不大；

6）96h收集发酵上清，进行蛋白电泳检测HSA表达量，结果见表2。

表2

从表2中数据可以看出，以改良Ⅰ、改良Ⅱ、改良Ⅲ、改良Ⅳ作为摇瓶水平的发酵培养基，与BMGY和BSM相比，HSA的表达量并没有显著差异；

实施例3、30L发酵罐水平菌株培养与检测

1）将HSA75-10冻存种子管中的种液接种于5只装有200mlBMGY的1000ml摇瓶中，于200rpm、30℃培养24h，制备得一级种子。

2）按5%的接种量将一级种子批式接入装有20LBMGY、BSM、改良Ⅰ、改良Ⅱ、改良Ⅲ、改良Ⅳ的30L发酵罐（购自B.BRAUN公司）中，设定发酵初始温度为30℃、转速500rpm、通气20L/min（通气量为1V/V·min）、pH5.0后开始发酵。

3）发酵初始溶氧值100%,发酵开始4-6小时后，溶氧开始缓慢下降。待发酵培养基中的甘油消耗完，溶氧迅速上升近至100%，即开始补加补料培养基，补加速度以溶氧值控制，溶氧值控制在25-35%之间。

4）按时间点0、24、48、72、96、120、144、168h分别取菌液样品，分析菌体湿重，并自72h开始检测上清中HSA的表达量。

5）各种培养基条件下，菌体生长比较结果如图2所示。可以看出，同时采用不同配方的发酵培养基均可实现菌株的高密度培养，其中改良Ⅳ条件下菌体湿重最高。

6）各培养基条件下蛋白表达量结果见表3。可以看出上述所有的培养基条件下，均能高效表达重组蛋白，其中BMGY、BSM、改良Ⅳ三种培养基条件下，蛋白表达差异不显著。

表3

经过分析，应用BMGY做种子培养基，在采用不同配方的发酵培养基条件下，HSA的含量均为分泌蛋白的85%以上，其中各培养基差别不大。

实施例4、以改良Ⅳ作为种子培养基的菌株培养与检测

1）将HSA75-10接种于5只装有200ml改良Ⅳ的1000ml摇瓶中，于200rpm、30℃培养24h，制备得一级种子。

2）按5%的接种量将一级种子接入装有20L改良Ⅳ的30L发酵罐中，设定发酵初始温度为30℃、转速500rpm、通气20L/min（通气量为1V/V·min）、pH5.0后开始发酵。

3）发酵初始溶氧值100%,发酵开始4-6小时后，溶氧开始缓慢下降。待发酵培养基中的甘油消耗完，溶氧迅速上升近至100%，即开始补加补料培养基，补加速度以溶氧值控制，溶氧值控制在25-35%之间。

4）按时间点0、24、48、72、96、120、144、168、192、216h分别取菌液样品，分析菌体湿重。

5）菌体生长情况和HSA的表达量见图3，可以看出发酵周期216小时（其中甲醇诱导表达192小时），菌体湿重高达56%，蛋白表达量达16g/L上清，与实施例3中以BMGY作为种子培养基相比，并无显著差别，且略有增长。

本发明的发明人还选用另外2种巴斯德毕赤酵母细胞：KM71H与X33（购自Invitrogen公司），用上述培养基按照上述实施例2-4中的方法重复验证，均得到了相似的实验结果。说明本发明中提供的培养基可以用于其他巴斯德毕赤酵母小规模，或中试和生产规模中的培养应用。

Claims (6)

1.一种巴斯德毕赤酵母培养基，其特征在于，按培养基的总体积计，所述培养基由以下成分组成：

NH4H2PO41.575～31.5g/L

KH2PO41.155～23.1g/L

MgSO4·7H2O1.49～14.9g/L

K2SO40～18.2g/L

CaSO40.093～0.93g/L

甘油10～40g/L

PTM1溶液0.435～4.35ml/L

氨水调pH值至4.5～6.2。

2.如权利要求1所述的培养基，按培养基的总体积计，所述培养基由以下成分组成：

NH4H2PO415.75g/L

KH2PO41.155g/L

MgSO4·7H2O1.49g/L

K2SO41.82g/L

CaSO40.093g/L

甘油10g/L

PTM1溶液0.435mL/L

氨水调pH值至5.0。

3.权利要求1-2中任一项所述的培养基在培养巴斯德毕赤酵母中的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其中所述的培养为发酵培养。

5.如权利要求3所述的用途，其中所述的培养为种子培养。

6.如权利要求1-2中任一项所述培养基，其特征在于：所述的巴斯德毕赤酵母是野生型菌株或是经过改造的含有外源基因的重组工程菌株。