CN103923192B - 用于富集、分离和检测循环肿瘤细胞的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于富集、分离和检测循环肿瘤细胞的多肽及其应用，所述多肽的氨基酸序列为SEQ？ID？NO:1所示的氨基酸序列；还包括多肽-磁性纳米颗粒，其含有磁性纳米颗粒和与其相偶联的上述所述的用于特异性识别肿瘤细胞的多肽；及所述多肽或多肽-磁性纳米颗粒在制备用于富集、分离或检测循环肿瘤细胞的产品或用于***转移相关疾病的药物中的应用。本发明提出了一种利用多肽细胞表面抗原进行特异性识别的新方法，并发明了一种新的富集、分离和检测CTC的多肽-磁性纳米颗粒物质，提供了一种富集、分离和检测CTC的快速、准确和低成本的检测技术，为临床肿瘤转移患者的诊断、治疗及预后提供了有效方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种多肽，尤其涉及一种可以用于富集、分离和检测循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCell，CTC）的多肽-磁性纳米颗粒及其制备方法和应用，该方法准确、快速，大大降低了富集、分离和检测上皮细胞粘附因子（EpithelialCellAdhesionMolecule，EpCAM）高表达的CTC细胞的成本。
背景技术
癌症是威胁人类的重大疾病之一，侵袭与转移是恶性肿瘤最显著的特征之一，肿瘤细胞自发或因诊疗操作从原发肿瘤脱落，发生上皮-间质转化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT），从而具有流动特性，进入外周血中，就形成了循环肿瘤细胞（CTC）。因此在外周血中检测到CTC预示着有可能发生肿瘤转移，另外，美国哈佛医学院的最新研究表明，原位肿瘤组织能够吸引CTC细胞再次浸润到原发肿瘤上从而促进肿瘤的生长（可参考K.Pantel等人，Nat.Rev.Clin.Oncol.2009,6,339-351；J.Kaiser等人，Science2010，327,1072-1074），因此CTC的高效检测对于研究肿瘤转移机制有指导意义，而且可以对指导肿瘤治疗、判断治疗效果、推断预后提供可靠参考，对监测肿瘤的转移或复发都有非常重要的意义。
自1869年澳大利亚医生ThomasAshworth在显微镜下首次从一名男性肿瘤转移患者的血液里观察到CTC以来，CTC的研究引起了人们的广泛关注。CTCs在血液中的含量极少（约几个CTCs/105～107个单个核细胞），人们对CTC的富集检测方法进行了不断的探究。这些方法可以分为两类：机械法和免疫分离法（可参考P.Paterlini-Brechot&N.L.Benali,CancerLett.2007，253,180-204）。前者是根据CTC与血液中的白细胞和红细胞的细胞直径及细胞密度不同，通过过滤或密度梯度离心的方法实现的；后者则主要是利用CTC表面的一些特异性标记物如：常见的上皮标记物细胞角蛋白（Cytokeratins，CKs）、上皮细胞粘附因子（EpCAM）、肿瘤胚胎抗原（CarcinoEmbryonicAntigene，CEA）和人表皮生长因子受体2（HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2，HER2）等，通过抗原抗体特异性结合反应实现CTC与血液中其他细胞的分离（可参考H.Xu等人，Biomaterials2011，32,9758-9765；S.L.Stott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2010，107,18392-18397；S.Nagrath等人，Nature2007，450,1235-1239；A.-E.Saliba等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2010，107,14524-14529；X.Wang等人，CancerRes.2011，71,1526-1532）。
与免疫分离方法相比，机械分离方法灵敏度底，分离的特异性差。因此人们不断改进免疫分离技术，试图提高分离效率。第一种被广泛用来检测CTC的是CellSearch，它是通过在磁珠上包被抗-EpCAM抗体实现对上皮组织来源的肿瘤细胞的识别，如乳腺癌和结肠癌细胞。CellSearch在临床上成功地用来评价肿瘤预后效果，于2004年被美国FDA批准用来作为乳腺癌转移的预后诊断方法；为了提高CTCs检测的准确度，麻省总医院（MGH）团队用一种叫做CTCChip的新装置来检测CTC，CTCChip有78000个微小的包被了抗-EpCAM抗体的作用位点，这样当血液流过时，只有肿瘤细胞被识别出来，MGH团队用于肝癌转移患者的临床测试结果于2007年在Nature上发表。其后，该组又用CTCChip收集肺癌患者的CTC并对其进行了基因分析。最近，AndrewWang课题组报到用抗体包被的纳米氧化铁颗粒分选CTCs的效率比用微球的分选方法效率大大提高，最大分选率达到84%。
在这些免疫分析中，上皮细胞粘附因子（EpCAM）和CKs是CTC检测的常用表面标志物。然而，由于抗体生产成本及生产技术的限制，导致这种基于EpCAM和CKs抗体检测CTC的技术成本较高，如CellSearch检测一个血样需要约600美元，因此寻找能与EpCAM和CKs特异性靶向结合的新型的化合物有重要的意义。
近年来，研究者们在利用多肽进行肿瘤细胞的识别，靶向肿瘤细胞表面方面展开了广泛的研究，人们已经从天然及合成的多肽中筛选出大量能分别靶向不同肿瘤细胞不同作用位点的多肽化合物（可参考M.Shadidi&M.Sioud，FASEBJ.2003，17,256-258；M.Shadidi&M.Sioud，DrugResist.Updates2003，6,363-371）。对于高转移肿瘤的CTC的检测，发展特异性识别EpCAM、CKs的多肽具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对目前检测CTC成本高的不足，提供一种富集、分离和检测CTC的新思路和新方法。本发明的一个目的是设计能够特异性识别CTC的多肽片段替代现有的抗-CTC抗体，从而降低检测成本。本发明的另一个目的是结合现有的纳米技术，将特异性识别多肽与纳米颗粒偶联，即提供一种多肽-纳米颗粒，提高对血液中稀少CTC的检测效率。本发明的又一个目的是提供特异性识别多肽-纳米颗粒在监测肿瘤的转移或复发肿瘤治疗效果评价方面的用途。
除非另外指明，本文中的“多肽-磁性纳米颗粒”是指“多肽在表面修饰的磁性纳米颗粒”。
除非另外指明，本文中的“2E7，2E8，2E9”分别表示“阴性细胞数为2×107个，2×108个，和2×109个”。
除非另外指明，本文中的“结合率”是指“一个磁性纳米颗粒的活性位点上修饰了多少条多肽”。
除非另外指明，本文中的“分离率”是指“分离的细胞样品的个数占加入的细胞样品个数的比例”。
针对上述目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽，所述多肽的氨基酸序列为下述SEQIDNO:1所示的氨基酸序列：
VRRDAPRFSMQGLDACGGNX1X2(X3)n1(X4)n2
其中，X1为Cys或Asn；
X2为Cys或Asn；
X3为Asn，n1=0或1；
X4为Asn，n2=0或1。
优选地，所述多肽的氨基酸序列选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，所述多肽可通过特异性结合细胞上皮粘附因子（EpithelialCellAdhesionMolecule，EpCAM）识别循环肿瘤细胞。
另一方面，本发明提供一种多肽-磁性纳米颗粒，其含有磁性纳米颗粒和与其相偶联的上述本发明所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽。
优选地，所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为0.01:5~4:5。
优选地，所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为1:5~3:5。
优选地，所述磁性纳米颗粒为链亲和素修饰的磁性纳米颗粒。
优选地，所述磁性纳米颗粒的粒径为600~1500nm。
优选地，所述磁性纳米颗粒的粒径为800nm。
还一方面，本发明提供一种上述本发明所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1）制备上述本发明所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽；
2）将步骤1）中的多肽制成生物素修饰的多肽溶液；
3）将链亲和素修饰的磁性纳米颗粒溶于缓冲液中制成溶液，优选地，还包括将磁性纳米颗粒溶液通过超声或涡旋的方法进行分散的步骤；
4）将步骤2）中生物素修饰的多肽溶液与步骤3）的磁性纳米颗粒溶液混合后，混匀，将多肽偶联到磁性纳米颗粒表面，即得。
优选地，所述生物素修饰的多肽溶液与链亲和素修饰的磁性纳米颗粒溶液以0.01:5~4:5的质量比混合，优选质量比为1:5~3:5，该质量比能够获得更好的效果。
优选地，于4~37℃混合0.5~2h。
优选地，于20~30℃混合10min~2h。
优选地，混合30~40min，该时间在确保获得较好的效果下，用时较少。
优选地，于恒温摇床上混合。
更优选地，于4℃的恒温摇床上混合。
还优选地，摇床的转速为150rpm。
再一方面，本发明提供一种上述本发明所述的用于特异性识别肿瘤细胞的多肽或上述本发明所述的用于特异性识别肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒在制备用于富集、分离或检测循环肿瘤细胞的产品中的应用。
优选地，所述产品为试剂盒或试剂。
又一方面，本发明提供一种上述本发明所述的用于特异性识别肿瘤细胞的多肽或上述本发明所述的用于特异性识别肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒在制备用于***转移相关疾病的药物中的应用。
优选地，所述肿瘤转移相关疾病为细胞上皮粘附因子（EpCAM）高表达相关的肿瘤。
更优选地，所述细胞上皮粘附因子高表达相关的肿瘤包括***癌、乳腺癌和肺癌。
还一方面，本发明提供了一种多肽-磁性纳米颗粒富集分离循环肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：
步骤A：制备生物素修饰的多肽溶液，制备磁性纳米颗粒分散的溶液，及生物素修饰多肽与磁性纳米颗粒的混合溶液，于摇床混合。
步骤B：将混合后的步骤A中的溶液，用强磁性磁铁吸引收集后，吸出溶液，而后用pH=7.2的PBS缓冲溶液将磁铁富集的颗粒重悬，再用磁铁富集，如此反复3遍，用pH=7.2的PBS重悬待用。
步骤C：将4体积%多聚甲醛固定，Hoechst.33342染色的EpCAM阳性的乳腺癌细胞（MCF-7）与EpCAM阴性的人早幼粒急性白血病细胞（HL-60）以50:2E7，50:2E8，50:2E9的比例混合分别混合成1ml的PBS溶液。
步骤D：取少量步骤B中修饰后的磁性纳米颗粒加入步骤C中的细胞混合液或待测血样，于摇床上混合。
步骤E：取下步骤D中的混合液，用强磁性磁铁吸引收集磁性纳米颗粒，弃去细胞液，用PBS重悬富集的磁性纳米颗粒，再用磁铁富集，如此反复3次。
步骤F：于显微镜下统计分离出的细胞并拍照。
优选地，所述步骤A具体包括以下步骤：
步骤A.1：将多肽溶解于缓冲液中，优选地，将多肽溶解到pH=6.8~7.5的磷酸盐缓冲液中，更优选地，将多肽溶解到pH=7.2的PBS溶液中；
步骤A.2：将分散于水中的磁性纳米颗粒提取出来，溶分散在少量的pH=6.8~7.5磷酸盐缓冲液中，优选地，将磁性纳米颗粒多肽溶解到pH=7.2的PBS溶液中，并在涡旋仪上涡旋3~5min；
步骤A.3：将A.1中制得的多肽溶液加入到A.2中的磁性纳米颗粒中制得共混液，优选地，多肽与磁性纳米颗粒的质量比为1:5~3:5，优选地，该混合液于25℃，150rpm的恒温摇床上混合30~40min；
优选地，步骤B及步骤E中，富集磁性纳米颗粒时，用强磁性磁铁，优选地，富集颗粒过程中，不断晃动被富集溶液，更优选地，磁铁富集过程持续至少10min/次；
优选地，所述步骤C具体包括以下步骤：
步骤C.1：取一定量的MCF-7，用4体积%的多聚甲醛室温下固定细胞20～40min，优选地，室温下固定30min。
步骤C.2：利用PBS缓冲液除去洗去细胞固定液，用60~120μg/ml的Hoechest.33342在室温作用下进行细胞染色30～50min，优选地，80μg/ml作用的Hoechest.33342在室温下进行细胞染色30min。
优选地，步骤D中，加入的磁性纳米颗粒的量为5~10μl，更优选地，加入5μl。
具体的为了获得本发明的技术方法，本发明进行了以下几个方面的试验和研究：
1）设计并合成了一系列异硫氰酸荧光素（FITC，fluoresceinisothiocyanate）-多肽-生物素（Biotin），以EpCAM阳性的MCF-7和EpCAM阴性的HL-60细胞为测试对象，通过流式细胞技术，发现设计的Pep7-2和Pep7-3能够特异性结合EpCAM阳性细胞，EpCAM阴性细胞结合率低，并且结合常数比较合适；而对于阴性细胞，作为对照的Pep7表现出一定的阴性结合特性，但是阴性结合率较高，选择性较低；
所述试验过程包括如下步骤：
a1：将设计的多肽制成溶液；
b1：取一定量的步骤a1得到的溶液，与MCF-7和HL-60细胞共混，4℃孵育30min。
c1：利用PBS缓冲液洗去未结合的多肽后制成一定密度（≥106个/ml）的细胞悬液。
将悬液于流式细胞仪上检测多肽与细胞的结合情况。
2）将1）中证明特异性识别EpCAM阳性细胞的多肽溶液加入到磁性纳米颗粒中，制备成多肽-磁性纳米颗粒；
所述特异性识别EpCAM的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：
a2：将所述FITC-多肽-Biotin与磁性纳米颗粒充分混合，形成混合液；
b2：并将上述a2中的溶液于25℃摇床上以150rpm的转速混合30～40min。
c3：除去未结合的多肽溶液，将多肽-磁性纳米颗粒重悬于PBS中。
利用荧光显微镜及激光粒度仪对合成的多肽-磁性纳米颗粒进行表征。
在制备多肽-磁性纳米颗粒中，采用恒温摇床来充分混合。去除未结合的多肽溶液，优选使用强力磁铁，优选吸附时间为10min，为了防止磁性纳米颗粒流失，对弃去溶液，用吸管从颗粒聚集的另一侧将其缓慢吸出。
此外，在制备多肽-磁性纳米颗粒前，还包括分散磁性纳米颗粒的步骤，可以采用超声/涡旋的方法分散磁性纳米颗粒。
3）将细胞用4体积%的多聚甲醛固定，Hoechst.33342染色后的乳腺癌细胞（MCF-7）与人早幼粒急性白血病细胞（HL-60）以50:2E7，2E8，2E9的比例混合，分别溶解在1ml的PBS溶液中。
a3：取一定量的MCF-7细胞，用4体积%的多聚甲醛室温下固定细胞30分钟。
b3：PBS除去细胞固定液，用80μg/mlHoechest.33342室温作用细胞30分钟。
c3：细胞计数板计数两种细胞后，取适量混合后定容至995μl。
4）取少量多肽-磁性纳米颗粒加入步骤3）中的细胞混合液或待测血样，于摇床上混合，利用磁铁对MCF-7细胞进行富集和分离。
具体地，富集和分离MCF-7细胞的步骤如下：
a4：取5μl多肽-磁性纳米颗粒，加入到995μl的待分离样品中。
b4：将多肽-磁性纳米颗粒于细胞样品的混合液置于150rpm的恒温摇床上，4℃下共同孵育30min。
C4：强磁性磁铁吸附磁性纳米颗粒10min，并不断晃动混合液，从富集位置的另一侧，将未结合的细胞悬液吸出，再用PBS重悬磁性纳米颗粒，再富集磁性纳米颗粒，如此反复3次。
5）于显微镜下统计细胞数。
具体的统计与成像包括如下步骤：
a5：将上面收集到的磁性纳米颗粒用PBS缓冲液重悬成10~20μl的悬液，为了增强分散性，可在涡旋仪上涡旋3~5min。
b5：吸取一定量的上述a6悬液于载玻片上，而后用盖玻片盖上，即可用荧光显微镜观察。
c5：在显微镜下，取不同视野（至少3个）对明场中的所有细胞及暗场中发蓝光的细胞进行统计，拍照。
综上所述，本发明的目的在于发展一种分离、富集和检测CTC的新方法，设计了两个具有特异性识别CTC的多肽片段，有望替代现有的抗体，并结合磁性纳米颗粒技术简单快速富集和分离CTC，从而大大降低临床CTC检测高昂的成本，并且可以为抗原-抗体免疫研究提供新的思路。
本发明的一个实施方案：在细胞水平，利用流式细胞仪验证多肽能够特异性结合EpCAM阳性细胞；并在分子水平上利用表面等离子激元共振技术（SurfacePlasmonResonancetechnology，SPR）进一步验证了该多肽片段及抗-EpCAM抗体与EpCAM的结合解离情况。利用动态光散射（DynamicLightScattering，DLS）及荧光技术对利用链亲和素反应制得多肽-磁性纳米颗粒进行表征，具体地，通过DLS测得偶联前后磁性纳米颗粒的zeta电位及粒径的变化，利用荧光显微镜拍照表明对修饰前后磁性纳米颗粒的变化进行观察。利用磁铁对磁性纳米颗粒的聚集、吸引、收集作用，对CTC进行富集和分离。具体包括如下步骤：
步骤1：设计并合成一系列FITC-多肽-Biotin，利用流式细胞技术及EpCAM阳性的MCF-7和EpCAM阴性的HL-60细胞，惊奇地发现设计的Pep7-2、Pep7-3和Pep7能够特异性结合EpCAM阳性细胞，但对于EpCAM阴性细胞，Pep7表现出一定的阴性结合特性，选择性较低；而Pep7-2、Pep7-3与EpCAM阴性细胞HL-60的结合率很低，选择性高；
步骤2：利用SPR技术检测步骤1中具有特异性识别CTC的多肽片段及抗EpCAM抗体与EpCAM的结合-解离常数，结果惊奇地发现Pep7-2、Pep7-3与目标蛋白EpCAM的亲合力与抗体相当，而Pep7与EpCAM阳性细胞的亲合力稍低；
步骤3：将步骤2证明的特异性识别多肽进行生物素修饰，并将其溶液与链亲和素修饰的磁性纳米颗粒混合30min，制备成多肽-磁性纳米颗粒；
步骤4：利用DLS、荧光显微技术和MALDI-TOF质谱法分析对步骤3中的多肽-磁性纳米颗粒进行表征；
步骤5：将利用4体积%的多聚甲醛固定，并利用Hoechst.33342染色后的乳腺癌MCF-7细胞与人早幼粒急性白血病细胞HL-60细胞以50:2E7，50:2E8，50:2E9的比例分别混合成1ml的PBS溶液；其中2E7，2E8，2E9分别表示阴性细胞数为2×107个，2×108个，和2×109个。
步骤6：取少量多肽-磁性纳米颗粒加入步骤3中的细胞混合液或待测血样，于摇床上混合30min，富集和分离CTC。
步骤7：于显微镜下统计明暗场下的细胞并拍照。
本发明设计了一系列多肽片段，并发现了两个具有特异性识别EpCAM特异性的多肽片段；在分子水平上利用SPR进一步分析了这两条多肽片段及抗-EpCAM抗体与EpCAM的结合解离情况特性。
本发明利用生物素-链亲和素的强相互作用，将生物素修饰的特异性识别多肽与链亲和素修饰的磁性纳米颗粒偶联，利用DLS表征了偶联前后磁性纳米颗粒Zeta电位的变化，用荧光显微镜观察了修饰FITC-多肽-Biotin后发荧光的磁性纳米颗粒；并通过试验证明本发明所述的多肽-磁性纳米颗粒能够用于CTC的分离、富集和检测，且本发明的两种多肽修饰后的纳米颗粒在对模拟的CTCs样品中CTCs的分离率达到80%以上，重现性很好，其研究对临床肿瘤转移的诊断及肿瘤的预后有重要的意义。
本发明提出了一种利用多肽对细胞表面抗原进行特异性识别的新方法，并发明了一种新的富集、分离和检测CTC的多肽-磁性纳米颗粒物质，提供了一种富集、分离和检测CTC的快速、准确和低成本的检测技术，为临床肿瘤转移患者的诊断、治疗及预后提供了有效方法。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1表明特异性识别多肽（摩尔浓度均为50μM）与MCF-7细胞作用后的荧光照片；A、B、C和D依次是PBS、50μMPep7、50μMPep7-2和50μMPep7-3作用MCF-7细胞30min后的荧光照片；
图2表明Pep7-2-磁性纳米颗粒和Pep7-3-磁性纳米颗粒的荧光显微镜照片；其中A、B分别代表Pep7-2-磁性纳米颗粒在明视场和蓝光激发下的照片；C、D分别代表Pep7-3-磁性纳米颗粒在明视场和蓝光激发下的照片；
图3表明Pep7-2和Pep7-3在495nm处的吸光度随浓度变化的关系及拟合直线，其中，其中图3a代表Pep7-2的浓度-OD曲线，图3b代表Pep7-3的浓度-OD曲线；
图4表明Pep7-2-磁性纳米颗粒和Pep7-3-磁性纳米颗粒对MCF-7细胞富集和分离的荧光显微镜照片；其中，A、B分别代表Pep7-2-磁性纳米颗粒分离的CTC在明视场和紫光激发下的照片；C、D分别代表Pep7-3-磁性纳米颗粒分离的CTC在明视场和紫光光激发下的照片；E、F分别代表磁性纳米颗粒分离的CTC在明视场和紫光激发下的照片；
图5表明Pep7-2-磁性纳米颗粒和Pep7-3-磁性纳米颗粒对MCF-7细胞的富集和分离效率的统计结果，图中，MINPs-Pep7-3表示Pep7-3-磁性纳米颗粒，MINPs-Pep7-3表示Pep7-2-磁性纳米颗粒，2E7表示MCF-7细胞与HL-60细胞数比例为50:2E7，2E8表示MCF-7细胞与HL-60细胞数比例为50:2E8，2E9表示MCF-7细胞与HL-60细胞数比例为50:2E9。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用的乳腺癌细胞（MCF-7）、人早幼粒急性白血病细胞（HL-60）均购自医学科学院基础科学研究所的细胞库。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂，且可从正规渠道商购获得。
实施例1.多肽特异性识别EpCAM的验证
1、所使用的多肽的序列、试剂及验证细胞
多肽片段（由上海科肽生物技术有限公司合成，纯度为98质量%），如下表1所示。磁性纳米颗粒：链亲和素-磁性纳米颗粒（solulink，ST022912，美国）。
表1
将已知报道一致的MCF-7细胞作为EpCAM阳性细胞，HL-60细胞作为EpCAM阴性细胞来验证特异性识别EpCAM的多肽片段。
2、具体方法
1）EpCAM阳性的特异性多肽的验证。
先将设计并合成的一系列FITC-多肽用pH=7.2的PBS配成1mg/ml的母液；收集一定量（≥106个）的MCF-7及HL-60细胞于1.5μl的离心管中，加入7μl的各多肽母液，并用PBS稀释成125μg/ml；用吸管将该混合液吹匀，4℃混合30min，而后在转速为1000rpm的离心机（LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司）中离心3min，弃去上清，再用PBS重悬，如此反复3次的方法除去未结合的多肽，最后将细胞重悬成1ml的溶液，用流式细胞仪（FCM，BDFACSAria，BD，美国）检测，统计检测结果，如下述表2所示。
表2
如表2所示，综合抗体的检测结果，可知，MCF-7为EpCAM阳性细胞，HL-60为EpCAM阴性细胞，与已有报道一致。
再用同质量体积浓度的Pep7、Pep7-2和Pep7-3，再按与上述1）相同的条件下作用于等量相同的细胞及处理方法处理。对于阳性细胞，Pep7、Pep7-2和Pep7-3均表现出很好的识别能力（结合率分别为91.71％,87.85%和86.67%），与抗体（92.76%）的阳性结合率相比基本相当；对于阴性细胞，Pep7表现出一定的阴性结合特性（55.94%），但是阴性结合率较高，Pep7-2和Pep7-3均表现出明显低的阴性结合率（9.22%和9.45%），与抗体的阴性结合率（2.20%）基本相当。综合以上的流式细胞术结果，表明Pep7-2和Pep7-3表现出对EpCAM的选择性识别和结合。
将MCF-7细胞以5000个/孔的密度接种于96孔平底黑板中，过夜待贴壁，将50μM的FITC-多肽（Pep7、Pep7-2和Pep7-3）分别加在不同孔中，4℃作用30min，而后用PBS轻轻洗去未结合的多肽，共3次，加入100μl/孔PBS于96孔平底黑板中每孔加入100μl的PBS缓冲液，并用PBS溶液作为阴性对照，在20×镜头的荧光倒置显微镜（IX71，OLYMPUS，日本），蓝光激发，20×镜头下拍照，结果见图1。
由图1，我们可知，同摩尔浓度的多肽作用等量的细胞，在相同的处理条件下，不同多肽的荧光强度不同，特异性识别多肽Pep7、Pep7-2和Pep7-3的荧光都较强，即可验证上面的流式结果，这三条多肽片段对EpCAM阳性细胞MCF-7的结合力较强。
将Pep7、Pep7-2、Pep7-3、及抗-EpCAM抗体（购自Biolegend公司）分别用超纯水（MilliQ）配置成浓度为5mg/ml、5mg/ml、5mg/ml及12.5ug/ml的溶液，取5μl将其滴在羧基化的SPR芯片（购自Plexera公司，KxV5型SPR标配基底）上，通过氨基酸缩合反应将多肽固定在SPR芯片上。而后用浓度系列为1.563μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/ml、12.5μg/ml和25μg/ml的EpCAM蛋白（购自R&D公司）水溶液作为流动结合相，1/20的磷酸为洗脱液，以2μl/s的流速结合240s，解离200s，进行SPR分析，并计算结合-解离常数，结果如下述表3所示；
表3
从表3我们可以看出多肽Pep7-2和Pep7-3与EpCAM有较强的结合，与抗体的结合常数3.72×109相比，Pep7-2、Pep7-3的结合常数分别为3.39×108、5.06×108与之相近，而Pep7与EpCAM的结合常数为6.62×107，亲和力稍微弱一些，因而，特异性识别多肽Pep7-2和Pep7-3对靶蛋白强的亲和力为其特异性识别及作为抗体的替代物提供了依据。
实施例2.将特异性识别多肽Pep7-2和Pep7-3通过生物素-链亲和素
相互作用与磁性纳米颗粒偶联
1.取5mg/ml的磁性纳米颗粒250μl，于vortexmixer涡旋仪（WH-866，太仓市华利达实验设备有限公司）上混合3~5min，用强磁性磁铁出去收集，并去除溶剂，而后取1mg/ml的FITC-Pep7-2-生物素（Biotin）和1mg/ml的FITC-Pep7-3-生物素（Biotin）的PBS溶液各500μl，分别与磁性纳米颗粒混合（多肽与磁性纳米颗粒的质量比为2:5），而后放在摇床（THZ-D，泰州市万达气弹簧有限公司）上在25℃，150rpm下混合40min。而后用强磁性磁铁富集磁性纳米颗粒于离心管一侧，约10min后从离心管的另一侧吸取液体，再加入一定量的PBS缓冲液，重悬磁性纳米颗粒，再富集，吸去液体，如此反复3次，即可去除未结合的多肽，得到FITC-Pep7-2-生物素（Biotin）-磁性纳米颗粒和FITC-Pep7-3-生物素（Biotin）-磁性纳米颗粒，最后分别再用250μl的PBS缓冲液溶解。
2.另外，取5mg/ml的磁性纳米颗粒250μl，于vortexmixer涡旋仪上混合3~5min，用强磁性磁铁出去收集，并去除溶剂，而后取1mg/mlFITC-Pep7-2-生物素（Biotin）和1mg/mlFITC-Pep7-3-生物素（Biotin）的PBS溶液各2.5μl,250μl,750μl,1ml分别与磁性纳米颗粒混合（多肽与磁性纳米颗粒的质量比分别为0.01:5,1:5,3:5,4:5），而后放在摇床上在25℃，150rpm下，分别混合10min、30min、1h和2h。而后用强磁性磁铁富集磁性纳米颗粒于离心管一侧，约10min后从离心管的另一侧吸取液体，再加入一定量的PBS缓冲液，重悬磁性纳米颗粒，再富集，吸去液体，如此反复3次，即可去除未结合的多肽，得到FITC-Pep7-2-生物素（Biotin）-磁性纳米颗粒和FITC-Pep7-3-生物素（Biotin）-磁性纳米颗粒，最后分别再用250μl的PBS缓冲液溶解。
实施例3.对多肽-磁性纳米颗粒的表征
取实施例2中的1制得的FITC-Pep7-2-生物素（Biotin）-磁性纳米颗粒和FITC-Pep7-3-生物素（Biotin）-磁性纳米颗粒溶液（多肽与磁性纳米颗粒的质量比为2:5）少许，显微镜下拍照，结果如图2所示，A和B为Pep7-2-磁性纳米颗粒分别在明场和蓝光激发下的照片，修饰Pep7-2的磁性纳米颗粒在蓝光下，发出绿光（FITC的吸收和发射波长为495nm和535nm）；C和D为Pep7-3-磁性纳米颗粒分别在明场和蓝光激发下的照片，修饰pep7-3的磁性纳米颗粒在蓝光下，发出绿光；表明多肽与磁性纳米颗粒偶联成功。
分别用FITC-Pep7-2-生物素（Biotin）和FITC-Pep7-2-生物素（Biotin）配置1μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml及500μg/ml浓度的PBS溶液于光度仪（TecaninfiniteM200，TECAN，SwissConfederation）上测试多肽在495nm处的吸光度值（OD），同时测定在上步骤中洗去的溶液在495nm处的OD值，并用origin软件（OriginPro8.0版）模拟OD-浓度的标准曲线和方程（图3），可用公式（Eq.(1))计算出磁性纳米颗粒与多肽的结合率；
磁性纳米颗粒表面结合的多肽量=加入的多肽量–洗脱下来的多肽量
Y=A+B*X（标准直线方程）
X=(Y-A)/B（1）
Y是多肽的OD495nm；A、B分别是线性方程拟合出的截距和斜率；X是通过线性方程由测得的OD495nm值算出来的多肽的量。
结合图3的标准方程及Eq.(1)可计算出Pep7-2、Pep7-3结合磁性纳米颗粒的效率分别为21.2nmol/mg、10.16nmol/mg。
取少量的Pep7-2-磁性纳米颗粒和Pep7-3-磁性纳米颗粒分别稀释成1ml分散液，将其转移到zeta电位池中，用激光粒度仪（ZetasizerNanoZS,马尔文有限公司，英国）分析样品的Zeta电位和平均粒径，结果如下述表4所示。
表4
由表4的结果可知，经Pep7-2-FITC和Pep7-3-FITC修饰后，磁性纳米颗粒的zeta电位由42.5mV变为-36.4mV和-32.0mV，粒径也略有增加，电位的变化与多肽带有负电荷有关，这一结果也说明了多肽被成功地偶联在磁性纳米颗粒上（D.-B.Shieh等人,Biomaterials2005,26,7183–7191）。
并且，取制得的纯化后的Pep7-2-磁性纳米颗粒和Pep7-3-磁性纳米颗粒，分别加入到不含离子的纯水中，60℃恒温解离5分钟，取解离液上清进行MALDI-TOF质谱法分析（Karas,M.;Bahr,U."LaserDesorptionIonizationMassSpectrometryofLargeBiomolecules".TrendsAnal.Chem.1990,9(10):321-5），结果表明有Pep7-2和Pep7-3的特征峰，从而进一步证明多肽确实偶联在了磁性纳米颗粒上。
此外，取实施例2中的2制得的其他FITC-Pep7-2-生物素（Biotin）-磁性纳米颗粒和FITC-Pep7-3-生物素（Biotin）-磁性纳米颗粒溶液（多肽与磁性纳米颗粒的质量比分别为0.01:5,1:5,3:5,4:5）进行与上述操作步骤相同的表征实验，可以获得上述相似的结果。
实施例4.利用多肽-磁性纳米颗粒进行CTC的分离、富集和检测
收集一定量的MCF-7细胞，而后用4体积%的多聚甲醛室温固定30min，之后用PBS洗去固定液，再加入20μl（可以是20~50μl中的任意一个值）的80μg/ml的Hoechst.33342（购自Sigma公司）对细胞进行染色（参见Q.Yuan等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2007,356,880885），室温30min；用细胞计数板对细胞计数。收集HL-60细胞，并计数，而后取适量的MCF-7细胞和HL-60细胞，以MCF-7细胞与HL-60细胞数比例为50:2E7，50:2E8和50:2E9混合制成体积为995μl的细胞液，而后加入上面5μl的多肽-磁性纳米颗粒溶液，在150rpm的摇床上4℃下混合30min。而后，用强磁性磁铁富集磁性纳米颗粒于离心管一侧，约10min后从离心管的另一侧吸取液体，再加入一定量的PBS，重悬磁性纳米颗粒，再富集，除去液体，如此反复3次，即得分离的MCF-7细胞。将其用20μl的PBS重悬，取10μl滴在载玻片上，盖玻片再盖上后，制成样本，于荧光显微镜下统计计数，结果见图4和图5。
图4A和4B为Pep7-2-磁性纳米颗粒对1ml的MCF-7细胞与HL-60细胞数量比为50:2E9的混合样本进行富集和分离的实验结果；图4C和4D为Pep7-3-磁性纳米颗粒对1ml的MCF-7细胞与HL-60细胞数量比为50:2E9的混合样本进行富集和分离的实验结果；图4E和4F为磁性纳米颗粒对1ml的MCF-7细胞与HL-60细胞数量比为50:2E9的混合样本进行富集和分离的实验结果，对比明场（4A、4C、4E）与暗场(4B、4D、4F)下的照片，我们可以看到，经多肽修饰后的磁性纳米颗粒能够从1ml高达2×109个EpCAM阴性细胞的混合细胞中分离出少量的EpCAM阳性细胞MCF-7，这种细胞比例与临床中CTC在血液中的含量（0~50CTCs/1010ml血细胞）相近，故分离结果具有临床参照意义。
如图5所示，进一步的统计结果表明，这两种多肽修饰后的纳米颗粒在对模拟的CTCs样品中CTCs的分离率达到80%以上，重现性很好，故Pep7-2-磁性纳米颗粒和Pep7-3-磁性纳米颗粒的研究对临床肿瘤转移的诊断及肿瘤的预后有重要的意义。
Claims (23)
1.一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽，所述多肽的氨基酸序列为下述SEQIDNO:1所示的氨基酸序列：
VRRDAPRFSMQGLDACGGNX1X2(X3)n1(X4)n2
其中，X1为Cys或Asn；
X2为Cys或Asn；
X3为Asn，n1＝0或1；
X4为Asn，n2＝0或1。
2.根据权利要求1所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
3.一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒，其含有磁性纳米颗粒和与其相偶联的权利要求1或2所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽。
4.根据权利要求3所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为0.01:5～4:5。
5.根据权利要求4所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为1:5～3:5。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为链亲和素修饰的磁性纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述磁性纳米颗粒的粒径为600～1500nm。
8.根据权利要求7所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述磁性纳米颗粒的粒径为800nm。
9.权利要求3至8中任一项所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)制备权利要求1或2所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽；
2)将步骤1)中的多肽制成生物素修饰的多肽溶液；
3)将链亲和素修饰的磁性纳米颗粒溶于缓冲液中制成溶液；
4)将步骤2)中生物素修饰的多肽溶液与步骤3)的磁性纳米颗粒溶液混合后，混匀，将多肽偶联到磁性纳米颗粒表面，即得。
10.根据权利要求9所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，其中，步骤3)还包括将磁性纳米颗粒溶液通过超声或涡旋的方法进行分散的步骤。
11.根据权利要求9所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，所述生物素修饰的多肽溶液与链亲和素修饰的磁性纳米颗粒溶液以0.01:5～4:5的质量比混合。
12.根据权利要求11所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，其中，所述生物素修饰的多肽溶液与链亲和素修饰的磁性纳米颗粒溶液的混合质量比为1:5～3:5。
13.根据权利要求11所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，其中，所述生物素修饰的多肽溶液与链亲和素修饰的磁性纳米颗粒溶液于4～37℃混合0.5～2h。
14.根据权利要求11所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，其中，所述生物素修饰的多肽溶液与链亲和素修饰的磁性纳米颗粒溶液于20～30℃混合10min～2h混匀。
15.根据权利要求11所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，混合30～40min。
16.根据权利要求15所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，其中，于恒温摇床上混合。
17.根据权利要求16所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，其中，于4℃的恒温摇床上混合。
18.根据权利要求17所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，其中，摇床的转速为150rpm。
19.根据权利要求1或2所述的用于特异性识别肿瘤细胞的多肽或权利要求3至8中任一项所述的用于特异性识别肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒在制备用于富集、分离或检测循环肿瘤细胞的产品中的应用。
20.根据权利要求19所述的应用，其中，所述产品为试剂盒或试剂。
21.根据权利要求1或2所述的用于特异性识别肿瘤细胞的多肽或权利要求3至8中任一项所述的用于特异性识别肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒在制备用于***转移相关疾病的药物中的应用。
22.根据权利要求21所述的应用，其中，所述肿瘤转移相关疾病为细胞上皮粘附因子高表达相关的肿瘤。
23.根据权利要求22所述的应用，其中，所述细胞上皮粘附因子高表达相关的肿瘤包括***癌、乳腺癌和肺癌。
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160531 Address after: 100037 Building 2, building 16, 2522 Mega street, Beijing, Xicheng District Patentee after: Beijing Kenatai Technology Co. Ltd. Address before: 102488 Beijing city Fangshan District Liangxiang Gongcheng No. 1 North Street Haotian Holiday Inn room 428 Patentee before: NATIONAL CENTER FOR NANOSCIENCE AND TECHNOLOGY(NCNST) OF CHINA |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20140716 Assignee: NATIONAL CENTER FOR NANOSCIENCE AND TECHNOLOGY(NCNST) OF CHINA Assignor: Beijing Kenatai Technology Co. Ltd. Contract record no.: 2016990000325 Denomination of invention: Polypeptide for enrichment, separation and detection of circulating tumor cells and application thereof Granted publication date: 20160316 License type: Common License Record date: 20160812 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20140716 Assignee: Tianjin Zhongke biological science and Technology Co Ltd Assignor: Beijing Kenatai Technology Co. Ltd. Contract record no.: 2016990000328 Denomination of invention: Polypeptide for enrichment, separation and detection of circulating tumor cells and application thereof Granted publication date: 20160316 License type: Common License Record date: 20160823 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model |