CN109253990B - 一种靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的纳米荧光探针 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的纳米荧光探针，所述探针包括H2O2响应性的荧光小分子和靶向胰腺癌表面标记物的聚合物，所述H2O2响应性的荧光小分子和靶向胰腺癌表面标记物的聚合物具有相反的亲疏水性。本发明通过透明质酸和胰腺癌肿瘤表面高表达的CD44抗原特异性结合，HA‑NP‑BE纳米荧光探针可以靶向性地进入胰腺癌细胞，检测细胞内的H2O2并对其成像，且具有快速的响应性，可以有效地区分胰腺癌肿瘤细胞和正常细胞，检测出胰腺癌肿瘤病人中的CTC，有助于胰腺癌的早期诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，更具体地讲，涉及一种靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的细胞内过氧化氢的“比率型”纳米荧光探针。
背景技术
目前循环肿瘤细胞(CTCs)检测主要包括富集和鉴定二部分。由于CTCs具有量少、异质性和变形性等特点，目前有许多方法可用于CTCs的检测。富集方法有根据细胞密度、大小、介电性等特性的物理学方法，根据细胞表面特异性抗原包括上皮粘附分子(EpCAM)、EGFR的免疫学方法和去红细胞、白细胞的负筛选方法；鉴定方法有流式细胞术、免疫荧光法、荧光原位杂交、反转录PCR和二代测序。其中负筛选和免疫荧光法的方法最常用或有效。
细胞内过氧化氢是细胞的“第二信使”，与细胞的生长、分化、迁移和凋亡有关。细胞内过氧化氢浓度的增高可以使细胞内DNA受损，引起细胞癌变。已有的研究表明，循环肿瘤细胞中过氧化氢浓度明显增高。
中国发明专利CN201710564408.5公开了一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用，虽然有不受H2O2浓度影响的内标荧光分子罗丹明B作为参照，但罗丹明B和香豆素的激发波长不一样，在激光共聚焦显微镜中的激光的功率很难保持一致，两种荧光的发射效率也不一样，体外的H2O2浓度标准曲线在应用于细胞内的H2O2检测时，细胞环境和检测设备的干扰因素太多，只能半定量检测。
透明质酸可以特异性地靶向肿瘤细胞表面高表达的CD44。CD44是黏附因子家族中的一员，是介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间黏附作用的膜表面糖蛋白，参与细胞的增殖、分化、黏附、迁移。CD44主要参与异质性粘附，即肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的粘附，异质性粘附在肿瘤细胞侵袭转移中起促进作用。
目前使用的循环肿瘤细胞的富集方法和鉴定方法均有局限性，结果不令人满意。尽管在正常人的外周血液中未能发现上皮细胞，但胰腺的良性疾病和恶性肿瘤病人外周血中均能发现上皮细胞，且细胞形态，包括细胞大小、核大小、核形态、细胞质/核比例等均无明显差别，因此基于物理方法的富集和鉴定方法不能用于胰腺癌的循环肿瘤细胞的检测。另一方面，用于胰腺癌诊断、疗效监测和术后生存率预测最常用的肿瘤标志物只有糖类抗原(CA19-9)和癌胚抗原(CEA)。但这两种肿瘤标志物都存在一个很大的问题--特异性不高。Lewis a和b-基因型血型的患者无法合成CA19-9。此外，在非恶性疾病如肝硬化、糖尿病、慢性胰腺炎、胆管炎、梗阻性黄疸以及其他消化道癌症患者中，CA19-9也有可能高表达。即使在可切除的胰腺癌患者中，高达35％的患者CA19-9也不高表达。同时，由于胰腺癌的肿瘤细胞存在异质性，在细胞的上皮-间质转换过程中(EMT)，EpCAM和CK19这些上皮标志物表达极有可能降低。因此，应用EpCAM和CK19抗体分别捕获富集和鉴别CTCs存在局限性，在捕获胰腺癌的CTCs运用中结果令人失望。
因此，亟需提供一种靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的纳米荧光探针，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种不依赖于细胞表面EpCAM和CK19抗原的表达，靶向肿瘤细胞表面的CD44，提高纳米荧光探针的检测效率，降低白细胞的干扰，降低胰腺癌肿瘤细胞检测中的假阴性结果和假阳性结果，具有良好生物相容性的靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的纳米荧光探针。
为了实现上述目的，本发明提供了一种靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的纳米荧光探针，其特征在于，所述探针包括H2O2响应性的荧光小分子和靶向胰腺癌表面标记物的聚合物，所述H2O2响应性的荧光小分子和靶向胰腺癌表面标记物的聚合物具有相反的亲疏水性。
作为一个优选方案，所述H2O2响应性的荧光小分子包括萘酰亚胺-硼酸酯荧光小分子NP-BE、香豆素硼酸酯、荧光素硼酸酯、咔唑-硼酸酯、氟硼二吡咯-硼酸酯中的一种。
作为一个优选方案，所述胰腺癌表面标记物为CD44。
作为一个优选方案，所述靶向胰腺癌表面标记物的聚合物为透明质酸HA。
CD44可对细胞内的H2O2快速响应，具有良好的生物相容性，特异性地靶向肿瘤细胞而正常细胞由于表面CD44低表达而不摄取纳米荧光探针。其他靶向胰腺癌细胞的靶标还有癌胚抗原(CEA)、糖类抗原CA19-9等，根据标记物选取合适的靶向胰腺癌表面标记物的聚合物即可。
本发明的优点在于，利用肿瘤细胞表面CD44高表达这一特点，用透明质酸对其进行靶向。因此，引入了CD44靶向性的透明质酸作为H2O2响应性萘酰亚胺-硼酸酯荧光小分子的载体，而其中，萘酰亚胺-硼酸酯在和H2O2反应前后具有蓝色和绿色两种不同颜色的荧光，是一种比率型的荧光分子。基于此形成的靶向性比率型纳米荧光探针可以靶向性地进入CD44高表达的胰腺癌CTC中并对细胞内的H2O2成像和半定量分析，从而最终鉴定CTC。通过透明质酸和胰腺癌肿瘤表面高表达的CD44抗原特异性结合，HA-NP-BE纳米荧光探针可以靶向性地进入胰腺癌细胞，检测细胞内的H2O2并对其成像，且具有快速的响应性，可以有效地区分胰腺癌肿瘤细胞和正常细胞，检测出胰腺癌肿瘤病人中的CTC，有助于胰腺癌的早期诊断。
附图说明
图1透明质酸-萘酰亚胺-硼酸酯接枝聚合物的合成。
图2(a)HA和(b)HA-NP-BE接枝共聚物的核磁氢谱。
图3HA-NP-BE纳米荧光探针的(a)DLS曲线和(b)TEM图片。
图4加入200μM的H2O2后HA-NP-BE纳米探针在(a)450nm处和350nm处的紫外吸收强度的比值和(b)550nm处的荧光强度随反应时间的变化曲线。
图5HA-NP-BE纳米荧光探针分别和不同浓度的H2O2反应(a)30min和(b)60min的紫外吸收光谱。HA-NP-BE纳米荧光探针和不同浓度的H2O2反应后(c)在350nm和450nm处的紫外吸收强度变化(d)以及随H2O2浓度变化的曲线。
图6HA-NP-BE纳米荧光探针和不同浓度的H2O2反应30min后分别在(a)405nm，(b)450nm和(c)488nm的激发波长下激发的荧光光谱(d)以及荧光强度和H2O2浓度之间的线性关系曲线，(e)405nm激发波长激发时，550nm和500nm处的荧光强度比值和H2O2浓度之间的线性关系曲线。
图7HA-NP-BE纳米荧光探针与RAW 264.7和PANC-1孵育24h后的细胞毒性。
图8HA-NP参比纳米荧光探针与(a)RAW 264.7，(b)HEK 293，(c)MIA-PaCa-2和(d)PANC-1细胞共培养不同时间后的流式细胞荧光图。
图9HA-NP参比纳米荧光探针和不同细胞共培养不同时间后的流式细胞荧光强度。
图10免疫印迹分析不同细胞表面的CD44蛋白表达。
图11HA-NP-BE纳米荧光探针的Zeta电位。
图12HA-NP-BE纳米荧光探针与(a)RAW 264.7，(b)HEK 293，(c)MIA-PaCa-2和(d)PANC-1细胞共培养不同时间后的流式细胞荧光图。
图13HA-NP-BE纳米荧光探针和不同细胞共培养不同时间后的流式细胞荧光强度。
图14正常细胞(a)RAW 264.7和(b)HEK 293分别与HA-NP-BE纳米荧光探针共培养0min、30min、60min和120min的激光共聚焦显微镜图片，细胞核用Hoechst 33328染色。
图15胰腺癌(a)MIA-PaCa-2和(b)PANC-1细胞分别与HA-NP-BE纳米荧光探针孵育0min、30min、60min和120min的激光共聚焦显微镜图片，细胞核用Hoechst 33328染色。
图16胰腺癌病人1007CTC的激光共聚焦显微镜图片。CTC先后用HA-NP-BE纳米荧光探针和CK19-Alexa Fluor 647染色。
图17胰腺癌病人1007中CTC各个通道的荧光强度、比率值和计算的H2O2浓度。
图18正常健康人白细胞的激光共聚焦显微镜图片。白细胞先后用HA-NP-BE纳米荧光探针和CK19-Alexa Fluor 647染色。
具体实施方式
以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。
实施例1.CD44靶向性纳米荧光探针的合成及肿瘤靶向性检测
图1为透明质酸-萘亚胺-硼酸酯接枝聚合物的合成，将160mg(0.4mmol)透明质酸钠溶解在50mL超纯水中，剧烈搅拌2h使其充分溶解。随后，加入117.8mg(0.4mmol)DMTMM将透明质酸上的羧基活化30min。最后，将溶解在DMSO中的43.9mg(0.12mmol)NP-BE逐滴加入到上述混合液中，在室温下避光反应24h。反应结束后，将上述反应混合物用截留分子量为14kDa的透析袋在DMSO/H2O(1:4v/v)的混合溶剂中透析两天，在纯水中透析两天。透析提纯后的水溶液冷冻干燥得到HA-NP-BE接枝聚合物。HA-NP-BE接枝聚合物具有良好的两亲性，可在水溶液中自组装形成CD44靶向的H2O2响应性纳米荧光探针。将HA-NP-BE纳米荧光探针和过量的H2O2在室温下搅拌反应3h，使HA-NP-BE接枝聚合物上的硼酸频哪醇酯脱除保护，得到HA-NP接枝聚合物，随后在截留分子量为14kDa的透析袋中用超纯水透析，除去过量的H2O2和反应生成的硼酸和频哪醇小分子，并在水中自组装形成HA-NP参比纳米荧光探针。通过核磁氢谱对HA-NP-BE接枝聚合物的化学结构进行表征，如图2所示，在化学位移7.0～9.0ppm处出现了归属于萘酰亚胺苯环氢的特征峰，证明成功地将NP-BE荧光分子接枝到HA上。
HA-NP-BE接枝聚合物中含有亲水性的透明质酸主链和疏水性的NP-BE侧链，该两亲性结构在水中可以自组装形成CD44靶向性的HA-NP-BE纳米荧光探针。用DLS和TEM表征了HA-NP-BE接枝聚合物的自组装行为。DLS结果表明，靶向性纳米荧光探针的平均粒径为60nm左右(图3a)。与此同时，通过TEM观察到HA-NP-BE接枝聚合物组装形成的球形纳米粒子的尺寸非常均一，约为50nm左右(图3b)，和DLS的测试结果相符合。
为了确定HA-NP-BE纳米荧光探针和H2O2反应的最佳反应时间，分别用紫外吸收光谱和荧光分光光度计对其进行了动力学研究。在200μg/mL的HA-NP-BE纳米荧光探针中加入200μM的H2O2，用紫外跟踪450nm处和350nm处的紫外吸收峰的比值随HA-NP-BE纳米荧光探针和H2O2的反应时间的变化趋势，用荧光分光光度计在450nm处激发，记录550nm处的荧光强度随反应时间的变化趋势。紫外和荧光的动力学研究表明，如图4所示，在和H2O2反应的4000s内，紫外光谱表明I450/I350的紫外吸收的比值随HA-NP-BE纳米荧光探针和H2O2的反应时间的增加而快速地增加，且呈现良好的线性增加趋势，荧光光谱表明HA-NP-BE纳米荧光探针在550nm处的荧光强度随反应时间的增加在2000s内呈现较好的线性关系，两者都在反应进行到7000s时趋于平衡。基于紫外和荧光的动力学实验结果，将后续的实验中HA-NP-BE纳米荧光探针和H2O2的反应时间统一设置为30min。
在体外PBS环境中，分别用紫外吸收光谱和荧光光谱评价了HA-NP-BE纳米荧光探针对H2O2的响应性。如图5所示，HA-NP-BE纳米荧光探针的最大紫外吸收峰在350nm处，一旦和H2O2反应后，最大紫外吸收峰则红移到了450nm，而且随着H2O2浓度的不断增加，350nm处的吸收峰不断降低，450nm处的吸收峰不断增强。HA-NP-BE纳米荧光探针和H2O2反应的时间越长，该变化趋势越明显(图5c)。此外，450nm处和350nm处的紫外吸收峰强度和H2O2浓度的变化呈线性关系(图5d)。
同时，也用荧光分光光度计评价了HA-NP-BE纳米荧光探针和不同浓度的H2O2反应30min的荧光强度变化。如图6所示，HA-NP-BE纳米荧光探针的绿色荧光强度随着H2O2浓度(0～200μM)的增加而不断增强。对HA-NP-BE纳米荧光探针增加的荧光强度和H2O2浓度进行线性拟合，发现两者具有很好的线性关系(图6d)，拟合的曲线的斜率为0.91(斜率越接近1，说明曲线的线性越好)，R2为0.9988。从紫外光谱可知，HA-NP-BE纳米荧光探针和H2O2反应后的最大紫外吸收在450nm，也就是说纳米探针的最大激发波长在450nm。但在后续的生物应用中，不管是流式细胞术还是激光共聚焦显微镜都没有450nm激发波长的激光器。因此，在荧光分光光度计上，除了在450nm的激发波长下测定HA-NP-BE纳米荧光探针的荧光强度随H2O2浓度的变化，同时也测定了生物检测的仪器中常用的激光波长405nm和488nm的条件下的荧光强度变化。对比三个激光波长激发下HA-NP-BE纳米荧光探针的荧光强度发现，450nm激发下的荧光强度最强(图6b)，405nm激发会出现500nm和550nm两个荧光发射峰(分别为该实验条件下体系中未和H2O2反应的荧光探针以及已经和H2O2反应完全的荧光探针的发射峰)，且随着H2O2的浓度的增加，500nm处的荧光发射峰不断减弱，而550nm处的荧光发射峰则会不断增强(图6a)，通过两者的荧光强度的比值可以定量地检测H2O2的浓度。如图6e所示，将550nm和500nm处的荧光强度比值(I550/I500)和H2O2的浓度进行线性拟合，得到的标准曲线为y＝0.0341x+0.5361，R2为0.99988。该H2O2的浓度的标准曲线，由于是同一个激发光激发同一个荧光分子而同时发射两种不同波长的荧光，其荧光强度的比值不受激发光功率的影响，也不受不同荧光分子的荧光发射效率的不同影响，只和H2O2的浓度相关，在实际的生物应用中，干扰因素较小，能更加真实地反应细胞内的H2O2水平。此外，488nm同样能激发HA-NP-BE纳米荧光探针的荧光(图6c)，但荧光强度比450nm和405nm激发弱。为了更加直观地观察绿色荧光强度从无到有的变化，在后续的生物实验中选用488nm的激光器激发细胞中的HA-NP-BE纳米荧光探针的荧光信号，而在循环肿瘤细胞检测中则用405nm激发，通过两种荧光颜色的变化半定量检测H2O2浓度。
为了更好地将HA-NP-BE纳米荧光探针应用到胰腺癌检测中，首先评价了纳米探针的生物相容性。用标准的MTT法检测了HA-NP-BE纳米探针的内在细胞毒性，选用的细胞株为正常细胞RAW 264.7和胰腺癌细胞PANC-1。将RAW 264.7和PANC-1细胞分别和不同浓度的HA-NP-BE纳米荧光探针孵育24h后用酶标仪检测吸光度值，并计算细胞的存活率。如图7所示，孵育了24h后，即使HA-NP-BE纳米荧光探针的浓度高达1000μg/mL，RAW 264.7和PANC-1也有80％的细胞存活率。MTT实验说明HA-NP-BE纳米荧光探针具有良好的生物相容性，可作为生物检测的理想材料。
用流式细胞术评价了CD44靶向性的HA-NP-BE纳米荧光探针的细胞內摄能力。体外的紫外和荧光实验都表明HA-NP-BE纳米荧光探针具有良好的H2O2响应性，无法直接用纳米荧光探针本身来评价细胞内摄能力。为此，预先将HA-NP-BE纳米荧光探针和H2O2充分反应，脱除了对H2O2响应性的硼酸频哪醇酯基团，制备得到HA-NP参比纳米荧光探针，其荧光强度不再受细胞内H2O2浓度的影响，可以有效地评价细胞摄取纳米荧光探针的能力。将HA-NP参比纳米荧光探针分别与HEK 293、RAW 264.7、PANC-1和MIA-PaCa-2细胞孵育30min、60min和120min，用流式细胞仪分析参比纳米探针在肿瘤细胞和正常细胞内的荧光强度，发现每种细胞对纳米荧光探针的摄取能力都不一样(图8)，对衡量细胞摄取量的流式细胞荧光图中的荧光强度进行统计分析，四种细胞的摄取能力的大小为MIA-PaCa-2>PANC-1>RAW 264.7≈HEK 293(图9)，胰腺癌细胞MIA-PaCa-2和PANC-1对参比纳米荧光探针的摄取量呈现随共培养的时间增加而增加的趋势，而正常细胞RAW 264.7和HEK 293即使和探针的孵育时间延长至两个小时，其细胞内的荧光强度也没有明显的变化。上述实验结果可以说明纳米荧光探针可以选择性地被胰腺癌肿瘤细胞摄取，而无法进入正常细胞。
上述实验结果表明，正常细胞和胰腺癌肿瘤细胞摄取纳米荧光探针的差异很有可能是由于细胞表面的CD44引起的，CD44是细胞黏附因子家族中的一员，介导了细胞与细胞、细胞与细胞外基质间黏附作用的膜表面糖蛋白，参与细胞的增殖、分化、黏附、迁移。CD44主要参与肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的异质性粘附，而异质性粘附在肿瘤细胞侵袭转移中起促进作用。因此，胰腺癌肿瘤细胞表面的CD44抗原很有可能高表达，而正常细胞的CD44则低表达。为了验证这一实验现象，用Western Blot实验分析了MIA-PaCa-2、PANC-1、RAW264.7和HEK 293四种细胞表面CD44蛋白的表达量并验证了这一设想。如图10a所示，MIA-PaCa-2的CD44的条带颜色最深，PANC-1其次，RAW 264.7和HEK 293和内参ACTIN条带相比，颜色都较浅，Western Blot实验中CD44的条带颜色越深说明CD44蛋白表达量越多。取CD44蛋白条带的灰度值和内参条带的灰度值的比值进一步分析，如图10b所示，CD44蛋白表达量MIA-PaCa-2>PANC-1>RAW264.7≈HEK 293，这和四种细胞摄取HA-NP参比纳米荧光探针的规律一致，有力地验证了实验结果的设想。此外，透明质酸是一种主链上每个结构单元都含有羧基的天然生物大分子，作为疏水的NP-BE荧光分子的水溶性载体，在水中自组装形成纳米粒子，其表面会带有大量的负电荷，Zeta电位为-29.1mV(图11)。如果纳米粒子没有靶向性，细胞膜本身带负电，由于同种电荷相互排斥，很难通过包吞作用进入细胞，从侧面证明了HA-NP-BE纳米荧光探针对胰腺癌肿瘤细胞具有靶向性。
用流式细胞术评价了HA-NP-BE纳米荧光探针对细胞内源性H2O2的响应性。首先，以正常细胞RAW 264.7和HEK 293细胞作为阴性对照组，在该实验中，为了更好地模拟血液中的正常细胞，特意选用了小鼠的巨噬细胞，巨噬细胞是白细胞的一种分型，而白细胞是人体血液中大量存在的正常细胞。流式实验结果表明和各自的空白对照细胞相比，HA-NP-BE纳米荧光探针即使和RAW 264.7和HEK 293细胞的孵育时间延长至2h，其细胞内也几乎没有绿色荧光信号(图12a和b)。一方面，正常细胞表面的CD44表达较低，很难摄取带负电的HA-NP-BE纳米荧光探针；另一方面，正常细胞内的内源性H2O2水平本身较低，无法使HA-NP-BE纳米荧光探针的绿色荧光有明显的增强，这两个因素共同导致了正常细胞的细胞内荧光强度很低。相反地，以胰腺癌肿瘤细胞MIA-PaCa-2和PANC-1作为阳性实验组，如图12c和d所示，细胞内的绿色荧光信号明显增强，说明肿瘤细胞内的内源性H2O2水平较高，能有效地将萘亚胺-硼酸酯基团上的硼酸频哪醇酯脱除保护，而使绿色荧光增强。对细胞内的荧光强度进行分析(图13)，再结合两种胰腺癌肿瘤细胞对HA-NP-BE纳米荧光探针的摄取量不同，虽然MIA-PaCa-2和PANC-1与纳米探针共同孵育30min后其细胞内的荧光强度基本一致，但纳米探针在MIA-PaCa-2细胞内的浓度要比PANC-1高很多，而PANC-1虽然细胞内纳米探针的浓度较低，但是其增强荧光强度却和MIA-PaCa-2不相上下，表明实际上细胞内的H2O2水平PANC-1要比MIA-PaCa-2高很多。
用激光共聚焦显微镜对HA-NP-BE纳米荧光探针对细胞内的内源性H2O2水平进行荧光成像分析。如图14所示，正常细胞RAW 264.7和HEK 293几乎看不到萘亚胺的绿色荧光，只有细胞核被Hoechst 33328染色后的蓝色荧光，而且随着HA-NP-BE纳米荧光探针和正常细胞孵育时间的延长，也没有明显的绿色荧光信号。而对胰腺癌MIA-PaCa-2和PANC-1细胞进行荧光成像时，除了细胞核的蓝色荧光，还能观察到细胞质中萘亚胺-硼酸酯和细胞内的内源性H2O2反应脱除硼酸频哪醇酯保护后发出的绿色荧光，并且随着孵育时间的延长，绿色荧光强度有所增强(图15)。上述激光共聚焦显微镜结果表明HA-NP-BE纳米荧光探针能够有效地进入细胞，并对细胞内的H2O2成像，正常细胞内绿色荧光较弱，H2O2浓度较低，而胰腺癌肿瘤细胞内的荧光较强，H2O2浓度较高，能够有效地区分正常细胞和胰腺癌肿瘤，实现肿瘤靶向性检测。
实施例2.胰腺癌病人循环肿瘤细胞鉴定
HA-NP-BE纳米荧光探针可以靶向性地检测胰腺癌细胞内的内源性H2O2，且具有快速的响应性，可以有效地区分胰腺癌肿瘤细胞和正常细胞，将其应用于辅助临床中胰腺癌病人的循环肿瘤细胞的检测。上海交通大学伦理委员会批准了该项实验。收集临床上的胰腺癌病人外周血，通过负筛选的方法富集循环肿瘤细胞。首先，利用红细胞裂解液去除红细胞，利用CD45抗体标记的磁珠去除血液中大部分的白细胞，再对富集到的CTC先后分别用HA-NP-BE纳米荧光探针和CK19-Alexa Fluor 647进行染色，最后在激光共聚焦显微镜下观察并计数。对捕获到的CTC进行了荧光成像分析，如图16所示，CLSM下观察到的CTC虽然每个细胞的绿色荧光强度都不完全一致，但都能观察到明亮的绿色荧光，表明胰腺癌病人的循环肿瘤细胞中H2O2水平很高。此外，通过Alexa Fluor 647红色荧光标记的CK19对检测到的疑似循环肿瘤细胞进行了共验证，大部分发绿色荧光的疑似CTC都能被染上较强的红色荧光，而且红色荧光和绿色荧光并不完全重叠，也就是CK19阳性，H2O2阳性，但也发现了CK19阴性，H2O2阳性，也就是只有较强的绿色荧光而红色荧光很弱的细胞，这很有可能是因为上皮间质转换效应导致的CK19的低表达或者不表达导致的，如图16中编号为8、9和12的三个疑似CTC。因而，H2O2阳性的细胞就是循环肿瘤细胞，虽然由于肿瘤的高度异质性，肿瘤细胞内的H2O2表达也会有高有低，但设计的H2O2响应性的纳米荧光探针对H2O2具有很高的灵敏度，能够通过荧光强度的增强有效地检测出细胞内的内源性H2O2，相比于通过检测细胞表面的特异性蛋白如CK19更灵敏。通过检测肿瘤细胞内的H2O2来鉴定CTC，只有H2O2响应性的纳米荧光探针进入了活的肿瘤细胞内才能有效地进行检测，而死亡的CTC无法摄取纳米荧光探针，细胞内的H2O2小分子也会随着细胞的死亡，细胞膜的通透性增加或扩散出细胞或因本身不稳定而分解。而检测细胞表面的特异性蛋白CK19检测CTC很容易因为CK19抗体和细胞孵育的时间长了或被细胞内吞进入细胞或在细胞表面发生非特异性的吸附，甚至凋亡或死亡的循环肿瘤细胞的表面也有CK19，最终造成非特异性的染色而产生假阳性结果。因此，通过检测CTC中的H2O2来鉴定CTC更具特异性。目前，临床上对胰腺癌这种特殊的肿瘤，由于EpCAM和CK19的低表达而导致CTC的检测率很低，假阴性结果很高。上述实验结果表明HA-NP-BE纳米荧光探针通过检测细胞内的H2O2水平可以有效地检测出胰腺癌肿瘤病人中的CTC，有助于胰腺癌的早期诊断。
由于HA-NP-BE纳米荧光探针能在405nm激发波长的激发下同时发射两种不同波长的荧光，可以利用蓝色荧光和绿色荧光的比值，根据体外标准曲线y＝0.0341x+0.5361计算循环肿瘤细胞内的H2O2水平，如图17所示，计算得到的胰腺癌病人CTC内的H2O2水平为10～30μM，与文献报道的浓度范围较为一致。该标准曲线虽然是在体外环境中拟合得到，但同一个荧光分子由同一个激发波长激发，其激发光的功率相同，荧光的发射效率也相同，即使在复杂的生物体环境中也能准确地衡量H2O2水平。
此外，将正常健康人的白细胞作为CTC的阴性对照实验组，以验证HA-NP-BE纳米荧光探针对胰腺癌病人循环肿瘤细胞检测的特异性。先后用HA-NP-BE纳米荧光探针和CK19-Alexa Fluor 647对正常健康人的白细胞进行染色，如图18的激光共聚焦显微镜图片所示，正常人的白细胞体积很小(<10μm)，没有HA-NP-BE纳米荧光探针和H2O2反应后的绿色荧光信号，表明正常人白细胞内的H2O2水平很低，也没有CK19的红色荧光信号，表明白细胞CK19不表达或者低表达。上述实验结果表明CD44靶向的HA-NP-BE纳米荧光探针可以有效地减少外周血中白细胞的干扰，提高探针的检测效率。
利用肿瘤细胞表面CD44高表达这一特点，用透明质酸对其进行靶向。因此，引入了CD44靶向性的透明质酸作为H2O2响应性萘亚胺-硼酸酯荧光小分子的载体，而其中，萘亚胺-硼酸酯在和H2O2反应前后具有蓝色和绿色两种不同颜色的荧光，是一种自比率计的荧光分子。基于此形成的靶向性自比率计纳米荧光探针可以靶向性地进入CD44高表达的胰腺癌CTC中并对细胞内的H2O2成像和半定量分析，从而最终鉴定CTC。通过靶向肿瘤细胞表面的CD44，可以提高纳米荧光探针的检测效率，降低白细胞的干扰，降低胰腺癌肿瘤细胞检测中的假阴性结果和假阳性结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的纳米荧光探针，其特征在于，所述探针包括H2O2响应性的荧光小分子和靶向胰腺癌表面标记物的聚合物，所述H2O2响应性的荧光小分子和靶向胰腺癌表面标记物的聚合物具有相反的亲疏水性，所述H2O2响应性的荧光小分子为萘酰亚胺-硼酸酯荧光小分子NP-BE，所述胰腺癌表面标记物为CD44，所述靶向胰腺癌表面标记物的聚合物为透明质酸HA，所述透明质酸HA和荧光小分子NP-BE以化学键结合的方式结合在一起，所述NP-BE的结构式如下所示：
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