CN115404220A - 一种分离富集循环肿瘤细胞的多肽功能化微纳界面材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离富集循环肿瘤细胞的多肽功能化微纳界面材料及其制备方法和应用。所述多肽功能化微纳界面材料包括肿瘤特异性靶向多肽、纳米纤维、连接多肽与纳米纤维的二硫键。该多肽功能化微纳界面材料能够实现肿瘤细胞的高效捕获(>90％)，可以同时分离捕获得到EpCAM阳性和EpCAM阴性的CTCs，实现了肝癌患者及治疗过程中体内CTCs及其变化的检测，在早期诊断、转移预测和预后方面具有应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物材料和临床检测技术领域，具体涉及一种分离富集循环肿瘤细胞的多肽功能化微纳界面材料及其制备方法和应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是存在于血液***中、源自于原发性肿瘤的癌细胞，和肿瘤转移、复发等密切相关，是癌症研究的重要标志物。作为液体活检的新型手段，CTCs的检测在指导治疗进程，预测疾病发展和评估生存率等方面发挥了重要作用。此外，CTCs的分离和后续的分子谱分析可为个性化治疗和理解转移的生物学机制提供重要信息。然而，CTCs在血液中的含量极其之少，109个血细胞中仅存在几个至几十个CTCs，为CTCs的分离和检测带来了巨大的挑战。
迄今为止，基于癌细胞的物理特性和生化特性，已发展了诸多用以识别CTCs的技术。一些纳米材料和设备可以区分CTCs和血细胞之间的大小或表面粗糙度，已广泛应用于CTCs的捕获与分离。为了在分子水平上靶向CTCs，抗体，适配体，多肽等也被用作CTCs的捕获元件。上皮细胞标志物，如上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)是CTC分析中最常见的靶标蛋白。目前，将尺寸选择和分子识别相结合的策略的发展大大提高了CTCs分离的灵敏度和选择性。然而，CTCs存在异质性，并且在上皮间质转移(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程中易丢失一些通用的靶标蛋白，限制了实际样本中CTCs检测的准确性。对于具有高转移潜能的肿瘤细胞，上皮标志物(如：EpCAM)的表达会下调，从而使得这些CTC亚群无法通过基于上皮标志物的方法检测出来。此外，肝癌细胞和软组织癌细胞等上皮标志物的表达量也很低，因此难以适用于通用的CTC分离方法。举例来说，超过80％的肝癌患者EpCAM阴性，从而难以通过基于EpCAM的方法来分离CTCs。与此同时，在分离的过程中保持CTCs的生物学活性对后续的分子谱分析至关重要。因此，发展一种新型的CTCs分离富集材料和方法，获取不同亚型的循环肿瘤细胞，对于肿瘤的早期筛查、精准治疗和分子机制研究十分关键。
发明内容
为解决现有技术中存在主要捕获EpCAM阳性的CTCs而易丢失EpCAM阴性的CTCs，导致检测结果不准确的问题，本发明提供了一种多肽功能化的、具有微纳表面形貌的材料，可实现血液样品中不同亚型循环肿瘤细胞的高效捕获和分离富集。
本发明第一方面提供了一种分离富集循环肿瘤细胞的多肽功能化微纳界面材料，其包括三个组成部分：
A)肿瘤特异性靶向多肽；B)纳米纤维；C)连接多肽与纳米纤维的二硫键；
优选地，所述肿瘤特异性靶向多肽以所述肿瘤细胞表面携带的标志蛋白溶酶体相关四次穿膜蛋白(lysosome-associated protein transmembrane 4 beta，LAPTM4B)作为特异性靶标；具体地，所述肿瘤特异性靶向多肽为AP2H多肽，其氨基酸序列如下所示：IHGHHIISVG(SEQ ID NO:1)。
优选地，所述纳米纤维为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(D,L-lactide-co-glycolide)，PLGA)纳米纤维(分子量为38000-54000)；具体地，所述纳米纤维由静电纺丝法制备而成。
进一步的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(D,L-lactide-co-glycolide)，PLGA)纳米纤维的纤维直径优选为100-1500nm。
优选地，所述连接多肽与纳米纤维的二硫键具有下式所示的结构：
其中，R1、R2选自C1-C5的直链烷烃的烷基，优选的R1、R2均为(CH2)2。
本发明第二方面提供了一种分离富集循环肿瘤细胞的多肽功能化微纳界面材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)采用固相多肽合成法制备肿瘤特异性靶向多肽；
2)采用静电纺丝法制备纳米纤维；
3)将所述肿瘤特异性靶向多肽与纳米纤维通过二硫键进行偶联，得到所述多肽功能化微纳界面材料。
优选的技术方案中，步骤1)中所述肿瘤特异性靶向多肽为AP2H多肽，具体制备方法包括：
a1)以Fmoc-Gly-Wang树脂作为起始原料，20％六氢吡啶/N,N’-二甲基甲酰胺(N,N’-dimethylformamide，DMF)溶液作为Fmoc基团脱去剂，2-(3’-N-氧代-苯并***)-1,1’,3,3’-四甲基脲六氟磷酸盐(2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate，HBTU)作为羧基的活化试剂，以此合成序列为IHGHHIISVG的AP2H；其中，所述Fmoc-Gly-Wang树脂中甘氨酸键合量为0.354mmol/g；
b1)脱去所述AP2H多肽序列的Fmoc保护基团，利用裂解液将AP2H从树脂上裂解下来，即得；其中所述裂解液由体积分数为95％三氟乙酸(trifluoroacetic，TFA)，2.5％水，2.5％三异丙基硅烷(triisopropylsilane，TIS)组成。
优选的技术方案中，步骤2)中所述纳米纤维为PLGA纳米纤维，具体制备方法包括：
a2)将PLGA溶解于六氟异丙醇中，以获得聚合物溶液；
b2)在静电纺丝过程中，将硅片(1cm×1cm)放置于铝覆盖接收器的中央，PLGA溶液通过注射泵注入，设置针头尖端和接收器之间的距离和电压；
c2)电纺30-90min后，在硅片表面即收集到PLGA纳米纤维。将所得到的PLGA纳米纤维在室温下真空干燥，即得到基底材料Si@PLGA-NF。
进一步地，所述a2)中，PLGA浓度为3wt％-15wt％，具体如：3wt％、5wt％、7wt％、10wt％、13wt％或15wt％。
进一步地，所述b2)中，注射泵流速为0.1-0.5mL h-1，具体如：0.1、0.3或0.5mL h-1，所述针头尖端和接收器之间的距离为15cm，其间电压为10kV。
优选的技术方案中，其中步骤3)中所述肿瘤特异性靶向多肽与纳米纤维之间的二硫键的连接方式具体方法包括：
a3)将PLGA纳米纤维Si@PLGA-NF置于六孔板中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimidehydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)进行活化反应，得到羧基活化的Si@PLGA-NF；
b3)在磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)中，使羧基活化的Si@PLGA-NF依次和半胱胺、3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate，SPDP)、AP2H多肽发生偶联反应，得到多肽功能化微纳界面材料Si@PLGA-NF@AP2H。
进一步地，所述a3)中，EDC和NHS的摩尔比为10:1，所述活化反应的条件为室温下摇床反应20-30min。
进一步地，所述b3)中，半胱胺浓度为1-2mg mL-1，所述SPDP浓度为0.45-0.6mg mL-1，所述AP2H多肽浓度为0.5-1mg mL-1。所述偶联反应的条件为室温下摇床反应10-12h。
本发明第三方面提供了所述多肽功能化微纳界面材料(具体如Si@PLGA-NF@AP2H)在循环肿瘤细胞高效分离富集中的应用。
所述肿瘤细胞为癌细胞(包括耐药性癌细胞)；所述癌细胞为肝癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、人脑胶质瘤细胞、黑色素癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、***细胞、鼻咽癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞。
所述肝癌细胞具体可为HepG2、HuH-7或Hep3B；所述人脑胶质瘤细胞具体可为人神经胶质瘤细胞U251。
本发明第四方面提供了所述多肽功能化微纳界面材料(具体如Si@PLGA-NF@AP2H)在制备用于循环肿瘤细胞高效分离富集的试剂中的应用。
相较于现有技术，本发明具有如下优点：
(1)本发明以LAPTM4B蛋白作为新型靶标。LAPTM4B蛋白在CTCs上及EMT过程中的高表达，使得基于多肽AP2H的CTC捕获新方法不依赖于上皮标志物。这种新策略可同时捕获不同亚型的CTCs，不仅能分离EpCAM阳性的CTCs，也能分离捕获到EpCAM阴性的CTCs，可以为癌症诊断和治疗提供准确、全面的信息；
(2)纳米纤维由PLGA静电纺丝而成。PLGA上存在丰富的羧基，因此可在纤维表面结合多个多肽配体，形成了对CTCs的多价亲和效应。堆积在硅片表面的纳米纤维模拟了肿瘤细胞胞外基质的形貌结构，从而增强CTCs的粘附并降低血细胞的非特异性吸附。通过结合多肽-蛋白的分子识别和纳米纤维的形貌识别，实现了患者全血中CTCs的高效、高纯度富集；
(3)在多肽修饰中引入了氧化-还原响应的可逆二硫键，用以实现肿瘤细胞的可逆释放。释放后的肿瘤细胞具有高存活率，适于CTCs的后续分子谱和基因分析；
(4)在低样品消耗量下，即可实现实际样品全血中CTCs的分离捕获；同时分离了EpCAM阳性和EpCAM阴性的CTCs；监测了治疗进程中CTCs的变化，在早期诊断和预后预测方面具有应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明多肽功能化微纳界面材料Si@PLGA-NF@AP2H的工作原理图；
图2为本发明实施例中材料Si@PLGA-NF@AP2H的制备流程图；
图3为本发明实施例中不同参数制备的PLGA-NF的直径和不同纤维直径Si@PLGA-NF的电镜表征图；
图4为本发明实施例中材料Si@PLGA-NF@AP2H的电镜表征图；
图5为本发明实施例中不同纤维直径影响肿瘤细胞捕获效率的结果数据图；
图6为本发明实施例中不同结构的基底对肿瘤细胞捕获效率的影响的结果数据图；
图7为本发明实施例中材料Si@PLGA-NF@AP2H对不同表型肿瘤细胞捕获效率的结果数据图；
图8为本发明实施例中材料Si@PLGA-NF@AP2H对模拟样本中肿瘤细胞捕获效率的结果数据图；
图9为本发明实施例中材料Si@PLGA-NF@AP2H对捕获所得肿瘤细胞的释放率和释放后肿瘤细胞活性检测的结果数据图；
图10为本发明实施例中材料Si@PLGA-NF@AP2H对临床样本中CTCs的捕获与表型分析的结果数据图；
图11为本发明实施例中材料Si@PLGA-NF@AP2H对治疗前后肝癌患者全血中CTCs的监测结果图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均为市售。
以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。
实施例1多肽功能化微纳界面材料Si@PLGA-NF@AP2H的合成
按照图2的反应流程图进行制备。
1、合成多肽AP2H
采用Fmoc固相合成策略手动合成。以Fmoc-Gly-Wang树脂作为起始原料(甘氨酸键合量为0.354mmol/g)，20％六氢吡啶/DMF溶液作为Fmoc基团脱去剂，HBTU作为羧基的活化试剂。
AP2H多肽序列具体合成步骤为：将称好的Fmoc-Gly-Wang树脂装入固相多肽合成管中，用DMF溶胀30分钟，之后用DMF洗涤三次。按30mL/g树脂的比例加入20％(体积分数)六氢吡啶/DMF溶液，磁子搅拌10分钟后抽干，重复两次，脱去氨基酸的Fmoc保护基。用DMF洗涤树脂六次，每次搅拌1分钟，抽干10秒。称取4倍量的Fmoc-AA-OH、4倍量的HBTU、4倍量的一水合1-羟基苯并***(1-Hydroxybenzotriazole，HOBt)，用0.4mol/L N-甲基***啉/DMF溶液溶解。将上述反应液加入固相多肽合成管的树脂中，磁子搅拌反应2小时后，进行Kaiser检测，树脂不变蓝紫色表明反应完全，否则延长反应时间，或重复偶联反应一次，然后用DMF洗涤树脂六次。重复上述脱保护和偶联步骤，以完成多肽链的延长。完成AP2H多肽序列(IHGHHIISVG)的合成后，脱掉肽链氨基末端Fmoc保护基，用DMF清洗树脂6次。之后利用新鲜配制的裂解液(95％TFA,2.5％H2O,2.5％TIS，v/v/v)将AP2H从树脂上裂解下来，得到的粗品用岛津半制备液相色谱进行纯化。
2、合成PLGA纳米纤维Si@PLGA-NF
将PLGA(分子量为38000-54000)溶解于六氟异丙醇中，以获得浓度分别为3wt％、5wt％、7wt％、10wt％、13wt％和15wt％的聚合物溶液。在静电纺丝过程中，将硅片(1cm×1cm)放置于铝覆盖接收器的中央。PLGA溶液通过注射泵注入，流速为0.1-0.5mL h-1。针头尖端和接收器之间的距离为15cm，其间电压为10kV。电纺60min后，在硅片表面即收集到PLGA纳米纤维。将所得到的PLGA纳米纤维在室温下真空干燥，即得到基底材料Si@PLGA-NF。聚合物溶液浓度越大，纤维直径越大；同时，纺丝时的流速越大，纤维直径越大。不同浓度的聚合物溶液和不同流速制备得到不同纤维直径的Si@PLGA-NF，不同纤维直径的Si@PLGA-NF的微观结构用扫描电子显微镜(SEM)进行表征，结果见图3。
3、合成多肽功能化微纳界面材料Si@PLGA-NF@AP2H
将Si@PLGA-NF置于六孔板中，表面滴加1mL 0.5M EDC及0.05M NHS磷酸盐缓冲液，室温反应20min活化羧基。用水清洗之后，加入1mg mL-1半胱胺/PBS溶液室温反应12h。之后用水清洗，加入0.45mg mL-1 SPDP溶液(溶剂为DMSO:PBS＝3:7，v/v)室温反应12h。最后用水清洗之后，加入0.5mg mL-1 AP2H/PBS溶液室温反应12h，以获得多肽功能化微纳界面材料Si@PLGA-NF@AP2H。Si@PLGA-NF@AP2H的微观结构用SEM进行表征，结果见图4。图4的产品采用的Si@PLGA-NF是10wt％的PLGA在0.5mL h-1流速下制备的。图1是Si@PLGA-NF@AP2H的工作原理图。
实施例2多肽功能化微纳界面材料Si@PLGA-NF@AP2H的性能考察
1、最适纤维直径的选择
(1)实验步骤：分别制备具有不同PLGA纤维直径的Si@PLGA-NF@AP2H(100-1500nm)，将其放置于六孔板中，加入1mL人肝癌细胞(HepG2)悬浮液或大鼠全血，于37℃、5％CO2条件下孵育1h。孵育完成之后，用PBS清洗5次，加入1mL Hoechst 33342孵育20min。PBS清洗后，用激光共聚焦显微镜进行成像并计数。
(2)结果分析：参见图5a，随着纤维直径从100nm增加至1000nm，捕获到的HepG2数目逐渐增加；进一步将纤维直径从1000nm增加至1500nm，捕获率逐渐降低。因此，平均直径为1μm的纤维在Si@PLGA-NF@AP2H上表现出最佳的捕获性能。另一方面，见图5b，当Si@PLGA-NF@AP2H表面PLGA纳米纤维直径为1μm时，吸附的白细胞(white blood cells，WBCs)数目少于200，显示了最少的非特异性吸附。
2、不同结构的基底对肿瘤细胞捕获效率的影响
(1)实验步骤：将Si，Si@PLGA-NF和Si@PLGA-NF@AP2H(各1cm×1cm)分别放置于六孔板中，加入1mL HepG2细胞悬浮液，于37℃、5％CO2条件下孵育1h。孵育完成之后，用PBS清洗5次，加入1mL Hoechst 33342孵育20min。PBS清洗后，用激光共聚焦显微镜进行成像并计数。
(2)结果分析：参见图6，裸露的硅片几乎不能捕获细胞，捕获效率低至10％。与之相比，Si@PLGA-NF捕获HepG2的数目有所增加，捕获率为34％。在同时存在纳米纤维和靶向多肽的情况下，Si@PLGA-NF@AP2H捕获的HepG2细胞数目最多，捕获率高达96％。
3、Si@PLGA-NF@AP2H对不同表型肿瘤细胞的特异性捕获
(1)实验步骤：将Si@PLGA-NF@AP2H(1cm×1cm)放置于六孔板中，分别加入1mLLAPTM4B蛋白低表达的人胚肾细胞(HEK293)和四种高表达LAPTM4B蛋白的肿瘤细胞(人神经胶质瘤细胞U251、人肝癌细胞HepG2、HuH-7和Hep3B)悬浮液，于37℃、5％CO2条件下孵育1h。孵育完成之后，用PBS清洗5次，加入1mL Hoechst 33342孵育20min。PBS清洗后，用激光共聚焦显微镜进行成像并计数。
(2)结果分析：参见图7，Si@PLGA-NF@AP2H对HepG2，HuH-7，Hep3B和U251细胞的捕获率均高于90％，而正常细胞几乎无捕获，说明Si@PLGA-NF@AP2H可以选择性识别捕获肿瘤细胞。值得注意的是，在所述四种肿瘤细胞中，Hep3B细胞上EpCAM表达水平最高，HuH-7、HepG2和U251细胞上EpCAM含量大大降低。对所述四种肿瘤细胞的高效捕获说明Si@PLGA-NF@AP2H不仅能捕获EpCAM阳性的肿瘤细胞，也能捕获到EpCAM阴性的肿瘤细胞。
4、Si@PLGA-NF@AP2H对模拟样本中肿瘤细胞的高灵敏度捕获
(1)实验步骤：全血模拟样本是通过向健康人全血中添加肿瘤细胞来得到。HepG2细胞用钙黄绿素-AM(Calcein-AM)预染。利用流式细胞分选仪(BD FACSAriall,USA)对预染的细胞进行计数，之后将分选后的肿瘤细胞加入1mL健康人全血以获得不同加标密度的CTC模拟样本(5-100mL-1)。在24孔板中加入Si@PLGA-NF@AP2H，加入1mL CTC模拟样本，于37℃、5％CO2条件下孵育1h。孵育完成之后，用PBS清洗10次，加入1mL Hoechst 33342孵育20min。PBS清洗后，用激光共聚焦显微镜进行成像并计数。Calcein-AM+/Hoechst 33342+的为HepG2细胞，Calcein-AM-/Hoechst 33342+的则为非特异性吸附的WBCs。
(2)结果分析：参见图8，将未经预处理的1mL CTC模拟样本直接与Si@PLGA-NF@AP2H共同孵育，捕获率为65％-93％。值得注意的是，当HepG2细胞加标密度为5mL-1时，平均捕获率高达93％。相比之下，WBCs的捕获率仅为0.01％。Si@PLGA-NF@AP2H能从全血中直接捕获稀少的肿瘤细胞，并排除血细胞的干扰，可望用于临床样本中CTC的分析。
5、Si@PLGA-NF@AP2H对肿瘤细胞的释放
(1)实验步骤：在细胞释放实验中，分别向PBS及大鼠全血中加入3×104个HepG2细胞。将上述细胞在37℃，5％CO2条件下与Si@PLGA-NF@AP2H孵育1h。之后用PBS清洗，加入1mL谷胱甘肽(glutathione，GSH)/PBS溶液(1mg/mL)室温反应30min，用以释放捕获到的细胞。释放后材料表面剩余的细胞用激光共聚焦显微镜进行成像计数，以计算释放率。与此同时，将从材料表面释放下来的细胞接种在培养皿中，在添加有10％胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)和1％双抗的DMEM高糖培养基中培养72h。对照组是将未经任何处理的HepG2细胞以相同的密度直接接种到培养皿中。培养24、48和72h后，利用倒置显微镜对细胞进行成像拍摄。
(2)结果分析：参见图9(a,b)，在用GSH(1mg mL-1)处理30min后，超过80％的HepG2细胞从材料表面释放。将释放后的HepG2细胞于培养基中培养3天，见图9c，观测到细胞在培养皿中的粘附和增殖，表明该释放过程保留了细胞的增殖活性，适于CTCs的后续分子谱和基因分析。
实施例3Si@PLGA-NF@AP2H对临床样本中CTCs的捕获与分析
(1)实验步骤：全血样本收集在真空采血管(BD EDTA真空采血管)中。在24孔板中加入Si@PLGA-NF@AP2H，加入0.7mL全血样本，于37℃、5％CO2条件下孵育1h。孵育完成之后，用PBS清洗10次，利用三色免疫染色来区分鉴定CTCs。首先加入1mL 2.5％戊二醛/PBS固定20min，PBS清洗2次(5min/次)。之后加入1mL Triton X-100通透20min，PBS清洗2次(5min/次)。接着以1mL 1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)为封闭液封闭30min，之后加入0.2mL PBS稀释的Alexa Fluor 488-标记CD45抗体(Abcam，1:100)和Alexa Fluor647-标记CK抗体(Abcam，1:50)25℃共同孵育1h。抗体孵育完成之后，PBS清洗2次(5min/次)，最后加入1mL DAPI核染料孵育10min。PBS清洗之后，用激光共聚焦显微镜进行观测。CTCs上EpCAM蛋白和LAPTM4B蛋白表达利用免疫荧光进行分析。
(2)结果分析：参见图10(a,b)，DAPI阳性/CK阳性/CD45阴性(DAPI+/CK+/CD45-)的细胞被计数为CTCs，DAPI+/CK-/CD45+的细胞为WBCs。可见，肝癌患者全血中均检测到了不同数目的CTCs，CTCs的个数为6-55mL-1(中位数为30mL-1，平均值为29±14mL-1)，健康人全血中无CTCs。根据BCLC(巴塞罗那临床肝癌)分期***，在20例肝癌患者中，有2例患者临床诊断为肝癌A期。基于Si@PLGA-NF@AP2H的方法对这些A期患者全血中的CTCs进行了有效富集和检测，分别检测到了6mL-1和12mL-1。值得注意的是，除了捕获到单个CTC，Si@PLGA-NF@AP2H也从肝癌患者全血中捕获到CTCs团簇。CTCs上EpCAM蛋白和LAPTM4B蛋白的免疫荧光结果见图10(c,d)，说明Si@PLGA-NF@AP2H不仅能分离EpCAM阳性的CTCs，也能分离捕获到EpCAM阴性的CTCs；在捕获的CTCs中，LAPTM4B蛋白高表达且稳定存在。
基于上述临床样本的分析结果，Si@PLGA-NF@AP2H被进一步应用于监测肝癌患者的治疗进程。参见图11，在治疗前，临床分期B期的患者A全血中CTC数目为16mL-1，临床分期C期的患者B CTC数目为30mL-1。对于患者A来说，在接受动脉血栓栓塞治疗(transarterialchemoembolization，TACE)2天后，患者A全血中的CTC数目降至10mL-1；在治疗30天后，CTCs数目进一步降低至8mL-1，是治疗前的一半。经过临床诊断发现，治疗30天后，患者A的肿瘤细胞发生了坏死，CTC数目的逐渐降低和该临床特征相一致。对于患者B来说，患者B接受了TACE和射频消融治疗。在治疗2天后，CTC数目急剧下降至2mL-1；然而，治疗30天后，CTC数目上升至16mL-1，与此同时，在相应的临床诊断中也发现了新的肿瘤病灶。
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 中国科学院化学研究所
<120> 一种分离富集循环肿瘤细胞的多肽功能化微纳界面材料及其制备方法和应用
<130> 211404
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Ile His Gly His His Ile Ile Ser Val Gly
1 5 10
Claims (10)
1.一种多肽功能化微纳界面材料，其特征在于：所述材料包括三个组成部分：肿瘤特异性靶向多肽、纳米纤维、连接多肽与纳米纤维的二硫键；
所述肿瘤特异性靶向多肽以肿瘤细胞表面携带的标志蛋白溶酶体相关四次穿膜蛋白LAPTM4B作为特异性靶标；
所述纳米纤维为聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA纳米纤维。
2.根据权利要求1所述的多肽功能化微纳界面材料，其特征在于：所述肿瘤特异性靶向多肽为AP2H多肽，其氨基酸序列如下所示：IHGHHIISVG。
3.根据权利要求1或2所述的多肽功能化微纳界面材料，其特征在于：所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA纳米纤维由静电纺丝法制备而成，其纤维直径为100-1500nm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽功能化微纳界面材料，其特征在于：所述连接多肽与纳米纤维的二硫键具有下式所示的结构：
其中，R1、R2选自C1-C5的直链烷烃的烷基，优选R1、R2均为(CH2)2。
5.权利要求1-4中任一项所述的多肽功能化微纳界面材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用固相多肽合成法制备肿瘤特异性靶向多肽；
2)采用静电纺丝法制备纳米纤维；
3)将所述肿瘤特异性靶向多肽与纳米纤维通过二硫键进行偶联，得到所述多肽功能化微纳界面材料。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述肿瘤特异性靶向多肽为AP2H多肽，具体方法包括：
a1)以Fmoc-Gly-Wang树脂作为起始原料，20％六氢吡啶/N,N’-二甲基甲酰胺溶液作为Fmoc基团脱去剂，2-(3’-N-氧代-苯并***)-1,1’,3,3’-四甲基脲六氟磷酸盐作为羧基的活化试剂，合成序列为IHGHHIISVG的AP2H；其中，所述Fmoc-Gly-Wang树脂中甘氨酸键合量为0.354mmol/g；
b1)脱去所述AP2H多肽序列的Fmoc保护基团，利用裂解液将AP2H从树脂上裂解下来，即得；其中所述裂解液由体积分数为95％三氟乙酸，2.5％水，2.5％三异丙基硅烷组成。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述纳米纤维为PLGA纳米纤维，具体方法包括：
a2)将PLGA溶解于六氟异丙醇中，得到PLGA溶液；
b2)在静电纺丝过程中，将硅片放置于铝覆盖接收器的中央，PLGA溶液通过注射泵注入；设置针头尖端和接收器之间的距离和电压；
c2)电纺60min后，在硅片表面即收集到PLGA纳米纤维，将所得到的PLGA纳米纤维在室温下真空干燥，即得到基底材料Si@PLGA-NF；
优选的，所述a2)中，PLGA浓度为3wt％-15wt％；
所述b2)中，注射泵流速为0.1-0.5mL h-1；
所述b2)中，所述针头尖端和接收器之间的距离为15cm，其间电压为10kV。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述肿瘤特异性靶向多肽与纳米纤维之间的二硫键的连接方式具体方法包括：
a3)将PLGA纳米纤维Si@PLGA-NF置于六孔板中，然后加入0.5M EDC和0.05M NHS进行活化反应，得到羧基活化的Si@PLGA-NF；
b3)在磷酸盐缓冲液中，使羧基活化的Si@PLGA-NF依次和1mg mL-1半胱胺、0.45mg mL-1SPDP、0.5mg mL-1AP2H多肽发生偶联反应，得到多肽功能化微纳界面材料Si@PLGA-NF@AP2H。
9.权利要求1-4中任一所述的多肽功能化微纳界面材料在循环肿瘤细胞高效分离富集中的应用或在制备循环肿瘤细胞分离富集试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞包括肝癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、人脑胶质瘤细胞、黑色素癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、***细胞、鼻咽癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞。
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2021
- 2021-05-27 CN CN202110582627.2A patent/CN115404220A/zh active Pending
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