CN107525920A

CN107525920A - 聚离子液体磁性纳米复合物及其对痕量循环肿瘤细胞特异性富集和检测的应用

Info

Publication number: CN107525920A
Application number: CN201710686464.6A
Authority: CN
Inventors: 印晓星; 于妍妍; 郁超; 汤道权; 杨渊; 李成林
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2017-12-29
Anticipated expiration: 2037-08-11
Also published as: CN107525920B

Abstract

本发明公开了一种聚离子液体磁性纳米复合物及其对痕量循环肿瘤细胞特异性富集和检测的应用，本发明提供了一种具有高灵敏度，高特异和高准确度的磁性纳米生物探针，并用于对CTCs的分离和富集中。磁珠表面丰富的羧基官能团，能够通过与抗体的氨基化学键合，提高与EpCAM抗体偶联的效率，结合磁珠本身较大的比表面积以及良好的分散性，显著提高了对CTCs的富集效率。同时，聚离子液体本身优良的生物相容性，也显著降低了对细胞的毒性，从而提高了富集后细胞的成活率。

Description

聚离子液体磁性纳米复合物及其对痕量循环肿瘤细胞特异性富集和检测的应用

技术领域

本发明属于医学检测领域，具体涉及一种聚离子液体磁性纳米复合物及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康和导致死亡的主要原因之一。肿瘤细胞具有向周围组织侵袭乃至向全身扩散和转移的特性。据报道，约90％的肿瘤患者死于肿瘤侵袭和转移。分子生物学和临床研究结果表明，肿瘤转移在肿瘤发生的早期就已经出现。然而目前肿瘤的发现和临床诊断仍依赖于影像学检查及传统肿瘤标志物的监测，难以在早期即发现肿瘤的转移或复发。因此，为了进一步提高肿瘤治疗的疗效，亟需寻找更有效的疗效和预后检测指标及治疗靶点。研究发现，在肿瘤转移的过程中，在患者的外周血中检测到循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)，因此，对此类肿瘤细胞的早期发现和检测有可能成为发现肿瘤早期转移的一种有效手段，对肿瘤的早期诊断、预后判断及治疗效果评价等方面具有重要的参考价值。

CTCs一般是由原发灶肿瘤细胞入血后转变而来。它在外周血中的数量极其稀少，通常肿瘤患者的血液中CTCs的浓度只有1～10个/mL。因而对CTCs的检测一般首先要经过分离富集的预处理步骤，以去除大部分血液中正常细胞。对CTCs的分离和富集主要分为物理法和生物化学法。物理法主要利用CTCs和血液正常细胞在物理性质方面的差异，如尺寸、密度、悬浮力大小等；生物化学法通常依赖于细胞膜表面的抗原与偶联在分离载体上的抗体相结合，达到分离捕获CTCs的目的。

CellSearch***是目前唯一通过美国食品药品监督管理局(FDA)批准应用于临床分离富集CTCs的仪器，其主要原理正是利用偶联了EpCAM抗体的磁颗粒与肿瘤细胞表面的抗原相结合，然后在磁场的作用下分离。对富集得到的CTCs，常用有分子生物学法(如定量PCR)和细胞生物学法(如免疫荧光、免疫细胞化学染色等)进行鉴定。然而，该***的主要缺陷是CTCs群体异源，一些CTCs不表达EpCAM。此外，在该***中，捕获的CTCs会失去了原有的活力。

四氧化三铁(Fe₃O₄)磁性纳米球是目前细胞分离和富集方面的磁性纳米材料之一。相比于纳米颗粒，Fe₃O₄纳米球(MNs)在磁性分离过程中的响应速度更快，在外加磁场的定向控制下，通过清洗和解吸操作，可将目标物从多组分环境中快速分离出来，省去了离心、过滤等繁琐的步骤，为复杂体系的分离带来了极大便利。但是，纳米尺寸的Fe₃O₄MNs因其粒径小、磁性强等特点，极易发生团聚，使其很难应用在CTCs的分离和富集方面。

发明内容

本发明的目的是的现有技术的基础上，采用磁性分离法，以羧基聚离子液体(PIL)功能化的四氧化三铁(Fe3O4)磁性纳米球(MNs)为分离载体，以上皮细胞黏附分子抗体(anti-EpCAM)作为血液中CTCs的特异性识别分子，通过将其与MNs进行生物偶联制备免疫磁珠(IMNs)，构建一种可直接用于对乳腺癌、***、肝癌等肿瘤细胞中痕量CTCs高效分离、富集、鉴定和检测的纳米生物探针，为恶性肿瘤的早期转移诊断以及预后评估提供重要的参考依据。

本发明的另一目的是提供一种上述纳米生物探针在痕量循环肿瘤细胞特异性富集和检测方面的应用。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种能够对痕量循环肿瘤细胞特异性富集或检测的聚离子液体磁性纳米复合物，其特征在于它由如下步骤制备而成：

(A)羧基功能化离子液体单体的合成：将溴乙酸和1-乙烯基咪唑在溶剂中加热反应，得到羧基功能化离子液体单体；

(B)Fe₃O₄/SH磁性纳米球的合成：将Fe₃O₄磁性纳米球分散在溶剂中，加入3-巯基丙基三甲氧基硅烷进行反应，得到Fe₃O₄/SH磁性纳米球；

(C)聚离子液体功能化磁珠的合成：将Fe₃O₄/SH磁性纳米球与羧基功能化离子液体单体和交联剂混合后，加入引发剂进行聚合反应，得到聚离子液体功能化磁珠MNs；

(D)聚离子液体磁性纳米复合物的制备：将MNs分散于含EDC和NHS的PBS溶液中进行活化，然后通过磁场分离活化的MNs，将其重新悬浮于PBS溶液中，加入EpCAM抗体进行孵育，多次洗涤，得到聚离子液体磁性纳米复合物IMNs。

本发明的所述羧基功能化离子液体单体由溴乙酸与1-乙烯基咪唑在甲苯中于50～60℃下反应制得。进一步的，所述羧基离子液体的制备方法为：将溴乙酸溶于甲苯后，缓慢加入1-乙烯基咪唑，在50～60℃下搅拌反应，反应后分离出固体，干燥即得。一种更具体的合成方法为：取溴乙酸和甲苯加入圆底烧瓶中，缓慢滴加1.1mmol 1-乙烯基咪唑。60℃下回流，磁力搅拌反应12h。经减压抽滤和真空干燥，得到白色固体粉末，即羧基功能化离子液体单体(IL-Br)。

本发明的交联剂由1-乙烯基咪唑与1,4-二溴丁烷反应制得。进一步的，所述交联剂BVD的合成方法为：将1-乙烯基咪唑和1,4-二溴丁烷在甲醇中混合后，在50～60℃搅拌反应，反应后将反应混合物冷却，然后加入***中，将所得的半透明溶液冷置后分离产物，洗涤干燥。

本发明的Fe₃O₄磁性纳米球可采用现有技术中的Fe₃O₄磁性纳米球，它也可以直接由FeCl₃在乙二醇和水中溶解后与乙酸钠和聚乙二醇反应后制得。进一步的，所述Fe₃O₄磁性纳米球的合成方法为：取FeCl₃、乙二醇和水混合搅拌至溶解，随后加入乙酸钠和聚乙二醇进行高速搅拌，得到透明溶液，然后在高压釜中于160～210℃进行反应，反应后将所得产物冷却、洗涤、干燥，即得。

在步骤(B)中，优选的，所述溶剂为甲苯，Fe₃O₄磁性纳米球与3-巯基丙基三甲氧基硅烷的用量比为1:0.1～5g/Ml，优选1:0.1～3g/mL，反应温度为60～100℃；反应后的产物冷却后，依次用甲苯、甲醇、去离子水和乙醇洗涤，然后干燥，置于1～5℃的条件下备用。

在步骤(C)中，优选的，Fe₃O₄/SH磁性纳米球与羧基功能化离子液体单体和交联剂在乙醇中混合；反应温度为60～80℃；反应后将获得反应物冷却、清洗、干燥后，置于1～5℃的条件下备用；Fe₃O₄/SH磁性纳米球与羧基功能化离子液体单体和交联剂的用量比分别均为1:0.01～0.04g/mol，所述引发剂为AIBN。

在步骤(D)中，优选的，先将MNs分散于含EDC和NHS的pH 6.7～6.9的PBS的溶液中进行活化，然后通过磁场分离活化的MNs，再用pH 7.3～7.5的PBS洗涤，将其重新悬浮于pH7.3～7.5的PBS溶液中，加入EpCAM抗体进行孵育，然后用pH 7.3～7.5的PBS洗涤，最后将其储存于pH 7.3～7.5的PBS中，置于1～5℃的条件下保存。

在步骤(D)中，优选的，MNs与EpCAM抗体的质量比为1:0.05～0.2，活化和孵育温度均为1～5℃。

本发明的聚离子液体磁性纳米复合物IMNs在复杂生物体系中稳定性良好，能够应用于全血中痕量CTCs的富集，特别是应用于对痕量循环肿瘤细胞的特异性富集和/或检测方面。

本发明的循环肿瘤细胞包括但不限于人乳腺癌MCF-7细胞、人单核细胞型淋巴瘤THP-1细胞、人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞、人***HeLa细胞中的一种或几种。

本发明中所指的痕量循环肿瘤细胞的含量为5～3000cell/mL，进一步可以达到5～400cell/mL，更进一步可以达到5～200cell/mL。

本发明提供了一种利用聚离子液体磁性纳米复合物对痕量循环肿瘤细胞进行特异性富集和/或检测的方法，其包括如下步骤：向含有痕量循环肿瘤细胞的缓冲液中加入上述的聚离子液体磁性纳米复合物IMNs，或者将含有循环肿瘤细胞的全血稀释后加入上述的聚离子液体磁性纳米复合物IMNs，混匀后静置孵育，然后在磁场作用下对缓冲液或全血中的循环肿瘤细胞进行分离和捕获，对捕获到的细胞进行染色鉴定和/或检测。

在富集或检测的方法中，缓冲液优选为PBS缓冲液；静置孵育的时间为2～30min，优选为2～25min或5～25min，最优选20min。

在富集或检测的方法中，聚离子液体磁性纳米复合物IMNs加入细胞后的浓度含量为0.1-0.5mg/mL。IMNs的浓度对CTCs富集的影响具有双重性。一方面，IMNs的浓度越高，无论是EpCAM抗体的数量，还是磁性分离的速度和效率，都会显著升高，因而对CTCs的富集是有利的；然而，若IMNs的浓度过高，由于纳米粒子之间的碰撞，磁珠容易发生自聚，因而会影响IMNs与细胞之间的吸附，不利于CTCs的富集。经反复实验发现，IMNs加入后的浓度含量为0.2-0.4mg/mL，特别是0.3mg/mL时可以使富集效率达到最佳。

本发明提供了一种利用聚离子液体磁性纳米复合物对痕量循环肿瘤细胞进行特异性富集和检测的方法：首先制备羧基功能化的咪唑离子液体单体(IL)和Fe₃O₄磁性纳米球。在此基础上，通过加入3-巯基丙基三甲氧基硅烷，制备羧基化聚离子液体(PIL)功能化的Fe₃O₄磁性纳米球，并命名为磁珠(MNs)。将其作为CTCs分离和富集的载体。将MNs与CTCs的特异性识别分子－上皮细胞黏附分子抗体(1.0mg/mL)在室温下生物偶联，制得免疫磁珠(IMNs)。

将本发明制得的IMNs加入到小鼠全血中，经离心洗涤5次后，测定其在580nm处的吸光度，并与加之前的吸光度比较，从而计算回收率，可以考察出本发明的IMNs的生物稳定性。

在应用方面，本发明的实验选择人乳腺癌MCF-7，肺癌A549，肝癌HepG2，***Hela细胞来模拟CTCs模型，以人单核细胞THP-1作为阴性对照细胞。在4℃下，将一定浓度的上述四种细胞与IMNs静置孵育一定时间后，置于磁铁上磁性分离，移除上清液，经PBS(pH7.4)洗涤3次并收集洗涤液后，重悬于PBS(pH 7.4)溶液中。利用流式细胞仪对上清液和洗涤液中未被IMNs捕捉的细胞进行计数，计算IMNs对CTCs的富集效率。同时采用DAPI染料对被IMNs捕捉到的细胞进行染色，从而对结果进行验证。

本发明进一步以MCF-7为例，考察了IMNs对CTCs富集的特异性，即采用相同的实验方法，分别将THP-1细胞与IMNs共孵育，以及MNs与MCF-7细胞共孵育，分别计算并比较三种条件下的富集效率，并利用共聚焦荧光显微成像对结果进行验证。对比有、无功能化聚离子液体修饰所制得的IMNs对CTCs富集效率的高低，从而说明聚离子液体对本方法灵敏度的影响。

本发明通过各种测试方法表明成功制备了聚离子液体功能化的MNs和IMNs。IMNs在小鼠全血中离心并洗涤5次后，经UV-vis测试，计算其回收率为(95.72±0.88)％，回收率良好，符合实验对材料稳定性的要求。特异性实验结果表明，IMNs仅对人乳腺癌MCF-7肿瘤细胞表现出了较高的富集效率，富集效率能够达到97％以上，而对人单核细胞THP-1几乎不能识别和捕捉((3.8±2.2)％)(n＝3)，与肿瘤细胞具有显著性差异；同时，未修饰EpCAM抗体的MNs同样也几乎无法识别和富集肿瘤细胞((3.8±1.4)％，n＝3)，这说明IMNs对CTCs的富集具有高度特异性。对富集后的MCF-7和THP-1细胞分别进行DAPI免疫荧光染色，结果表明MCF-7细胞为DAPI核染阳性，THP-1表现为阴性，染色结果与富集效率定量结果一致。同时，聚离子液体修饰的IMNs对肿瘤细胞的富集效率要远远高于无聚离子液体修饰的IMNs(两者的富集效率分别为(97.6±1.1)％，(18.4±2.3)％)。本发明所制备的IMNs对MCF-7,A549,HepG2和Hela四种肿瘤细胞的富集效率可以分别达到(97.6±1.1)％，(97.6±1.3)％，(95.2±1.1)％和(91.1±4.1)％(n＝3)。

本发明IMNs于三种介质(PBS(pH 7.4)缓冲液，MCF-7与THP-1细胞混合液，全血)中，对5～400cell/mL浓度范围内的MCF-7细胞均呈现良好的线性关系以及较高的富集效率，线性回归方程分别为y＝0.96x+0.65(R²＝0.999)，y＝0.97x+0.17(R²＝0.999)，y＝0.97x–1.57(R²＝0.999)。结果表明，IMNs在任意介质中，都能高效富集一定浓度的CTCs。

三种染色方法对富集到的模拟临床样本中的肿瘤细胞进行鉴定后的结果表明，MCF-7细胞表现为DAPI核染色阳性，抗CD45染色阴性，抗CK19染色阳性；周围的白细胞为抗CD45染色阳性，抗CK19染色阴性。细胞活性实验结果显示，在与IMNs孵育之后，绝大多数细胞在富集后仍能保持较高活性，细胞成活率约为98.8％。

本发明提供了一种具有高灵敏度，高特异和高准确度的磁性纳米生物探针，并用于对CTCs的分离和富集中。磁珠表面丰富的羧基官能团，能够通过与抗体的氨基化学键合，提高与EpCAM抗体偶联的效率，结合磁珠本身较大的比表面积以及良好的分散性，显著提高了对CTCs的富集效率。与多种已报道的方法相比，本工作对CTCs的富集效率较高，能够达到97％以上。本实验选择EpCAM抗体作为特异性识别CTCs的分子。该抗体能够高效识别CTCs，相同实验条件下，对阴性对照细胞THP-1的富集效率仅有(3.8±2.2)％，远远低于乳腺癌MCF-7((97.6±1.1)％)。实验结果表明，该方法具有较好的临床应用前景，能够为临床肿瘤患者血液中痕量CTCs的检测和肿瘤早期转移诊断提供重要的参考依据。

附图说明

图1是本发明IMNs的制备及对肿瘤细胞富集过程的示意图。

图2是实施例所得的Fe₃O₄纳米球(A)、MNs(B)和IMNs(C)的TEM图；

从图中可看出，未经功能化处理的Fe₃O₄纳米球分散性较好，平均粒径为210nm。当羧基功能化聚离子液体包裹到Fe₃O₄纳米球外层后，能够明显的观察到所制得的功能化磁珠的粒径变大，经计算，平均直径达到290nm；而当EpCAM抗体进一步修饰到磁珠表面后，由于生物大分子膜的覆盖，所制得的免疫磁珠的粒径继续增大至320nm左右。上述三种材料平均粒径的逐步增大，也说明了聚离子液体以及抗体在Fe₃O₄纳米球表面的成功修饰。值得注意的是，在对Fe₃O₄纳米球进行修饰前后，上述三种材料在乙醇中均保持了良好的分散性能。磁珠或免疫磁珠能够在血样中保持良好的分散性能，使其充分与细胞接触，这是CTCs成功分离的重要条件。因而这一结果对于后续实验中CTCs的磁性分离奠定了良好的基础。

图3为实施例所得Fe₃O₄纳米球和MNs的XRD图谱；

其中上曲线为MNs，可以看出在2θ为30.1°，35.5°，43.1°，57°，62.6°的5个特征峰分别对应的是标准四氧化三铁的{220}，{311}，{400}，{511}和{440}5个位面。同时，MNs的特征峰与Fe₃O₄纳米球的特征峰完全一致。这表明已经成功制备了具有立方尖晶石结构的Fe₃O₄，且聚离子液体的功能化修饰并不会破坏原有的Fe₃O₄晶型结构。

图4为Fe₃O₄纳米球(a)，MNs(b)、IMNs(c)的表面成分全谱分析以及上述三种纳米材料中C1s的高分辨XPS谱图(d)；

由于聚离子液体的母体结构为乙烯基咪唑，含有N元素，且在制备MNs及IMNs过程中使用到了-SH，因此相较于a图，在b和c图中出现了明显的N1s和S2p的特征吸收峰，分别位于结合能为401.8和167.6eV处。Fe₃O₄中Fe2p的特征峰在710.7eV处，随着纳米球外层被聚离子液体和抗体逐步覆盖，该峰的强度也逐渐减弱，在IMNs中完全消失。d图的C1s的高分辨能谱结果表明，Fe₃O₄纳米球和MNs中的C元素的C1s特征峰位于284.5eV处(黑色和绿色曲线)，而IMNs中C1s的特征峰位于286.0eV处(红色曲线)处，经文献查阅后证实，这两处的吸收峰可分别归属于芳香环中的C＝C以及C-N键 ³⁸，这也充分说明，抗体表面的-NH₂和MNs中的-COOH已经通过氨羧反应结合在一起。XPS的结果进一步表明，聚离子液体和抗体已成功修饰到Fe₃O₄纳米球表面，已成功制得了能够用于CTCs分离和富集的免疫磁珠。

图5为IMNs加入到小鼠全血中孵育前(A)和后(B)的水力学粒径曲线；

孵育前，IMNs的平均粒径为321.3nm左右。孵育后，其粒径几乎未发生变化(339.6nm)。由此可见，在复杂的生物环境中，IMNs能够抵抗非特异性的吸附，保持稳定的形态与CTCs发生特异性识别。

图6为IMNs(A，B)和MNs(C,D)分别和FITC标记山羊抗小鼠lgG共孵育30min后的明场和荧光图。

图7为(A)IMNs对MCF-7，THP-1的富集效率，MNs对MCF-7的富集效率的比较；(B)IMNs对HepG2，A549，HeLa细胞的富集效率；

其中，细胞浓度：200cells/mL。图9A表明，所设计的IMNs对200cell/mL的MCF-7细胞的富集效率可以达到97％以上((97.6±1.1)％，n＝3)。同时，为了验证IMNs对CTCs富集的特异性，选取人单核细胞THP-1作为阴性对照细胞，并在相同实验条件下，分别进行了MNs对MCF-7细胞以及IMNs对THP-1细胞的富集实验(图9A)。与IMNs对MCF-7细胞的富集效率相比，MNs对MCF-7细胞几乎没有富集能力((3.8±1.4)％，n＝3)，这主要是由于缺少CTCs的特异性识别抗体。同时，IMNs对THP-1细胞的富集效率也仅有(3.8±2.2)％(n＝3)，远远低于MCF-7细胞，证实IMNs对MCF-7细胞的富集是高度特异性的。在此基础上，还进一步考察了IMNs对人肺癌A549、肝癌HepG2 和***Hela细胞的富集效率。与MCF-7细胞结果相似，IMNs仍然能够对上述三种肿瘤细胞高效富集，富集效率分别为(97.6±1.3)％，(95.2±1.1)％和(91.1±4.1)％(n＝3)(图9B)。

图8为IMNs富集后的MCF-7(A,B,C)和THP-1细胞的DAPI荧光染色图；

其中，A和D：明场图；B和E：荧光染色图；C和F：明场和荧光染色的叠加图。在明场图中，可观察到，捕捉细胞后的IMNs粒子以细胞为中心，从分散态变为聚集状态(图A)。同时在荧光染色图中，呈现出DAPI染色的特有亮蓝色细胞核，且细胞形态较好的保存下来(图B)，说明IMNs已经成功捕捉了MCF-7细胞；然而在THP-1细胞富集后的IMNs中，在明场中，大部分IMNs粒子独立存在(图D)，并且在荧光显微镜下的全视野中并未出现DAPI染色的亮蓝色细胞核(图E)，表明IMNs无法识别和富集该细胞。以上结果充分说明，IMNs对肿瘤细胞的识别和富集具有特异性。

图9为(A)富集时间对IMNs与MCF-7细胞富集效率的影响；(B)IMNs浓度对IMNs与MCF-7细胞富集效率的影响；

其中，MCF-7细胞浓度：200cells/mL。在5个富集时间下所得到的IMNs对MCF-7细胞的富集效率分别为(77.9±3.5)％、(90.9±4.2)％、(92.5±3.0)％、(97.0±2.3)％、(97.6±2.1)％(n＝3)。如图9的(B)所示，通过5个浓度的IMNs(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL)对CTCs的富集效率，可以发现随着IMNs浓度的增加，富集效率也随之升高，但是当IMNs浓度超过0.3mg/mL时，富集效率反而下降。

图10为不同浓度MCF-7细胞在PBS(pH 7.4)，THP-1细胞(10⁶/mL)混合液以及全血中的富集效率。

图11为三种免疫细胞化学技术对IMNs富集后的模拟临床血液样本中的MCF-7和白细胞的鉴定；

图中，DAPI：核染，激发波长为405nm，发射波长为447nm；CK19(Alexa594)：激发波长为605nm，发射波长为685nm；CD45(Alexa488)：激发波长为488nm，发射波长为525nm。混合图为三种荧光染色的叠加图。

图12为IMNs富集后的MCF-7细胞的DAPI(A)，PI(B)以及两种染色的叠加荧光图(C)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于以下各实施例。

0.01M PBS缓冲液(pH 6.8)的配制：分别精密称取0.6119g NaH₂PO₄，2.621gNa₂HPO₄·12H₂O溶于一定体积的双蒸水中，用1M HCl调pH至6.8后定容至1000.00mL，室温下保存。

0.01M PBS缓冲液(pH 7.4)的配制：将PBS干粉溶解于一定体积蒸馏水中，取5mL双蒸水溶解袋中残余粉末，重复三次，将溶剂和洗液于2000.00mL容量瓶定容，室温下保存。

0.1％Triton-X 100的配制：取1mL Triton-X 100溶解于900mL PBS(pH 7.4)，定容至1000.00mL，4℃保存。

1％BSA的配制：取1g Triton-X 100溶解于100mL PBS(pH 7.4)，4℃保存。

实施例1：羧基离子液体(IL)的合成

取溴乙酸10mmol和10mL甲苯加入干燥的圆底烧瓶中，待溶解完全后，缓慢滴加1.1mmol 1-乙烯基咪唑。60℃下回流，磁力搅拌反应12h。反应结束后，减压抽滤得到白色固体，50℃真空干燥24h，得白色固体粉末。置于4℃冰箱备用。所得离子液体的结构式如下：

m/z 153.0为在正离子模式下得到的电喷雾质谱的正离子峰，与离子液体IL-Br的分子式相吻合。以DMSO为溶剂，对离子液体单体IL-Br进行了¹HNMR分析，谱图数据分析如表1所示。

表1.离子液体单体IL-Br的¹HNMR分析结果

实施例2：交联剂BVD的合成

取1-乙烯基咪唑(2.82g，30mmol)和1,4-二溴丁烷(13g，60mmol)在5mL甲醇中，60℃搅拌20h。将反应混合物冷却至室温，然后加入250mL***中。将所得的半透明溶液置于冰箱中5h。通过倾析分离固体产物上清液，用***洗涤数次，50℃真空干燥24h，置于4℃冰箱备用。

实施例3：Fe₃O₄磁性纳米球的合成

取FeCl₃(0.405g，25mmol)和乙二醇(20.0mL)，水(0.270g，270μL)混合，搅拌直至FeCl₃完全溶解。随后，无水加入乙酸钠(1.8g)，聚乙二醇(0.5g)高速搅拌30min，得到透明溶液。所得溶液转移到高压釜中200℃反应16h。将所得产物冷却，并用热水和乙醇洗涤数次。50℃真空干燥24h，置于4℃冰箱备用。所得Fe₃O₄纳米球用红外，TEM，XPS，XRD等方法进行表征。

实施例4：Fe₃O₄/SH磁性纳米球的合成

取Fe₃O₄磁性纳米球(3.0g)分散在无水甲苯(20.0mL)中，加入过量的3-巯基丙基三甲氧基硅烷(3.0mL)。将悬浮液在回流下机械搅拌12h。将所得产物冷却，依次用甲苯，甲醇，去离子水，和乙醇洗涤数次。50℃真空干燥24h，置于4℃冰箱备用。

取Fe₃O₄磁性纳米球(0.382g)分散在无水甲苯(20.0mL)中，加入过量的3-巯基丙基三甲氧基硅烷(2.0mL)。将悬浮液在回流下机械搅拌12h。将所得产物冷却，依次用甲苯，甲醇，去离子水，和乙醇洗涤数次。50℃真空干燥24h，置于4℃冰箱备用。实施例5：磁珠(MNs)的制备

将0.1g Fe₃O₄/SH与0.002mol的IL和BVD混合于8.0mL乙醇。加入1.0％AIBN后，混合物在70℃下振动反应10小时。将获得反应物冷却，依次用去离子水和乙醇清洗三次，50℃真空干燥24h，置于4℃冰箱备用。

对比Fe₃O₄纳米球和MNs的傅里叶红外吸收光谱图，相比较于Fe₃O₄纳米球，MNs在3380cm^-1处新增了一个吸收峰。同时，1625cm^-1处的吸收峰强度明显增强。上述两个吸收峰分别对应于COOH基团中的-OH和C＝O，由此证明，在Fe₃O₄纳米球表面成功修饰了羧基功能化的聚离子液体。

实施例6：IMNs的合成

将5mg的MNs分散于1mL含50mM EDC和50mM NHS的0.01M pH 6.8PBS的溶液中，室温轻轻摇动30min进行活化。通过磁铁分离活化的MNs，并用0.01M PBS(pH 7.4)洗涤三次。将其重悬于1mL的PBS(pH 7.4)中，加入50μg EpCAM抗体，室温摇动孵育4h。所得IMNs用PBS(pH7.4)洗涤数次以除去过剩的抗体，储存于PBS(pH 7.4)中，置于4℃冰箱备用。

将5mg的MNs分散于1mL含50mM EDC和50mM NHS的0.01M pH 6.8PBS的溶液中，室温轻轻摇动30min进行活化。通过磁铁分离活化的MNs，并用0.01M PBS(pH 7.4)洗涤三次。将其重悬于1mL的PBS(pH 7.4)中，加入100μg EpCAM抗体，室温摇动孵育4h。所得IMNs用PBS(pH 7.4)洗涤数次以除去过剩的抗体，储存于PBS(pH 7.4)中，置于4℃冰箱备用。

各取50μg IMNs和MNs，分别分散于100μL 5μg/mL的FITC-山羊抗小鼠IgG溶液中，4℃孵育半小时。用磁铁吸附，PBS清洗三次，于荧光显微镜下观察，结果图6表明EpCAM抗体已修饰到MNs表面。

实施例7：IMNs的稳定性的考察

粒径测试：取实施例6制得的0.3mg IMNs分散于1mL去离子水中，于粒径分析仪中检测。

回收率考察(紫外-可见分光光度法)：取0.3mg IMNs分散于1mL大鼠血液中，4℃孵育20min，磁力吸附5min，所得IMNs用PBS(pH 7.4)洗涤数次，并分散于1mLPBS(pH 7.4)中，测试其在580nm处吸光度，与IMN加入到血液中之前的吸光度比较，按下式计算IMNs的回收率：

Recovery＝A_c/A₀×100％

其中A_c是IMNs加入到血液中兵孵育后所测吸光度，A₀是IMN加入到血液中之前所测吸光度。

本实验的结果表明IMNs在复杂生物体系中稳定性良好，能够应用于全血中痕量CTCs的富集。

实施例8：IMNs的应用

细胞培养及处理：

实验所使用的细胞系包括人乳腺癌细胞系MCF-7，肺癌细胞系A549，肝癌HepG2，子***细胞系HeLa，人单核细胞型淋巴瘤细胞，THP-1；其中MCF-7为贴壁生长细胞系。THP-1为悬浮细胞。

细胞培养操作：

MCF-7，A549，THP-1细胞培养于添加了10％胎牛血清(FBS)及双抗(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)的1640培养基中。

HeLa，HepG-2细胞培养于添加了10％胎牛血清(FBS)及双抗(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)的DMEM培养基中。

MCF-7细胞培养于添加了10％胎牛血清(FBS)及双抗(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)的1640培养基中。

细胞于培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱内进行培养。

细胞冻存与复苏：

细胞复苏：将所需的细胞的冻存管于液氮中罐取出，立即置于37℃水浴锅中快速搅动使细胞冻存液溶解，将冻存液转入15mL离心管，补充3～4mL培养基，1500R/min离心5min，弃去上清液，取5mL培养基轻轻吹打细胞沉淀，混匀，接种于25mm²培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱内进行培养。

细胞冻存：收集对数生长期细胞悬液，1500r/min离心5min，弃上清，取培养基及DMSO 9:1配制细胞冻存液，用细胞冻存液对细胞沉淀进行重悬，浓度约为1×10⁷/mL，轻轻吹打混匀，悬液转移至无菌细胞冻存管中(1mL/管)，封闭后置于4℃(30min)，-20℃(30min)，-80℃(过夜)，最后置于液氮罐中保存。

贴壁细胞的换液与传代：

培养基每两天更换一次，换液时用适量PBS清洗细胞；当显微镜下贴壁细胞生长至70％及以上需进行传代。首先弃去培养基，然后于细胞瓶中加入1mL含EDTA的胰酶37℃消化适当时间；当细胞***圆润发光时立即加入培养基终止消化，用巴氏吸管将细胞吹打均匀，将所得细胞悬液1:3转移进入新培养瓶中，添加4mL培养基，置于细胞培养箱中。

悬浮生长细胞的换液与传代：

将细胞悬液1000R/min离心3min，沉淀1:3重悬于新鲜培养液即可。

细胞计数：

将血球计数板用酒精棉球擦拭干净，使用75％酒精冲洗，自然风干；将盖片置于计数板上，覆盖计数区；使用移液器吸取10μL细胞悬液分别从计数板计数区加样(利用毛细现象使悬液自行充盈渗透入计数区)；置于倒置显微镜下进行计数；计数时对上下两区域的各4个中格(内有4×4小格)进行计数，压线个体情况计算采取取上不取下，取左不取右的原则。

细胞固定及染色：

细胞固定：弃去细胞/磁珠培养基或PBS(pH 7.4)，加入4％多聚甲醛，室温下静置10min；用PBS洗涤细胞两次；用含0.1％Triton X-100的PBS溶液透化固定后的细胞5min(室温)，PBS(pH 7.4)洗涤细胞3次。

DAPI染色：弃去细胞/磁珠培养基或者PBS(pH 7.4)，用10mM PBS，pH7.4，清洗一次，再滴加入100μL的DAPI染液，室温避光染色5～15min，弃去染色液，PBS(pH 7.4)漂洗一次。滴加甘油或者Buffer A，荧光显微镜以340/380nm紫外激发，观测，拍照。

Anti-CK19抗体染色：将已固定细胞分散于100μL 5μg/mL的Anti-CK19抗体中，4℃过夜孵育。滴加甘油，荧光显微镜以590/617nm激发，观测，拍照。

Anti-CD45抗体染色：将已固定细胞分散于100μL 20μg/mL的Anti-CD45抗体中，4℃过夜孵育。滴加甘油或者Buffer A，荧光显微镜以488/519nm激发，观测，拍照。

IMNs对MCF-7和THP-1细胞的识别比较

实施例6所得的IMNs对CTCs的富集过程如示意图1所示。将MCF-7细胞，THP-1细胞，收集并重悬计数后，使用PBS(pH 7.4)缓冲液稀释至2000个/mL，置于1.5mL离心管中，并分别加入相同浓度的IMNs，混匀后4℃静置孵育20min，然后使用磁铁对悬液中的细胞进行分离和捕获(5min)。捕获后，吸取上清液移至另一干净离心管中，并将捕获到的细胞用PBS(pH 7.4)缓冲液进行重悬洗涤两次，并与首次吸取的上清液合并，采用流失细胞分析仪对该溶液中未被IMNs捕获的细胞进行计数。同时将IMNs捕获到的细胞固定，进行DAPI染色，荧光显微镜下观察。结果见图7。

MNs和IMNs对MCF-7细胞的识别比较

将MCF-7细胞收集并重悬计数后，用PBS(pH 7.4)缓冲液稀释至约2000个/mL，置于1.5mL离心管中，并分别加入相同浓度的IMNs和MNs，混匀后4℃静置孵育20min，然后使用磁铁对悬液中的细胞进行分离和捕获。捕获后，吸取上清液移至另一干净离心管中，并将捕获到的细胞用PBS(pH 7.4)缓冲液进行重悬洗涤两次，并与首次吸取的上清液合并，采用流式细胞分析仪对该溶液中未被捕获的细胞进行计数。计算富集效率，即细胞捕获率＝(捕获的细胞个数/原液细胞个数)×100％。同时将捕获到的细胞固定，进行DAPI染色，荧光显微镜下观察。结果见图8。

IMNs对其他种类肿瘤细胞的捕获

将HepG2、A549、HeLa细胞收集并重悬计数后，使用PBS(pH 7.4)缓冲液稀释至2000个/mL，置于1.5mL离心管中，并分别加入相同浓度的IMNs，混匀后4℃静置孵育20min，然后使用磁铁对悬液中的细胞进行捕获。捕获后，吸取上清液移至另一干净离心管中，并将捕获到的细胞用PBS(pH 7.4)缓冲液进行重悬洗涤两次，并与首次吸取的上清液合并，采用流式细胞分析仪对该溶液中未被捕获的细胞进行计数。细胞捕获率＝(捕获的细胞个数/原液细胞个数)×100％。结果见图8。

IMNs与MCF-7细胞孵育时间和细胞孵育时所用浓度

将MCF-7细胞收集并重悬计数后，使用PBS(pH 7.4)缓冲液稀释至2000个/mL，置于1.5mL离心管中，并分别加入相同浓度的IMNs，混匀后4℃静置孵育2min，5min，10min，20min，30min，平行测定3次。然后使用磁铁对悬液中的细胞进行捕获。捕获后，吸取上清液移至另一干净离心管中，并将捕获到的细胞用PBS(pH 7.4)缓冲液进行重悬洗涤两次，并与首次吸取的上清液合并，采用流式细胞分析仪对该溶液中未被捕获的细胞进行计数。细胞捕获率＝(捕获的细胞个数/原液细胞个数)×100％。结果见图9。

将MCF-7细胞收集并重悬计数后，使用PBS(pH 7.4)缓冲液稀释至2000个/mL，置于1.5mL离心管中，并分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的IMNs，混匀后4℃静置孵育20min，然后使用磁铁对悬液中的细胞进行捕获。捕获后，吸取上清液移至另一干净离心管中，并将捕获到的细胞用PBS(pH 7.4)缓冲液进行重悬洗涤两次，并与首次吸取的上清液合并，采用流式细胞分析仪对该溶液中未被捕获的细胞进行计数。细胞捕获率＝(捕获的细胞个数/原液细胞个数)×100％。结果见图9。

IMNs对MCF-7细胞特异性捕捉的线性范围

将正常生长中MCF-7细胞悬液进行计数后分别于PBS(pH 7.4)，THP-1细胞悬浮液(10⁶个/mL，PBS(pH 7.4))，和全血中，并分别稀释到5、50、100、200、300、500/mL的浓度。利用流式细胞分析仪对上述几种浓度的细胞原液准确计数后，依次加入一定浓度的IMNs，静置孵育20min。然后使用磁铁对悬液中的细胞进行捕获。捕获后，吸取上清液移至另一干净离心管中，并将捕获到的细胞用PBS(pH 7.4)缓冲液进行重悬洗涤两次，并与首次吸取的上清液合并，采用流式细胞分析仪对该溶液中未被捕获的细胞进行计数。细胞捕获率＝(捕获的细胞个数/原液细胞个数)×100％。

从图12中可以看出，在PBS(pH 7.4)溶液中，随着细胞原液浓度的增加，被IMNs富集到的细胞个数也线性增加，线性回归方程为y＝0.96x+0.65(R²＝0.999)；当5个MCF-7细胞加入到免疫磁珠中，能够富集到4个，并且这4个捕获的细胞全部保持活性，富集效率为83％；除该浓度之外，IMNs对该浓度范围内较大浓度MCF-7细胞的富集效率均在92％以上；同时，IMNs对MCF-7和THP-1细胞混合液以及全血介质中相同浓度的MCF-7的富集能力也较高，均在90％以上，线性回归方程分别为y＝0.97x+0.17(R²＝0.999)(n＝3)，y＝0.97x-1.57(R²＝0.999)(图12)。且统计学结果表明，MCF-7在三种介质中的富集效率没有显著性差异(P＞0.05)。

捕获后的肿瘤细胞的鉴定

将上述实验捕获得到的MCF-7细胞重悬于PBS(pH 7.4)中，分别用DAPI，anti-CK19，anti-CK45对其进行染色，并在荧光显微镜下观测，具有圆形到椭圆形的细胞和DAPI和CK19阳性，CD45阴性的细胞被鉴定为肿瘤细胞。

结果见图11。从图中可以看出，(1)MCF-7肿瘤细胞体积大于白细胞体积(一般情况，但并非是必须)；(2)MCF-7肿瘤细胞显示为DAPI核染色阳性，抗CD45染色阴性，抗CK19染色阳性；周围的白细胞为DAPI核染色阳性，抗CD45染色阳性，抗CK19染色阴性。符合以上特征的细胞被鉴定为CTCs。

捕获后的肿瘤细胞活性考察

将细胞用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS(pH 7.4)将细胞稀释到2000个/mL，取500μL进行特异性捕获。用500μL的Binding Buffer重悬捕获后的细胞，加入5μL AnnexinV-FITC，5μL Propidium Iodide，混匀，室温、避光反应5～15min，于1h内在荧光显微镜下观测。

结果见图12，从图中可以看出，绝大多数的MCF-7细胞在富集后，都能保持较高的活性，只有极少数的细胞凋亡，因而在PI染色图中只能观察到很少量的红色荧光(B)。经计算，约98.8％的细胞在富集后能够存活下来。与目前报道的很多类似方法相比，本发明中所使用的富集材料生物兼容性优良，对细胞基本上没有毒性，所以细胞能够保持较高的成活率。

Claims

1.一种能够对痕量循环肿瘤细胞特异性富集和检测的聚离子液体磁性纳米复合物，其特征在于它由如下步骤制备而成：

2.根据权利要求1所述的聚离子液体磁性纳米复合物，其特征在于所述羧基功能化离子液体单体由溴乙酸与1-乙烯基咪唑在甲苯中于50～60℃下反应制得，所述交联剂由1-乙烯基咪唑与1,4-二溴丁烷反应制得，所述Fe₃O₄磁性纳米球由FeCl₃在乙二醇和水中溶解后与乙酸钠和聚乙二醇反应后制得。

3.根据权利要求1所述的聚离子液体磁性纳米复合物，其特征在于在步骤(B)中，所述溶剂为甲苯，Fe₃O₄磁性纳米球与3-巯基丙基三甲氧基硅烷的用量比为1:0.1～3g/mL，反应温度为60～100℃；反应后的产物冷却后，依次用甲苯、甲醇、去离子水和乙醇洗涤，然后干燥，置于1～5℃的条件下备用。

4.根据权利要求1所述的聚离子液体磁性纳米复合物，其特征在于在步骤(C)中，Fe₃O₄/SH磁性纳米球与羧基功能化离子液体单体和交联剂在乙醇中混合；反应温度为60～80℃；反应后将获得反应物冷却、清洗、干燥后，置于1～5℃的条件下备用；其中Fe₃O₄/SH磁性纳米球与羧基功能化离子液体单体和交联剂的用量比分别为1:0.01～0.04g/mol，所述引发剂为AIBN。

5.根据权利要求1所述的聚离子液体磁性纳米复合物，其特征在于在步骤(D)中，先将MNs分散于含EDC和NHS的pH 6.7～6.9的PBS的溶液中进行活化，然后通过磁场分离活化的MNs，再用pH 7.3～7.5的PBS洗涤，将其重新悬浮于pH 7.3～7.5的PBS溶液中，加入EpCAM抗体进行孵育，然后用pH 7.3～7.5的PBS洗涤，最后将其储存于pH 7.3～7.5的PBS中，置于1～5℃的条件下保存。

6.根据权利要求1所述的聚离子液体磁性纳米复合物，其特征在于在步骤(D)中，MNs与EpCAM抗体的质量比为1:0.05～0.2，活化和孵育温度均为1～5℃。

7.根据权利要求1所述的聚离子液体磁性纳米复合物，其特征在于所述羧基功能化离子液体单体的制备方法为：将溴乙酸溶于甲苯后，缓慢加入1-乙烯基咪唑，在50～60℃下搅拌反应，反应后分离出固体，干燥即得；

所述交联剂BVD的合成方法为：将1-乙烯基咪唑和1,4-二溴丁烷在甲醇中混合后，在50～60℃搅拌反应，反应后将反应混合物冷却，然后加入***中，将所得的半透明溶液冷置后分离产物，洗涤干燥；

所述Fe₃O₄磁性纳米球的合成方法为：取FeCl₃、乙二醇和水混合搅拌至溶解，随后加入乙酸钠和聚乙二醇进行高速搅拌，得到透明溶液，然后在高压釜中于160～210℃进行反应，反应后将所得产物冷却、洗涤、干燥，即得。

8.权利要求1所述的聚离子液体磁性纳米复合物对痕量循环肿瘤细胞的特异性富集和检测方面的应用。

9.一种利用聚离子液体磁性纳米复合物对痕量循环肿瘤细胞进行特异性富集和检测的方法，其特征在于包括如下步骤：向含有痕量循环肿瘤细胞的缓冲液中加入权利要求1所述的聚离子液体磁性纳米复合物IMNs，或者将含有循环肿瘤细胞的全血稀释后加入权利要求1所述的聚离子液体磁性纳米复合物IMNs，混匀后静置孵育，然后在磁场作用下对缓冲液或全血中的循环肿瘤细胞进行分离和捕获，对捕获到的细胞进行染色鉴定和/或检测。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述循环肿瘤细胞选自人乳腺癌MCF-7细胞、人单核细胞型淋巴瘤THP-1细胞、人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞、人***HeLa细胞中的一种或几种；所述缓冲液为PBS缓冲液；所述痕量循环肿瘤细胞的含量为5～3000cell/mL；静置孵育的时间为2～30min；聚离子液体磁性纳米复合物IMNs加入细胞后的浓度含量为0.1～0.5mg/mL。